BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDAD.

ALCANCES Y LIMITACIONES

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA CLINICA-INFIBIOC.Facultad de Farmacia y Bioquímica.

Universidad de Buenos Aires

CIGETOX- CITOGENETICA HUMANA Y GENETICA TOXICOLOGICA

Prof. Dra. Marta Ana CarballoProf. Dra. Marta Ana Carballo

ENTORNO / AMBIENTE

EVENTOS BIOLÓGICOS TEMPRANOS

EVENTOS BIOLÓGICOS TARDÍOS

ENFERMEDAD CLÍNICA

La Genética Toxicológica es la unión de dos grandes áreas del conocimiento como son la Toxicología y la Genética.

Identifica y analiza la acción de los agentes con toxicidad dirigida hacia los componentes hereditarios de los

organismos vivos.

• 1927 - Muller - radiaciones• 1947 - Auerbach - agentes químicos• 1953 - Watson y Crick - ADN• 1969 - Alexander Hollaender - EMS

••Determina el impacto que los distintos agentes Determina el impacto que los distintos agentes (f(fíísicos, qusicos, quíímicos, biolmicos, biolóógicos) pueden tener sobre gicos) pueden tener sobre

el material genel material genééticotico

••Trata de establecer la relaciTrata de establecer la relacióón entre mutagenesis n entre mutagenesis e iniciacie iniciacióón del proceso neopln del proceso neopláásicosico

Componentes celulares proclives a los Componentes celulares proclives a los procesos mutagprocesos mutagéénicosnicos

Daño severo del ADN

Errores en la reparación del ADN

Arresto del ciclo celular

Si hay una lesión en el ADN …

Reparación del ADN

Proliferación normal

Proliferación anormal Apoptosis Necrosis

MicromutacionesMacromutaciones

Tipos y frecuencias de daño en el ADN

Tipo de daño en ADN(SSB) Ruptura de simple cadena

Metilación de la Guanina N7

Depurinación

Metilación de la Guanina O6

Oxidación del ADN

Depirimidación

Deaminación de la Citosina

(DSB) Rupturas de doble cadena

Tipo de daño en ADN(SSB) Ruptura de simple cadena

Metilación de la Guanina N7

Depurinación

Metilación de la Guanina O6

Oxidación del ADN

Depirimidación

Deaminación de la Citosina

(DSB) Rupturas de doble cadena

Eventos/día/célula120.000

84.000

24.000

3.120

2.880

1.320

360

9

Eventos/día/célula120.000

84.000

24.000

3.120

2.880

1.320

360

9

% de daño total diario50,9

35,6

10,2

1,3

1,2

0,5

0,2

0,01

% de daño total diario50,9

35,6

10,2

1,3

1,2

0,5

0,2

0,01

AGENTE GENOTOXICOAGENTE GENOTOXICO

Rayos X ROS

Agentes alquilantes

Rayos X ROS

Agentes alquilantes

LESIONESLESIONES

Luz UV Hidrocarburos

policíclicosaromáticos

Luz UV Hidrocarburos

policíclicosaromáticos

RILuz UVAgentes

antitumorales

RILuz UVAgentes

antitumorales

Errores de replicación Errores de replicación

PROCESOS DE REPARACIONPROCESOS DE REPARACION

8-oxidGRupturas de

simple cadena

8-oxidGRupturas de

simple cadena

FotoproductosAductos

Dímeros de pirimídinas

FotoproductosAductos

Dímeros de pirimídinas

Enlaces cruzados

Rupturas de doble cadena

Enlaces cruzados

Rupturas de doble cadena

Reparación por escisión de

bases(BER)

Reparación por escisión de

bases(BER)

Reparación por escisión de nucleótidos

(NER)

Reparación por escisión de nucleótidos

(NER)

Recombinación Homóloga (HR)

Reunión de extremos no

homólogos (NHEJ)

Recombinación Homóloga (HR)

Reunión de extremos no

homólogos (NHEJ)

Reparación deMal

apareamiento (MMR)

Reparación deMal

apareamiento (MMR)

A-GT-C

Inserciones Deleciones

A-GT-C

Inserciones Deleciones

B

I

O

M

A

R

C

A

D

O

R

E

S

DE EXPOSICIÓN: Señala presencia de sustancia exógena o metabolitos, o producto de interacción entre agente y molécula blanco.

