PseudomonasPseudomonas aeruginosaaeruginosa

Prof. Adjunto Ary Fernandes JuniorProf. Adjunto Ary Fernandes JuniorDepartamento de Microbiologia e Imunologia

Instituto de Biociências - UNESPDistrito de Rubião Júnior s/n

CEP 18618-000/ Botucatu/ SP /BrasilTel. 14 3880.0412ary@ibb.unesp.br

Pseudomonas

� Gessard (1882) - Bacillus pyocyaneus

� Migula (1894) - Pseudomonas

� Dispostas em pares de células que lembram uma

única célula

� Em 1992, esse gênero foi subdividido em vários

novos gêneros (ex. Burkholderia e Stenotrophomonas)

CLASSIFICAÇÃO

Família Pseudomonadaceae

Pseudomonas (P. aeruginosa e outras), Stenotrophomonas (S. maltophilia), Stenotrophomonas (S. maltophilia),

Burkholderia (B. cepacia, B. pseudomallei), Acinetobacter, Xanthomonas, Frateuria,

Zoogloea, etc.

CLASSIFICAÇÃO

Gênero Pseudomonas

200 espécies e 18 subespécies

� Pouco exigentes nutricionalmente (Inúmeros compostos orgânicos como fonte de

C) � Ampla distribuição na natureza � Grande versatililidade

P. aeruginosa PAO1 � 6,3 milhões de pares de base; 5.570 genes (open reading frames - ORFs); 8,4% dos genes são de regulação

(Stover et al., 2000)

Taxonomia � Similaridades RNAr e relacionamentos filogenéticos

Grupo I:- Pseudomonas “verdadeiras”

- Subdivisão γ das Proteobactérias- Exemplos: P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida

– espécies relacionadas

Grupo II:- Subdivisão β das Proteobactérias- P. cepacia, P. mallei Burkholderia

- P. solanacearum, P. picketti Ralstonia

Grupo III:- Subdivisão β das Proteobacérias- P. testosteroni Comamonas

- P. acidovorans Comamonas Delftia

- P. facilis Acidovorax

- P. palleronii Hydrogenophaga

- P. saccharophila

Grupo IV:Grupo IV:- Subdivisão α das Proteobactérias- P. diminuta, P. vesicularis Brevundimonas

Grupo V:- Subdivisão γ das Proteobactérias- P. maltophilia Xanthomonas Stenotrophomonas

Classificação de algumas pseudomonas clinicamente importantes

Pertence ao grupo I ���� homologia de rRNA

Grupo Fluorescente (Pigmento pioverdina = fluoresceína � Difusível) � P. aeruginosa,

P. fluorescens, P. putida)

Pseudomonas

Grupo Não Fluorescente���� P. stutizeri, P. mendocina)

� Bacilos Gram-negativos pertencentes ao grupo de não-fermentadores (Aeróbios)

� Ubíquos: Solo, matéria orgânica em decomposição, vegetação, água, ambiente

Pseudomonas

decomposição, vegetação, água, ambiente hospitalar em reservatórios úmidos

� Exigências nutricionais míninas: Acetato e amônia como fontes de carbono e de nitrogênio

(Biorremediação)

� É incomum a colonização persistente, como parte da microbiota normal humana

Pseudomonas

� Não resistem ao ressecamento e baixas temperaturas

PseudomonasPseudomonas aeruginosaaeruginosa ((±± 70% das 70% das doenças por doenças por PseudomonasPseudomonas))

� Bacilos Gram negativos, retos ou ligeiramente encurvados, isolados ou aos pares, curtos

(≅ cocobacilos) (1,5 a 3,0 µm de comprimento e 0,5 µm de diâmetro)0,5 µm de diâmetro)

PseudomonasPseudomonas aeruginosaaeruginosa

� Móveis (monotríqueas) (as vezes 2 ou 3 flagelos)

�Não esporulada

� Fimbrias - Importante para patogenicidade

� Algumas cepas capsuladas (cápsula de polissacarídeo - Alginato) (liga-se ao ácido siálico da membrana plasmática) (Aspecto mucóide da colônia)

Em P. aeruginosa, os flagelos são necessários para aproximar a bactéria da superfície, enquanto o LPS media as primeiras

interações, havendo talvez a participação de proteínas da membrana externa. Quando formam monocamadas, fímbrias tipo

IV mediam o movimento pulsante, necessário à formação de microcolônias. A produção destas fímbrias é regulada, em parte,

por sinais nutricionais (Crc), havendo ainda a ativação de genes envolvidos na síntese de alginato e repressão de genes

flagelares. A formação do biofilme maduro envolve a participação de homoserina lactonas sinalizadoras.

