Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Tallinna Reaalkool
Proteiinkinaasi Aurora B jaoks biligandsete inhibiitorite arendamine ning biokeemilise mitte-radioaktiivse inhibeerimismeetodi väljatöötamine
Uurimistöö
Mirel Mesila 11.c
Juhendaja: PhD Darja Lavõgina (TÜ keemia instituut)
Kooli kontaktisik: õp Kersti Veskimets
Tallinn 2017
Sisukord
Kasutatud lühendid ..................................................................................................................... 4
Sissejuhatus ................................................................................................................................ 7
1. Kirjanduse ülevaade ............................................................................................................... 9
1.1. Valkude fosforüülimine ................................................................................................... 9
1.2. Proteiinkinaasid ja nende talitlus ..................................................................................... 9
1.3. Proteiinkinaas Aurora B ................................................................................................ 11
1.3.1. Aurora B aktiveerimine .......................................................................................... 12
1.3.2. Aurora B roll mitoosis ning sellega seotud võimalikud häired .............................. 13
1.4. Aurora A versus Aurora B ............................................................................................. 13
1.5. Inhibiitorid ..................................................................................................................... 14
1.5.1. Mono- ja multisubstraatsed inhibiitorid ................................................................. 15
1.5.2. Biligandsed inhibiitorid .......................................................................................... 15
1.5.3. Aurora B inhibiitorid .............................................................................................. 16
2. Metoodika, aparatuuri ja reagentide kirjeldus ...................................................................... 18
2.1. Fmoc-tahkefaassüntees .................................................................................................. 18
2.2. HPLC ehk kõrgefektiivne vedelikkromatograafia ......................................................... 20
2.3. TLC ehk õhukese kihi kromatograafia .......................................................................... 22
3. Eksperimentaalne osa ........................................................................................................... 24
3.1. Tahkefaassüntees ........................................................................................................... 24
3.2. Biokeemilised katsed ..................................................................................................... 27
4. Tulemuste analüüs ................................................................................................................ 31
4.1. Inhibiitorite disain .......................................................................................................... 31
4.2. Inhibiitorite süntees ning RP-HPLC ja MS ................................................................... 31
4.2.1. Tahkefaassüntees .................................................................................................... 31
3
4.2.2. RP-HPLC ja MS ..................................................................................................... 32
4.3. Biokeemilised katsed ..................................................................................................... 34
4.3.1. Inhibiitorite emalahuste ning vahelahjenduste valmistamine ................................. 34
4.3.2. Fosforüülimisvõime määramine ............................................................................. 34
4.3.3. Katsed inhibiitoritega ............................................................................................. 37
4.4. Võimalikud arengusuunad ............................................................................................. 39
Kokkuvõte ................................................................................................................................ 40
Kasutatud materjalid ................................................................................................................. 42
Lisa 1 Tellitud dervatiseeritud vaigu andmed .......................................................................... 47
Lisa 2 Sünteesitud peptiidi struktuur ........................................................................................ 48
Lisa 3 Kasutatud mõisted ja definitsioonid .............................................................................. 49
Lisa 4 RP-HPLC tulemused ja puhtusesüstid ........................................................................... 50
Lisa 5 Massi-laengu suhte väärtused massispektromeetrias ..................................................... 54
Lisa 6 Fosforüülimisreaktsiooni tulemused TLC plaadil ......................................................... 55
Resümee .................................................................................................................................... 57
Abstract ..................................................................................................................................... 59
Kinnitusleht .............................................................................................................................. 61
Kasutatud lühendid
Lühend Inglisekeelne nimetus Eestikeelne nimetus
ACN acetonitrile atsetoonitriil
ADP adenosine diphosphate adenosiin-5'-difosfaat
Ahx 6-aminohexanic acid 6-aminoheksaanhape
ATP adenosine-5'-triphosphate adenosiin-5'-trifosfaat
