Prokaryotická a eukaryotická bunka

Ako vybudovať membránovú organelu(Vnútrobunkový transport a triedenie proteínov v bunke)

• Cytosolické (rozpustné)

• Makromolekulárne štruktúry

• Proteíny bunkového jadra

• Organelové proteíny (mitochondrie, chloroplasty, peroxizómy)

• Proteíny ER a Golgi („retikuloendotelialného“) systému

• Sekrétované proteíny

Mitochondriálne kompartmenty a ich vybavenie

• vonkajšia membrána

Porin (P70, VDAC);MAO -norepinephrine;TOM-komplex

• medzi-membránový priestor

Cytochrom c; cyt.c peroxidáza; cyt.c1; cyt. b2

• vnútorná membrána

ADP/ATP prenášač; Pi/OH prenášač; cyt.c oxidáza; CoQH-cyt.c reductáza; proteolipid FoATPase;termogenin; TIM-complex

• matrix

RNA a DNA polymerázy; Mn-SOD; enzýmy Krebsovho cyklu; OTC; carbamoyl-Pi syntetáza; mHSP70; mt-proteázy

Kontaktné polohy

Aký je pôvod mitochondriálnych proteínov?

Semi-autonómia organel a pôvod mitochondriálnych proteínov?

Ako to vieme?

• In vitro proteosyntéza ?• mtDNA v elektrónovom mikroskope ?• Rho- (0) mutanty S.cerevisiae • pro-mitochondrie (-O2) v anaeróbnych bunkách

Mitochondrie majú vlastnú DNA a

proteosyntetický aparát

Čo kóduje ľudská mtDNA (16,569 bp) :

-22 tRNA; 16S a 12S rRNA,?5S rRNA

-sub.7 NADH-CoQ reduktázy, sub.3 Fo-ATPázy, sub.3 COX, apo-cyt.b,

Veľkosť a kódovacia schopnosť mtDNA varíruje v závislosti od organizmu

mtDNA h. sapiens

h mtDNA 16. 6 kbp

y mtDNA 78 kbp

p mtDNA do 330 kbp

Ako môžeme vidieť mitochodrie

Elektrónová mikroskopia DiOC6 DAPI

0

DAPI – 4´,6-diamidino-2-fenylindolDiOC6(3) - dihexaoxacarbocyanine iodide

Mitochondriálna sieť v kvasinkách

Mitochondriálna morfológia v priebehu delenia organel

Dnm1-GFP

mitochondria

Drp1-GFP

mitochondria

Mitochondrial fusion and fission in mammals, CHAN DC. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 22. 79-99. (2006). Mitochondrial fragmentation in apoptosis, ARNOULT D. Trends in Cell Biol. 17:1. 6-12. ( 2007).

Enzymatické komplexy OXFOS uložené vo vnútornej mitochondriálnej membráne

ADP/ATP prenášač vnútornej mitochondriálnej membrány

F1F0-ATPázae- transport

+/- O2

Ako sa tieto proteíny dostanú do správnej organely, membrány??????

Ako mutanty pomohli objasniť import proteínov do mitochondrii

ADP/ATP prenášač (AAC2)

Mutanty S.cerevisae:

• 0 – respiračno-deficitné „petite“ mutantyrespiračné komplexy (-); F1F0-ATPáza (+/-); glu+;gly-

Kužela a spol., 1968

• op1 mutantrespiračné komplexy (+); F1F0-ATPáza (+); glu+;gly-;

Kováč a spol., 1969

•0 x op1 mutant zastavenie rastu Kováčová a spol.

•op1 (aac2-) mutant transport ADP/ATP (AAC)Kolarov a spol., 1972;Šubík a spol.,1972)

op1

glukóza + 2Pi + 2ADP + 2NAD+ 2pyruvat + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O

0 x aac2- mutant [ATPmito]

(inhibitory antimycin A+ bongkrekate)+/- O2

ADP/ATP

ADP/ATP

ADP/ATPADP/ATP

NADH + H+ + 1/2O2 NAD+ + H2O

AAC2

AAC2

Prečo dvojitý (0 x op1) mutant nie je schopný rasť a deliť sa

Záver:• Z neschopnosti rastu dvojitého mutanta (0 x

aac2-) vyplýva, že prítomnosť ATP vo vnútri mitochondrii je esenciálne pre život a delenie buniek.

Otázka: K čomu je potrebné ATP vo vnútri mitochondrii?

Experiment:

• k bunkám (0 x op1 ) mutanta a divého kmeňa (kontróla) pridať 35S-Met po čase pridať detergent antiserum mit.proteín.