Nature Reviews Microbiology 8, 623-633 (September 2010)

a | A model of a bacterial biofilm attached to a solid surface. Biofilm formation starts with the attachment of a cell to a surface. A microcolony forms

through division of the bacterium, and production of the biofilm matrix is initiated. Other bacteria can then be recruited as the biofilm expands owing to cell

division and the further production of matrix components. b | The major matrix components — polysaccharides, proteins and DNA — are distributed

between the cells in a non-homogeneous pattern, setting up differences between regions of the matrix. c | The classes of weak physicochemical interactions

and the entanglement of biopolymers that dominate the stability of the EPS matrix47. d | A molecular modelling simulation of the interaction between the

exopolysaccharide alginate (right) and the extracellular enzyme lipase (left) of Pseudomonas aeruginosa in aqueous solution. The starting structure for the

simulation of the lipase protein was obtained from the Protein Data Bank117. The coloured spheres represent 1,2-dioctylcarbamoyl-glycero-3-O-

octylphosphonate in the lipase active site (which was present as part of the crystal structure), except for the green sphere, which represents a Ca2+ ion. The

aggregate is stabilized by the interaction of the positively charged amino acids arginine and histidine (indicated in blue) with the polyanionic alginate.

Water molecules are not shown. Image courtesy of H. Kuhn, CAM-D Technologies, Essen, Germany.

� Catalase positiva (Aeróbias estritas) (algumas crescem anaerobicamente na presença de Nitrato-

receptor de elétrons, sendo o nitrato reduzido a nitrito).

O teste é revelado através da adição

de 3 gotas do reativo de Griess A

com 3 gotas do

Redução do nitrato a nitrito e nitrito a gás (após a adição de zinco

� Não fermentam carboidratos (BGNNF)(utilizam poucos carboidratos (glicose, ribose e gluconato),

com 3 gotas do reativo de Griss B no caldo nitrato

a adição de zinco em pó)

?

�Oxidam glicose � pequena quantidade de ácidos, citocromo oxidase positiva (Diferenciar

das enterobactérias)

Escherichia coli. (Ann C. Smith, University of Maryland, College Park, MD)

Pseudomonas aeruginosa (Ann C. Smith, University of Maryland, College Park, MD)

Oxidação do Citocromo C pelo O2

Para fenilenodiamina é oxidado pela enzima adquirindo cor

vermelha

Pseudomonas (+), Enterobactérias (-)

� Não exigentes nutricionalmente (cepas multiplicam em água destilada e algumas podem

utilizar mais de 30 compostos orgânicos como fonte de C e N)

� Em Ágar Sangue � β hemólise

� Produção de pigmentos difusíveis (hidrosolúveis - Piocianina - Azul, e Fluresceina (Pioverdina)

(algumas produzem também Piorrubina-vermelho)

PIGMENTO PIOCIANINA

�Patógeno oportunista � Introduzida em áreas desprovidas de defesas normais (mucosa ou pele rompidas por lesões teciduais diretas; cateteres

intravenosos ou urinários, neutropenia quando na quimioterapia de tratamento de câncer)

�Resistente a corantes, muitos anti-sépticos e drogas antimicrobianas (comum nos hospitais)

�Cresce bem entre 37oC e 42oC

Quege GE, Bachion MM, Lino Junior RS, Lima ABM, Ferreira PS, Santos QR, Pimenta FC. Comparação da atividade de ácidos graxos essenciais

e biomembrana na microbiota de feridas crônicas infectadas. Rev. Eletr. Enf. [Internet]. 2008;10(4):890-905

Cápsula Polissacaridica(Alginato)

Endotoxina (LPS)

Fímbrias

Flagelo

Principais fatores de virulência de P. aeruginosa

Outros produtos

-Proteases:Elastases (LasA, LasB) Protease Alcalina

-Hemolisinas: Fosfolipase CRamnolipídio

-Exotoxina A-Exoenzima S-Piocianina

Fator de virulência Efeito biológico

Fímbrias(Neuraminidase)

Aderência ao epitélio respiratório(Melhora adesão das fímbrias)

Cápsulas de polissacarídios(Polimeros de ácido manurônico e gulurônico) = Alginato ou alginolato

