PROPRIETPROPRIETĂŢILEĂŢILE FIFIZICO-CHIMICEZICO-CHIMICE ALE ALE

PROTEINELORPROTEINELOR

Obiectivele:Obiectivele: Masa moleculară a proteinelor. Noțiuni generale referitor la

metodele de determinare a masei moleculare a proteinelor. Proprietăţile amfotere ale proteinelor. Sarcina electrică a

proteinelor. Factorii ce determină sarcina proteinei. Punctul şi starea izoelectrică.

Solubilitatea proteinelor. Proprietăţile hidrofile ale proteinelor în funcție de componența aminoacizilor și de particularităţile structurale. Factorii de stabilizare în soluţie a substanţelor coloidale. Starea soluţiilor coloidale: sol, gel, xerogel. Exemple.

Denaturarea proteinelor, agenţii ce provoacă denaturarea. Modificările structurale ale proteinei la denaturare.

Metodele de studiere a componenţei calitative şi cantitative a proteinelor:

a)hidroliza; b) cromatografia; c) electroforeza; d) salifierea; e) dializa.

6. Importanța biomedicală a metodelor de evaluare calitativă și cantitativă a proteinelor.

Proprietăţi fizico-chimiceProprietăţi fizico-chimice

Masa molecularăSolubilitatea proteinelor Proprietăţile amfotereSarcina electrică a proteineiDenaturarea

MasMasaa moleculară moleculară a a proteinelproteineloror

intre 10.000 şi 40.000.000 Daltoni.

MasMasaa moleculară moleculară a a proteinelproteinelor or

se determină prin următoarele metode:1. prin calcul cu ajutorul compoziţiei chimice

cunoscute: Ex: Masa mol. a Hb (Fe)=56x100 / 0,34=16470Da

2. mărimea presiunii osmotice, constanta ultracentrifugării (pr. sedimentează în raport cu m şi mărimea lor)

3. Metoda difuziunii luminii (intensitatea ei e dependentă de nr. particulelor şi de m ei)

4. Mărimea difracţiei razelor Roentgen5. Microscopia electronică

Proprietăţile electrochimice ale proteinelor

Sarcina electrică a Sarcina electrică a proteinelorproteinelor

Proteinele prezintă polielectroliţi amfoteri

Sarcina electrică a Sarcina electrică a proteinelorproteinelor

Sarcina electrică a proteinelor este determinată de 2 factori: I. de componenţa AA

II. de pH mediului

Sarcina electrică este determinată: Sarcina electrică este determinată:

1. de componenţa AA: 1. de componenţa AA:

dacă predomină AA acizi (Glu,Asp) sarcina sumară a proteinei va fi negativă

Sarcina electrică este determinată: Sarcina electrică este determinată:

1. de componenţa AA: 1. de componenţa AA:

b. dacă predomină AA bazici (Lys,Arg) sarcina sumară a proteinei va fi pozitivă

Sarcina electrică este Sarcina electrică este influenţată influenţată IIII. de pH mediului:. de pH mediului:

Sarcina electrică este Sarcina electrică este influenţată influenţată IIII. de pH mediului:. de pH mediului:

CONCLUZIE:CONCLUZIE:A. Proteina neutrăÎn mediu acid sarcina sumară va fi

pozitivăÎn mediu bazic sarcina sumară va fi

negativăDatorită acestui fapt la trecerea unui curent

electric în soluţie, AA vor migra în mediu acid spre catod(-), iar în mediu alcalin spre anod(+).

Punct izoelectricPunct izoelectric- Este o valoare a pH-ului la care suma

sarcinilor pozitive este egală cu suma sarcinilor negative (migrarea proteinelor sau a AA într-un cîmp electric este nulă)

- se notează pHi şi este diferit pentru fiecare aminoacid sau proteină.

În această formă se exercită forţe de atracţie reciproce între grupările – COO- şi - NH3+; are loc o aglomerare a moleculelor din soluţie şi solubilitatea devine minimă.

