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V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 1V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Metabolismo dei nucleotidi
Prof. Giorgio Sartor
Copyright © 2001-2013 by Giorgio Sartor.
All rights reserved.
N01 - Versione 0.2 – may 2013
1: introduzione
2: biosintesi de-novo delle purine
3: biosintesi de-novo delle pirimidine
4: catabolismo delle purine
5: catabolismo delle pirimidine
6: sintesi deossiribonucleotidi
7: regolazione della sintesi deossiribonucleotidi
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 2V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
A cosa servono i nucleotidi• Informazione:
– Acidi nucleici: RNA e DNA (NMP; dNMP → NTP; dNTP)
• Sintesi proteica e regolazione:
– Acidi nucleici: mRNA, tRNA, smRNA…
• Trasporto di energia:
– ATP (GTP), ADP, AMP
• Metabolismo:
– UTP, ATP
• Segnali intracellulari:
– cAMP, cGMP
• Trasporto di equivalenti ridotti:
– NAD+/NADH, NADP+/NADPH, FAD/FADH2
• Trasporto di acili:
– CoA
• …
2
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 3V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Le basi azotate
• PURINE– Adenina– Guanina
– Inosina
– Xantina
• PIRIMIDINE– Uridina– Ciditina– Timidina
– Orotidina
NHN
NN
N
N
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 4V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Le basi azotate
• PURINE– Adenina– Guanina
– Inosina
– Xantina
• PIRIMIDINE– Uridina– Ciditina– Timidina
– Orotidina
NHN
NN
N
N
3
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Nucleotidi purinici• Adenosinmonofosfato (AMP)
• Guanosinmonofostato (GMP)
• Inosinmonofosfato (IMP)
• Xantinamonofosfato (XMP)
OHOH
O
OPO3--
NN
NN
NH2
OHOH
O
OPO3--
NN
NNH
O
NH2
AMP
GMP
OHOH
O
OPO3--
NN
NNH
O
OHOH
O
OPO3--
NNH
NNH
O
O
IMP XMP
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 6V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Nucleotidi pirimidinici
OHOH
O
OPO3--
N
NH
O
O
OHOH
O
OPO3--
N
NH
O
O
CH3
OHOH
O
OPO3-
N
N
O
NH2
UMP
TMP
CMP
• Uridinmonofosfato (UMP)
• Timidinmonofosfato (TMP)
• Ciditinmonofosfato (CMP)
• Orotidinmonofosfato (OMP)
OHOH
O
OPO3--
N
NH
O
O
O
OOMP
4
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 7V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Metabolismo delle Purine
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 8V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Metabolismo delle Pirimidine
5
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 9V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Sintesi de-novo• Quasi tutti gli organismi sintetizzano
nucleotidi da zero:
Acidi Nucleici Coenzimi
NUCLEOTIDI Basi azotate
ENERGIA
Aminoacidi, CO2, N10-formil-THF, ATP, Ribosio
BIOSINTESI
DEGRADAZIONE
Ribosio
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 10V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Chi sintetizza nucleotidi de-novo
• Tutte le cellule che proliferano!–Linfociti–Batteri–Tumori–…
• Le vie metaboliche di sintesi de-novo dei nucleotidi sono il bersaglio di farmaci antibatterici e antitumorali.
6
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 11V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Sintesi de-novo
• Diversa strategia:–Nucleotidi purinici
• La sintesi de-novo dei nucleotidi purinici avviene attraverso la costruzione dell’anello purinico sul ribosio-5-P per formare INOSINA MONO FOSFATO (IMP);
–Nucleotidi pirimidinici • La sintesi de-novo dei nucleotidi pirimidinici
avviene attraverso la sintesi di una purina(OROTATO) e, quindi, legame al ribosio-5-P con conversione in URIDIN MONO FOSFATO (UMP)
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 12V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
α-riboso-5-fosfato
P OO
O
O O
OH OH
OH
7
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 13V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Via dei pentosi fosfati
• A secondo dei bisogni della cellula la via dei pentosi fosfati opera in vari modi per massimizzare la concentrazione dei diversi prodotti:
• riboso-5-fosfato, NADPH, e ATP,
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 14V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
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V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 15V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 16V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Sintesi di riboso-5-P e NADPH
• Duplicazione cellulare.
– Il ribuloso-5-fosfato viene convertito in riboso-5-fosfato, necessario per la sintesi di nucleotidi e acidi nucleici.
– Viene anche prodotto del NADPH.