Aderência ao epitélio traqueal (receptor ácido siálico da MP), anti -fagocitose

Endotoxina (LPS) (lipídeo A) Febre, oligúria, leucopenia ou leucocitose,

Fatores de Virulência associados à P. aeruginosa

Endotoxina (LPS) (lipídeo A) Febre, oligúria, leucopenia ou leucocitose, coagulação intravascular disseminada (CID),

anormalidades metabólicas, choque

Exotoxina A (mais importante (Termo lábil e imunogênica)

Impede alongamento da cadeia polipeptídica (Inibe síntese protéica) - danos a tecidos e

inibe ação de fagócitos

Exoenzima S (Termo estável e imunogênica)

Ação semelhante da exotoxina A

Fator de virulência Efeito biológicoElastase Lesão do tecido vascular (quebra elastina e

colágeno) - lesões hemorrágicas (=éctimagangrenoso), inibição da função dos

neutrófilos (interfere na resposta inflamatória e imunológica)

Protease alcalina (atividade em pH alcalino)

Lesão tecidual, anticomplementar, inativação da IgG, inibição da função dos

neutrófilos (interfere na resposta inflamatória e imunológica)e imunológica)

Fosfolipase C Hemolisina termo lábil, ação necrosante(degradação de lipídeos e lecitina) (fosfatidil

colina da membrana de eritrócitos)

Leucocidina Inibe ação de neutrófilos e linfócitos (capaz de matar o fagócito mesmo após a bactéria

ter sido fagocitada)

Bacteriocinas (Piocinas) Matar bactérias (microbiota normal)

Fímbrias do tipo IV

Receptor: Gangliosídeo GM1 quando desprovido de ácido siálico

Fatores de virulência

Sialidase (Neuraminidase)

Flagelo ����Tipo “b” flagelina peso molecular de 53KDa

Tipo “a” pertence a um grupo heterogêneo PM 45 a 52 Kda

Fatores de virulência

Lipopolissacarídeo (LPS) ���� Liberação de citocinasLipopolissacarídeo (LPS) ���� Liberação de citocinas

Obs. LPS � adesão ao tecido pulmonar e às células

da córnea

Febre, oligúria, leucopenia ou leucocitose, coagulação intravascular

disseminada (CID), anormalidades metabólicas, choque

Alginato ���� Polímero de ácido α-L- gulurônico e β-D-manurônico) � Antifagocítico e de adesão

Produção de alginato (gene alg) - mutação gene muc –

condições normais inibe a expressão do gen alg

Fatores de virulência

Produção de alginato em meio Luria-Bertani (LB) Agar sem NaCl e incubados a 37°C durante 12 h,

e, a 25°C durante 24 h para melhorar a pigmentação.

A. tipo selvagem (linhagem PAO1). B. linhagem mucóide

isolada de paciente com fibrose cística (FRD1 (mucA22).

Alginato/biofilme

Fatores de virulência

Microscopia eletrônica de P. aeruginosa em superfícies de vidro. Fracamente aderentes formando uma monocamada

(B e D) e moderada e fortemente aderente (A e C). (A e B; 7 e 14 h após a inoculação, respectivamente) e com o

biofilme (C e D; 20 e 40 h, respectivamente, após a inoculação) .

Deligianni et al. BMC Microbiology 2010 10:38

a) biofilme sobre a superfície de granito. Barra de escala, 10 mícrons.

b) ampliação de um biofilme mostrando em a P. aeruginosa e filamentos de matrix

extracelular. Barra de escala, 1 mícron. (Whiteley et al, 2001)

Elastase A (LasA) – serina protease

Elastase B (LasB) –metaloprotease –Zinco

Protease Alcalina

Fatores de virulência

Proteases

Elastina LasA

Lesão do tecido vascular (quebra elastina e colágeno) - lesões

hemorrágicas (=éctima

lesões de pele e tecidos hemorragia e necrose

Elastina

Parede vascular e tecido

pulmonar

LasA

LasBProtease Alcalina

hemorrágicas (=éctimagangrenoso), inibição da

função dos neutrófilos (interfere na resposta

inflamatória e imunológica)

Fosfolipase C (Plc)

(hemolisina termo lábil)

Ramnolipídeo (Rhl) – Glicolipídeo (ramnose)

Fatores de virulência

Ação necrosante (degradação de lipídeos e lecitina) (fosfatidil

colina da membrana de eritrócitos)

surfactante pulmonar

Ramnolipídeo

Fosfolipase C

Ação sinérgica

Exotoxina A

Exotoxina A (termo lábil e imunogênica) ���� Inibe síntese protéica � Danos a tecidos e inibe ação de fagócitos

