LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

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PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO: VISÃO GERAL E PAPEL NA INTERAÇÃO PLANTA-MICRORGANISMO

Michele de Cássia Pereira e SilvaWelington Luiz de Araújo

Sumário

Visão geral das proteínas de choque térmico

Interação planta-microrganismo – mecanismos e consequências

Proteínas de choque térmico na interação – “papel”

Conclusões

Visão Geral das Proteínas de Choque Térmico

Heat Shock Proteins – proteínas de choque térmico (HSP)

São encontradas em todos os organismos, de bactérias a humanos.

Auxílio no dobramento de polipeptídeos recém sintetizados e proteínas parcialmente desnaturas por estresse, alterações ambientais ou metabólicas (Chaperonas moleculares).

DefiniDefiniççãoão

ConformaçãoNativa

ProteínasFuncionais

Chaperonas moleculares (HSP 70, HSP 90, DnaK)

Chaperoninas(HSP 60, GroEL)

Lodish et al, 2005. Biologia Celular e Molecular

Classes de Classes de ChaperonasChaperonas

Proteínaparcialmente

dobradas

Proteínadobrada

corretamente

Proteínadobrada

corretamente

Proteína

Proteína

Ribossomo

PrincipaisPrincipais FamFamííliaslias

Classes Membros Representativos Localização Intracelular Principais Funções

Previnir agregados, auxiliardobramento, importação e translocação de proteínas, transduçãode sinais, ativação transcricional

CitosolCloroplasto, mitocôndriaRetículo EndoplasmáticoCitosol

Dobramento de protéinas e re dobramento

Cloroplasto, mitocôndriaCitosol

CitosolCloroplastoMitocôndriaRetículo Endoplasmático

Facilita maturação de moléculas sinais, tampão genético

Subfamília

Subfamília

HSP – atuação emconjunto

AtuaAtuaççãoão

Síntese de HSP/chaperonase outras proteínas de resposta ao estresse

Desnaturação Protéica

Agregados

Hsp 70, Hsp 90Sinalização para chaperonas e

Ativação da transcrição

sHsp, Hsp 70Estabilização e prevenção de

agregados

Hsp 60, Hsp 70, Hsp 90Re dobramento

Hsp 100/ClpRessolubilização

Estresse

Degradação

Interação Planta-Microrganismo

Reconhecimento do microrganismo - elicitores

Fragmentos do patógeno (carboidratos, proteínas, glicoproteínas

Fragmentos da membrana do hospedeiro

Como ocorre reconhecimento??

InteraInteraççãoão plantaplanta--microrganismomicrorganismo

RespostaResposta dada PlantaPlanta HospedeiraHospedeira

“Teoria gene a gene” – Harold H. Flor (1942)

Plantas com gene dominante de resistência ( gene

R - moléculas receptoras) --- patógenos com gene

dominante de avirulência (gene Avr - moléculas

indutoras).

Patógeno

Avirulento Virulento

Planta Suscetível + +

Resistente - +

+ = ocorre doença – Interações Compatíveis

- = planta sadia – Interações Incompatíveis

RespostaResposta dada PlantaPlanta HospedeiraHospedeira

Qual a resposta de defesa daplanta??

Resposta de Hipersensibilidade (Hypersensitive Reponse)

Ativada no ponto de agressão

RespostasRespostas de de DefesaDefesa dada PlantaPlanta

Interação - Produçãode moléculas

Indução de morte celular – limitação dainfecção

Indução de outras respostas de defesa, próximas ou não do local de lesão

Patógeno

Célula vegetal

Hospedeiro

RespostaResposta de de HipersensibilidadeHipersensibilidade

OO22..--, H, H22OO22, OH, OH.., NO, NO

Sistema integrado e amplificado de sinalização

Induzida por fatores abióticos, mas principalmente bióticos

Estabelecimento de resposta sistêmica - SAR

EspEspééciescies ReativasReativas de de OxigênioOxigênio -- EAOsEAOs

Cross linking da parde celular; efeitosantimicrobianos, ativação de genes de proteção(GST, GPX); SAR

Morte Celular

EspEspééciescies ReativasReativas de de OxigênioOxigênio -- EAOsEAOs

EspEspééciescies ReativasReativas de de OxigênioOxigênio –– EAOsEAOsFunFunççõesões

Ativação de estado de resistência contra doenças

Ativação de mecanismos de resistência associados a conjuntode genes de defesa

Espécies reativas de oxigênio: H2O2 SA – forte sinal indutor

Resistência Sistêmica Adquirida (SAR)

RespostasRespostas de de DefesaDefesa dada PlantaPlanta

Proteínas de Choque Térmico na InteraçãoPlanta-Microrganismo

ProteProteíínasnas de de ChoqueChoque TTéérmicormico nana InteraInteraççãoão PlantaPlanta--MicrorganismoMicrorganismo

A colonização de plantas por microrganismos - produção de EAOs e enzimas antioxidantes.