Sarcina electrică este Sarcina electrică este influenţată influenţată IIII. de pH mediului:. de pH mediului:

Sarcina electrică este Sarcina electrică este influenţată influenţată IIII. de pH mediului:. de pH mediului:

Sarcina electrică este Sarcina electrică este influenţată influenţată IIII. de pH mediului:. de pH mediului:

Sarcina electrică este Sarcina electrică este influenţată influenţată IIII. de pH mediului:. de pH mediului:

CONCLUZIE:CONCLUZIE:pHiPentrui AA neutri se află între pH 5-6Pentrui AA bazici se află în mediu bazicPentrui AA acizi se află în mediu acid

CONCLUZIE:CONCLUZIE:Sarcina proteinei La un pH mai acid ca valoarea pHi

proteina capătă o sarcină pozitivă (cation) şi migrează spre catod(-);

la PH mai mare ca pHi proteina capătă o sarcină negativă şi migrează spre anod(+)

SSolubilitatea olubilitatea proteinelorproteinelorProteinele - substanţe cu proprietăţi

hidrofileSolubilitatea variază în limite mari: - Proteinele globulare prezintă

grade diferite de solubilitate, - cele fibrilare sunt insolubile în

apă

SSolubilitatea este deteminată de:olubilitatea este deteminată de:

1. Componenţa aminoacidică2. Forma moleculei3. Sarcina proteinei4. Natura solventului5. Temperatura solventului6. pH-ul solventului

Solubilitatea Solubilitatea este influienţată de:este influienţată de:

◦ Prezenţa sărurilor metalelor uşoare – NaCl, MgCl2, Na2SO4, care:

1. la concentraţii mici măresc solubilitatea proteinelor

2. la concentraţii mari scad solubilitatea proteinelor şi ele precipită. Acest proces se numeşte salifiere.

Stabilitatea soluţiei proteice e Stabilitatea soluţiei proteice e determinată de 2 factori:determinată de 2 factori:

sarcina electrică – determină respingerea moleculelor proteice încărcate pozitiv sau negativ.

membrana apoasă care îndepărtează moleculele proteice una faţă de alta impiedicând agregarea şi precipitarea lor.

Membrana apoasă (apa Membrana apoasă (apa fixată)fixată)

Se formează la interacţiunea grupelor ionogene ce fixează dipolii de apă:

Grupa COO fixează 4 mol de H2O, NH2- -3; OH şi NH – câte 2. Apa ce intră în componenţa

membranei apoase e numită “apă legată”

Membrana hidricăMembrana hidrică

Proprietăţile apei fixate Proprietăţile apei fixate 1. moleculele ei au o dispunere mai

compactă, ce o apropie de un corp solid

2. proprietăţile ei de solvent sunt reduse3. îngheaţă la temperaturi joase( -40C)4. constanta dielectrică (forţa de atracţie

dintre ionii încărcaţi opus) este de 2,8, pe cînd la H2O obişnuită este de 8

Proprietăţile coloidale şi Proprietăţile coloidale şi osmotice ale proteinelorosmotice ale proteinelor

Proteinele sunt substanţe macromoleculare,solubile, la dizolvarea cărora se formează soluţii coloidale proteice.

Spre deosebire de soluţiile coloidale obişnuite, soluţiile proteice nu necesită prezenţa stabilizatorului. Soluţiile proteice sunt stabile şi cu timpul nu se precipită.

Soluţiile proteice posedă Soluţiile proteice posedă proprietăţi caracteristice proprietăţi caracteristice

soluţiilor coloidale:soluţiilor coloidale:Proprietăţile optice (efectul Tindal) Viteză de difuzie mică. Viscozitate mareProprietăţi osmotice Proprietatea de a forma geluri

Proprietăţile opticeProprietăţile optice efectul Tindal - la iluminarea laterală a soluţiei

proteice raza de lumină în ea devine vizibilă, formând conul de lumină.

Acest efect de dispersie a luminii se explică prin difracţia razelor de lumină de către particulele în soluţie.

Capacitatea proteinelor de a dispersa lumina este folosită:

1. la determinarea cantitativă a proteinelor prin metoda nefelometrică

2. la studierea microscopică a structurilor celulare.