Fatores de virulência

EF-2 Fator 2 de elongação

Exotoxinas (ExoS (90% das cepas), ExoT, ExoU, ExoY) (termo estável e imunogênica) ���� Tóxicas para fagócitos (macrófagos), danos teciduais)

Pigmentos Piocianina

Catalisa a produção de superóxido e peróxido de hidrogênio

-Danos aos tecidos endoteliais-Impede o crescimento de outras bactérias

Fatores de virulência

-Impede o crescimento de outras bactérias -Elimina a atividade ciliar respiratória-Produz danos oxidativos nos tecidos oxigenados, como o pulmonar

Pioverdina � Sideróforo que se liga aos íons ferro e pode regular secreção de outros FV (Exotoxina A)

Leucocidina ���� Inibe ação de neutrófilos e linfócitos (capaz de matar o fagócito mesmo após a bactéria ter sido fagocitada)

Fatores de virulência

Paradoxo da P. aeruginosa� Muitos fatores virulência

-Incapacidade de completar os primeiros passo da infecção �Não é capaz de invadi-las

-Não conseguem manter a colonização persistente concomitantemente com a produção de fatores tóxicos que

causariam danos ao indivíduo

Paradoxo da P. aeruginosa� Muitos fatores virulênciaPor que patógeno oportunista???

PACIENTES DE RISCO

-Queimaduras

-Fibrose cística

-Transplante de órgãos

Patogenicidade

-Traqueostomia

-Cateteres permanentes

-Neoplasia hematológica, diabetes, usocorticóides, uso de antibióticos, prótesesintravascular, cateterização, etc.

Manifestações clínicas causadas por Pseudomonas aeruginosa

Manifestação clínica Condições predisponentes

Endocardite Viciados em drogas injetáveis, indivíduo com prótese de válvulas cardíacas, cirúrgias cardíacas (acometimento de valvas

cardíacas)

Sepsis Cirurgias, cateterização, queimaduras graves, leucemia, diabetes mellitus

Infeções pulmonares (Traqueobronquites, Broncopneumonia

necrosante)

Pacientes com fibrose cística , pacientes entubados (lesão do epitélio traqueal)

necrosante)

Infecções de ouvido (otite)

Natação é um importante fator de risco

Infecções de feridas por queimaduras

Infecções das vias urinárias

Normalmente através de sondas vesicais (infecção nosocomial)

SNC - Meningites Via hematogênica, extensão de estruturas contíguas(ouvido, seios paranasais) ou por via direta (punção lombar, traumatismo)

Infecções oculares (ceratite e endoftalmite)

Associado a uso de lentes de contato, após cirurgias no olho

Dermatite por Pseudomonas aeruginosa

Ceratite por Pseudomonas aeruginosa

Infecção por Pseudomonas aeruginosa

Ectima gangrenoso

Vesículas eritematosas que se tornam

hemorrágicas, necróticas e ulceradas

cultura: isolamento e identificação

Material Clínico (lesões cutâneas, pús, urina, fezes, sangue,líquido cefaloraquidiano, escarro, etc)

Gram: BGNÁgar sangue: hemolítica

McConkey: lactose negativa

Diagnóstico

McConkey: lactose negativa

série bioquímica

não fermentador

- oxidase positiva

- movimento positivo

- crescimento a 42º C

- pigmento

Bacterioscopia ���� Método de Gram

Diagnóstico

ISOLAMENTO

Diagnóstico

Ágar sangue: hemolítica

McConkey: lactose negativa

Meio seletivo para P. aeruginosa para análise de água para consumo humano.

Resistência à inúmeras drogas

Imipenem

Tratamento

Imipenem

Aminoglicosídeos (gentamicina)

Fluoroquinolonas (ciprofloxacina)

Polimixinas (caso de multiresistentes)

Gonçalves et al., 2009 Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 42 (4), 2009

-Taxa de portadores na comunidade: 0 a 6%

-Taxa de portadores no hospital: 50%

-Fontes de infecção diversificadas: flores, verduras,

equipamentos respiratórios, água, medicamentos,

endoscópios, anti-sépticos, prótese.

Epidemiologia

-Fontes humanas do microrganismo podem ser

pacientes, profissionais de saúde ou visitantes.

-Práticas efetivas de controle de infecção devem ser

concentradas na prevenção da contaminação de

equipamentos estéreis, como equipamento de

ventilação mecânica e máquinas para diálise.

Muito obrigado!!!