Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologiaPRODUKCJA BIOMASY CZ. 1

W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat obserwuje się na całym świecie nasilający się deficyt żywności, w szczególnościbiałka zwierzęcego. Zapewnienie pokarmu dla stale zwiększającej się liczby mieszkańców naszej planety, a także pasz dlazwierząt hodowlanych, zaczyna stanowić coraz poważniejszy problem. Samo powiększenie areału upraw, czy wydajnościrolnictwa nie wystarczy. Stąd od pewnego czasu przemysł spożywczy zaczyna poszukiwać nowych źródeł pokarmu. Jednym znich są drobnoustroje, które odpowiednio prowadzone mogą stać się kopalnią wielu cennych składników pokarmowych.Wśród mikroorganizmów o wysokiej wartości odżywczej, jako dodatki do pasz wykorzystuje się drożdże paszowe,otrzymywane w procesach fermentacji w postaci biomasy. Skład chemiczny komórki drożdżowej ulega znacznym wahaniom,w zależności od warunków hodowli, wieku komórek i szybkości wzrostu. Teoria Finka dotycząca hodowli drożdży mówi, że2/3 wprowadzonej do podłoża glukozy powinno przejść w biomasę. Pozostała część cukrów wykorzystywana jest przezkomórki do syntezy produktów ubocznych oraz na potrzeby życiowe. Oprócz drożdży cennym źródłem składnikówpokarmowych są bakterie i glony, do pasz dodaje się masę z hodowli bakterii Azotobacter, wykorzystuje się także glonyfotosyntezujące Chlorella i Scenedesmus.

Drożdże piekarskieDrożdże piekarskie (nazywane też piekarniczymi) należą do gatunku Saccharomyces cerevisiae, ale nie zawsze pochodzą

od czystej kultury jednej rasy. Może to być mieszanka trzech lub czterech ras. Dodatek drożdży do ciasta, wynoszący 2-5% wstosunku do użytej mąki, powoduje nie tylko spulchnianie ciasta. Chleb produkowany na drożdżach ma większą wartośćodżywczą niż chleb pieczony na zakwasie, gdyż drożdże zawierają 50% łatwo przyswajalnego białka, kilka procent tłuszczu, aprzede wszystkim witaminy: B1, B2, B6, B12, PP, witaminę D oraz kwas pantotenowy, które rozkładają się tylko częściowo wprocesie pieczenia.Dobre drożdże piekarskie powinny charakteryzować się:- wysoką właściwą szybkością wzrostu,- wysoką aktywnością w procesie glikolizy,- zdolnością adaptacji do szybko zmieniających się substratów w pożywce hodowlanej,- wysoką aktywnością p-fruktofuranozydazy, a-glukozydazy oraz innych enzymów przeprowadzających hydrolizę

węglowodanów,- zdolnością wzrostu i syntezy eznzymów zarówno w warunkach tlenowych jak również beztlenowych,- wysoką zdolnością wykorzystania soli amonowych i fosforowych (jako źródła azotu i fosforu),- wysoką możliwością wykorzystania związków organicznych w tym cukrów, aminokwasów, kwasów organicznych oraz

alkoholu i gliceryny do budowy masy komórkowej,- wysoką zawartością trehalozy, a także odpornością na zwiększone ciśnienie osmotyczne.Wszystkie wymienione powyżej cechy drożdży piekarskich decydują o ich przydatności w technologii piekarskiej. Jakośćhandlowych drożdży piekarskich jest określana przez wiele parametrów, m.in. trwałość przechowywania, osmotolerancyjność,odporność na niskie temperatury. Najważniejsza jest jednak aktywność fermentacyjna (siła pędna), czyli ilość dwutlenkuwęgla wytworzonego i zatrzymanego w cieście.