OH
OH
O
O
OH
P
O
O
O
OH
OH
O
O
OH
P
O
OO
P OO
O
O O
OH OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
PO
OO
PO
OO
OOH
O
H
O
OH
O OH
OH
P
OH
OO
O
PO
O
O
O
OH
OH
O
PO
OO
OOH
O
H
POO
O
OO
OH
OH
OH
OH
POO
O
OO
OH
OH
OH
OH
POO
O
OO
OH
OH
O
OH
P
OO
O
O
OH
OH
OHOH
O OD-ribuloso-5-fosfato
Ribuloso-fosfato3-epimerasi(EC 5.1.3.1)
D-xiluloso-5-fosfato
Riboso-5-fosfatoisomerasi
(EC 5.3.1.6)
D-riboso-5-fosfato
+
D-gliceraldeide-3-fosfato
D-sedoeptuloso-7-fosfato
Transchetolasi(EC 2.2.1.1)
+
Transaldolasi(EC 2.2.1.2)
D-fruttoso-6-fosfato
D-eritroso-4-fosfato
Transchetolasi(EC 2.2.1.1)
D-gliceraldeide-3-fosfato
Glucoso-6-fosfato isomerasi
(EC 5.3.1.9)
α-D-Glucoso-6-fosfatoβ-D-Glucoso-6-fosfato 6-fosfo-D-glucono-1,5-lattone
Glucoso-6-fosfatodeidrogenasi(EC 1.1.1.49)
6-fosfogluconolattonasi(EC 3.1.1.31)
6-fosfo-D-gluconato
CO2
NADP+
NADPH
NADP+
NADPH
Fosfogluconatodeidrogenasi(EC 1.1.1.44)
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V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 17V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Metabolismo dei nucleotidi
2: biosintesi de-novo delle purine
Prof. Giorgio Sartor
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 18V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
BIOSINTESI delle PURINE
NNO
N
OH
N
NH2
OH
OP
O
O
O
NNO
N
OH
NH
O
OH
OP
O
O
O
NH2
AMP GMP
10
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 19V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Purine
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 20V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Purine
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V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 21V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Metabolismo purinico
• I nucleotidi purinici sono sintetizzati sia a partire da precursori più semplici attraverso la biosintesi de-novo, sia mediante il riutilizzo delle basi azotate e dei nucleosidi attraverso le vie di recupero.
• L’IMP gioca un ruolo centrale nel metabolismo purinico in quanto è sia il prodotto della biosintesi de-novo che un intermedio metabolico necessario alla sintesi dell’AMP e del GMP.
• Un altro substrato chiave è il αPRPP che è coinvolto sia nelle prime tappe della biosintesi de-novo, sia nelle vie di recupero delle basi puriniche.
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 22V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Metabolismo purinico
• La biosintesi de-novo delle purine avviene principalmente nel fegato;
• altri tessuti, nei quali la biosintesi de-novo èmeno rappresentata (cervello) o del tutto assente (globuli rossi), dipendono dal fegato per fabbisogno di purine e si riforniscono di nucleotidi purinici attraverso le vie di recupero;
• il globulo rosso svolge un ruolo importante in questo processo in quanto incorpora le purine nel fegato e le cede agli altri tessuti.
12
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 23V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Biosintesi dei nucleotidi purinici• La sintesi dei nucleotidi purinici (AMP e GMP)
avviene attraverso la sintesi dell’intermedio comune
• IMP – inosinmonofosfato
NN
O
N
OH
NH
O
OH
OP
O
O
O
NN
O
N
OH
N
OH
OH
OP
O
O
O
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Biosintesi dei nucleotidi purinici
NNO
N
OH
NH
O
OH
OP
O
O
O
NNO
N
OH
N
NH2
OH
OP
O
O
O
NNO
N
OH
NH
O
OH
OP
O
O
O
NH2AMPGMP
IMP
13
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 25V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Biosintesi del nucleo purinico
N
NN
NR5P
NH2
O
O
OH
O
H
NH2
OO
NH2 O
H
CO2
NH2
O
OH
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
N10-Formil-THF
N10-Formil-THF
Glicina
Glutamina
Aspartato
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 26V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Biosintesi IMP
• Undici reazioni– Tre reazioni per convertire il riboso-5-P a fosforibosil
glicinamide (GAR). L’azoto proviene da Gln. Si usano tre molecole di ATP: una per formare αPRPP (ad AMP), una per attivare la Gln e una per attivare la Gly;
– Quattro reazioni per la costruzione dell’anello a cinque termini aminoimidazolo carbossilato (FGAR, FGAM, AIR, CAIR) usando 10N-Formil-THF, Gln, CO2. Si usano due molecole di ATP: una per usare la Gln e una per chiudere l’anello;
– Quattro reazioni per la chiusura dell’anello purinico dell’IMP (SAICAR, AICAR, FAICAR) usando, Asp, 10N-Formil-THF e una molecola di ATP per usare Asp.
