SKRINING FITOKIMIA

1. Senyawa Tanin dan Polifenolat1 g simplisia diekstraksi dengan akuades panas kemudian didinginkan. Setelah itu ditambahkan 5 tetes NaCl 10% dan disaring. Filtrat yang diperoleh dibagi menjadi 3. Filtrat A sebagai blanko, filtrat B ditambahkan 3 tetes FeCl3 dan filtrat C ditambahkan garam gelatin. Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi.

2. Flavonoid1 g sampel dicuci dengan heksana sampai jernih. Residu dilarutkan dalam 20 ml etanol kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh dibagi menjadi 3 bagian. Filtrat A sebagai blanko, filtrat B ditambahkan HCl pekat dan dipanaskan pada penangas air. Jika terjadi perubahan warna merah tua-ungu menunjukkan hasil yang positif. Pada filtrat C ditambahkan 0,5 ml HCl dan logam Mg kemudian diamati perubahan warna. Warna merah-jingga diberikan oleh senyawa flavon, warna merah tua diberikan oleh flavonol atau flavonon, warna hijau-biru diberikan oleh aglikon atau glikosida.

3. Antrakuinon (Uji Brontrager)1 g simplisia ditambah 10 ml akuades kemudian disaring. Filtrat diekstrak dengan 5 ml benzen. Filtrat A sebagai blanko dan filtrat B ditambahkan 5 ml ammonia kemudian dikocok. Warna merah pada filtrat B menunjukkan hasil positif.

4. Monoterpen dan SeskuiterpenSimplisia digerus dengan eter lalu disaring. Filtrat ditempatkan pada cawan penguap dan dibiarkan menguap sampai kering. Kemudian ditambahkan larutan vanillin 10% dalam asam sulfat pekat. Timbulnya warna-warna menandakan positif senyawa monoterpen dan seskuiterpen.

5. Steroid dan Triterpenoida. Metode Keller-Killani

Simplisia dicuci dengan heksana sampai heksana jernih. Residu dipanaskan di atas penangas air. Kemudian ditambahkan 3 ml pereaksi FeCl3 dan 1 ml H2SO4 pekat. Jika terlihat cincin merah bata menjadi biru atau ungu, maka identifikasi menunjukkan adanya kardenolin (steroid) dan bufadienol (triterpenoid).

b. Metode Lieberman-BuchardSimplisia ditambah 10 ml heksana dan diaduk selama ± 5 menit lalu dibiarkan. Kemudian diuapkan di atas penangas air dan ditambah 0,1 g Na2SO4 anhidrat lalu diaduk. Larutan disaring sehingga diperoleh filtrat. Filtrat A sebagai blanko dan filtrat B ditambahkan 3 tetes pereaksi asam asetat glasial dan H2SO4. Senyawa kardenolin (steroid) dan bufadienol (triterpenoid) akan menunjukkan warna merah sampai ungu.

6. Saponina. Metode Forth

1 g simplisia ditambahkan 10 ml akuades lalu dikocok selama 30 detik. Kemudian diamati perubahan yang terjadi. Apabila terbentuk busa yang mantap (tidak hilang selama 30 detik) maka identifikasi menunjukkan adanya saponin.

b. Uji Penegasan SaponinSampel dibilas dengan heksana sampai filtrat jenih. Residu yang tertinggal ditambahkan kloroform dan diaduk 5 menit. Kemudian ditambah Na2SO4 anhidrat dan disaring. Filtrat A sebagai blanko dan filtrat B ditetesi asetat anhidrat kemudian diaduk perlahan dan ditambah H2SO4 pekat lalu diaduk kembali. Terbentuknya cincin merah sampai coklat menunjukkan adanya saponin.

7. Alkaloida. Uji Alkaloid

1 g simplisia diletakkan dalam cawan poselin kemudian ditambahkan 5 ml HCl 2M dan diaduk lalu dinginkan dalam suhu ruangan. Setelah sampel dingin, ditambahkan 0,5 g NaCl lalu diaduk dan disaring. Fitrat yang diperoleh ditambahkan HCl 2M sebanyak 3 tetes. Filtrat A sebagai blanko, filtrat B ditambah pereaksi Mayer, filtrat C ditambah pereaksi Wagner, dan filtrat D digunakan untuk uji penegasan. Apabila terbentuk endapan putih pada penambahan pereaksi Mayer dan endapan merah-coklat pada penambahan pereaksi Wagner, maka identifikasi menunjukkan adanya alkaloid.

b. Uji Penegasan AlkaloidFiltrat D ditambah ammonia 25% hingga pH 8-9. Kemudian ditambah kloroform dan diuapkan di atas waterbath. Seteah itu ditambah HCl 2M kemudian diaduk dan disaring. Filtrat A sebagai blanko, filtrat B ditambah pereaksi Mayer, dan filtrat C ditambah pereaksi Dragendorff. Terbentuknya endapan menunjukkan adanya alkaloid.

EKSTRAKSI (REFLUKS)Alat refluks yang akan digunakan dibersihkan dengan etanol teknis. Kemudian ke dalam

labu destilasi dimasukkan batu didih. 150 g simplisia dimasukkan ke dalam labu destilasi dan ditambahkan 600 ml pelarut (alkohol). Setelah itu dididihkan campuran di dalam labu selama ± 3 jam kemudian didinginkan. Filtrat disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam wadah penampung.

Kemudian heri berikutnya, 150 g simplisia dimasukkan ke dalam labu destilasi dan ditambahkan 600 ml pelarut (alkohol). Setelah itu dididihkan campuran di dalam labu selama ± 3 jam kemudian didinginkan. Filtrat disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam wadah penampung.