Aur Aurora protein kinase family Aurora perekonna proteiinkinaas
Chk1 checkpoint kinase 1 rakutsükli kontrollpunkti kinaas 1
CPC chromosomal passenger
complex
Kromosoomide tsentromeeridel paiknev
valguline kompleks
DCM dichloromethane diklorometaan
DIPEA N,N-diisopropylethylamine N,N-diisopropüületüülamiin
DMF N,N-dimethylformamide N,N-dimetüülformamiid
DMSO dimethylsulfoxide dimetüülsulfoksiid
DTT dithiothreitol ditiotreitool
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid etüleendiamiintetraäädikhape
ESI-MS electrospray ionization mass
spectrometry
elektropihustusionisatsiooni
massispektromeetria
Fmoc 9-fluorenylmethoxycarbonyl 9-fluorenüülmetoksükarbonüülrühm
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-
ethanesulfonic acid
4-(2-hüdroksüetüül)piperasiin-1-
etüülsulfoonhape
HBTU N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-
benzotriazol-1-yl)uronium
hexafluorophosphate
N,N,N’,N’-tetrametüül-O-(1H-
bensotriaso-1-üül)uroonium
heksafluorofosfaat
HOBt 1-hydroksybenzotriazole 1-hüdroksübensotriasool
HPLC high performance liquid
chromatography
kõrgefektiivne vedelikkromatograafia
HSTU N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(N-
succinimidyl)uronium
hexafluorophosphate
N,N,N’,N’-tetrametüül-O-(N-
suktsiinimidüül)uroonium
heksafluorofosfaat
IC50 half maximal inhibitory
concentration
Inhibiitori kontsentratsioon, mille
juures väheneb inhibeeritava ensüümi
aktiivsus katses kasutatud oludes 50%
võrra
ivDde 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-
1-ylidene)-3-methylbutyl
1-(4,4-dimetüül-2,6-dioksotsükloheksa-
1-ülideen)-3-metüülbutüül
Lys lysine lüsiin
MLN8054 4-[[9-chloro-7-(2,6-
difluorophenyl)-5H-pyrimido[5,4-
d][2]benzazepin-2-
yl]amino]benzoic acid
4-[[9-kloro-7-(2,6-difluorofenüül)-5H-
pürimido[5,4-d][2]bensasepiin-2-
üül]amino]bensoehape
MS mass spectrometry massispektromeetria
MQ Milli-Q® deioniseeritud (ultrapuhas) vesi
NMM 4-methylmorpholine 4-metüülmorfoliin
PK protein kinase proteiinkinaas
PKAc catalytic subunit of cAMP-
dependent protein kinase
cAMP-sõltuva proteiinkinaasi
katalüütiline alaühik
RP-HPLC reversed-phase high performance
liquid chromatography
pöördfaasi kõrgefektiivne
vedelikkromatograafia
RNA ribonucleic acid
ribonukleeinhape
SAC spindle assembly checkpoint Käävi mitootiline kontrollpunkt
Ser serine seriin
TAMRA-
kemptiid
Kemptide (LRRASLG) labeled
with 5-
carboxyltetramethylrodamine via
N-terminus
Kemptiid (aminohappeline järjestus
LRRASLG), mille N-terminaal on
märgistatud 5-
karboksüültetrametüülrodamiiniga
TFA trifluoroacetic acid trifluoroetaanhape
Thr threonine treoniin
Tyr tyrosine türosiin
TIPS triisopropylsilane triisopropüülsilaan
TLC thin layer chromatography õhukese kihi kromatograafia
UV-Vis ultraviolet–visible spectroscopy ultravioletse ja nähtava ala
spektroskoopia
Sissejuhatus
Proteiinkinaasid (PK-d) on ensüümid, mis katalüüsivad reaktsioone, kus fosforüülrühm
kantakse üle valgule, muutes nii viimase aktiivsust. See on üks tähtsamaid rakusiseseid
valkude reguleerimise mehhanisme, mis võimaldab ensüümidel kontrollida seal toimuvaid
protsesse, reageerida väliskeskkonna muutustele ja tagada raku normaalne elutegevus.
Proteiinkinaasid teevad koostööd peaaaegu kõikide rakus toimuvate protsesside
koordineerimises: metabolismi ja rakujagunemise regulatsioonis, valkude transkriptsioonis ja
isegi apoptoosi vältel. Paraku on PK-de funktsioneerimishäired (üleekpsresseeritus,
kõrgendatud aktiivsus) või proteiinfosfataaside alatalitlus vahetult seotud mitmete kasvajate,
diabeetide, Alzheimeri tõve ja teiste haigustega. Sellega seoses on proteiinkinaaside uurimine
ja nende aktiivsust blokeerivate ühendite arendamine tõusnud viimase kahe aastakümne
jooksul kiirelt üheks kõige huvipakkuvamaks ravimiarendusobjektiks.
Farmakoloogiliselt potentsiaalse ravimiarendusena nähakse inhibiitoreid – ühendeid, mis
otseselt takistavad fosforüülülekannet. Selleks peaks inhibiitor seostuma PK ATP-, substraadi
ja/või mõne muu saidiga võimalikult selektiivselt ja kõrge efektiivsusega. Käesoleva töö
eesmärk oli leida selline ühend, mis sobib inhibeerima proteiinkinaasi Aurora B. Aurora B on
üks kolmest Aurora perekonda kuuluvast ensüümist, mis kindlustab raku jagunemisprotsessi
käigus erinevate osakomponentide korrapärase töö. Muu hulgas aitab ta kontrollida
kromosoomide kokkupakkimist enne raku jagunemist, parandab mitoosi käigus kääviniitide
kinnitumist tsentromeerile ja osaleb jagunemise viimases etapis tsütokineesis. Aurora B
valgukompleksi üks olulisemaid osafragmente on INCENP – regulaatorvalk, mis muude
ülesannete hulgas ka aktiveerib antud kinaasi. Potentsiaalselt sobivaim arendatav ühend peaks
seega seostuma nii PK ATP-saiti kui ka sellesse taskusse, kuhu muidu seostuks Aurora B
looduslik aktivaator INCENP.
Inhibiitori sünteesiks oli plaanis kasutada TÜ Keemia instituudi meditsiinilise keemia
uurimisrühmas pikaaegset rakendust leidnud tahkefaassünteesi strateegiat. Inhibiitori
biokeemilisi omadusi sooviti iseloomustada optimeerides eelnevalt muude PK-de
8
iseloomustamiseks arendatud mitte-radioaktiivset inhibeerimismeetodit, mis kasutab õhukese
kihi kromatograafia eeliseid.
Uurimistöö on jaotatud neljaks osaks. Teoreetilise aluspõhjana antakse ülevaade valkude
fosforüülimise olulisusest raku signaaliradade loomisel, proteiinkinaaside tööst ja eripäradest
ning inhibiitorite disainist ja tööpõhimõtetest. Ülevaates suunatakse fookus eelkõige antud
uurimistöös käsitletavale PK Aurora B-le: tema ülesannetele rakus,
aktivatsioonimehhanismile ja seni uuritud inhibiitoritele. Töö kirjutamisel ja metoodikate
iseloomustamisel on tuginetud uurimisrühma kogemustele, teemakohastele teaduslikele
publikatsioonidele ja varasematele diplomitöödele. Töö eksperimentaalne osa ja tulemuste
analüüs koosneb inhibiitorite sünteesist ja biokeemilistest katsetest, mis viidi läbi Tartu
Ülikooli Keemia instituudi bioorgaanilise keemia laboris.