Trwałość drożdży piekarskich Drożdże mają niewielką zawartość suchej masy, w związku z czym podatne na autolizę, są szczególnie w wysokiejtemperaturze. Dlatego też powinny być przechowywane w temperaturze od +2 do +8ºC (jest to dla nich optymalnatemperatura). Jej podwyższenie powoduje wzrost zakażenia lub lizę komórek, a ujemne temperatury przechowywaniaprowadzą do wymrożenia wody w wakuolach i w konsekwencji zniszczenie komórek.Drożdże miękkie w dotyku, wskazują na zaawansowane procesy autolityczne. Nieprzyjemny zapach zepsutych drożdżyudziela się pieczywu. Oznaką zepsucia drożdży są:- szarożółta barwa- plamy niebieskie (pochodzenia bakteryjnego)- tłustość w dotyku- nieprzyjemny zapach (przypominaj ący klej lub rozkładaj ące się białka)Trwałość drożdży prasowanych, czyli handlowych, w temperaturze 20ºC powinna wynosić co najmniej 10 dni, a pożądana jesttrwałość 14-dniowa. W temperaturze 4°C drożdże można przechowywać do 4 tygodni, po tym czasie dochodzi do zbyt dużegoobniżenia ich siły pędnej. Trwałość termostatowa w temperaturze 35ºC nie może wynosić więcej niż 96 godzin.Wraz ze wzrostem zawartości substancji azotowych w komórkach drożdży wzrasta siłą pędna, czyli zdolność wytwarzaniadwutlenku węgla ze znajdujących się w cieście cukrów (zarówno rodzimych, jak i tych, które powstają w wynikuenzymatycznej hydrolizy skrobi i w czasie fermentacji ciasta), maleje natomiast ich trwałość. Wysoki poziom glikogenuwyraźnie zwiększa trwałość, a podwyższona zawartość trehalozy (15-20%) ma stabilizujący wpływ na aktywność biologicznadrożdży.Trwałość i aktywność fermentacyjna drożdży są ze sobą ściśle powiązane. Istnieje związek między przyrostem azotuaminowego podczas przechowywania a ich trwałością i siłą pędną. W pierwszych 7 dniach przechowywania (w 4°C) następujenieznaczny spadek zawartości wolnych aminokwasów, drożdże zużywają je na własne potrzeby metaboliczne. Następnie,podczas dalszego przechowywania (7 do 28 dni) obserwuje się wzrost ilości wolnych aminokwasów, wywołany działalnościąwewnątrzkomórkowych enzymów proteolitycznych. Zbyt długie przechowywanie prowadzi do obniżenia siły pędnej i ichtrwałości.

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologiaNa trwałość i aktywność biomasy komórkowej drożdży wpływają też cechy genetyczne rasy użytego szczepu S. cerevisiae,szczególnie wzajemne stosunki enzymów wewnątrzkomórkowych. Teoretycznie regulacja aktywności fermentacyjnejodbywać się może na drodze:- pobierania cukrów do komórki,- rozkładu cukrów w procesie glikolizy i fermentacji alkoholowej,- regeneracji ADP z ATP podczas glikolizy.Szczególnie wysoką aktywnością powinny charakteryzować się enzymy biorące udział w katabolizmie węglowodanów. Dużeznaczenie mają p-fruktofuranozydaza i a-glukozydaza oraz enzymy występujące w mące, np. a-amylaza i p-amylaza.Mąka zawiera bardzo małą ilość cukrów prostych mogących uczestniczyć w procesie glikolizy. Powyższe enzymy sąkluczowymi biokatalizatorami, decydującymi o przebiegu procesu glikolizy podczas fermentacji ciasta. Im wyższa aktywnośćwymienionych enzymów, tym większą siłą pędną będą charakteryzowały się drożdże piekarskie.Na trwałość znaczny wpływ ma również czystość mikrobiologiczna (stopień skażenia drożdży obcą mikroflorą, w tympleśniami i drożdżami dzikimi). Szczególnie groźne są zakażenia drożdżami obcymi, gdyż są trudne do zwalczenia, a tekomórki rozmnażają się szybciej od drożdży piekarskich i lepiej wykorzystują składniki pokarmowe z podłoża, opanowującśrodowisko. Zakażenia obcymi drożdżami powodują słabą aktywność i małą przydatność do wypieku chleba. Zakażeniabakteryjne (np. z wody użytej w procesie produkcji) mogą prowadzić do obniżenia jakości gotowego produktu lub naruszyćnormalny proces hodowli. W efekcie Bakterie gnilne, które rozkładają komórki powodują, że biomasa zakażonych drożdżyulega rozmiękczeniu i upłynnieniu, inne bakterie prowadzą do hydrolizy białka, wytworzenia kwasów lub wydzielają dużeilości śluzów, które zlepiają masę komórkową drożdży. Natomiast zakażenia pleśniami stanowią najmniejsze zagrożenieprocesów technologicznych, ze względu na kilkukrotnie dłuższy czas generacji niż u drożdży.