Viteză de difuzie micăViteză de difuzie micăDifuzie – deplasarea spontană a moleculelor

substanţei dizolvate datorită gradientului de concentraţie (de la zone cu concentraţii mai mare spre cele cu concentraţie scăzută).

Viteza de difuzie a proteinelor depinde mai mult de forma moleculei, decât de masa ei.

Repartizarea intracelulară a proteinelor din locul de sinteză (ribosomi) are loc prin difuzie.

Deoarece viteza de difuzie e mică are loc limitarea vitezei proceselor dependente de funcţiile proteinelor difuzabile în sectorul respectiv.

Viscozitate mare –Viscozitate mare – e dependentă de masa şi forma

moleculelor. Mărirea c% proteinei conduce şi la mărirea

viscozităţii soluţiei (se măresc forţele de coeziune între moleculele proteice).

Proteinele fibrilare sunt mai vîscoase comparativ cu cele globulare.

Viscozitatea e dependentă de:1. temperatură- ↑t0 – viscozitatea scade2. prezenţa electroliţilor (ex. sărurile de Ca2+

măresc viscozitatea prin formarea punţilor de Ca2+)

Proprietăţi osmotice Proprietăţi osmotice

proteine fiind macromolecule – nu difundează prin membrane semipermiabile, pe când micromoleculele trec prin asemenea membrane. Acest proces e numit dializă.

Proprietăţi osmotice Proprietăţi osmotice Incapacitatea de a difuza prin membranele

semipermiabile are ca urmare apariţia fenomenului de osmoză (deplasarea mol. de H2O prin membrană în soluţia proteică).

Deplasarea apei este limitată de presiunea hidrostatică (presiunea coloanei de apă). Presiunea vare trebuie aplicată pentru a opri curentul osmotic se numeşte presiune osmotică.

Presiunea osmotică determinată de proteine – presiune oncotică.

Proprietatea de a forma Proprietatea de a forma gelurigeluri

Proteinele prezintă coloizi liofili, şi deci pot forma geluri.

Moleculele proteinei interacţionează între ele formînd reţele structurale în interiorul cărora se imobilizează apa.

Gelatinizarea are loc mai uşor în sol. pr. fibrilare Formarea de gel se observă la coagularea

sîngelui (formarea reţelei de fibrină).La învechirea gelurilor are loc sinerezisa –

expulzarea apei, datoprită contracţiei mol din reţea şi eliminarea apei.

Formarea gelului depinde Formarea gelului depinde de : de :

concentraţia soluţiei (odată cu creşterea concentraţiei);

temperatură (la scăderea temperaturii);

concentraţia ionilor de hidrogen (în punctul izoelectric se observă o viteză maximă de formare a gelului);

prezenţa electroliţilor (Ionul SO42- contribuie în mod preferat la transformarea solului în gel).

XerogelXerogeleste gelul secat (uscat) - lipsit de apă. se capătă prin secare liofilă a soluţiilor

coloidale Secarea liofilă constă în îndepărtarea apei

în vid din soluţia coloidală îngheţată.se păstrează un timp mai îndelungat ceea

ce prezintă importanţă practică în industria de preparare a medicamentelor de origine proteică.

Ex: deferite proteine (albumina, gama-globulinele şi altele).

Denaturarea proteinelorDenaturarea proteinelor

Sub acțiunea agenților denaturanți are loc distrugerea nivelurilor superioare de organizare ale moleculei proteice (secundar, terţiar, cuaternar) în afară de structura primară cu pierderea proprietăţile fizico-chimice şi biologice ale proteinei.

Agenţii denaturanţiAgenţii denaturanţise împart în fizici şi chimici.1. factorii fizici: temperatura, presiunea,

radiaţiile ultraviolete, radiaţii X.2. factorii chimici : acizi, bazele,

solvenţii organici (eter, cloroform), ureea, detergenţii, metale grele (Pb, Hg), amidele.