• Si consumano sette legami P~O~P
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V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 27V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Tetraidrofolato (THF)• La sintesi avviene attraverso la cessione
di unità monocarboniose veicolate dal tetraidrofolato (THF).
N
NH
N
NH
NH2
O
N
NH
OOHO
OH
O
n
R'
R"105
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 28V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Tetraidrofolato (THF)• La sintesi avviene attraverso la cessione
di unità monocarboniose veicolate dal tetraidrofolato (THF).
N
NH
N
NH
NH2
O
N
R'
R"
R
NH
OOHO
OH
O
n
105
R =
15
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 29V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Sintesi del THF
NH2 NH
N
NH
RN
O
N
H NH2 NH
N
NH
RN
O
N
HH
H
NH2 NH
N
HH
H
NH
RN
O
N
HH
NADPH + H+
NADP+
NADP+
NADPH + H+
EC 1.5.1.3Diidrofolato reduttasi
Folato Diidrofolato
Tetraidrofolato THF
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 30V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
NH2 NH
NH
HH
NH
RNO
N
HH
NH2 NH
NH
HH
NH
RNO
N
CH3
H
NH2 NH
NH
HH
NRN
O
N
HH
O
O
N
NH2 NH
NH
HH
NH
R
O
NH
NH
N
NH2 NH
NH
HH
NH
R
O
NH
N
N
NH2 NH
NH
HH
O
N H
R
N
N
NH2 NH
NH
HH
O
N H
R
Formiato + ATP
Formil Glu
FormimminoGlu
His
Gly + NAD+
NADH + H+
CO2 + NH4+
Glu
Glu
ADP + Pi
ADP+ Pi
ATP
H2O
Ser
Gly
Omocys Met
NADPH + H+
NADPH + H+
NAPD+
NAPD+
NH4+
16
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 31V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
NH2 NH
NH
HH
NH
RNO
N
HH
NH2 NH
NH
HH
NH
RNO
N
CH3
H
NH2 NH
NH
HH
NRN
O
N
HH
O
O
N
NH2 NH
NH
HH
NH
R
O
NH
NH
N
NH2 NH
NH
HH
NH
R
O
NH
N
N
NH2 NH
NH
HH
O
N H
R
N
N
NH2 NH
NH
HH
O
N H
R
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 32V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
NH2 NH
NH
HH
NH
RNO
N
HH
NH2 NH
NH
HH
NH
RNO
N
CH3
H
NH2 NH
NH
HH
NRN
O
N
HH
O
O
N
NH2 NH
NH
HH
NH
R
O
NH
NH
N
NH2 NH
NH
HH
NH
R
O
NH
N
N
NH2 NH
NH
HH
O
N H
R
N
N
NH2 NH
NH
HH
O
N H
R
THF
N5-formimmino-THF N5-formil-THF N10-formil-THF
N5,N10-metenil-THF
N5,N10-metilene-THF
N5-metil-THF
FormiatoN.O. +2
FormaldeideN.O. 0
Metanolo
N.O. -2
17
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 33V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
N10-formil-THF
N
NH
NH
NH
NH2
O
N
O
NH
OOHO
OH
O
n
H
105
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 34V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Folato
• Il folato è necessario per la sintesi, la riparazione e la metilazione degli acidi nucleici
• I mammiferi non possono sintetizzare folato de-novo;
• I batteri sono sensibili agli inbitoridella sintesi del folato (Sulfonamidi);
18
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 35V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Biosintesi del folato
http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?ko00790
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 36V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Pool del folato
http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?ko00670
19
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 37V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Costruzione dell’IMP
N
N
N
R5P
O
NH
NH2
R5P
NH
NH2
O
R5P
NH
NH
O
R5P
O
NH