Autor tänab eelkõige oma juhendaja PhD Darja Lavõginat, kelle tarvilikud näpunäited,
soovitused ja innustus olid suureks abiks ja motivatsiooniks terve protsessi vältel. Teisena
lähevad tänuavaldused õp Kersti Veskimetsale, kes toetas töö valmimist ja viimast viimistlust
heade nõuannetega ning ilma kelleta ei oleks tekkinud võimalust töötada sellise projekti
kallal. Suur tänu ka Tartu Ülikooli keemia instituudile labori kasutamise ja seal töötamise
kogemuse eest.
9
1. Kirjanduse ülevaade
1.1. Valkude fosforüülimine
Organismide elutegevuse aluseks on võimsad ja spetsiifilised katalüsaatorid: ensüümid.
Ensüümid katalüüsivad peaaegu kõiki biokeemilisi reaktsioone ja on valdavalt valgud
(eranditeks on mõned RNA-ensüümid). Kuni pooltes eukarüootse raku valkudes toimub
mingil ajahetkel fosforüülimisreaktsioon doonormolekulilt aktseptorile. (Lehninger et al.
2005: 191, 574) Fosforüülimiseks nimetatakse valkudele fosforüülrühma (PO32-) ülekandmist.
Reaktsiooni käigus kantakse fosforüülrühm sihtmärkvalgu ehk substraadi Ser, Thr või Tyr
aminohappejääkide külgrühma hüdroksüülrühmale, mis seejärel omandab negatiivse
osalaengu. Fosforüülrühma doonoriks on mõni nukleotiid, tüüpiliselt adenosiin-5’-trifosfaat
ehk ATP. Fosforüülülekanne on biokeemias üks olulisemaid reaktsioone, mille tagajärjel
negatiivse laengu saanud hüdroksüülrühm põhjustab valgu ruumilise struktuuri ehk
konformatsiooni muutust. Sellised ehituslikud muutused põhjustavad omakorda muutusi
valgu aktiivsuses ja võimes osaleda rakusisestes signaaliradades. (Lehninger et al. 2012: 228-
230)
1.2. Proteiinkinaasid ja nende talitlus
Suurt osa raku signaaliradadest reguleerivad erinevad ensüümid, nende hulgas ka 538 seni
kindlaks tehtud inimese PK-i (näiteks AGC-kinaasid, Haspin, Aurora ja NEK perekonnad)
(Manning et al. 2002: 1912-1934). Proteiinkinaasid on ensüümid, mis katalüüsivad
fosforüülekannet ATP-lt aktseptormolekulile. Sidudes oma "taskusse" järjest fosforüüli
doonori ja substraadi, loovad nad sobiva keskkonna fosforüülülekandeks (Wang, Cole 2014:
1-21). Ülekanne toimub 1011 korda kõrgema efektiivsusega kui ilma proteiinkinaasideta
(Adams 2001: 2271-2290). Proteiinkinaas seob esimesena ATP-d (kõrgema kontsentratsiooni
tõttu rakus) ja alles teisena toimub fosforüülülekanne ATP-lt substraadile. Lõpp-produktid –
ADP ja fosforüülitud valk – saavad seejärel PK sidumistaskutelt lahkuda (vt joonis 1).
10
Organismi seisukohalt on äärmiselt oluline, et protsessides valitseks teatav dünaamika – uue
impulsi läbitulekuks peab eelmise lõpetama. Selleks on ka fosforüülrühma eemaldamiseks
valkudelt (defosforüleerimiseks) omad ensüümid. Neid nimetatakse fosfataasideks ning nende
ülesanne on teostada valgu aminohappejäägi hüdroksüülrühmaga seotud fosforüüli hüdrolüüsi
ehk defosforüülimist. (Lehninger 2012: 228-229)
Joonis 1. Proteiinkinaasi katalüütiline tsükkel. Kinaas on joonisel tähistatud kollaste
ovaalidena, nukleosiid sinise kolmnurgana ning selle külge seotud fosforüülid valgete
ringidena.
Kinaaside ja fosfataaside erinevus seisneb ka selles, et fosfataasid püsivad rakus enamasti
püsivalt aktiivsetena ja tagavad sel viisil puhkeolekus rakus valkude madalat
fosforüülitustaset. Kinaaside aktiveerimiseks rakus on aga mitmeid võimalusi:
• väikeste molekulide (nn sekundaarsed virgatsained) või suuremate valkude (nt
tsükliinid) abi;
• fosforüülimine teiste valkude poolt;
• fosforüüli eemaldamine fosfataaside poolt;
• di- või oligomiseerumine;
• osaline proteolüüs jms.
(Lodish et al. 2007)
11
Proteiinkinaas Aurora B kasutab mainitutest enda aktivatsiooniks suuremate valkude abi (nt
INCENP ja Survivin) ning fosforüülimist teiste valkude poolt (nt Ser331 jäägile, mida
katalüüsib Chk1) (Petsalaki et al. 2011: 449-466). Proteiinkinaaside aktiivsust saab vähendada
eeltoodud aktivaatorite mahavõtmisega või inhibiitorite abil (vt peatükk 1.5.).
1.3. Proteiinkinaas Aurora B
Inimese genoom kodeerib kolme Aurora kinaaside perekonda kuuluva liikme järjestust:
Aurora A, Aurora B (vt joonis 2) ja Aurora C. Aurora kinaasid on perekond Ser-/Thr-kinaase,
mille ülesanne on reguleerida raku tööd mitoosi (Aurora A ja Aurora B) ja meioosi (Aurora
C) käigus. Mitoos on raku jagunemise protsess, mille käigus moodustuvad kaks tütarrakku,
mis on geneetiliselt identsed nende emarakuga. Häired mitoosimehhanismis, sh ka
proteiinkinaaside töös, on eelduseks vähirakkude tekkeks. (Goldenson, Crispino 2015: 537-
545)
Joonis 2. Proteiinkinaasi Aurora B kompleks. PK on näidatud rohelisena, INCENPi
fragment helesinisena ning MLN8054 värviliste sfääridena (oranžina tähistatud C, sinisena N,
punasena O, tumerohelisena Cl ning helerohelisena F aatomid).