Exposição de hospedeiro e microrganismo a ambienteestressante.

O que pode acontecer???

ProteProteíínasnas de de ChoqueChoque TTéérmicormico nana InteraInteraççãoão PlantaPlanta--MicrorganismoMicrorganismo

Produção proteínas de choque térmico (HSPs)

Produção de substâncias que atuam na sua interação com a planta

MicrorganismoPlantaProdução proteínas de choque térmico (HSPs)

Respostas de defesa (HSPs)

Estresse

Introdução

RAR1 e SGT1 - componentes essenciais de resistência conferida por muitos genes R

RAR1 interage com SGT1

Resultados e Discussão

Estrutura de HvHSP 90 (Cevada)

Domínio ATPaseN-Terminal

(N)

Domínio de ligação aosubstrato

(M)

Domínio C-TerminalLigação à

domínios TPR de cochaperonas

(C)

Resultados e Discussão

RAR 1 interage com HvHSP 90

1. HvRAR1 e AtRAR1 interagem com Hv HSP 90 – funções dessa ligaçãoconservadas em mono e dicotiledôneas.

2. Interação específica com CHORD-I

Resultados e Discussão

SGT 1 interage com HvHSP 90

1. HvSGT1 e AtSGT1 interagem com Hv HSP 90 – funções conservadasem mono e dicotiledôneas.

RPS-2

SGT1

RAR1

HSP 90 Resistência

Resultados e Discussão

Testar se GDA afeta HR em Arabidopsis mediada por RMP1 e RPS2GDA: Geldanamicina – inibe atividade de HSP 90

Linhagens de P. syringae pv. Tomato (Pst) contendo genes de avirulência avrRpm1 e avrRpt2

1. 10µM de GDA não afetou HR dependentede RPM1

2. 10µM de GDA diminui HR dependente de RPS2 em 20hpi.

Folhas (lado direito) - infiltradas com Pst DC3000 (vetor, avrRmp1 e avrRpt2).

Tripan Blue – HR visível

Resultados e DiscussãoGDA afeta resistência mediada por genes R contra Pst DC 3000

1. avrRpm1 – GDA afetacrescimento bacteriano com 2 dpi (~ 6x) --- inibição daresistência.

2. avrRpt2 – GDA inibiu ~ 6x com 1dpi --- inibição mais acentuadada resistência mediada por RPS2.

Linha rosa: solução com GDA; Linha azul: solução sem GDA

Conclusão

A atividade de HSP 90 é requerida para resistência a doença dependente de RPS2 e RPM1, e na HR mediada por RPS2.

SGT1 e RAR1 ---- estruturas e interações --- co chaperonas ----modulação, junto com HSP 90, da atividade/ estabilidade de substratos protéicos importantes na resistência.

Resultados

Xylella fastidiosa foi afetada em uma correlação direta com o aumento da concentração da droga

Variação no transcriptoma - modulação de 665 genes

Análise da Resposta a Estresse Oxidativo de Xylella fastidiosa através de Hibridações de Microarranjos de DNA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação Interunidades emBiotecnologia da Universidade de São Paulo/ Instituto de Pesquisas Tecnológicas

Muniz, C.R. (2006)

Genes Superexpressos: Enzima responsáveis pela detoxificação direta de peróxido de

hidrogênio (enzima alquil-hidroperóxido desidrogenase)

Fatores associados ao revestimento celular

Fator associado à ativação de moléculas de hemolisina

Bacteriocinas

Adesinas (biofilme)

Análise da Resposta a Estresse Oxidativo de Xylella fastidiosa através de Hibridações de Microarranjos de DNA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação Interunidades emBiotecnologia da Universidade de São Paulo/ Instituto de Pesquisas Tecnológicas

Muniz, C.R. (2006)

Interação com outros microrganismos

Interação com a planta

Introdução

P. shigelloides – patógeno intestinal

Interação patógeno-hospedeiro – invasão de células Caco-2 por P. shigelloides induz apoptose

HSP: - estudos recentes indicam que algumas podem ser expressas na superfície bacteriana

- transporte de proteínas através de membranas, dobramento

Investigar envolvimento de GroEL nos estágios de adesão

Caracterização do perfil transcricional de P. shigelloides durante infecção de células Caco-2 por RT-PCR

Cinética de expressão de GroEL durante infecção por P. shigelloides.