NH
NH
R5P
O
N
N
NH2
R5P
N
N
NH2
R5P
O
O
N
N
NH2
R5P
O
NH2
N
N
NH R5P
O
NH2
O
Fosforibosilamina GAR FGAR AIRFGAM
CAIR AICAR FAICAR IMP
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 38V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Tre reazioni per convertire il Riboso-5-P a fosforibosilglicinamide(GAR)
OH
OHOH
OOPO3-
O O
OH
P
OH
O
O
O
OPO3-
PO
O
O
ONH
2
OHOH
OPO3-O
NH
OHOH
OPO3- ONH
2
NH3+
OO
NH2 O
NH3+
OO
O O
NH2
O
O
EC 2.7.6.1Riboso-fosfato difosfokinasi
ATP AMP
Fosforibosilpirofosfato(ααααPRPP)
Gln + H2O
Glu + PPi
EC 2.4.2.14amidofosforibosiltransferasi
Gly + ATP
ADP + Pi
EC 6.3.4.13Fosforibosilamina
-glicina ligasi
Fosforibosilglicinamide(GAR)
Fosforibosil-ββββ-amina
1
2
3
20
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 39V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Tre reazioni per convertire il Riboso-5-P a fosforibosilglicinamide(GAR)
LIMITANTE
OH
OHOH
OOPO3-
O O
OH
P
OH
O
O
O
OPO3-
PO
O
O
ONH
2
OHOH
OPO3-O
NH
OHOH
OPO3- ONH
2
NH3+
OO
NH2 O
NH3+
OO
O O
NH2
O
O
EC 2.7.6.1Riboso-fosfato difosfochinasi
ATP AMP
Fosforibosilpirofosfato(ααααPRPP)
Gln + H2O
Glu + PPi
EC 2.4.2.14amidofosforibosiltransferasi
Gly + ATP
ADP + Pi
EC 6.3.4.13Fosforibosilamina
-glicina ligasi
Fosforibosilglicinamide(GAR)
Fosforibosil-ββββ-amina
1
2
3
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 40V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Controllo
• Il prodotto fosforibolipirofosfato (αPRPP) èil prodotto limitante;
• Il pirofosfato che si forma viene convertito in due ioni fosfato;
• Nella formazione della ribosilamina vi èinversione della configurazione di C1 del ribosio che passa da α a β;
• La configurazione β di C1 viene mantenuta in tutti i nucleotidi.
21
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 41V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
1. Riboso-fosfato difosfochinasi (EC 2.7.6.1)
OH
OHOH
OOPO3-
O O
OH
P
OH
O
O
O
OPO3-
PO
O
O
ATP AMP
Fosforibosilpirofosfato(ααααPRPP)
• È presente sia come esamero (B. subtilis) che come tetramero (Methanocaldococcusjannaschii, 1U9Z)
1U9Z
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 42V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
2. Amidofosforibosiltransferasi (EC 2.4.2.14)• La sintesi dei nucleotidi purinici è regolata, in
parte, dai prodotti finali attraverso l’inibizione di amidofosforibosiltransferasi.
• Lo studio della struttura ternaria del complesso Enzima:ADP:GMP ha determinato che:
• ADP si lega nel sito allosterico A• GMP si lega al sito catalitico e il legame di GMP
aumenta l’affinità per ADP al sito A di venti volte
O O
OH
P
OH
O
O
O
OPO3-
PO
O
O
O NH2
OHOH
OPO3-
NH3+
OO
NH2 O
NH3+
OO
O O
Fosforibosilpirofosfato(ααααPRPP)
Gln + H2O
Glu + PPi
Fosforibosil-ββββ-amina
1AO0
22
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 43V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
3-4-6. Fosforibosilamina-glicina ligasi (EC 6.3.4.13)
• L’enzima GART umano (108 kDa, 1010 aminoacidi) è tri-funzionale e catalizza le reazioni 3, 4 e 6 della via biosintetica de-novo delle purine:– Glicinamide ribonucleotide
sintetasi (GARS, PurD, E.C.6.3.4.13),
– Glicinamide ribonucleotidetransformilasi (GARTfase, PurN, E.C. 2.1.2.2.) e
– Aminoimidazolo ribonucleotidesintetasi (AIRS, PurM, E.C.6.3.3.1).