1. K bunkám (0 x op1 ) pridať 35S-Met po čase

pridať detergent

Immunoprecipitácia (IP)

2. Pridať primárne protilátky proti proteínu,

ktorý nás zaujíma

3. Pridať sekundárne protilátky konjugované

s agarózou

4. Premyť vyzrážané IgG-Ag komplexy

a aplikovať naSDS-PAGE

Separácia proteínov SDS-PAGE(Laemmli system)

D.T. M D.T. M M D.T. M št. m.v.

-F1 aconitáza ADP/ATP

ATPáza translokátor

Záver:

1) Intramitochondriálne ATP je esenciálne pre delenie eukaryotických buniek.

2) Mitochondriálne proteíny (kódované jadrovou DNA) sú syntetizované v cytoplazme ako prekurzory s väčšou mol.hmotnosťou.

3) Importované mito-prekurzory sú proteolitickým ošetrením (processing) premenené na dospelé formy.

4) Import mito-prekurzorov potrebuje intramitochondriálne ATP.

Mitochondrie (CBB) - - + + + + - - + +

Trypsin - + - + - + - + + +

ATP + + +

(inhib.)

„In vitro“ rekonštrukcia importu proteínov do mitochondrií

PAGETestovanie importu in vitro

Záver:

• Prekurzory sú najprv syntetizované v cytoplazme a potom „post-translačne“ sú importované do mitochondrie

• Okrem ATP je pre import potrebný

• Existujú mito-prekurzory, ktoré majú rovnakú mol. hmotnosť ako dospelá forma proteínu v mitochondriach.

Importovaný Lokalizácia Funkčné domény v

proteín importovaného proteínu N-term. sekvenciach

Matrixová signálna

sekvencia

Matrixová proteáza

(MP-I)

Akonitáza Matrix

Prekurzory mitochondriálnych proteínov majú na N-terminálnom konci odštiepiteľnú adresnú sekvenciu

Vlastnosti mitochondriálnej adresnej sekvencie

• malá podobnosť medzi mito. adresnými sekvenciami

• vlastnosti vyplývajúce zo sekundárnej a terciárnej štruktúry adresnej sekvencie sú zodpovedné za rozpoznanie

? – Obsahuje adresná sekvencia všetku potrebnú informáciu pre lokalizáciu mitochondriálneho proteínu?

Experiment:

Proteínové chiméry ozrejmujú mechanizmus importu

Záver:

• Mito. adresná N-terminálna sekvencia je postačujúca pre import

• Importovaný peptid musí byť v rozvinutom (unfolded) stave

• Kontaktné polohy medzi OM a IM sú miestami pre import proteínov do mito.

!Tvorba stabilného translokačneho intermediatu!

• Aký je mechanizmus importu?

• Aké proteíny sa zúčastňujú?

Experimenty: G. Schatz; W. Neupert; N. Pfanneridentifikácia zúčastnených proteínov pomocou, i) chemický „cros-linking“ , ii) genómová analýza (bioinformatika)

3 rôzne importné dráhy pre mitochondriálne proteíny syntetizované v cytosole

• import proteínov s N-terminálnou presekvenciou

• import proteínov s vnútornou signálnou sekvenciou

• proteíny s osobitou importnou dráhou

Translokátory proteínov v mitochondriálnych membránach

Import proteínov s N-terminálnou presekvenciou

ATP- poháňaný importný motor obsahuje (mtHsp70),

Import proteínov s N-terminálnou presekvenciou

(Úloha rôznych foriem energie v importe proteínov do mitochondriálneho matrixu)

vyžaduje 3 oddelené vklady energie:- ATP hydrolýza v cytosole- protón-motívna sila ( ) cez vnútornú mit. membránu- ATP hydrolýza v mit. matrix

Import proteínov bez N-terminálnej presekvencie

Sú to:

- niektoré proteíny importnej mašinérie vnútornej mitochondriálnej membrány (napr. Tim23)

- proteíny vnútornej mitochondriálnej membrány patriace do rodiny mitochondriálnych prenášačov (napr. ADP/ATP; Pi/OH-; citrát/malát, iné… )

Proteíny z rodiny mitochondriálnych prenašáčov nemajú N-terminálnu

presekvenciu

cytosol

matrix

N

C

Funkcia mitochondriálnych prenášačov

Mitochondrie (CBB) - - + + + + - - + +

Trypsin - + - + - + - + + +

ATP + + +

„Post-translačný“ import proteínov do mitochondrie

PAGE

Import hydrofóbnych proteínov s vnútornou signálnou sekvenciou do IM

Mitochondriálne kompartmenty a ich vybavenie

• vonkajšia membrána

Porin (P70, VDAC);MAO -norepinephrine;TOM-komplex

• medzi-membránový priestor

Cytochrom c; cyt.c peroxidáza; cyt.c1; cyt. b2

• vnútorná membrána

ADP/ATP prenášač; Pi/OH prenášač; cyt.c oxidáza; CoQH-cyt.c reductáza; proteolipid FoATPase;termogenin; TIM-complex

