PRODUKSI PROTEIN DENGAN SISTEM EKSPRESI DI SEL EUKARYOT

Suharsono• Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB

• Departemen Biologi, FMIPA, IPB• E-mail: sony-sh@ipb.ac.id; sony@rcbio.org

Kelemahan sel prokaryot

Produksi protein heterologus eukaryot di sel prokaryot (bakteri):-Tidak stabil-Kekurangan aktivitas biologis-Dapat terkontaminasi oleh toksin dari bakteri

di dalam sel prokaryot tidak terjadi modifikasi pascatranslasi

Pembentukan ikatan disulfida oleh disulfida isomerase pelipatan protein menentukan stabilitas dan aktivitasPemotongan proteolitik dari protein prekursor menentukan fungsi proteinGlikosilasi melalui penambahan residu gula menentukan stabilitas protein-Terikat pada O: serin, treonin-Terikat pada N: asparagin

Penambahan pada protein: fosforilasi, asetilasi, sulfatasi, asilasi, γ-karboksilasi, miristilasi, palmitasi

Pascatranslasi pada eukaryot

Glikosilasi

Terikat pada O

Khamir

Serangga

Mamalia

Terikat pada N

Khamir

Serangga Mamalia

Vektor ekpresi pada eukaryot

1. Gen penanda seleksi di eukaryot

2. Promoter3. Signal berhenti transkripsi

dan translasi4. Sekuen yang menandai

poliadenilasi pada transkrip mRNA

+ Ori (plasmid) atau sekuen komplementer (untuk integrasi ke DNA kromosom sel inang)

Introduksi DNA ke dalam sel:•Transformasi (bakteri, khamir)•Transfeksi (sel hewan)

Teknik untuk transformasi khamir1. Elektroporasi (kejutan listrik berenergi tinggi)2. Perlakuan Li asetat3. Menggunakan protoplast

Transveksi pada sel hewan1. Sel dicampur dengan DNA yang telah

dipresipitasi dengan CaPO4 atau DEAE-dextran2. Elektroporasi

Sistem ekspresi Saccharomyces cerevisiae

Sebagai sel inang ekspresi gen eukaryot:1. Sel tunggal, secara genetik dan fisiologis telah

diketahui, mudah tumbuh (di tabung reaksi dan bioreaktor)

2. Mempunyai promoter kuat dan plasmid (2 μm)3. Melakukan proses modifikasi pascatranslasi4. Mensekresi beberapa protein, shg bila digunakan

untuk produksi protein rekombinan ekstraselpurifikasi mudah

5. Organisme yang dianggap aman

Protein rekombinan yang diproduksi oleh sistem ekspresi S. cerevisiae

Insulin: 50% produksi dunia diproduksi oleh S. cerevisiae

Vektor ekspresi S. cerevisiae

3 kelompok1. Vektor episom atau plasmid, yeast episomal

plasmid (YEp)2. Vektor terintegrasi atau yeast integrating plasmid

(YIp)3. Kromosom-khamir buatan atau yeast artificial

chromosome (YAC)

YEp:-ekstensif digunakan (produksi protein intra/ekstra sel)-berdasarkan plasmid 2 μm dengan jumlah kopi yangtinggi-menggunakan inang S.c mutan auxotrofik, gen WT di vektor komplementasi misal: YEp (LEU2), S.c (leu2)

Vektor ekspresi S. cerevisiaePromoter yang disenangi:teregulasi secara ketat, indusibelMisal: promoter yg diinduksi galaktosa: transkripsi naik1000x bila + galaktosaTerminasi transkripsi ekspresi maksimal

•dalam kultur berskala besar (>10 liter)

integrasi gen ke kr. YIp

Kendala: produk rendah krn kopi gen tunggal

diatasi: sasaran keDNA repetitif (rDNA= 200 kopi; sekuen δ = 400 kopi)δ = bagian retrotransposon= sekuen DNA RNA DNA integrasi ke beberapa situs

A1 & A2 = ujung genyang tidak esensial

Plasmid tidak stabil di S. c.

YAC-pengklonan segmen besar(100 kb), kromosom terpisah di S.c.

-stabil-untuk: peta fisik genommanusia, analisis gen besar,pustaka genom

-mirip kromosom: Ori (ARS), sentromer, telomer

-belum digunakan untuk produksi protein

-potensi: produksi protein dg jumlah besar dari gen multikopi atau protein dengansubunit yang berbeda

Produksi protein intrasel di S. cerevisiae

Superoksida + H+ Cu/Zn-SODH2O2

katalase/peroksidaseH2O + O2

Cu/Zn-SOD: agen terapi untuk penyakit bengkak(osteroarthritis, rheumatoid arthritis, scleroderma,ankylosing spondylitis)

perlu Cu/Zn-SOD dari manusia

• Ekspresi cDNA Cu/Zn-SOD manusia di E. colialanin setelah metionin inisiator tidak terasetilasi

Produksi SOD manusiaDengan YEp sehingga:1. gen LEU2; 2. Ori dari plasmid 2 μm; 3. gen AmpR; 4. OriE. coli; 5. cDNA Cu/Zn-SOD manusia (promoter danterminator GAPD= glyceraldehyde phosphatedehydrogenase)

S. c (LEU2-)

Seleksi medium tanpa leusin

LEU2 tumbuhproduk Cu/Zn-SOD

Untuk memudahkan purifikasi:

Protein disekresikan ke luar sel

fusi dengan sekuen signal (peptida signal, sekuen pendahulu) di hulucontoh sekuen signal: faktor tipe kelamin (mating)gen α, prepro-α-factorContoh: hirudin (dari Hirudo medicinalis) sebagai antikoagulan darah

