Projet de Biologie: Mesure in vitro de la créatinine Molécule de créatinine Source: wikipédia Test papier pH Source: GUILBOT Nils ISMAN

Projet de Biologie:Mesure in vitro de la

créatinine

Molécule de créatinineSource: wikipédia

Test papier pHSource: www.teesfrance.com

GUILBOT Nils ISMAN Julien KONCKI AriellePOMATTO LauriannePOUJOL Julie

Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

Plan

I. Qu’est ce que la créatinine?

II. La détection de la créatinine

III. La réaction de Jaffé

IV. Test de dépôt sur papier

V. Test de dépôt sur microbilles

VI. Test sur gel d’agarose

VII.Bilan, perspective et coût du projetSoutenance projet créatinine - 13/05/2011

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I. Qu’est ce que la créatinine?


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Qu’est ce que la créatinine?


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Qu’est ce que la créatinine?

Taux constant, hors effort

Dégradation par les reins et évacuation dans l’urine

Concentration sanguine faible (30 mg/L)

Gamme de valeurs de concentration chez l’homme :

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II. La détection de la créatinine


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Pourquoi vouloir détecter la créatinine?

L’insuffisance rénale

3 millions de personnes touchées La filtration glomérulaire n’est plus assurée Augmentation de la créatinine sanguine Diminution de la clairance


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Comment on la détecte?

Où trouve-t-on la créatinine? Sang : méthode actuelle Urine : on doit détecter une diminution de la

clairance Salive : méthode la plus simple

Actuellement, on mesure la créatinine par voie sanguine Méthode invasive Problèmes à long terme Obligation de faire appel au personnel médical


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Avantage de détecter la créatinine dans la salive

Méthode non invasive

Aucun problème de contamination

Possibilité de faire le test soi même, à la maison

Résultat quasi immédiat


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Objectifs initiaux

Trouver une méthode de mesure de la créatinine Moins invasive Moins contraignante Moins chère

Test papier


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III. La réaction de Jaffé

La réaction de Jaffé

Simple

Avec une cinétique de réaction

Mais réaction sensible à différents facteurs (sérum: drogue, glucose ….)

12Soutenance projet créatinine - 13/05/2011

La Gamme de concentration

Nécessité d’avoir 1/3 créatinine

1/3 acide picrique

1/3 soude

Volume puits: 200µL

Cinétique: 15 minutes

Extension de la gamme

13Soutenance projet créatinine - 13/05/2011



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Décalage de la gamme de concentration

=> zone à risque dans la zone de virage de la

couleur.

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Gamme décalée

Mais écart réduit

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V. Test de dépôts sur papier


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Test de dépôts sur papier

Objectifs : Etude du comportement des liquides sur les

différents papiers Détermination d’un papier optimal pour la

réaction Etude de la réaction : visualisation de la couleur

Protocole expérimental : Dépôt d’une goutte de 10 μL de picrate Choix du papier optimal pour la réaction Dépôt d’une goutte de 5μL de créatinine à 800

μM


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Dépôt d’une goutte de 10μL de picrate : Test sur 10 papiers différents : plus ou moins

absorbant Dépôt sur chaque face des papiers

Résultats :

Papier blanc épaisCalque

Papier carton face 1Papier carton face 2


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Analyse des résultats : Dépôts de couleur différente selon les papiers Diffusion différente entre deux papiers différents Diffusion différente entre les faces d’un même

papier Pénétration plus ou moins lente dans les papiers :

immédiatement 30 minutes

Contour plus foncé des gouttes : conséquences sur la réaction?

Goutte de picrate


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Dépôt d’une goutte de 5 μL de créatinine à 800 μM :

Choix des papiers où la goutte de picrate a pénétré rapidement

Résultats : Limite picrate

Limite créatinine

Diffusion des molécules

On observe un liseré orangé : Réaction qui se produit ?


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Analyse des résultats : Molécules de picrate chassées par la goutte de

créatinine Présence d’un liseré orange : la réaction

« semble » se produire

MAIS faux positif ?

VS

picratepicrate + créatinine

Différence aisée pour public non

averti ?


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Cependant un espoir : le papier n° 7 Papier standard créé par les élèves de Pagora en

TP Pénétration du liquide dans le volume

Diffusion homogène dans le papierGoutte de picrate :

Couleur jaune Couleur homogène

Réaction semble se produire

MAIS diffusion des molécules de picrate par la créatinine Méthode pour les fixer sur le papier

V. Tests de dépôt sur micro billes


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Colonne PD 10

Elimination du tampon par Lavage

Saturation de la colonne en picrate

microbilles poreuses imbibées de picrate


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Observation au microscope


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Réalisation d’une gamme sur billes

50 mg de mélange bille/picrate+15 μlitres de créatinine à différentes concentrations

Changements de couleur peu discernables entre 0 et 600 μMolaires.