Trăsăturile proteinei Trăsăturile proteinei denaturate:denaturate:

◦pierderea activităţii biologice◦micşorarea solubilităţii◦schimbarea formei şi mărimii

moleculelor◦creşterea reactibilităţii unor grupe◦pierderea capacităţii de a se

cristaliza

Substanţele ce pot împedica Substanţele ce pot împedica denaturareadenaturareasoluţii de glucideglicerinaa. graşiPentru a evita denaturarea proteina

se păstrează la rece, în soluţii concentrate de săruri la un pH anumit

Renaturare (renativare)Renaturare (renativare)..

- este restabilirea structurii şi activităţii biologice a proteinei la înlăturarea agentului denaturant.

FOLFING FOLFING ŞI REFOLDINGŞI REFOLDINGFOLDING – aranjarea

spaţială corectă de novo a catenei:

Metodele de studiere a Metodele de studiere a componenţei calitative şi componenţei calitative şi cantitative a proteinelorcantitative a proteinelor

a) hidroliza (ruperea unei legăturin ordinare cu adiţia unei molecule de apă)

b) cromatografie c) electroforeza d) salifiere e) dializa f) gel-filtrare

Cromatografie Cromatografie - este identificarea şi separarea

aminoacizilor.Principiul: Metoda este bazată pe diferenţa

coeficientului de repartiţie a aminoacizilor în apă şi solvent organic (butanol), care nu se amestecă cu apa.

Apa se absoarbe pe hîrtia cromatografică, constituind faza staţionară, iar solventul organic, migrează pe ea. Concomitent cu ultimul se mişcă şi aminoacizii.

Viteza migrării aminoacizilor pe banda cromatografică este direct proporţională cu gradul de solubilitate în butanol.

ElectroforezaElectroforeza -

este metoda de separare a particulelor ce posedă sarcină (proteine) într-un cîmp electric

Direcţia migrării Pr depinde de pH-ul mediului; Pr fiind electroliţi amfoteri — în mediul acid ele posedă sarcină + şi se mişcă spre C, în mediul bazic posedâ sarcină “-”migrează spre A.

.

ElectroforezaElectroforeza -

Separarea Pr din serul sanguin

La pH-ul 8,6 -8,9 în câmpul electric continuu Pr serului posedă sarcina negativă şi vor migra spre A cu o viteză care depinde în aceeaşi măsură de mărimea sarcinii electrice şi de masa moleculară a particulelor. În rezultat se separă Albumine (care agung primele),apoi 1, 2; şi în final -globulinele.

ElectroforezaElectroforeza

SalifiereaSalifierea -

•este metoda de precipitare a P din soluţie la acţiunea c % mari de săruri neutre (sulfatul de amoniu, clorura de sodiu şi al.) •este un proces reversibil. •Mecanismul salifierii se reduce la dehidratare macromoleculelor proteice şi înlăturarea sarcinii electrice.

SALIFIEREA

SalifiereaSalifierea -

Asupra vitezei de precipitare a proteinelor prin salifiere acţionează un şir de factori ca: hidrofilitatea proteinei, masa moleculară, sarcina electrică; de aceea salifiere diferitelor proteine are loc în concentraţii diferite de săruri. De exemplu, albuminele se precipită în soluţie saturată de sulfat de amoniu, pe când globulinele - în soluţie semisaturată

SALIFIEREA

Dializa proteinelorDializa proteinelorDializa – metoda de separare

şi purificare a substanţelor macromoleculare de substanţe micromoleculare cu ajutorul membranelor semipermeabile (celofan, pergament etc.).

Prin porii acestor membrane pot trece numai substanţele micromoleculare, ce au masă moleculară şi dimensiuni mici.

Membrana nu poate fi traversată de proteine şi alte macromolecule.

Dializa proteinelorDializa proteinelor

Gel filtrareGel filtrareSitele moleculare sunt

formate din granule de gel polizaharidic inert hidratat. Granulele posedă pori de diferit diametru.

Micromoleculele cu dimensiuni mici pătrund prin aceşti pori, macromoleculele- nu.

Gel filtrareGel filtrareV migrării micromol. prin

coloană este mai mică decât a macromol. - fapt ce permite purificarea proteinelor de substanţe micromoleculare.

Viteza migrării proteinelor prin coloană este în funcţie de masa şi dimensiunile lor – se mişcă mai repede cele ce au m şi d mai mari.