DE SUSCEPTIBILIDAD: Indicador de limitación adquirida o inherente de un organismo para responder a la exposición a un xenobiótico.

DE RESPUESTA BIOLOGICA: representa representa estadestadííosos del proceso de dadel proceso de dañño. Representan o. Representan alteraciones genalteraciones genééticasticas

DE ENFERMEDAD: manifestaciones preclínicas o tempranas de la enfermedad.

DE DAÑO BIOLOGICO EFECTIVO: Indica que el tóxico ha producido algún tipo de daño en el organismo.

INTERNO DE DOSIS : Indica que el tóxico ha entrado al orgsnimo..

DE EFECTO: Indicador de una alteraciIndicador de una alteracióón n bioqubioquíímica, fisiolmica, fisiolóógica o gengica o genéética, resultado de la tica, resultado de la exposiciexposicióón a un xenobin a un xenobióóticotico.

EVALUACION NIVELES DE COMPLEJIDAD

CRECIENTE

PRIMARIO (Bacteriano, Viral) (I)

SECUNDARIO (Cultivo de células) (II)

TERCIARIO (Organismo entero) (III)

CUATERNARIO (Epidemiológico) (IV)

Niveles de EvaluaciNiveles de Evaluacióónn

PRIMER NIVEL (I)PRIMER NIVEL (I) SEGUNDO NIVEL (II)SEGUNDO NIVEL (II)

CUARTO NIVEL (IV)CUARTO NIVEL (IV)TERCER NIVEL (III)TERCER NIVEL (III)

Nivel Molecular o bacterianoNivel Molecular o bacteriano

Ensayos en procariotes o Ensayos en procariotes o eucariotes inferioreseucariotes inferiores

Ejemplo: Test de Ames ; Ejemplo: Test de Ames ; Bacillus subtiliusBacillus subtilius

Nivel Nivel ““In vitroIn vitro””Ensayos en cultivos de cEnsayos en cultivos de céélulas lulas

eucariotaseucariotasEjemplo: LEjemplo: Lííneas celulares CHO, neas celulares CHO,

V79, Hela , Linfocitos de Sangre V79, Hela , Linfocitos de Sangre PerifPerifééricarica

Nivel Nivel ““In vivoIn vivo””

Ensayos organismo enteroEnsayos organismo entero

Ejemplos: Plantas, animales Ejemplos: Plantas, animales (invertebrados o vertebrados) y (invertebrados o vertebrados) y humanos expuestoshumanos expuestos

Nivel EpidemiolNivel Epidemiolóógicogico

Ensayos en poblaciones Ensayos en poblaciones expuestasexpuestas

Ejemplo: exposiciEjemplo: exposicióón n accidental, terapaccidental, terapééutica o laboral utica o laboral de individuos expuestosde individuos expuestos

Principales Ensayos Utilizados en Genética Toxicológica

• Mutaciones GénicasTest de AmesEnsayo de reversión a triptofano en E.coliMutaciones génicas en cultivo de células de mamífero (HPRT o TK)Mutaciones recesivas ligadas al sexo en Drosophila

• Evaluaciones citogenéticas en células de mamíferoEnsayo de aberraciones cromosómicasEnsayo de intercambio de cromátides hermanasEnsayo del micronúcleoEvaluación de Aneuploidías

• Otros ensayosDaño y reparación en células de mamíferoEstudios de recombinación mitótica en levaduras y/o Drosophila