Koordinaatide allikad: 4AF4 ja 2X81. Protein Data Bank
Aurora B on üks neljast osakomponendist kromosoomidega seostunud valkude kompleksist
(ingl chromosome passenger complex, CPC) (vt joonis 3). Aurora B ülesanne on kontrollida
kogu kompleksi katalüütilist aktiivsust ja tagada eri osade koostöö. Regulaator- ja
sihtmärkvalgud INCENP (ingl Inner Centromere Protein), Survivin ja Borealin, mis
kuuluvad samuti CPC koostisse, vastutavad süsteemi korrektse lokaliseerimise eest rakus.
12
INCENP on kogu kompleksi siduv valk, mille N-terminaalne ots moodustab koos teiste
valkudega kolmeheeliksilise "puntra" ja C-terminaal seob ning aktiveerib Aurora B kinaasi.
Muutused CPC lokalisatsioonis terve mitoositsükli vältel (vt peatükk 1.3.2.) tagavad
substraatide efektiivsema ja ruumiliselt piiratud fosforüülimise. CPC substraatidel on
omakorda tähtis roll kromosoomide kokkupakkimises, ebaõnnestunud kinetohoor-
miktotuubul kinnituste parandamises, mitootilise kontrollpunkti SAC (ingl spindle assembly
checkpoint) aktiveerimises ja tsütokineesis. (Carmena et al. 2012: 789-803)
Joonis 3. CPC kompleks. Sinisega on tähistatud INCENP, rohelisega Borealin, oranžiga
Survivin ja kollasega Aurora B.
Allikas: Carmena et al. (2012) Nature Review Molecular Cell Biology
1.3.1. Aurora B aktiveerimine
Aurora B aktivatsioon toimub mitmeetapilise ja üsna keeruka sündmuste jadana. Kõigepealt
seostub Aurora B-ga valgu INCENP üks osa (nn IN-BOX, mis asub INCENPi C-terminaalses
osas). Selle seostumisega kaasneb Aurora B katalüütilise aktiivsuse mõningane tõus.
Saavutatud aktiivsuse arvelt saab Aurora B edasi fosforüülida nii INCENPi C-terminaali kui
ka teise, lähedal paikneva Aurora B molekuli aktivatsiooniaasa (osa kinaasimolekulist, mis
tavaolekus seostub kinaasi katalüütilise "keskusega" ning blokeerib seega ensümaatilist
aktiivsust). Sel viisil tagatakse Aurora B maksimaalne aktivatsioon. Seega toimib põhimõte,
kus kinaasimolekul peab esmalt leidma rakus sobiva asukoha (tagatakse ühelt poolt INCENPi
seostumise kromatiiniga ning teiselt poolt INCENPi seostumise Aurora B-ga), mille
tagajärjena tõuseb kinaasi lokaalne kontsentratsioon ja kinaasimolekulide hulk ühes
13
lokatsioonis saab hakata oma ülesandeid täitma. (Carmena et al. 2012: 789-803)
Aurora B aktiivsust reguleerivad ka teised kinaasid (nt TLK-1, Chk1). Inimese rakus paikneva
PK täielikku aktiveerimist soodustab ka PK Chk1 (ingl Checkpoint kinase 1) ja valgu
Survivin fosforüülimine. Viimast viib läbi PK PLK1 (ingl polo-like kinase 1). (Petsalaki et al
2011: 449-466; Grossman 2001: 635-640)
1.3.2. Aurora B roll mitoosis ning sellega seotud võimalikud häired
Valgukompleks CPC paikneb mitoosi metafaasi käigus kromosoomi tsentromeeril. Selles
faasis fosforüülib Aurora B mitut substraati kinetohooridel (ingl kinetochore), mis parandavad
kinetohooride ja mikrotuubulite omavahelisel kinnitumisel tehtud vead. (Carmena et al. 2012:
789-803) Vigadeta kromosoomipaaride lahknemine hoiab ära soovimatud muutused
kromosoomide arvus. Kahekordistunud kromosoomid tuleb kinnitada käävile (ingl spindle;
mitotic spindle) bipolaarselt ja tagada, et lahknemine ei algaks enne selle faasi lõppu. Seega
tuleb pidurdada raku jagunemist kuni kõik tütarkromatiidid on korrektselt kinnitunud ja
tekkinud eksimused parandatud. (van der Waal et al. 2012: 1408)
Tsütokineesi (tsütoplasma jagunemine telofaasi lõpus) ajaks liigub CPC raku vahekehasse
(ingl midbody) (Adams et al. 2000: 1075-1078; Terada 2001: 653-657). Viimane on eriti
oluline: ilma selleta ei jagune tütarrakud teineteisest korrektselt ning jäävad seetõttu omavahel
tsütoplasmast ühendatuks. See võib omakorda põhjustada polüploidsust ehk
kromosoomikomplektide paljusust rakus. (Goldenson, Crispino 2015: 537-545)
Aurora B üleekspresseeritust on seostatud mitmete kasvajate ja vähkrakkude tekkega, sest on
vahetult seotud kromosoomide ebaühtlase jagunemisega mitoosi käigus. Siiski pole ainsana
ohtlik aktiivse Aurora B üleekspresseeritus – sama ohtlik võib olla ka tema üleküllus
mitteaktiivses olekus. CPC aktiveerijana ja lokaliseerijana tagab ta kogu kompleksi jõudmise
rakujagunemise tsütokineesi etappi. Kui seda ei juhtu, jäävad tütarrakud tsütoplasmat pidi
ühendatuks ning tekib polüploidne rakk. (Terada 2001: 653-657)
1.4. Aurora A versus Aurora B
Kõik kolm Aurora perekonda kuuluvat proteiinkinaasi on aminohappeliselt järjestuselt väga
sarnased. Eksperimentaalselt on koguni täheldatud, et vaid üksainus aminohappeline
muudatus Aurora A järjestuses (Gly198Asn) võib anda talle Aurora B funktsionaalsed
14
omadused. (Fu et al. 2009: 6939-6944; Hans et al. 2009: 3491-3502) Seepärast kasutatakse
Aurora perekonna kinaaside detailsetes uuringutes kontroll-kinaasidena sageli sama
perekonna esindajaid.