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Expériences et résultats complémentaires

- La réaction ne marche que sur des billes humides

La réaction marche que les billes soient mises au frais ou laissées à l’air ambiant.

- La réaction est limitée dans le temps: les billes redeviennent jaune clair après quelques heures


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Combinaison billes papier

Sur papier peu diffusif:

50 mg mélange Billes picrate +15 μlitres deCréatinine

200 400 600 800

ConcentrationCréatinine(μmolaires)


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Combinaison billes papier

Sur papier diffusif:


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Une limite: la fixation des billes

Scotch : Peu efficace

Colle scolaire : empêche la réaction

VI. Test sur gel d’agarose


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Comment empêcher le dessèchement des

billes ? Si le billes restent en

contact avec l’air

Þ Assèchement du picrate et absence de réaction après ajout de créatinine

Þ Problème de conservation du test

Conclusion: nécessité d’isoler les billes de l’air


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Effectuer la réaction dans un gel d’agarose

Agarose 0,5%

Puits1 : gel 60μL + picrate en solution 60μL

Puits2 : billes (50mg) + gel 60μL

Puits3 : mélange homogène billes + gel 60μL

Ajout de 30 μL de créatinine après solidification du gel

Agarose 0,25%

Puits1 : 50μL picrate en solution + 50μL gel + 50μL créatinine

Puits2 : 50μL picrate en solution + 50μL gel + 25μL créatinine

Stœchiométrie 2/3, picrate 1/3 créatinine

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Résultats

Agarose 0,5%

Puits1 : la réaction a lieu => coloration orangée

Puits2 : billes au fond du puits, présence d’une couche de gel en surface => le gel s‘est-il glissé entre les billes? La créatinine ne semble pas pénétrer le gel

Puits3 : pas de coloration, la créatinine ne pénètre pas le gel

Agarose 0,25%

Puits1 : coloration orangée au bout de 15-30min

Puits 2 : idem

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Réalisation d’une gamme colorimétrique

réalisation d’une gamme colorimétrique sur gel d’agarose mélangé à 50μL de picrate en solution

Ajout de créatinine de 300 à 1000mM


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Test de conservation

Réalisation de la même gamme colorimétrique après 48h de repos du mélange gel+picrate

La réaction a lieu mais intensité très faible => différence indiscernable.

Bilan

L’utilisation d’un mélange picrate en solution + gel d’agarose semble être une solution exploitable.

Problématique1: déplacer la gamme pour distinguer les couleurs correspondant à différentes concentrations en créatinine ?

Problématique2: problème de conservation du test, inexploitable à moyen terme.

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VII. Bilan, perspectives et coût du projet


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Bilan des expériences

Réactions sur trois types de support :

Support Avantages Inconvénients

Papier Peu couteuxFacilité d’utilisation

Diffusion de picrate lors de l’ajout de la créatinine

Micro billes Pseudo réaction en solutionObservation de la gamme de couleur

CouteuxAssèchement des billes si mauvais conditionnement

Gel d’agarose Peu cherObservation de la gamme de couleur


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Perspectives du projet

A développer : Fixation du picrate sur le papier :

Structure du picrate à étudier Réaction dans le gel d’agarose :

Conditionnement du gel pour faciliter le test

Dans des micro-puits

Sur une bandelette

Gel d’agarose + picrate

Goutte de salive

Gel d’agarose + picrate salive

Analyse


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Coût du projet


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Merci de votre attention !


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bibliographie An Enzymic Reaction-Rate Assay for Serum Creatinine with a Centrifugal

Analyzer, Patrick K. Jaynes, Ronald D. Feld, and George F. Johnson

Enzymic Creatinine Assay: A New Colorimetric Method Based on Hydrogen Peroxide Measurement, Piero Fossati, Lorenzo Prencipe, and Giovanni Bert

Kinetic Enzymatic Method for Determining Serum Creatinine, Gerald A. Moss, Richard J. L. Bondar, and Diane M. Buzzelli

Direct detection of renal function markers using microchip CE with pulsed electrochemical detection, Carlos D. Garcia and Charles S. Henry

Method for the microassay of endogenous creatinine in blood and urine of small murid rodents, S. HEWITT

Mechanism of Interference with the Jaffé reaction for Creatinine, Martin H. Kroli, Nell A. Roach, Brent Poe, and Ronald J. EIIn

Reaction of Alkaline Sodium Picrate with Creatinine: Kinetics and Mechanism of Formation of the Mono-Creatinine Picric Acid Complex John Vasillades

Documents

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