Ensayo del locus específico en ratónEnsayo del letal dominanteAnálisis citogenético y Ensayo de traslocaciones heredablesEnsayo de alteraciones esqueléticas en ratón

ALCANCES

DISEDISEÑÑO DE PROTOCOLOS PARA EVALUACION DE O DE PROTOCOLOS PARA EVALUACION DE DROGAS, ADITIVOS, MEDICAMENTOS, Y DROGAS, ADITIVOS, MEDICAMENTOS, Y COMPUESTOS QUIMICOS EN GENERALCOMPUESTOS QUIMICOS EN GENERAL

METODOLOGIAS DIAGNOSTICAS PARA LA METODOLOGIAS DIAGNOSTICAS PARA LA CARACTERIZACION DE DACARACTERIZACION DE DAÑÑO EN SINDROMES DE O EN SINDROMES DE

INESTABILIDAD CROMOSOMICAINESTABILIDAD CROMOSOMICA

MONITOREO DE INDIVIDUO / S EXPUESTOS EN MONITOREO DE INDIVIDUO / S EXPUESTOS EN FORMA LABORAL, ACCIDENTAL O TERAPEUTICAFORMA LABORAL, ACCIDENTAL O TERAPEUTICA

Las agencias internacionales de regulación han seleccionado grupos de biomarcadores de efecto con el

objeto de lograr la mejor y más segura caracterización del daño,

evaluando tanto “in vitro” como “in vivo” la genotoxicidad potencial.

OPPTS: OFFICE OF PREVENTION, PESTICIDES AND TOXIC SUBSTANCES (EPA)

OECD: ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND DEVELOPMENT (FDA)

Guidelines Guidelines

S2A: Aspectos específicos de regulación de Ensayos de genotoxicidad

S2B: Genotoxicidad: Una batería standard para el ensayo de genotoxicidad de productos farmacéuticos

Los Comité Internacionales de Armonización (ICH) sugieren la realización de baterías de ensayos constituidas por:

◊ un ensayo de reversión en bacterias◊ un estudio citogenético para detectar daño cromosómico (test de

aberraciones cromosómicas) o un estudio in vitro para mutaciones génicas)

◊ un test in vivo para genotoxicidad que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas o test de micronúcleo en ratón)

Desarrollo de cepas de S.typhimurium auxótrofas para histidina que permiten evaluar la retromutación de este organismo a histidina (+ ).

Es decir que una especie que ha perdido una característica, vuelve a adquirirla en base a otra mutación.

TA100, TA98, TA1535, TA1537, TA102, TA104

rfa, ∆uvr B, plásmido pKM101, plásmido pAQ1

Test de Salmonella o Test de Ames

UN ESTUDIO CITOGENETICO PARAUN ESTUDIO CITOGENETICO PARADETECTAR DADETECTAR DAÑÑO CROMOSOMICOO CROMOSOMICO

(TEST DE ABERRACIONES (TEST DE ABERRACIONES CROMOSOMICAS )CROMOSOMICAS )

O O UN ENSAYO IN VITRO PARA DETECTAR UN ENSAYO IN VITRO PARA DETECTAR

MUTACIONES GENICASMUTACIONES GENICAS(MOUSE LYMPHOMA ASSAY)(MOUSE LYMPHOMA ASSAY)

ABERRACIONES CROMOSÓMICAS

• Detecta alteraciones numérica y estructurales.

• Se basa en evidenciar cambios en la morfología de los cromosomas o en su número pudiendo detectar modificaciones de ploidía.

• Se utiliza para determinar el efecto clastogénico y/o aneunógeno de las drogas en estudio.

• Es el test más utilizado históricamente para evaluación de drogas.