Aurora A seostub rakus tsentrosoomiga ja tagab raku valmiduse mitoosi alustamiseks; eriti
tähtis on tema osa tsentrosoomide eraldumisel ja kääviniitide moodustamisel. Metafaasis
seostub Aurora A käävi mikrotuubulitele valgu TPX2 abil, mis käitub nii PK-i aktivaatori kui
ka substraadina. (Marumoto et al. 2005: 42) Sarnaselt Aurora A-le nõuab Aurora B
aktiveerimine tema nn aktivatsiooniaasa (ingl T-loop) autofosforüülimist (Ma, Poon 2011:
18). Seda aitavad teostada CPC kompleksi liikmed, sh INCENP. Vaatamata asjaolule, et
Aurora A ja Aurora B paiknevad erinevatel käävi poolustel, aktiveeritakse erinevate
mehhanismide poolt ja koostööd tehakse erinevate valkudega, on nende kokkupuude käävi
mikrotuubulitel paratamatu ja lausa hädavajalik raku jagunemisprotsessi õnnestumiseks.
Antud töösse valiti eksperimentaalsete katsete jaoks Aurora A, millele on ka viimastel
aastakümnetel tehtud uuringutes leitud palju potentsiaalseid ja kõrge selektiivsusega
inhibiitoreid, mis sobituksid mõlemale PK-le. Töös kasutatud MLN8054 (vt joonis 5; IC50 = 4
nM Aurora A suhtes) inhibeerib PK Aurora A-d 40 korda kõrgema selektiivsusega kui Aurora
B-d (Manifredi et al. 2007: 4106-4111). Seetõttu on inhibiitor heaks võrdlustasandiks
arendatava inhibiitori omadustele ja selektiivsusele.
1.5. Inhibiitorid
Proteiinkinaaside tegevus raku signaaliradadel (sh raku kasvamises, paljunemises ja
hävimises) on ülioluline rakkude normaalseks elutööks ja loomulikult on igasugused
kõrvalekalded aluseks paljudele tõsistele haigustele. Nii ravimitööstuses kui teadusasutustes
on fookusesse tõusnud selliste inhibiitorite arendamine, mis pidurdaksid PK-de toimet
olukorras, kus viimased on kas üleekspresseeritud või anomaalselt kõrgendatud aktiivsusega.
Inhibiitor on aine, mis seostub sihtmolekuliga ja pidurdab keemilist reaktsiooni või muudab
selle võimatuks. (Roskoski Jr. 2015: 1-23)
Praeguseks on enamik väljatöötatud inhibiitoreid ATP-konkurentsed (st inhibiitor "võistleb"
ATP-ga sidumiskoha pärast), mille eeliseks on hea afiinsus ja tänu ATP-sidumissaitidele ka
selektiivsuselement (Cohen 2002: 309-315). ATP-d (ja teisi nukleosiidtrifosfaate) seovad aga
kõik 538 PK-d ja veel mitmed muud valgud. Seega pole sugugi välistatud, et ATP-d
15
jäljendavad molekulid võivad siiski seostuda mõne teise valguga. (Adachi et al. 2014: 5461-
5470; Chauhan et al. 2009)
1.5.1. Mono- ja multisubstraatsed inhibiitorid
Inhibiitori disainimisel tuleb jälgida kahte olulist tegurit – efektiivsus ja selektiivsus.
Ravimitööstuse suureks väljakutseks on sellise ravimi välja töötamine, mis mõjuks haigust
põhjustavale tegurile, kuid oleks samal ajal ohutu seda manustavale elusorganismile ja
osavõtmatu temas toimuvates protsessides. Loomulikult on olulised ka ravimikandidaadi
muud omadused, sh bioloogiline stabiilsus ning võime oma sihtmärk-valku õiges kohas „üles
leida“. (Swinney 2004: 801-808)
Kui ATP-saiti suunatud inhibiitorite puhul on põhiliseks riskiks võimalik vähene selektiivsus,
siis vaid substraadisaidile seostuvad inhibiitorid on sageli väheefektiivsed. Nimelt, on
substraadisait väga avatud solvendile, mistõttu inhibiitoril on raske luua piisavalt palju
efektiivseid vastasmõjusid selle konkreetse taskuga. Samuti nõuab kõrgema efektiivsuse
saavutamine seda, et inhibiitor sisaldaks võtmejääke, mida soovitud kinaas ära tunneb.
