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Projet IProjet I
Vérifier la carte de Vérifier la carte de restriction d’une insertion restriction d’une insertion
d’ADNd’ADN
ObjectifsObjectifs
Déterminer quel gène vous avez Déterminer quel gène vous avez (Bioinfo)(Bioinfo)
Générer une carte théorique Générer une carte théorique (Bioinfo)(Bioinfo)
Vérifier expérimentalement la carteVérifier expérimentalement la carte Déterminer l’orientationDéterminer l’orientation
Cartographie des plasmides Cartographie des plasmides inconnusinconnus
Vecteur pUC19Vecteur pUC19
Clonage dans pUC19Clonage dans pUC19
X
SCM Digéré avec X
Clonage dans pUC19Clonage dans pUC19
X
X
+Insertion
Déterminer le site Déterminer le site d’insertiond’insertion
Couper avec XX
X
+Insertion
X Delimites la droite & la X Delimites la droite & la gauchegauche
Ex. Si Pst est le site d’insertion: Bam est à la gaucheSi Xba est le site d’insertion, alors Bam est à la droite
Déterminer l’orientation Déterminer l’orientation relativerelative
X XA A
X XA A
Orientation 1
Orientation 2
Projet IIProjet II
Mutagenèse dirigée de Mutagenèse dirigée de LacZLacZ
ObjectifsObjectifs
Utiliser le PCR pour faire Utiliser le PCR pour faire l’amplification et la mutagenèse du l’amplification et la mutagenèse du gène Lacz dans pUC19gène Lacz dans pUC19
Utiliser le PCR pour ajouter des Utiliser le PCR pour ajouter des sites de restrictions appropriés aux sites de restrictions appropriés aux extrémités du gène LacZ pour extrémités du gène LacZ pour permettre le clonagepermettre le clonage
Réplication & Réplication & Amplification Amplification
d’ADNd’ADN
La Réaction de la Polymérase en La Réaction de la Polymérase en ChaîneChaîne
PolymérasesPolymérases
5’…GTACT3’…CATGAATGCTGCATTTGCGGGCATTACTC…5’
Polymérase
Amorce
-OH
Extrémité 3’OH
TACGACGTAAACGCCCGTAATGAG
Matrice d’ADN ou ARN
2 Types de Polymérases ADN:2 Types de Polymérases ADN: ADN dépendanteADN dépendante :
Requiert une matrice ADN Fait la synthèse d’ADN
Ex. Polymérase Taq ARN dépendante
Requiert une matrice ARN Fait la synthèse d’ADN (ADNc)
Ex. Transcriptase inverse
14
La Réaction de la La Réaction de la Polymérase en Chaîne-PCRPolymérase en Chaîne-PCR
Réplication répétitive d’une région Réplication répétitive d’une région donnée d’ADNdonnée d’ADN
Permet l’amplification exponentielle Permet l’amplification exponentielle d’une région donnée d’ADNd’une région donnée d’ADN
Augmente la représentation relative Augmente la représentation relative d’une région d’intérêtd’une région d’intérêt
Permet l’isolation d’une région Permet l’isolation d’une région donnée d’ADNdonnée d’ADN
PCR-1PCR-1ierier Cycle Cycle
5’5’3’3’
3’
3’
5’
5’
Dénaturation (95Dénaturation (95ooC)C)
Appariement des amorces (Tm)Appariement des amorces (Tm)
5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’
3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’5’CCGTGGGGT3’>
<3’GGAACGGTACCGT5’
16
----------------------------------
--------------------------------
Extension (72Extension (72ooC)C)
3’
3’
5’
5’
5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’
3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’5’CCGTGGGGT3’>
<3’GGAACGGTACCGT5’
PCR-2PCR-2ee Cycle Cycle3’5’
3’ 5’
---------------------------------- --------------------------------------5’ 3’5’3’
AppariementAppariement
----------------
----------------------------------
-------------------------------
3’
3’
3’5’
3’ 5’
----------------------------------
--------------------------------------5’
5’
DDénaturationénaturation
--------------- /Extension/Extension
PCR- Cycles Subséquents PCR- Cycles Subséquents --------------------
-------------------
SeulementSeulement cette matrice est cette matrice est amplifiée de façon exponentielle : amplifiée de façon exponentielle :
22nn fois fois------------------------ ------------------------
------------------------ ------------------------
------------------------ ------------------------------------------------ ------------------------
------------------------ ------------------------------------------------ ------------------------
------------------------ ------------------------------------------------ ------------------------
------------------------ ------------------------------------------------ ------------------------