Metafase Parcial de Linfocitos de Sangre Periférica con Aberraciones Cromosómicas

Metafase Parcial de línea celular CHO con Aberraciones Cromosómicas

IM =IM =NNººcelcel en en estadestadííosos de mitosis/de mitosis/NNºº total total celcel interfaseinterfase

Técnica de coloración diferencial de cromátideo FPG- fluorescencia plus giemsa

IR= Nº cél. M1+2 Nº cél. M2 + 3 Nº cél. M3/100

Se puede realizar en distintas líneas celulares

L5178Y linfoma de ratón (TK)TK6 línea linfoblastoide humana (HGPRT)

Ambos ensayos se basan en la adquisición de resistencia a un producto. Línea normal→no crece en presencia del producto.Línea mutada→ crece en presencia del producto.

Para TK se seleccionan por resistencia a Trifluorotimidina.Las células deficientes en HPRT son seleccionadas por resistencia a la 6-tioguanina u 8 azaguanina.

Ensayo de Mutaciones Génicas en Células de Mamífero

UN TEST IN VIVO PARA UN TEST IN VIVO PARA GENOTOXICIDAD QUE DETECTE GENOTOXICIDAD QUE DETECTE

DADAÑÑO CROMOSOMICOO CROMOSOMICO

(ABERRACIONES CROMOSOMICAS (ABERRACIONES CROMOSOMICAS O TEST DE MICRONUCLEO EN O TEST DE MICRONUCLEO EN

RATON)RATON)

Evento Genotóxico

MN MN

Mala segregación Daño al ADN

Defectos en:• Huso mitótico• Centrómero• Mala condensación cromosómica

• Roturas de ADN• Errores de reparación

GuidelinesGuidelines

S2 R1: Ensayos de genotoxicidad e Interpretación de datos para Productos farmacéuticos de uso Humano

◊ un ensayo de reversión en bacterias◊ un estudio citogenético para detectar daño cromosómico (test de aberraciones cromosómicas o , o TEST DEL MICRONÚCLEO in vitro o ensayo de mutaciones génicas)◊un test in vivo para genotoxicidad que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas, test de micronúcleo en ratón, TEST DEL COMETA)

◊ un ensayo de reversión en bacterias◊ un test in vivo para genotoxicidad UTILIZANDO DOS TEJIDOS , uno que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas, test de micronúcleo en ratón) Y OTRO ENSAYO IN VIVO COMO TEST DEL COMETA, UDS, TRANSGENIC MOUSE MUTATION ASSAY)

Célula Binucleada con MN

BLOQUEODE LA

CITOCINESIS

AGENTES GENOTÓXICOS

CITOCALASINA B

Inhibe la polimerización

de actina

No se forma el anillo

contráctil

Ensayo de MNCB

MICRONÚCLEOS

CARACTERÍSTICAS

Redondo u oval

Borde liso y uniforme

Igual plano focal que núcleo

No ser refringente

1/16 y 1/3 del diámetro del núcleo

Igual coloración y textura que núcleo

No superpuesto ni conectado

Se analizan 1000 células BN

Expresión de resultados:• Nº MN/1000 células BN

• Frec. células BN con MN en 1000 BN

DETECTA

• Roturas de ADN simple cadena.

• Roturas de ADN doble cadena.

• Sitios Alcali lábiles.

• ADN-ADN y ADN-prot cross linking.

• Roturas simples asociadas con

mecanismos de reparación

incompletos

ANALISIS DE RESULTADOSCONTEO VISUAL

Se deben contar 50 cometas/vidrio. 2 vidrios/muestra. Total: 100 células por

muestra.

Estableciendo Categorias de Daño:1:< 20 micras2: 20-40 micras3: 40-80 micras4: > 80 micras

• ID= n1+2 n2+ 3 n3+4 n4, siendo n la cantidad de células dañadas que se

registraron para cada una de las cuatro categorías.

SINDROMES DE SINDROMES DE INESTABILIDAD INESTABILIDAD CROMOSOMICACROMOSOMICA

Inestabilidad cromosInestabilidad cromosóómica:mica:Rearreglos, comportamiento citogenéticoanormal. Causas:

• Mutaciones de proteínas involucradas en la replicación y reparación del ADN.