Wymagania sensoryczne drożdży piekarskich Drożdże oprócz wymienionych powyżej cech muszą spełniać także wymagania sensoryczne i fizykochemiczne, narzuconeprzez odpowiednie normy.Drożdże prasowane powinny zawierać nie mniej, niż 26% suchej masy (najczęściej 27% - co oznaczamy symbolem D27). Dlaporównania, drożdże suszone zawierają około 92% suchej masy. W ich skład wchodzi 40 pierwiastków chemicznych.Najważniejszymi są: węgiel, tlen, wodór, azot, fosfor, potas i magnez. Stanowią one 98% suchej masy drożdży. Te właśniepierwiastki w postaci przyswajalnej dla drożdży stanowią ich pożywienie. Głównym źródłem węgla są cukry zawarte w melasieburaczanej. Jest ona nie tylko źródłem przyswajalnego węgla organicznego, ale częściowo również związków azotowych,substancji wzrostowych i soli mineralnych. Na produkcję drożdży powinna być przeznaczona melasa najlepszej jakości imożliwie jednolita. Melasa gorszej jakości wymaga takich zabiegów, jak sterylizacja, klarowanie brzeczki melasowej,usuwanie szkodliwych składników i wzbogacanie w niezbędne dla drożdży sole mineralne.Aby zachować siłę pędną drożdży piekarskich, suszenie po produkcji musi odbywać się w stosunkowo niskich temperaturach,nie przekraczających 40ºC. Drożdże przeznaczone do suszenia powinny charakteryzować się wysoką zawartością trehalozy(dwucukier odpowiedzialny m.in. za trwałość termiczną drożdży).Żywotność drożdży dobrej jakości powinna wynosić nie mniej niż 95%. Oznacza to, że na każde 100 komórek drożdży tylko 5może być martwych. W celu wykonania oceny barwi się przygotowany preparat błękitem metylenowym i obserwuje podmikroskopem. Komórki martwe barwią się na niebiesko, a żywe pozostają bezbarwne.Drożdże hodowane są na melasie, a ich barwa zależy od sposobu produkcji i powinna być jak najjaśniejsza, kremowa,dopuszczalny jest odcień szary oraz zbrunatnienie krawędzi cegiełek drożdżowych wskutek ich wysychania.Smak i zapach powinien być swoisty bez posmaku gorzkiego i obcych zapachów (gł. pleśni). Dobre drożdże są w dotyku lekkoziarniste.Konsystencja powinna być ścisła, dopuszcza się zamarznięcie oraz zewnętrzną mazistość, jeżeli nie jest połączona z przykrymzapachem rozkładającego się białka.

Formy handlowe drożdży piekarskichDrożdże piekarskie na potrzeby handlu produkowane są w formie świeżej lub suszonej. Prasowane drożdże piekarskie w

formie świeżej biomasy komórkowej charakteryzują się wysoką aktywnością i łatwością użycia. Wadą ich jest stosunkowoszybka utrata trwałości, która nie pozwala na dłuższe magazynowanie zarówno w drożdżowni, jak i sklepach. Stąd takznaczny rozwój technologii produkcji drożdży suszonych, które umożliwiają suszenie nadwyżek drożdży w okresiezmniejszonego popytu i magazynowanie ich w chłodniach w celu uzupełnienia braków na rynku w odpowiednim momencie.Suszenie drożdży prowadzi się w suszarkach różnego typu, np. tunelowych, bębnowych, fluidyzacyjnych. W wyniku suszeniaotrzymujemy materiał biologicznie aktywny o zawartości 8% wody. Dalsze usuwanie wody ma już niekorzystny wpływ naaktywność drożdży gdyż jest związane z inaktywacją enzymów komórkowych. Drożdże suszone w stosunku do prasowanychcharakteryzują się wieloma zaletami:- nieporównywalnie większa trwałość,- ułatwiona dystrybucja ze względu na ich mniejszą masę o około 65% i objętość o 20-50%- łatwość pakowania, przechowywania i transportuPosiadają jednak również wady:- konieczność prowadzenia rehydratacji (uwodnienia) wysuszonych drożdży, które dodaje się do fermentacji ciasta- obniżona aktywność w stosunku do drożdży prasowanych, wynikająca najczęściej z uszkodzenia ich systemu

enzymatycznego w trakcie suszenia- wyższa zawartość komórek martwych.Najnowsze osiągnięcia w procesie suszenia polegają na dobraniu nie tylko optymalnych warunków samego procesu suszenia,ale także na zastosowaniu termostabilnych szczepów (bogatych w trehalozę), dodatku stabilizatorów oraz dobraniunajkorzystniejszych parametrów hodowli drożdży i składu biomasy komórkowej.

