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Séparation magnétique des

plasmocytes

dans le cadre des myélomes multiplesElodie DAVIDEquipe Onco-hématologie en cytogénétique

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Sommaire

1. Le Myélome Multiple : Définition

4. Les outils de séparation : Différents appareils

3. La séparation magnétique : Principe

2. La purification des plasmocytes : Pourquoi ?

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1. Le Myélome Multiple Définition :prolifération maligne d’un clone plasmocytaire produisant de manière inadaptée et exagérée une immunoglobuline ou l’un de ses fragments

3 stades (classification de Durie et Salmon) :

Plasmocytes matures

Stade I

Plasmocytes immatures

Cytoplasme important

Stade II

PlasmoblastesFormation d’agrégats

Stade III

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Incidence:-Augmente avec l’âge-Légèrement plus fréquent chez l’homme que chez la femme-Moyenne d’âge de 64 ans

Diagnostic :-Mise en évidence d’une gammapathie monoclonale sérique et/ou urinaire-Mise en évidence d’une prolifération plasmocytaire médullaire

Signes cliniques:-Lésions osseuses-Hypercalcémie-Anémie-Insuffisance rénale…

1. Le Myélome Multiple

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Anomalies cytogénétiques :

- Hyperdiploïdie : 48-74 chromosomes : +3, +9, +15, +19…

- Hypodiploïdie

- t(4;14)

- Délétion totale ou partielle des chromosomes 13 et 17

1. Le Myélome Multiple

Valeur pronostique permettant un traitement adapté

sans anomalies de structure associées

Cytogénétique conventionnelle : vue d’ensemble du caryotype hyperdiploïdie

Diagnostic et suivi :

Cytogénétique moléculaire : plus précis et sensible anomalies fines comme t(4;14), del(13),

del(17)

ET

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2. Pourquoi une purification des plasmocytes?

Tri magnétique des plasmocytes avec étude des chromosomes 4, 14, 13 et 17

Etude du Myélome Multiple = étude des plasmocytes

Plasmocytes dilués dans la masse cellulaire

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3. Séparation magnétique des plasmocytes

Plasmocytes = CD138+

1. Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique

2. Tri sur colonne magnétique

3. Création d’un champ magnétique

4. Récupération des plasmocytes en cassant le champ magnétique

Principe :

3 appareils (Miltenyi) : - VarioMACS

- AutoMACS- AutoMACS Pro

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3. Séparation magnétique des plasmocytes VarioMACS et AutoMACS

Réalisation d’un ficoll

Récupération des globules blancs au niveau de l’anneau

Filtration de la moelle totale

Lavage

Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique

Passage de l’échantillon dans une colonne de billes magnétiquesCréation d’un champ magnétiqueRécupération de la fraction négativeCassure du champ magnétiqueRécupération fraction positive

1

3

4

6

7

5

Plasma

Cellules

mononucléesFicoll

Polynucléaires et

globules rouges

2

Lavage

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3. Séparation magnétique des plasmocytes VarioMACS et AutoMACS

Perte cellulaire dans le ficoll :

Utilisation de l’AutoMACS Pro

Colonnes et valves souvent saturées

Technique lourde (temps)

- agrégations protéique et plasmocytaire

- cellules de tailles différentes

I II III

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AutoMACS Pro

3. Séparation magnétique des plasmocytes

Sélection du programme

Tri magnétique sur AutoMacs Pro3 tubes : échantillon, fraction négative et positive

Après cassure du champ magnétique, récupération fraction positive

Après technique, 3 lames étalées :t(4;14),13 et 17

Filtration de la moelle totale

Lavage

Marquage spécifique des plasmocytes : Ac anti-CD138 couplé à une bille magnétique

1

3

4

2 Lavage

5

6

7

8

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AutoMACS Pro

3. Séparation magnétique des plasmocytes

Adaptation du programme de séparation

Travail sur moelle totale : Ac anti-CD138 plus concentrés

rendement augmenté (>86% : panel FISH complet)

automate moins saturé, maintenance adaptée

Tampons plus agressifs et filtres 40 µm

pureté augmentée (<5% d’échec de purification)

Automatisation

Gain de temps

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CONCLUSION

routine dans les bilans de myélome multiple

si nécessaire préférée à la mise en culture

support pour les études pangénomiques

Séparation magnétique :

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Remerciements

L’équipe d’onco-hématologie en cytogénétique, CERBA

L’équipe de FISH, CERBA

Hossain MOSSAFA, cytogénéticien à CERBA

MILTENYI

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Annexe 1 : Classification de Durie et Salmon

http://med2.pagesperso-orange.fr/import/CANCERO/CLASSIFICATION/MYELOME.htm

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4p13 : fluorochrome rouge 14q32 : fluorochrome vert

t(4;14)(p13;q32)

del(17)(p11)

Bandes R

del(13)(q14q21)Bandes G

Annexe 2 : quelques anomalies cytogénétiques

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1er test 2007 : Programme Possel-D avec utilisation uniforme de 50µL d’Ac anti-CD138

PatientBone

Marrow (ml)

Total WBC

% Plasma

cells slide

Theoric Total

plasma cells

MicroBea

ds

Control Purity by flow cytometry

Obtened Total

Labeled P cell

Performance

07D0570753 4.8 mL

3.3*10^6 c/mL

36%  50 µL 94,60% 5.3*10^5

 

60% 6.5*10^6 8,15%07D0572

733 6.2 mL5.8*10^6 c/mL

8%  50 µL 93,4 5.6*10^5

 72.7% 2.6*10^7 2,15%

07D0566314 4.3 mL

4.1*10^6 c/mL

5%  50 µL 68,40%

10.9*10^4

 59.3% 1*10^7 1,10%

07D0577164 5.8 mL

5.6*10^6 c/mL

4%  50 µL 72,80% 1.7*10^5

 1% 3.2*10^5 53,13%

07D0583892 3 mL

4*10^6 c/mL

22%  50 µL 88,40% 2.5*10^5

 15% 1.8*10^6 13,90%

07D0583530 5.3 mL

8.4*10^6 c/mL

0%  50 µL 65,50% 5.2*10^4

 5% 2.2*10^6 2,36%

07D0587071 2.7 mL

3*10^6 c/mL

15%  50 µL 88,70% 1.8*10^5

 12% 9.7*10^5 19%

07D0606916 6.1 mL

7.7*10^6 c/mL

3%  50 µL 31% 7.4*10^4

 1% 4.7*10^5 15,70%

07D0609147 6.8 mL

1.1*10^6 c/mL

60%  50 µL 54,10% 1.5*10^5

 5% 3.7*10^5 40,50%

07D0609191 6.3 mL

1.6*10^7 c/mL

8%  50 µL 65,50% 1.8*10^5

 1% 10^6 18,00%

  % of plasma cells reported by cytologist      

 

% and total plasma cells number determined by flow cytometry labelled by CD138/CD38

 

Annexe 3 : mise en place d’un nouveau protocole

Mauvais rendement : adaptation

de la quantité d’Ac

: 50µL Ac pour 107 cellules

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Annexe 4 : Comparaison des programmes de séparation

Pas assez de noyaux pour réaliser une FISH

PosselWB+Clean=

Meilleur rendement

Possel-D+Rinse # Possel WB+Clean