O NH
OHOH
OPO3- ONH
2
N
NH
NH
NH
NH2
O
N
O
R
ONH
OHOH
OPO3- ONH
O
O NH
OHOH
OPO3- NHNH
O
O N
OHOH
OPO3- NH2
N
NH2
OHOH
OOPO3--
NH2
O
O
NH2
O
NH
OHOH
OOPO3--
GAR
N10-Formil-THF
THF
ADP + PiATP
EC 2.1.2.2GAR transformilasi
N2-formil-N1-(5-fosfo-D-ribosil)glicinamide (FGAR)
EC 6.3.3.1AIR sintetasi
5-amino-1-(5-fospho-D-ribosil)imidazolo (AIR)
2-(Formamido)-N1-(5'-fosforibosil)acetamidina
(FGAM)
Gly + ATP ADP + PiFosforibosil-ββββ-amina
Fosforibosilglicinamide(GAR)
EC 6.3.4.13Fosforibosilamina
-gicina ligasi
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 44V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
HsGART• L’enzima GART umano (108
kDa, 1010 aminoacidi) è tri-funzionale e catalizza le reazioni 3, 4 e 6 della via biosintetica de-novo delle purine :– Glicinamide ribonucleotide
sintetasi (GARS, PurD, E.C.6.3.4.13),
– Aminoimidazolo ribonucleotidesintetasi (AIRS, PurM, E.C.6.3.3.1) e
– Glicinamide ribonucleotidetransformilasi (GARTfase, PurN, E.C. 2.1.2.2.).
Schematic presentation of crystal structures of the HsGART domains. (A) GARS in complex with ATP. (B) Ternary complex of GARTfase with 10-(trifluoroacetyl) 5,10-dideazaacyclic-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid and substrate glycinamide ribonucleotide (PDB ID. 1RBY). (C) Dimeric structure of AIRS. M. Welin, J. G. Grossmann, S. Flodin, T. Nyman, P. Stenmark, L. Trésaugues, T. Kotenyova, I. Johansson, P. Nordlund and L. LehtioNucleic Acids Res. 2010 November; 38(20): 7308–7319.
23
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 45V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Quattro reazioni per la costruzione dell’anello a cinque termini aminoimidazolo carbossilato
O NH
OHOH
OPO3- ONH
2
N
NH
NH
NH
NH2
O
N
O
R
O NH
OHOH
OPO3- ONH
O
O NH
OHOH
OPO3- NHNH
O
NH3+
OO
NH2 O
NH3+
OO
O O
O N
OHOH
OPO3- NH2
NO N
OHOH
OPO3- NH2
N
OO
GAR
N10-Formil-THF
THF
Glu + ADP +Pi
Gln + ATP + H2O
ADP + Pi
ATP
CO2
EC 2.1.2.2GAR transformilasi
N2-formil-N1-(5-fosfo-D-ribosil)glicinamide (FGAR)
EC 6.3.3.1AIR sintetasi
5-amino-1-(5-fospho-D-ribosil)
imidazolo (AIR)
2-(Formamido)-N1-(5'-fosforibosil)acetamidina
(FGAM)
EC 6.3.5.3Fosforibosilformil
glicinamidina sintasi
EC 4.1.1.21AIR carbossilasi
5-amino-1-(5-fosfo-D-ribosil)
imidazolo-4-carbossilato (CAIR)
4
5
67
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 46V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
5. FGAM sintasi (EC 6.3.5.3)
• Ci sono due tipi di FGAM sintasi:– Il tipo I è presente negli
eucarioti e batteri Gram-consiste in unico polipepeptide di 140 kDa chiamato “largePurL” (lgPurL);
– Il tipo II, “small PurL”(smPurL), è stato identificato in archaea e batteri Gram+ e consiste in un polipeptide di 80 kDa
ONH
OHOH
OPO3- ONH
O
O NH
OHOH
OPO3- NHNH
O
NH3+
OO
NH2 O
NH3+
OO
O O
Glu + ADP +Pi
Gln + ATP + H2O
N2-formil-N1-(5-fosfo-D-ribosil)glicinamide (FGAR)
2-(Formamido)-N1-(5'-fosforibosil)acetamidina
(FGAM)
24
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 47V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
5. FGAM sintasi (EC 6.3.5.3)
• Ci sono due tipi di FGAM sintasi:– Il tipo I è presente negli
eucarioti e batteri Gram-consiste in unico polipepeptide di 140 kDa chiamato “largePurL” (lgPurL);
– Il tipo II, “small PurL”(smPurL), è stato identificato in archæa e batteri Gram+ e consiste in un polipeptide di 80 kDa.