GroEL

Resultados

Marcador Adesão Invasão Indução de apoptose

Resultados

A) Linha pontilhadas: células Caco-2 controle; Linha fina: células Caco-2 infectadas com P. shigelloides; Linhagrossa : células Caco-2 pré tratadas com 10, 20 e 30 µg de GroEl

B) Idem A porém tratadas com BSA (controle)

• Células não infectadas: 2,23

Papel de GroEL na adesão celular73,81

150,93

231,64

49,23

50,07

53,89

RT-PCR de ICAM-1 expressa por células Caco-2 estimuladas por 10µg, 20µg e 30µg de GroEL.

Capacidade de GroEL de P. shigelloides de estimular expressão de ICAM-1

Resultados

Conclusão

Contato patógeno-hospedeiro - sinal para P. shigelloides – superexpressão de GroEL.

GroEL de P. shigelloides estimula sua adesão às células hospedeiras – “superexpressão” de receptor envolvido na adesão celular.

GroEL desempenha importantes funções no estabelecimento da infecção

Objetivo

Identificar proteínas produzidas especificamente durante colonização da filosfera (folhas) através de comparações de proteomas de M. extorquens colonizando folhas, raízes e crescida em meio de cultura.

A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth

Gourion, B., Rossignol, M., Vorholt, J.A.

PNAS 2006; 103;13186-13191

Identificação de 40 proteínas super reguladasdurante colonização dafilosfera.

Pontos em laranja: filosfera. Pontos em azul: meio de cultura.

Resultados

A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth

Gourion, B., Rossignol, M., Vorholt, J.A.

PNAS 2006; 103;13186-13191

Tabela 1: Lista de proteínas de M. extorquens AM1 induzidas durante a colonização da filosfera (P) relativo ao meio de cultura (MM) e colonização na rizosfera (R)

Resultados

Identificação de um suposto regulador de resposta (PhyR –Phyllosphere-induced regulator)

Importância de PhyR:- NCBI: Domínio semelhante a RpoE (δE) em N-terminal ---- papel

na manutenção da integridade do envelope celular, e naresistência a estresses ambientais

- Domínio fosforeceptor em C-Terminal

N-Terminal C-Terminal

Resultados

Avaliação da importância de PhyR na colonização da planta

A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth

Gourion, B., Rossignol, M., Vorholt, J.A.

PNAS 2006; 103;13186-13191

Servera diminuição nacolonização da planta pormutantes.

Resultados

Identificação de proteínas positivamente reguladas por PhyR

Comparação do proteoma de linhagem superexpressandophyR com linhagem mutante deficiente.

A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth

Gourion, B., Rossignol, M., Vorholt, J.A.

PNAS 2006; 103;13186-13191

Tabela 2: Lista de proteínas reguladas positivamente por PhyR

Conclusão

PhyR - papel chave na adaptação de M. extorquens ao ambiente da planta, frente aos vários fatores de estresse que a bactéria possa enfrentar.

δB – regulador de resposta a estresse emGamaproteobactérias

Importância de proteínas de estresse na colonização

A proteomic study of Methylobacterium extorquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth

Gourion, B., Rossignol, M., Vorholt, J.A.

PNAS 2006; 103;13186-13191

Estudo

Identificação de genes alterados em Erwinia chrysanthemi3937 isolada da planta hospedeira, em comparação com a crescida em laboratório em meio de cultura, por meio de microarranjos.

Resultados

Regulação gênica Classe Número

Genes hipo regulados na planta Síntese de proteínas 5Transcrição 5TCA/ fosforilação oxidativa 4

Resultados

Reguação gênica Classe Subclasse Número

Genes super reguladosna planta

Transporte e nutrição Transporte de ferroTransporte de sulfatoTransporte de aa ou peptídeosTransporte de polissacarídeosOutros

QuimiotaxiaAnaerobioseProteínas regulatórias

Regulador traducionalOutras proteínas regulatórias

Síntese de peptídeosEnzimas de degradação Enzimas pécticas

ProteasesResistência e xenobióticosOutros genes de estresse

Defesa contra estresse

Reparo de DNA e recombinaçãoElementos transponíveisComponentes de fagosHomólogos de proteínas desconhecidasORFs sem homólogos significantes

Conclusão

Grande número de genes envolvidos em resistência a xenobióticos, resposta ao estresse oxidativo e térmico indica sua importância frente a colonização e adaptação.

Conclusões Finais

HSP --- papel em processos onde há necessidade de alteração de conformação de proteínas.

Pouco conhecimento sobre papel de HSP na interação planta-microrganismo.

Estudos em organismos eucarióticos sugerem importante papel na colonização do hospedeiro por microrganismos.

ProteProteíínasnas de de ChoqueChoque TTéérmicormico nana InteraInteraççãoão PlantaPlanta--MicrorganismoMicrorganismo

Proteínas de interação

com a planta

Adesinas

Interação (estresse)

HR e resistência

mediada porgenes R

Proteínas de interação com

outrosmicrorganismos

Bacteriocinas

HSP

Estabilidadede

substratosproteícos

Fim!!!