Näiteks basofiilsed kinaasid (nagu Aurora perekondki) fosforüülivad sellseid substraate,
millel fosforüülitava Ser/Thr/Tyr ümber paiknevad positiivselt laetud aminohappejäägid (nt
Arg või Lys). Ühe perekonna kinaasidel kipuvad aga olema sarnased peptiidsubstraadi
sidumissaidi funktsionaalrühmad, mis võtmejääke ära tunnevad. Taoliste probleemide
ennetamiseks pakuti 1972. aastal välja uus meetod – bisubstraatsete inhibiitorite disain ja
süntees. (Lavõgina et al. 2010: 23-34)
1.5.2. Biligandsed inhibiitorid
Teades, et PK-l on kaks kinaasitaskut, millest ühega seostub ATP ja teisega valgusubstraat, on
sobivaks just sellised inhibiitorid, mis seostuksid kinaasi mõlema taskuga. Bisubstraatsete
inhibiitorite disainis on ühendatud kahe substraadi (PK puhul ATP ja fosforüleeritava
peptiidi) struktuursed elemendid, mis on omavahel seotud sobiva linkeriga. Linkeri pikkus,
jäikus, keemiline struktuur jt parameetrid võimaldavad suurendada arendatava ühendi
selektiivsust. (Lavõgina et al. 2010: 23-34)
Bisubstraatse inhibiitori peamiseks eeliseks on entroopiafaktor – ühe molekuli sidumine on
lihtsam ja kasulikum kui kahe substraadi "tabamine". Samuti on taolise inhibiitori sünergism
16
eksperimentaalselt määratav: tema sidumisenergia on suurem vastavate üksikute
komponentide sidumisenergiate summast. Bisubstraatse inhibiitori kasuks räägib ka
tõenäosusteooria. PK ühe substraadi (ATP) sidumisel suureneb teise kinaasitasku
(fosfaataktseptori) juures teise substraadi kontsentratsioon ja inhibiitori sidumine toimub
kiiremini. (Lavõgina et al. 2010: 23-34)
Joonis 4. PK-ga seostunud biligandne inhibiitor. A, proteiinkinaasi kompleks nukleotiidi
analoogi ja substraatvalguga (PDB 4OUC); jooned tähistavad proteiinkinaasi, suuremad
sfäärid – fosforüülrühma doonorit (vasakul) ning aktseptorit (paremal). B, sama
proteiinkinaasi kompleks bisubstraatse inhibiitoriga; jooned tähistavad proteiinkinaasi,
suuremad sfäärid – inhibiitorit (PDB 5HTB).
Allikas: Lavõgina et al. (2010) Tartu Ülikooli meditsiinilise biokeemia rühma publikatsioon
Biligandse inhibiitori võib disainida aga nii, et üks inhibiitori osa seostub PK ATP-taskuga,
teine inhibiitori osa aga hoopis muu saidiga (st mitte substraatvalgu sidumissaidiga) (vt joonis
4). Näiteks võib olla teise saidi puhul tegemist taskuga, kuhu muidu seostuks valk, mis
vastutab kinaasi lokaliseerimise eest. Kuna see tasku on enamasti ka "unikaalsem" kui ATP-
tasku, on lootust kokkuvõttes disainida ühend, mis oleks eriti selektiivne. Sellise biligandse
inhibiitori disain oli ka antud töö eesmärk.
1.5.3. Aurora B inhibiitorid
Aurora B uurimine hoogustus, kui avastati, et kinaas on üleekspresseeritud ägedat lümfoidset
leukeemiat, ägedat müeloidset leukeemiat ja kroonilist lümfoidset leukeemiat põdevate
patsientide rakkudes (Goldenson, Crispino 2015: 537-545). AZD1152 on enim testitud
Aurora B inhibiitor (vt joonis 5A). Uuringud on näidanud, et AZD1152 kasutamine AML
vähirakkude ravis aitab vähendada nende vohamist ning kiirendab rakusurma. (Walsby et al.
17
2008: 662-669; Hartsink-Segers et al. 2013: 560-568) Kuigi ravim on osutunud nii mõneski
kliinilises katses edukaks, säilib riskifaktor, et ravi käigus "rünnatakse" terveid ka rakke (Oke
et al. 2009: 4150-4158).
Käeolevas töös kasutati Aurora B inhibiitorina MLN8054 (vt joonis 5B), kuna see on
sünteetiliselt kergesti derivatiseeritav ning omab piisavalt head afiinsust Aurora B suhtes.
MLN8054 võimet inhibeerida Aurora A-d loodeti vähendada, kasutades MLN8054
konjugeerimist INCENPi fragmendiga, mis peaks suurendama saadud biligandse inhibiitori
selektiivsust Aurora B suhtes.
Nii AZD1152 kui MLN8054 seostuvad Aurora B ATP-sidumissaidiga. Bisubstraatseid või
biligandseid inhibiitoreid pole Aurora B jaoks teadaolevalt varem arendatud.
Joonis 5. AZD1152 (A) ja MLN8054 (B) struktuurid
Allikas: MLN8054 ja Barasertib (AZD1152-HQPA). Selleckchem kodulehekülg
A B
18
2. Metoodika, aparatuuri ja reagentide kirjeldus
2.1. Fmoc-tahkefaassüntees
Tahkefaassünteesi (ingl solid phase peptide synthesis, SPPS) rajajaks on ameerika biokeemik
Robert Bruce Merrifield, kes avaldas 1969. aastal ajakirjas Journal of the American Chemical
Society samateemalise artikli ning pälvis 1984. aastal selle eest ka Nobeli keemiaauhinna.
Tänapäeval on tahkefaassüntees laboris peamine meetod peptiidide sünteesiks. (Chan, White
2000: 1)
Tahkefaassünteesis sünteesitakse peptiid tahkel kandjal, mille funktsionaalrühmad on
reaktsioonitsentriteks. Tahke kandjana (ingl resin) kasutatakse üldjuhul polüstüreeni, millesse
on divinüülbenseeni abil (tavaliselt 1-2 % massi järgi) tekitatud ristsidemed. Polümeeritera
külge kinnitatakse teatud hulk funktsionaalrühmi, mis on tulevase peptiidsünteesi
reaktsioonitsentriteks; tsentrite arv vaigu pinnal (ingl loading, tavaliselt väljendatuna
milliekvivalentides vaigu massiühiku kohta) peab olema optimaalne, et leida kompromiss
soovitava vaiguhulga väiksuse ja kasvavate peptiidahelate steeriliste nõudmiste vahel. (Chan,
White 2000: 26)
Üldiselt toimub süntees aminohappeahela karbonüülrühmast (C-terminaalist) aminorühma
(N-terminaali) suunas ning kasvav järjestus on üht otsa pidi (tavaliselt C-terminaali kaudu)
seotud tahke kandjaga, mistõttu pole tarvis C-terminaali kaitsta (vt joonis 6). Peptiidi
ülesehitus toimub astmeliselt, st tahkele kandjale kinnitatakse korraga vaid üks aminohape.