ACP (ATP)FGAR
2HS4
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 48V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
5. FGAM sintasi (EC 6.3.5.3)
FGAR ACP (ATP)
25
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 49V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
7. AIR carbossilasi (EC 4.1.1.21)
• Diversa dalle solite carbossilasi: non sono necessari né ATP né biotina
O N
OHOH
OPO3-NH
2
N
O N
OHOH
OPO3-H
2N
N
OO
H
O O
O N
OHOH
OPO3-NH
2
N
OO
5-amino-1-(5-fospho-D-ribosil)imidazolo (AIR)
5-amino-1-(5-fosfo-D-ribosil)imidazolo-4-carbossilato (CAIR)
+
H+
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 50V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
7. AIR carbossilasi (EC 4.1.1.21)
• Nei vertebrati la sintesi di CAIR è catalizzata da AIR carbossilasi (EC 4.1.1.21)
• In Escherichia coli sono necessari due enzimi:– 5-(carbossiamino)imidazolo
ribonucleotide sintasi (EC 6.3.4.18) che forma 5-Carbossiamino-1-(5-fosfo-D-ribosil)imidazolo
– 5-(carbossiamino)imidazolo ribonucleotide mutasi (EC 5.4.99.18) che sposta il gruppo carbossilico sulla posizione 4 dell’anello imidazolico.
NONH
N
OHOH
OP
O
O
O
OH
O
4
26
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 51V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Quattro reazioni per la chiusura dell’anello purinico dell’IMP
NH3+
O
O
O
O
N
N
RibosioNH2
O
ON
N
RibosioNH2
O
NH
O
OO
O
N
N
RibosioNH2
O
NH2
N
N
RibosioNH
O
NH2
O
N
NH
NH
NH
NH2
O
N
O
R
N
OHOH
O
O
N
N
O
NH
PO
O
O
Asp + ATP ADP + Pi
EC 6.3.2.6SAICAR sintasi
CAIR
1-(5'-fosforibosil)-5-amino-4-(N-succinocarbossamide)-imidazolo (SAICAR)
N10-Formil-THF
THF
EC 4.3.2.2 Adenilosuccinato liasi
1-(5'fosforibosil)-5-amino-4-imidazolocarbossamide
(AICAR)
5-formamido-1-(5-fosfo-D-ribosil)imidazolo-4-carbossamide
(FAICAR)
Inosina monofosfato(IMP)
EC 3.5.4.10IMP cicloidrolasi
H2O
Fumarato
EC 2.1.2.3AICAR transformilasi
8
9
10
11
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 52V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
8. SAICAR sintasi (EC 6.3.2.6)• I substrati possiedono mutuo
antagonismo con maggiore antagonismo tra CAIR e ATP e Asp
• CAIR si lega all’enzima libero con un’affinità 200 volte maggiore rispetto al complesso Enzima-ATP-Asp
• Il complesso Enzima-ATP-Aspsembra esser la forma dominante in vivo
• IMP è un inibitore competitivo di CAIR, suggerendo la possibilitàdella formazione di un legame H tra il carbossile in 4 e l’ NH2 in 5 di CAIR legato all’enzima. S.W. Nelson, D.J. Binkowski, R.B. Honzatko, H.J. Fromm
Properties of SAICAR SynthetaseBiochemistry, Vol. 44, No. 2, 2005
27
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 53V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
8. SAICAR sintasi (EC 6.3.2.6)
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 54V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
9. Adenilosuccinato liasi (EC 4.3.2.2 )
• La Adenilosuccinato liasi(ASL) ha diverse funzioni:
• Converte adenilosuccinato ad AMP e fumarato nella sintesi di AMP da IMP
• Converte SAICAR in AICA e fumarato
• ASL è parte della superfamiglia degli enzimi che catalizzano le β-eliminazioni
• È un omotetramero con tre domini in ogni monomero e quattro siti attivi per tetramero.