Kelemahan ekspresi di S. cerevisiae1. Kadang ekspresi rendah dan hasil rendah2. Hiperglikosilasi (>100 residu manosa)

mengganggu fungsi, antigen3. Protein kadang disekresikan di ruang periplasmik

purifikasi mahal4. Pada konsentrasi sel yang tinggi, menghasilkan

etanol yang toksik terhadap sel sehingga jumlahprotein yang disekresikan rendah

Sistem ekspresi selain khamir

• Pichia pastoris (methylothropic yeast), karena:1. punya promoter yang diinduksi metanol (alkohol

oksidase): + metOH 30% AOX; -metOH 0% AOX)

2. tidak mensintesis etanol sehingga dapat mencapai kerapatan sel yang tinggi jumlah protein yangdisekresikan tinggi

3. mensekresikan sedikit protein sehingga mempermudah purifikasi protein rekombinan yangdisekresikan

1. GOI di antara promoter dan terminator AOX12. Ori dan penanda seleksi di E. coli3. Penanda seleksi di khamir

Vektor ekspresi di P. p

Vektor integratif P. pastorismenghindari instabilitas plasmid

GOI dan penanda seleksi diintegrasikan ke kromosom:1). rekombinasi tunggal; 2). rekombinasi ganda

GOI-bakteri, fungi, tan,hewan

-manusia:HBsAg, HSA

Alternatif inang lain:

Hansenula polymorpha: hemoglobin A manusia (2 α- dan 2 β-globin) Schizosaccharomyces pombeCandida utilis: monelinAspergillus: α-amylase, lipase, amyloglucosidase,cellulase untuk pangan, minuman, dan industri danpulp.

Sistem ekspresi sel serangga-baculovirusBaculovirusInang: invertebrata (serangga)Siklus infeksi: 2 bentuk1. Nukleokapsid tunggal (partikel virus):

dari sel terinfeksi2. Polihedron: kumpulan nukleokapsid

(virion) terbungkus di dalam matriksprotein (polihedrin)

Sel lisis, organisme mati polihedronPolihedron melindungi virionPolihedrin disintesis dalam jumlah banyak pada tahap akhir (36-48 jam setelah infeksi, selama 4-5 hari) s/d sel lisis dan inang mati

• sangat kuat, tidak untuk produksi virus• proses pascatranskripsi• dapat untuk produksi protein (polihedrin diganti

dengan GOI)baculovirus digunakan utk produksi protein

mamalia

Contoh:Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) menginfeksi ulat jengkal alfalfa (A.c) dan 30 spesies serangga, sel serangga (ulat tentara, Spodoptera frugiperda)

Promoter polihedrin (polyh)

Sistem vektor ekspresi BaculovirusAcMNPV rekombinan:1. promoter polihedrin dan bagian hulu AcMNPV

(situs rekombinasi)2. MCS (di antara promoter dan terminator

polihedrin)3. terminator polihedrin dan daerah hilir AcMNPV

(situs rekombinasi)diperbanyak di E. coli

Sel serangga diinfeksi dengan AcMNPV dan vektor(GOI) c.o. ganda GOI terintegrasi ke AcMNPV,gen polihedrin hilang. Virion tanpa gen polihedrin baculovirus rekombinan dapat diisolasi dari plak tanpa oklusi

Identifikasi virus rekombinan: -hibridisasi, PCR-biru-putih bila lacZ di bawah kontrol promoter baculovirus

Sel inang + baculovirus rekombinan4-5 hari panen protein

Protein yang dihasilkan oleh baculovirus

Sistem ekspresi sel mamalia

•produksi protein dg modifikasi pascatranslasi•Sel COS, BHK, HEK-239: ekspresi sementara dan cepat untuk mengetahui integritas konstruksi•Sel CHO: ekspresi stabil & produksi protein dalam jumlah besar

Vektor ekspresi sel mamalia:•Ori di sel eukaryot (dari virus ex: SV40)•promoter & terminator pengendali GOI•penanda seleksi di sel eukayot (thymidine kinase)

Vektor ekspresi sel mamalia

p= promoterI= intronpa= polyadenilationMCS= multiple cloning sitesSMG= selectable marker geneori= origin of replication

•Protein yang tersusun dari 2 rantai peptida yang berbeda•human thyroid-stimulating hormone (heterodimer); hemoglobin (tetramer, α2β2) & antibodi (tetramer, H2L2)

Sintesis: @ peptida terpisah, dirakit menjadi dimer atau tetramer secara in vitro tidak efisien

In vivo efisien:2 vektor ekspresi @ cDNA untuk satu subunit & penanda seleksi berbeda

Protein dengan 2 atau lebih subunit

•Seleksi dengan 2 agen sel hidup membawa dua vektorprotein rekombinan dimer/tetramerKendala: satu vektor hilang, jumlah kopi berbeda (jumlahprotein beda)

satu vektor membawa 2 gen di bawah promoter & terminator berbeda

•jumlah kedua protein sama•mengandung 2 GOI dipisah oleh IRES (internal ribosome entry site, dari virus mamalia) dikontrol satu promoter & terminator transkrip tunggal translasi dari ujung 5’untuk rantai α dan dari IRES untuk rantai β

Vektor bisistronik

Penanda seleksi untuk vektor ekspresi mamalia

Skema seleksi untuk meningkatkan produksi protein

•jumlah kopi vektor ekspresi dinaikkan dengan peningkatan konsentrasi agen seleksi secara bertahap