Lisatava aminohappe N-terminaal kaitstakse ajutiselt lämmastiku vaba elektronpaari
delokaliseerimiseks – nii ei saa aminorühm kuni kaitsva rühma mahavõtmiseni
reaktsioonidest osa võtta. Sünteesi käigus kaetakse ka aminohapete kõrvalahelad püsivate
kaitserühmadega. See on eeskätt oluline funktsionaalrühmade katmiseks, mis esinevad ka
põhiahelas ja võtavad reaktsioonidest osa (karboksüül- ja aminorühmad). Kaitserühmade
valik tuleb aga langetada ortogonaalsuse alusel, st kaitseid peab olema võimalik eemaldada
19
erinevates tingimustes. Nii ei ole peptiidahela kasvatamisel muret, et võetakse maha vale
kaitserühm või toimub reaktsioon mõne kõrvalrühmaga.
Joonis 6. Fmoc-tahkefaassünteesi skeem. X-ga on tähistatud N-terminaalse aminorühma
kaitserühm, Y-ga kõrvalahela kaitserühm ja A-ga karboksüülrühma aktiveeriv rühm. Hall ring
on vaik, mille külge on kinnitatud linker.
Enne ahela järgmise aminohappe lisamist eemaldatakse põhiahela eelmiselt aminohappelt
ajutine kaitserühm (tavaliselt 20% piperidiini lahus DMF-s). Seejärel saab toimuda
atsüülimisreaktsioon vabastatud aminohappe aminorühma ning uue, ülehulgas oleva
aminohappe karboksüülrühma vahel, mille tulemusel moodustub kahe aminohappe vahel
peptiidside. Liitumine (ingl coupling reaction) toimub aktiveeritud estri moodustamise või
reaktsiooni abistavate reagentide kasutamisega. Antud töös kasutati karboksüülrühma
aktiveerimiseks ja peptiidsideme moodustumiseks reagentidena HOBt-i ja HBTU-d või
HSTU-d. See aitab aktiveerida liidetava aminohappe karboksüülrühma, mis tagab rühma
suurema keemilise aktiivsuse ja kindlustab peptiidsideme moodustumise. Peale liitumist
eemaldatakse üleliigsed reagendid jm kõrvalsaadused filtreerimise abil, resin pestakse üle
DMF-ga ning viimasena liidetud aminohappelt eemaldatakse kaitserühm. Protseduur kordub
kuni soovitud peptiidahela valmimiseni. (Chan, White 2000: 9, 11, 26)
20
Käesolevas töös kasutati sünteesiks Fmoc-kaitserühmal põhinevat meetodit (ingl Fmoc solid
phase peptide synthesis, Fmoc-SPPS). See tähendab, et aminohapete N-terminaal on
tüüpiliselt kaitstud Fmoc kaitserühmaga. Fmoc-i meetod on ortogonaalne kahel viisil:
aminohapete ja nende kõrvalrühmade kaitserühmade eemaldamine ning peptiidi lõplik
mahavõtmine (ingl cleavage) teostatakse erinevatel tingimustel. Fmoc-i eemaldamiseks
kasutatakse tavaliselt nõrgalt aluselist 20% piperidiini lahust DMF-s. Lõplik peptiid ja enamik
kõrvalahelate kaitserühmadest eemaldatakse tahke kandja küljest aga happelise 95% TFA
lahusega. (Chan, White 2000: 11)
Tahkefaassünteesi eelisteks on selle tõhusus, universaalsus, kõrge saagis (korralikul
teostamisel 99.5% või rohkem ühe atsüülimise kohta) ja hõlbus puhastamine etappide
vahepeal (üksnes filtreerimine). Täiendavalt on võimalik kasutada erinevaid analüütilisi
meetodeid, kuigi kasvava peptiidi ahela kontrollimine sünteesi käigus on siiski veel piiratud.
Lihtsas sünteesis kasutatakse tihti värviteste funktionaalrühmade olemasolu või puudumist.
Käesolevas töös olid nendeks Kaiser-test (kvalitatiivne), mis näitab vabade aminorühmade
olemasolu (vt peatükk 3.1.1.), ja Fmoc-test (kvantitatiivne) (vt peatükk 3.1.2.). Fmoc-testis
kogutakse vaigult lahus, mis tekib pärast Fmoc-rühma eemaldamist; kaitserühma
mahavõtmisel tekib produkt, millel on talle iseloomulik neeldumine UV-alas (Chan, White
2000: 27). Fmoc-SPPS meetodi muudeks puudusteks on suur reagentide kulu (kasutatakse
3...10-kordset reagentide ülehulka vaigu loadingu suhtes), probleemid vaigu kandevõime ja
pundumisega.