2VD6
28
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 55V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
AMP
• Nel muscolo scheletrico serve per rifornire il ciclo di Krebs di fumarato
NO
NH
N
OHOHN
OO
PO
O
ONO
NH
N
OHOHN
OP
OO
O
NH
O
O
O
O
NH2
O
O
O
O
NO
NH
N
OHOHN
OP
OO
O
NH2
O
O
O
O
NH3
GTP
GDP
IMP
AMP
Asp
Fumarato
EC 6.3.4.4Adenilosuccinato sintasi
EC 4.3.2.2Adenilosuccinato liasi
EC 3.5.4.6AMP deaminasi
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 56V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
9. Adenilosuccinato liasi (EC 4.3.2.2 )
NO
NH
N
OHOHN
OO
PO
O
ONO
NH
N
OHOHN
OP
OO
O
NH
O
O
O
O
NH2
O
O
O
O
NO
NH
N
OHOHN
OP
OO
O
NH2
O
O
O
O
NH3
O
OHOH
OP
OO
O N
N NH2
O
NH
O
OO
O
O
OHOH
OP
OO
O N
N NH2
O
NH2
GTP
GDP
IMP
AMP
Asp
Fumarato
EC 6.3.4.4Adenilosuccinato sintasi
EC 4.3.2.2Adenilosuccinato liasi
EC 3.5.4.6AMP deaminasi
1-(5'-fosforibosil)-5-amino-4-(N-succinocarbossamide)-imidazolo (SAICAR)
1-(5'fosforibosil)-5-amino-4-imidazolocarbossamide
(AICAR)
29
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 57V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
8
Quattro reazioni per la chiusura dell’anello purinico dell’IMP
NH3+
O
O
O
O
N
N
RibosioNH2
O
ON
N
RibosioNH2
O
NH
O
OO
O
N
N
RibosioNH2
O
NH2
N
N
RibosioNH
O
NH2
O
N
NH
NH
NH
NH2
O
N
O
R
N
OHOH
O
O
N
N
O
NH
PO
O
O
Asp + ATP ADP + Pi
EC 6.3.2.6SAICAR sintasi
CAIR
1-(5'-fosforibosil)-5-amino-4-(N-succinocarbossamide)-imidazolo (SAICAR)
N10-Formil-THF
THF
EC 4.3.2.2 adenilosuccinao liasi
1-(5'fosforibosil)-5-amino-4-imidazolocarbossamide
(AICAR)
5-formamido-1-(5-fosfo-D-ribosil)
imidazolo-4-carbossamide (FAICAR)
Inosina monofosfato(IMP)
EC 3.5.4.10IMP cicloidrolasi
H2O
Fumarato
EC 2.1.2.3AICAR transformilasi
9
11
Enzima bifunzionaleAICAR transformilasi (EC2.1.2.3)
IMP cicloidrolasi (EC 3.5.4.10)
1M9N 10
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 58V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Sintesi dell’IMP
N
N
N
R5P
O
NH
NH2
R5P
NH
NH2
O
R5P
NH
NH
O
R5P
O
NH
NH
NH
R5P
O
N
N
NH2
R5P
N
N
NH2
R5P
O
O
N
N
NH2
R5P
O
NH2
N
N
NH R5P
O
NH2
O
Fosforibosilamina GAR FGAR AIRFGAM
CAIR AICAR FAICAR IMP
Gly N10-formil-THF Gln
Glu
Asp
Fum
N10-formil-THF
H2O
ATP ATP
ATP
ATP
ααααPRPP
Gln3 54 6
87 9 10 11
30
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 59V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Controllo della biosintesi IMP
• Concentrazione limitante di Fosforibosilpirofosfato (αPRPP);
• Utilizzo di N10-Formil-THF – Negli eucarioti antagonisti dell’acido folico:
• Metopteridina• Metotrexato• Amminopteridina
– Nei batteri inibitori della sintesi del folato:• Sulfonamidi che competono con l’acido
paraminobenzoico
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 60V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Inibizione• Antagonisti dell’acido folico
• Sulfonamidi che competono con l’acido paraminobenzoico
N
N
NH
NH
NH2
OH
N
CH3
NH
OOO
O
O
N
N
NH
NH
NH2
NH2
N
CH3
NH
OOO
O
O
N
N
NH
NH
NH2
NH2
NH
NH
OOO
O
O
Metopteridina
Amminopteridina
Metotrexato
N
N
NH
NH
NH2
OH
NH
NH
OOO
O
O
NH2
OH
O
NH2
SO
ONHR
Pteridina
PABA
(Glu)n; n < 8
PABA Sulfonamidi
31
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 61V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Sintesi di AMP e GMP da IMP
• La sorgente di energia per la sintesi di AMP è il GTP
• AMP:– Il C=O in posizione 6 del IMP viene convertito
in NH2 utilizzando Asp e GTP
• la sorgente di energia per la sintesi di GMP è ATP
• GMP:– IMP viene ossidato a XMP e il C=O in
posizione 2 viene convertito in NH2 utilizzando Gln e ATP ad AMP
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 62V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Sintesi di AMP e GMP da IMP
• La sorgente di energia per la sintesi di AMP è il GTP
• AMP:– Il C=O in posizione 6 del IMP viene convertito
in NH2 utilizzando Asp e GTP
• la sorgente di energia per la sintesi di GMP è ATP
• GMP:– IMP viene ossidato a XMP e il C=O in
posizione 2 viene convertito in NH2 utilizzando Gln e ATP ad AMP
32