• Fallos en puntos de control del ciclo celular.• Anomalías centrosómicas.• Defectos en la segregación.• Mal funcionamiento de los telómeros.• Recombinación homóloga vinculada a la reparación de

roturas de ADN de doble hebra.

ClasificaciClasificacióónnSíndromes clásicos

• Anemia de Fanconi• Síndrome de Bloom• Ataxia Telangiectasia

Síndromes menos frecuentes• Nijmegen breakage• ICF• Cockayne• Xeroderma Pigmentosa

Otros• Riyadh • Rothmund-Thompson• Radial-renal• Craniostenosis-Microcefalia• Dubowitz

factores intrínsecos hereditariosCarcinogénesis Ambiental

exposición a agentes carcinogénicos

Defectos en la replicación o Incremento en el riesgo Reparación del ADN de cáncer

Dependiendo del síndrome, el comportamiento anormal tomará la forma de:

• Frecuencia elevada de aberraciones espontáneas• Niveles elevados de intercambio de cromátides hermanas• Hipersensibilidad cromosómica a Xenobióticos• Rearreglos cromosómicos estables o recurrentes

Predisposición a tumoresCaracterísticas en común Inmunodeficiencia

Retardo en el crecimiento

SINDROMES DE INESTABILIDAD SINDROMES DE INESTABILIDAD CROMOSOMICACROMOSOMICA

Es autosómica recesiva.Mayor frecuencia en judíos Askenaziy japoneses. Presentación: microcefalia, alteraciones de piel y deficiencia inmunológicas. Poseen inteligencia normal.Riesgo: desarrollan distintos tipos de cáncer y leucemias agudas.Pronóstico de vida: la edad promedio de vida son los 24 años (14 a 49).

Características citogenéticas::rupturas de cormosomas dando figuras de cuadriradiales e intercambio de cromátides hermanas.El diagnóstico citogenético se hace mediante ICH espontáneo, (90 o más) .El gen afectado es el BLM que se encuentra en 15q26.1

SINDROME DE BLOOMSINDROME DE BLOOM

Autosómica recesiva.Presentación.: retardo mental, malformaciones esqueléticas, anomalías en piel, anemia severa. Riesgo: desarrollan sindromesmielodisplásicos y LMAPronóstico de vida: La edad de sobrevida es hasta los 16 años y la causa de muerte es hemorragia y sepsis asociado a sindromes mielodisplásicos.Tipos: 7 grupos . Los genes involucrados se describen como FANC y se adicionan las letras que van desde A hasta G. Por ahora los de peor pronóstico son los del grupo G.

ANEMIA DE FANCONIANEMIA DE FANCONI

Características citogenéticas: alteraciones estructurales espontáneas que se ven incrementadas cuando se exponen los cultivos a agentes inductores de cross-linking. Para el diagnóstico se utiliza DEB.

Autosómica recesiva, Ataxia cerebelar y telangiectasiaocular, nariz y orejasNo reconocen mecanismos de reparación de DSBPresentación: segundo año de vida con ataxia cerebelar progresiva, disartria y distonía. Riesgo: de leucemia y linfomas y tumores de piel, ovario, mama y estómago.Pronóstico de vida: hasta la 4ªdécada con medicación permanante.