------------------------ ------------------------------------------------ ------------------------
------------------------ ------------------------------------------------ ------------------------32 fois totale32 fois totale
Survol des Cycles du PCRSurvol des Cycles du PCR
Amorces:Amorces: Courte séquence de nucléotidiques Courte séquence de nucléotidiques
simple brins complémentaires aux simple brins complémentaires aux ciblescibles
15-30 nucléotides15-30 nucléotides Utilisée en excès comparativement à Utilisée en excès comparativement à
la cible afin de favoriser la cible afin de favoriser l’appariement des amorces plutôt que l’appariement des amorces plutôt que l’appariement des matricesl’appariement des matrices
Survol des Cycles du PCRSurvol des Cycles du PCR
Appariement:Appariement: Température à laquelle les amorces Température à laquelle les amorces
s’apparient aux séquences s’apparient aux séquences complémentairescomplémentaires
Dois être sous le Tm des amorcesDois être sous le Tm des amorces Dois être une température qui permet Dois être une température qui permet
aux deux amorces de s’apparieraux deux amorces de s’apparier Habituellement entre 55-75Habituellement entre 55-75ooCC
Survol des Cycles du PCRSurvol des Cycles du PCR
Extension:Extension: Fait à la température optimale pour la Fait à la température optimale pour la
polymérase ADNpolymérase ADN Habituellement 72-75Habituellement 72-75ooC pour la C pour la
polymérase Taqpolymérase Taq
Polymérase TaqPolymérase Taq
Isolé d’une bactérie thermophileIsolé d’une bactérie thermophile Thermus aquaticusThermus aquaticus
Stable à des températures élevéesStable à des températures élevées 9595ooC - utilisée pour dénaturer l’ADNC - utilisée pour dénaturer l’ADN
Aucune activité exonucléaseAucune activité exonucléase Pas d’autocorrectionPas d’autocorrection
Possède une activité deoxynucléotidyl Possède une activité deoxynucléotidyl transférasetransférase Activité polymérase indépendante d’une matrice Activité polymérase indépendante d’une matrice Ajoute dA aux extrémité 3’OH libresAjoute dA aux extrémité 3’OH libres
23
AmorcesAmorces
Caractéristiques:Caractéristiques: Courts oligonucléotides Courts oligonucléotides
complémentaires aux séquences qui complémentaires aux séquences qui bordent la région d’intérêtbordent la région d’intérêt
Établis le point d’initiation de la Établis le point d’initiation de la réplicationréplication
Établis le point de terminaison de la Établis le point de terminaison de la réplicationréplication
24
Conception d’AmorcesConception d’Amorces
Autocomplémentarité:Autocomplémentarité:
5’GGGGCCCC3’
GGGG
CCCC
Complémentarité de la paireComplémentarité de la paire
5’GGGGAAAA3’
3’CCCC TTTT5’
25
Conception d’AmorcesConception d’AmorcesComplémentarité 5’Complémentarité 5’
3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’Matrice
CCATAACCGG-OH3’ 5’CGA
Complémentarité 3’Complémentarité 3’
3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’Matrice
TACCCATAACC TA-OH3’
26
Conception d’AmorcesConception d’Amorces
5’
5’3’
3’
Région d’intérêt
Région d’intérêt3’
3’
3’
3’
Bonne orientationMauvaise orientation
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ProblèmeProblème
Vous désirez amplifier la séquence Vous désirez amplifier la séquence représentée par la boite. Quelle représentée par la boite. Quelle paire d’amorces est dans la bonne paire d’amorces est dans la bonne orientation pour accomplir ceci?orientation pour accomplir ceci?
5’-AAAAAAAAAAAA GGGGGGGGGGGGG-3’
1- AAAAAA2- TTTTTT3- GGGGGG4- CCCCCC
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Utilité du PCRUtilité du PCR
Amplification et isolation d’une région donnée Amplification et isolation d’une région donnée en changeant sa représentation relativeen changeant sa représentation relative Entre 100pb et 10KpbEntre 100pb et 10Kpb
Criblage pour déterminer la présence d’une Criblage pour déterminer la présence d’une séquence d’intérêtséquence d’intérêt Présence ou absence d’un produit d’amplificationPrésence ou absence d’un produit d’amplification
Mutagenèse dirigéeMutagenèse dirigée Utilisé pour ajouter ou enlever des nucléotides sur Utilisé pour ajouter ou enlever des nucléotides sur
la matrice originalela matrice originale