Pada hari ketiga, 150 g simplisia dimasukkan ke dalam labu destilasi dan ditambahkan 450 ml pelarut (alkohol). Setelah itu dididihkan campuran di dalam labu selama ± 3 jam kemudian didinginkan. Filtrat disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam wadah penampung.

PEMANTAUAN EKSTRAK (Kromatografi Lapis Tipis)Chamber disiapkan kemudian ke dalamnya dimasukkan fase gerak/pengembang (etil asetat : n-heksana = 5 : 5). Kemudian dicelupkan kertas saring sampai chamber jenuh. Plat KLT diaktivasi dengan metano 10 ml dan dipanaskan ke dalam oven selama 15 menit (105oC). Kemudian ditotolkan ekstrak kental yang telah dilarutkan ke dalam beberapa ml pelarut sampai diperoleh ekstrak kental yang tidak terlalu encer dan ditotolkan di atas plat KLT GF254 yang sudah diberi batas atas dan bawah dengan menggunakan pipa kapiler. Setelah itu totolan ekstrak dibiarkan mongering sampai pelarut menguap. Plat KLT yang sudah ditotolkan kemudian dimasukkan ke dalam chamber. Fase gerak/pengembang dibiarkan naik sampai batas atas. Setelah terelusi, plat KLT diangkat dan dibiarkan mongering sampai fase gerak/pengembang menguap. Kemudian plat KLT diletakkan di bawah sinar UV λ 254 nm dan 366 nm.

FRAKSINASI1. Ekstraksi Cair-cair

Corong pisah disiapkan dan dibilas dengan etanol teknis dan dikeringkan. 17 g ekstrak kental dilarutkan dalam 100 ml air panas dan 2 ml kloroform kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah. Ke dalam corong pisah ditambah 100 ml n-heksan. Corong pisah ditutup dan dikocok sembari dibuka sesekali untuk mengeluarkan uap. Setelah itu corong pisah disimpan pada klem dan dibiarkan hingga kedua lapisan terpisah dengan jelas. Kemudian lapisan bawah ditampung pada wadah untuk diuapkan.

2. Kromatografi Kolom Klasik3. Kromatografi Cair Vakum

Seperangkat alat KCV disiapkan. Kemudian 5 gram ekstrak kental ditambah sedit pelarut dimasukkan ke dalam mortir dan ditambah serbuk silika gel dengan perbandingan 1:1 lalu gerus hingga homogen. Setelah itu, 60 gram serbuk adsorben dimasukkan ke dalam kolom KCV. Kemudian kertas saring yang sudah dibentuk bulat selebar mulut kolom KVC

dimasukkan di atas serbuk ekstrak. Ke dalam kolom KCV dimasukkan komposisi eluen. Alat vakum dihidupkan dan eluen ditampung pada vial. Setelah semua pelarut habis, alat vakum dimatikan. Lakukan hal yang sama untuk komposisi eluen selanjutnya. Fraksi-fraksi yang diperoleh dipekatkan dan ditimbang untuk dilakukan pemantauan KLT.

UJI KEMURNIAN1. Klt Tunggal

Disiapkan 3 buah chamber dimana chamber pertama berisi eluen n-heksana, chamber kedua berisi etil asetat, dan chamber ketiga berisi methanol sebanyak 10 ml. Kemudian ke dalam chamber dimasukkan kertas saring dan ditunggu hingga chamber jenuh. Plat KLT yang akan digunakan diaktivasi terlebih dahulu. Plat KLT dimasukkan ke dalam methanol, kemudian dimasukkan ke dalam oven selama 15 menit. Setelah 15 menit, plat KLT diambil dan diberi batas atas dan batas bawah 1 cm. Setelah diberi batas, plat KLT ditotolkan dengan larutan kristal. Setelah itu, plat KLT dimasukkan ke dalam chamber dan dibiarkan sampai eluen terelusi. Setelah eluen terelusi sempurna, plat KLT ditunggu hingga kering kemudian dianalisis dengan sinar UV λ 254 nm dan 366 nm. Kemudian, plat KLT disemprot dengan penampak bercak H2SO4.

2. Klt Dua DimensiDisiapkan 2 buah chamber dimana chamber pertama berisi eluen n-heksana : etil asetat = 7 : 2 dan chamber kedua berisi n-heksana : etil asetat = 2 : 7 sebanyak 10 ml. Kemudian ke dalam chamber dimasukkan kertas saring dan ditunggu hingga chamber jenuh. Plat KLT yang akan digunakan diaktivasi terlebih dahulu. Plat KLT dimasukkan ke dalam methanol, kemudian dimasukkan ke dalam oven selama 15 menit. Setelah 15 menit, plat KLT diambil dan diberi batas atas, bawah dan samping 1 cm. . Setelah diberi batas, plat KLT ditotolkan dengan larutan kristal. Setelah itu, plat KLT dimasukkan ke dalam chamber dan dibiarkan sampai eluen terelusi. Setelah eluen terelusi sempurna, plat KLT ditunggu hingga kering kemudian dianalisis dengan sinar UV λ 254 nm dan 366 nm. Kemudian, plat KLT disemprot dengan penampak bercak H2SO4.

3. Spektofotometri UVKuvet yang akan digunakan dibilas terlebih dahulu dengan methanol. Setelah itu dimasukkan larutan kristal yang telah diencerkan dengan methanol ke dalam kuvet. Kemudian dilakukan spektofotometri. Apabila pada spektofotometri menunjukkan garis lurus ke atas, maka perlu dilakukan pengenceran. Setelah terbentuk satu puncak, maka hasil spektofotometri diprint dan dilakukan analisis.