Características citogenéticas:Incremento de alteraciones tipo cromátide, roturas cromosómicas, triradiales y cuadriradialesGen ATM 11q22-q23.1Diagnóstico citogenético mediante exposición a rayos X o radiomiméticos (BLM)

ATAXIA TELANGIECTASIAATAXIA TELANGIECTASIA

BIOMONITOREO BIOMONITOREO DE INDIVIDUOS DE INDIVIDUOS

EXPUESTOSEXPUESTOS

MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A CITOSTATICOSCITOSTATICOS

EdadEdad Tiempo de Tiempo de trabajotrabajo

SexoSexo Manifestaciones clManifestaciones clíínicasnicas

AA 2828 2 a2 aññosos FF Lagrimeo/ Lagrimeo/ rinorrearinorrea y descamaciy descamacióón en pieln en piel

BB 3232 3 a3 aññosos MM Lagrimeo/ fotofobiaLagrimeo/ fotofobia

CC 3232 9 a9 aññosos MM IrritaciIrritacióón visual/sequedad n visual/sequedad nasal/nasal/oligoazoospermiaoligoazoospermia

DD 3333 2 a2 aññosos FF IrritaciIrritacióón visual/sequedad en pien visual/sequedad en pie

EE 5454 9 a9 aññosos FF Sin sSin sííntomas ntomas

FF 4646 25 a25 aññosos FF Sequedad conjuntivalSequedad conjuntival

GG 3636 2 a2 aññosos FF DescamaciDescamacióón/blefaritis/sequedad conjuntivaln/blefaritis/sequedad conjuntival

MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A CITOSTATICOSCITOSTATICOS

IMIM IRIR ICHICH MNMN

AA 2.52.5 1.61.6 7.37.3±± 0.480.48 3.923.92

BB 2.22.2 1.51.5 5.945.94±± 1.281.28 2.882.88

CC 2.32.3 1.481.48 7.467.46±± 0.650.65 12.6612.66

DD 3.63.6 1.651.65 6.96.9±± 0.980.98 11.9911.99

EE 3.23.2 1.611.61 6.186.18±± 0.640.64 15.2915.29

FF 2.52.5 1.451.45 7.937.93±± 1.131.13 32.5032.50

GG 2.72.7 1.381.38 8.428.42±± 020020 16.2016.20

CONTROL: IM:1.5 CONTROL: IM:1.5 --6.8 IR: 1.36.8 IR: 1.3--2.4 ICH : 22.4 ICH : 2--7.8 MN: 37.8 MN: 3--2323

ESTRATEGIASESTRATEGIAS•• 5 de los individuos presentan valores en el rango de 5 de los individuos presentan valores en el rango de

los controles histlos controles históóricos y de la literaturaricos y de la literatura

•• En tres casos alguno o varios de los biomarcadores En tres casos alguno o varios de los biomarcadores se encuentran modificados con respecto a los se encuentran modificados con respecto a los valores controlvalores control

•• Se sugiere la repeticiSe sugiere la repeticióón luego de pasado un mn luego de pasado un míínimo nimo de 6 meses para analizar comportamiento celular de 6 meses para analizar comportamiento celular con el mismo biomarcador alterado y/o la con el mismo biomarcador alterado y/o la introducciintroduccióón de una nueva metodologn de una nueva metodologíía que aporte a que aporte mayor sensibilidad.mayor sensibilidad.

LIMITACIONES

MOTIVO DE APLICACIMOTIVO DE APLICACIÓÓN DEL ESTUDION DEL ESTUDIO

ELECCION DEL/LOS BIOMARCADORESELECCION DEL/LOS BIOMARCADORESANAMNESISANAMNESIS

INTERPRETACION DEL RESULTADOINTERPRETACION DEL RESULTADOFACTORES CONFUNDENTESFACTORES CONFUNDENTES

Muchas Gracias por su atención !!!

CIGETOX

Prof. Dra. Marta Ana Carballo

Dra. Marcela López Nigro- Bioq. Victoria ArroyoLic. y Ms. Susana Bartolotta

Becarios Doctorado: Bioq. Catalina Cortada; Bioq. Fernanda Simoniello; Bioq. Natalia CasanovaBecarios Iniciación: Med. Gabriel Angeleri- Lic. Erika Portmann

Tesistas de Licenciatura: Estud. Silvana Curieses- Estud. Natalia Balarino