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologiaDrożdże paszowe

Drożdże paszowe powinny zawierać co najmniej 50% białka w s.m., szybko się rozmnażać, odznaczać się małąwrażliwością na zawartość substancji toksycznych w środowisku, maksymalnie wykorzystywać wszystkie składnikipokarmowe znajdujące się w substracie i nie mogą ulegać degeneracji w procesie ciągłym.Produkcja drożdży paszowych z melasy jest deficytowa, ale bezwartościowe surowce odpadkowe z różnych gałęzi przemysłujak hydrolizaty surowców celulozowych, ługi posiarczynowe, wywar pospirytusowy, mogą być z powodzeniem wykorzystane.Wiele z tych surowców stanowi uciążliwe odpady zawierające substancje toksyczne i zatruwające wody powierzchniowe.Ponieważ surowce do produkcji drożdży paszowych zawierają substancje bakteriobójcze (SO2) lub zostały wysterylizowane(wywar), a także dzięki zwiększeniu odporności ras drożdży dzikich na zakażenie, stosuje się z zasady ciągła metodęprodukcji. Rozmnaża się je w dużych kadziach wolno stojących i stosuje automatykę sterującą niemal wszystkimi procesamitechnologicznymi.Najczęściej stosuje się drożdże z rodzajów: Torula i Torulopsis. W zależności od podłoża są to zwykle: Candida utilis, Torulautilis, Candida tropicalis, Candida arborea, Candida crusei, Candida humicola, Candida robusta, Monilia murmanica,Torulopsis Cremonie, Endomycopsis bistora, Trichosporon cutaneum i inne.Wymienione gatunki i szczepy drożdży mają zdolność przyswajania substancji nie dostępnych dla drożdży gorzelniczych, amianowicie: gliceryny, kwasów organicznych, pentoz, resztek niedofermentowanych lub nie ulegających fermentacji cukrów,alkoholu, a nawet części azotu białkowego. Wszystkie te składniki są przetwarzane na biomasę drożdży.

Wykonanie ćwiczeniaI. Ocena jakościowa drożdży

1. Sprawdzenie masy drożdży piekarskich.Zawartość opakowania zważyć z dokładnością do 0,1g i porównać z wagą kostki na opakowaniu deklarowanąprzez producenta

2. Określenie barwy.Barwę próbki należy określić wzrokowo przy świetle dziennym

3. Określenie smaku.Smak drożdży piekarskich należy określić biorąc do ust ok. 1g badanej próbki.

4. Określenie konsystencji.Cegiełkę drożdży lekko nagnieść palcem w środku bocznej powierzchni. Konsystencja powinna być ścisła;dopuszcza się zewnętrzną mazistość, jeżeli nie jest połączona z przykrym zapachem rozkładającego się białka.

5. Oznaczanie zawiesiny wodnej.Do probówki szklanej wrzucić grudkę drożdży (około 1 g na 20 cm3) pobraną z wnętrza cegiełki, dodawaćporcjami wodę do około połowy pojemności probówki i każdorazowo wstrząsnąć probówkę zamknąwszy jąkorkiem. Obserwować zawiesinę po całkowitym wymieszaniu - zawiesina powinna być jednorodna, w ciągu 5min nie powinna wykazywać grudek ani kłaczków na dnie probówki.

6. Oznaczanie zawartości suchej masy. Oznaczenie polega na wysuszeniu próbki drożdży do stałej masy

- metoda wagowaW zważonym naczyńku wagowym (wraz z przykrywką), wysuszonym w temperaturze 105°C do stałejmasy, odważyć około 1g drożdży z dokładnością 0,001g. Przed odważeniem końcowym drożdże dokładnierozetrzeć na dnie i dolnej części bocznej ścianki naczyńka. Po dokładnym zważeniu i zanotowaniu wagi,naczyńko otwarte wraz z przykrywką umieścić w suszarce na 1,5 – 2h w temp. 105°C. Następnie naczyńkozamknąć pokrywką, wstawić do eksykatora, po ochłodzeniu zważyć, po czym otwarte naczyńko ponownieumieścić w suszarce w temp. 105°C na 1h. Oznaczenie uważa się za zakończone, jeśli różnica masy pokolejnym dosuszaniu nie przekracza 0,001g. Zawartość suchej masy obliczyć w procentach wg wzoru

100´--

=abacX

c – masa naczyńka z przykrywką i drożdżami po wysuszeniu [g]a – masa naczyńka z przykrywką [g]b – masa naczyńka z przykrywką i drożdżami przed wysuszeniem [g]

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia- oznaczenie zawartości suchej masy za pomocą wagosuszarki

· 15 minut przed rozpoczęciem pomiaru włączyć wagosuszarkę – urządzenie musi się nagrzać· po 15 minutach otworzyć wieko wagosuszarki, umieścić na szalce folię aluminiową (kwadrat ok.