• matrix

RNA a DNA polymerázy; Mn-SOD; enzýmy Krebsovho cyklu; OTC; carbamoyl-Pi syntetáza; mHSP70; mt-proteázy

Kontaktné polohy

Importovaný Lokalizácia Funkčné domény v

proteín importovaného proteínu N-term. sekvenciach

Matrixová signálna

sekvencia

Matrixová proteáza

(MP-I)

I. II.

Akonitáza Matrix

Cyt c1 Medzimembránový

Cyt b2 priestor(MP-II)

Import proteínov do intermembránovéhomit. priestoru

Hierarchicky usporiadané sekvencie určujú lokalizáciu vo vnútri organel

• Obidve časti signálnejsekvencie majú odlišné zloženie.• N-terminálna časť sa podobá iným mit. signálnymsekvenciám. • Následných 19 AK je nepolárnych a vytvárajú neprerušený segment.

•Ani jedna sekvencia v maturovanom proteíne nie je prítomná.

Rôzne cesty proteínov z cytoplazmy do medzi-membránového priestoru a vnútornej

mitochondriálnej membrány

Import cyt c do intermembránového priestoru -špecifická importná dráha

- bez N-terminálnej pre-sekvencie

- nevyžaduje prot. zložky Tim a Tom

- ireverzibilné umiestnenie v IMS je

zabezpečené zmenou konformácie

Importovaný Lokalizácia Funkčné domény v

proteín importovaného proteínu N-term. sekvenciach

Matrixová signálna

sekvencia

Matrixová proteáza

(MP-I)

I. II.

„stop-transfer“ sekvencie

Akonitáza Matrix

Cyt c1 Medzimembránový Cyt b2 priestor

Porín (VDAC) Vonkajšia membrána

(MP-II)

Import mitochondriálnych proteínov

Importovaný Lokalizácia Funkčné domény v

proteín importovaného proteínu N-term. sekvenciach

Matrixová signálna

sekvencia

Matrixová proteáza

(MP-I)

I. II.

„stop-transfer“ sekvencie

Aconitáza Matrix

Subj.4 COX Vnútorná

membrána

Cyt c1 Medzimembránový Cyt b2 priestor

Porín (VDAC) Vonkajšia membrána

(MP-II)

Import mitochondriálnych proteínov

Metódy štúdia importu proteínov :

1. metódy in vitro

2. metódy in vivo

A. vyžadujúce dezintegráciu buniek:

i. stanovenie enzymatickej aktivity

ii. imunochemické metódy

B. nevyžadujúce dezintegráciu buniek:

i. využívajúce fúziu s reportérom (GFP)

Proteíny z rodiny mitochondriálnych prenašáčov nemajú N-terminálnu

presekvenciu

cytosol

matrix

N

C

? - Kde sa nachádza adresná sekvencia?

pAAC1-GFP

GFP

MET25

promoter

CYC

terminator

URA3

Amp

r

ARSH4

CEN6

AAC1

Aac - GFP fúzie

AAC1 fragments + GFP

Experiment

Proteínové chiméry fragmentov ADP/ATP translokátora (Aac) so zeleným fluorescenčným proteínom (GFP)

Lokalizácia Aac-GFP fúzie

DAPI – 4´,6-diamidino-2-fenylindol

Fragmenty ADP/ATP prenášača zacieľujú fúzieS GFP do mitochondrie

• translokátory vnútornej mitochondriálnej membrány majú viacnásobnú adresnú sekvenciu, ktorá je reprezentovaná v každej transmembránovej slučke

• každá jedná transmembránova slučka obsahuje potrebnú informáciu pre lokalizáciu vo vnútornej mit. membráne.

Záver:

Tri hlavné cesty importu proteínov do mitochondrii- súhrn

Čo poháňa vstup proteínov do mitochondrie: -Translokačný „motor“ versus „brownov“ pohyb

Nanotechnológie – molekulárne stroje

Dôsledky zlého fungovania importu proteínov do mitochondrií

Mom19 je proteín vonkajšej mitochondriálnej membrány a funguje pri rozpoznávaní signálnych sekvencií. Bunky s mutantným mom19 génom tvoria organely s nevyvinutými kristami. V membráne chýbajú cytochrómy a a b.