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 63V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
AMP
NO
NH
N
OHOHN
OO
PO
O
O
NO
NH
N
OHOHN
OP
OO
O
NH
O
O
O
O
NH2
O
O
O
O
NO
NH
N
OHOHN
OP
OO
O
NH2
O
O
O
O
GTP GDPIMP
AMP
Asp
Fumarato
EC 6.3.4.4Adenilosuccinato sintasi
EC 4.3.2.2Adenilosuccinato liasi
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 64V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
GMP
NO
NH
N
OHOHN
OO
PO
O
O
NO
NH
N
OHOHNH
OP
OO
O
O
O
NO
NH
N
OHOHN
OP
OO
O
O
NH2
NH2
O
OO
ONH2
O
ONH2
O
Glu + AMP + PPi
Gln + ATP
IMP
GMP
XMP
NAD+ + H2O
NADH + H+
EC 1.1.1.205IMP deidrogenasi
EC 6.3.4.1GMP sintasi
33
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 65V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Energia
• Per sintetizzare NTP da ribosio5-fosfato vengono consumati:–Sette ATP (6 ATP + 1 GTP) per AMP
–Otto ATP per GMP
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 66V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
RegolazioneRibosio-5-P
ααααPRPP
5-fosforibosil-ββββ-ammina
IMP
Adenilosuccinato
AMP
ADP
ATP
XMP
GMP
GDP
GTP
EC 2.7.6.1Riboso-fosfato difosfochinasi
ATP
AMP
Gln + H2O
Glu + PPi
EC 2.4.2.14amidofosforibosiltransferasi
EC 1.1.1.205IMP deidrogenasi
EC 6.3.4.4Adenilosuccinato sintasi
34
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 67V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Interconversione delle purine• Il turnover degli acidi nucleici (soprattutto mRNA) porta al
rilascio di basi puriniche per formare adenina, guanina e ipoxantina.
• Visto il costo metabolico per la loro sintesi vengono riutilizzate per risintetizzare i nucleotidi attraverso le fosforibosil trasferasi (HGPRT):
BASE + ααααPRPP →→→→ NMP + PPi
• L’idrolisi di PPi rende la reazione irreversibile• L’assenza, o la sintesi ridotta, di HGPRT è causa della
sindrome di Lesch-Nyhan nella quale la sintesi di purine ècirca 200 volte maggiore e la concentrazione di acido urico nel sangue è elevata
• Questo aumento è dovuto all’attivazione allosterica da αPRPP della biosintesi de-novo delle purine.
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 68V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Interconversione delle purine
O
HOH
OP
OP
OH
O
O O
O
NN
NN
NH2
O
OHOH
OP
OP
OH
O
O O
O
NN
NN
NH2
O
OHOH
OP
OO
O
NN
NNH
O
O
OHOH
OPO
O
O
NNH
NNH
O
O
O
OHOH
OP
OP
OH
O
O O
O
NN
NNH
O
NH2
O
HOH
OP
OP
OH
O
O O
O
NN
NN
NH2
O
OHOH
OP
OHO
O
NN
NN
NH2
O
OHOH
OP
OHO
O
NN
NNH
O
NH2
dATP ATP GTP dGTP
dADP ADP GDP dGDP
dAMP AMP GMP dGMPIMP XMP
dAdenosina Adenosina Guanosina dGuanosinaInosina
Adenina GuaninaIpoxantina
αPRPPαPRPP
αPRPP
Riduzione
TrasferimentoNH2
Ossidazione
TrasferimentoNH2
Riduzione
BASE
Nucleoside
NMP
NDP
NTP
Traut TW. Enzymes of nucleotide metabolism: the significance of subunit size and polymer size for biological function and regulatory properties. CRC Crit Rev Biochem. 1988;23(2):121-69.
35
V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi - 69V.0.2 © gsartor 2001-2013 Metabolismo dei nucleotidi
Crediti e autorizzazioni all’utilizzo• Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica:
– CHAMPE Pamela , HARVEY Richard , FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BIOCHIMICA [ISBN 978-8808-17030-9] – Zanichelli
– NELSON David L. , COX Michael M. I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER - Zanichelli – GARRETT Reginald H., GRISHAM Charles M. BIOCHIMICA con aspetti molecolari della Biologia
cellulare - PICCIN– VOET Donald , VOET Judith G , PRATT Charlotte W FONDAMENTI DI BIOCHIMICA [ISBN 978-
8808-06879-8] – Zanichelli
• E dalla consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali:– Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.ad.jp/kegg/– Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/– Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/– Rensselaer Polytechnic Institute:
http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/MB1index.html
Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/ oppure da http://www. gsartor.org/
Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna – Alma MaterGiorgio Sartor - [email protected]