5x5cm) i nacisnąć dwukrotnie przycisk TARE – tarowanie wagi· zdjąć folię z szalki, rozprowadzić na niej ok. 2g drożdży (cienka warstwa) i ponownie położyć na szalkę

– zanotować masę drożdży!· zamknąć wieko wagosuszarki· nacisnąć przycisk F1 (programowanie temperatury) i klawiszem F2 ustawić temperaturę - 1040C· nacisnąć klawisz F1 (czas próbkowania) i klawiszem F2 ustawić czas próbkowania – 20· nacisnąć klawisz F1 – pojawi się komunikat na wyświetlaczu READY – potwierdzić ponownie

naciskając F1, rozpoczyna się pomiar· wynik podawany jest w % wilgotności próbki· pomiar prowadzić do momentu uzyskania stałej wartości wilgotności· zapisać wynik i wyliczyć suchą masę analizowanej próbki· zakończyć pomiar naciskając klawisz TARE – otworzyć wieko wagosuszarki, wyciągnąć folię z

drożdżami, zamknąć wieko, wyłączyć urządzenie

7. Oznaczanie aktywności sacharolitycznej i maltatycznej drożdżySacharaza (P-fruktofuranozydaza, inwertaza) zawarta w drożdżach hydrolizuje sacharozę do fruktozy i glukozy. Wwyniku dalszych przemian powstaje alkohol i CO2. Wydzielona ilość cm3 CO2 przez biomasę drożdży wokreślonym czasie jest miarą aktywności sacharolitycznej.

- W kolbie o pojemności 50 cm3 sporządzić 20ml 5% roztworu sacharozy (do rozpuszczenia cukru użyćogrzanej do ok. 350C wody destylowanej). Następnie dodać 0,5 g drożdży, w przeliczeniu na suchą masę.Kolbkę zamknąć szczelnie korkiem zaopatrzonym w rurkę fermentacyjną wypełnioną wodą destylowaną.Naczynie zważyć, masę kolbki zanotować i wstawić do termostatu (35°C) na 1h. Znając różnicę mas przed ipo fermentacji obliczyć ilość wydzielonego CO2 [cm3]. Aktywność sacharolityczną podać jako ilość cm3 CO2wydzielonych przez 0,1 g suchej masy drożdży w ciągu 1 godziny (1 mol CO2= 44,0 g odpowiada objętości22,4 dm3).

C12H22O11 + H2O ® 4C2H5OH + 4CO2

Maltaza (a-glukozydaza) drożdżowa hydrolizuje maltozę na dwie cząsteczki glukozy, które w dalszym etapieulegają fermentacji na alkohol etylowy i CO2. Wydzielona ilość cm3 CO2 przez biomasę drożdży w określonymczasie jest miarą aktywności maltatycznej.

- aktywność maltatyczną oznacza się w sposób analogiczny jak aktywność sacharolityczną z tą różnicą, żezamiast sacharozy używa się maltozy. Aktywność maltatyczną podać jako ilość cm3 CO2 wydzielonychprzez 0,1 g suchej masy drożdży w ciągu 1 godziny (1 mol CO2 = 44,0 g odpowiada objętości 22,4 dm3).

8. Opracowanie wynikówPrzedstawić obserwacje, uzyskane wyniki oraz ich interpretację (wnioski), w postaci zbiorczej tabeli opisującejorganoleptyczne i technologiczne cechy drożdży piekarskich prasowanych i/lub suszonych.

L.p. Cechy Wymagania Próba I Próba II1 Barwa Kremowa, dopuszczalny odcień szary2 Smak Swoisty bez posmaku gorzkiego i pleśni4 Konsystencja Ścisła, dopuszcza się zewnętrzną mazistość,

jeśli nie jest połączona z przykrym zapachemrozkładającego się białka

5 Zawiesina wodna Jednolita, bez grudek i kłaczków6 Zawartość suchej masy [%] Nie mniej niż 27 (prasowane)

7 Aktywność sacharolityczna8 Aktywność maltatyczna

9. Materiały do ćwiczeń, które zapewnia student !!!!- drożdże piekarskie, świeże 2 rodzaje np.: drożdże w kostce, drożdże suszone

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia10. Zagadnienia teoretyczne:

- charakterystyka drożdży- trwałość drożdży piekarskich- wymagania sensoryczne dla drożdży- formy handlowe drożdży piekarskich- drożdże paszowe

11. Literatura:1. Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998.2. Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 19983. Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 20004. Bednarski W., Reps A.; Biotechnologia żywności; WNT; Warszawa; 2003.