2.2. HPLC ehk kõrgefektiivne vedelikkromatograafia
Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia ehk kõrgsurvevedelikkromatograafia (ingl high
pressure liquid chromatography/high performance liquid chromatography, HPLC) on
meetod, mida kasutatakse segude (sh väikeste molekulide, peptiidide ja nukleotiidide)
komponentideks lahutamiseks, tuvastamiseks ja nende kontsentratsioonide määramiseks
lahuses. Segu komponendid jaotuvad vastavalt polaarsusomadustele kahe faasi vahel:
liikumatu ehk statsionaarse ja liikuva ehk mobiilse. (Hitatchi 2014)
Proov sisestatakse kromatograafi dosaatori kaudu (vt joonis 7). Liikuv faas ehk eluent
paikneb mahutis ning liigub koos sisestatud prooviga läbi süsteemi pumba toimel. Pump
võimaldab eluendil liikuda läbi süsteemi ühtlasel voolukiirusel. Kõrge rõhk aitab eluenti
suruda läbi tihedalt pakitud kolonni – ainult gravitatsioon sellega toime ei tuleks. HPLC
21
muudab võrreldes teiste kromatograafia meetoditega kordades efektiivsemaks peeneteraline
kolonni täidis – nii saab toimuda rohkem komponentide üleminekuid statsionaarse ja mobiilse
faasi vahel lahutatavas segus. (Kromatograafia 2015)
Joonis 7. HPLC süsteem
Allikas: HPLC Basic Course. Hitatchi High-Technologies Corporation
Antud töös kasutatud pööratud faasi kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (ingl reversed-
phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) poorse täidisega kolonn on
mittepolaarne ning läbi selle liikuv mobiilne faas polaarne. Sel viisil on võimalik segu
lahutamine hüdrofoobsuse ja hüdrofiilsuse alusel, sest hüdrofiilsed osad jäävad eelistatult
eluenti ning läbivad kolonni kiiremini. Hüdrofoobsed molekulid seevastu kinnituvad kolonni
pinnal olevale poorsele kihile, mis koosneb pikkade alküülahelatega (C18) derivatiseeritud
ränidioksiidi osakestest. Liikuva faasina kasutati vee ja atsetonitriili (metüültsüaniidi,
CH3CN) segu. (Katz 1997: 13, 105)
Segu komponentide tuvastamiseks on kasutusel mitmed erinevad detektorid:
ultraviolettkiirgust mõõtev detektor ehk UV-detektor, elektrokeemiline detektor,
fluorestsentsdetektor, massispektromeetriline detektor (MS) jt. (Hitatchi 2014)
Dioodrividetektor (ingl diode array detector, DAD) on olemuselt ultraviolett- ja nähtava
valguse spektrofotomeeter. Detektor valgustab jooksvalt kolonnist väljuvaid proovi
komponente UV- ja nähtava kiirgusega ning registreerib samas komponentide
neeldumisspektrid. Selline tehnoloogia võimaldab HPLC süsteemis eraldunud aineid
identifitseerida ainele iseloomuliku neeldumisspektri alusel (iga aine neelab valgust kindlate
lainepikkusete vahemikus). Seejärel kujutatakse töödeldud andmed detektoriga ühendatud
arvutis graafikuna – kromatogrammina. Kromatogrammis vastab igale proovis esinenud
ainele piik, mis on iseloomulik just selle komponendi neelduvusele. Kui komponent läbib
22
detektorit, saadab viimane arvutisse signaali, millest tekib kromatogrammile piik. Mida
kõrgem on piik, seda kõrgem on aine kontsentratsioon lahuses. Seega on võimalik süsteemist
väljuvate ainete kogumine, kui on teada nende neeldumisspekter. (Hitatchi: 2014)
Vedelikkromatograafi MS detektoritest levinuim on elektropihustus-ionisatsioon (ingl
electrospray ionization, ESI). Massispektromeetria lähtub ainete määramisel nende
molekulidest või aatomitest tekitatud erineva massi ja laengu suhte (m/z) ioonide erinevast
liikumisest elektromagnetväljas. Spektomeeter registreerib ainult laetud osakesi ja jätab
neutraalsed fragmendid detekteerimata. ESI meetodil tekivad ioonid vahetult lahuses
elektrivälja toimel. HPLC kolonni väljundis pihustatakse gaas, mis tagab protoneerunud
osakeste tekke ja aurustumise. Edasi suunab elektriväli ioonid massispektromeetrisse ja jäägid
eraldatakse. ESI eripäraks on molekulide õrn käsitlus, mistõttu tekkinud kõrge energiaga
ioonid ei tekita fragmente, vaid pigem liituvad mitmelaengulisteks ioonideks või
liitioonideks. (Massispektromeetria: 2016)
Antud töös kasutatigi dioodrividetektorit (UV-detekror) ning segu esialgsel analüüsil ka ESI-
MS detektorit.
2.3. TLC ehk õhukese kihi kromatograafia
Õhukese kihi kromatograafia ehk planaarkromatograafia (ingl thin layer chromatography,
TLC) on üks kiiremaid jaotuskromatograafia meetodeid, mis võimaldab komponentide
tuvastamise ka väikese segu koguse või tugevasti lahjendatud proovi korral. Lisaks on tegu ka
küllaltki odava meetodiga. (Kromatograafia 2015)
Segude eraldamiseks kasutatakse statsionaarse faasina õhukese poorse aine (silikageel,
alumiiniumoksiid vms) kihiga metall- või klaasplaati ja mobiilse faasina voolutit (ehk
eluenti), mis liigub plaadil kapillaarjõudude toimel. Proov kantakse väikeste täpikestena
plaadi alaserva nn startijoonele, sageli koos posiitivse kontrolliga aine(te)st, mille sisaldust
segus kontrollida soovitakse. Plaat asetatakse voolutusanumasse, mille põhjas asub vooluti.
Kapillaarjõudude toimel hakkab uuritav proov mööda plaadi poorset kihti üles liikuma,
komponentide lahutumine toimub sõltuvalt ainete afiinsusest statsionaarse faasi suhtes. Mida
suurem on afiinsus, seda aeglasem on ka aine liikumiskiirus. Nii jäävad lahutunud ained
erinevatele kaugustele stardijoonest. (Kromatograafia 2015)
23
TLC meetodiga käib kaasas analüüsitavate ainete visualiseerimine või detekteerimine, sest
sageli on ained värvitud, mistõttu pole neid plaadil näha. Ilmutamiseks kasutatakse sobivaid
kemikaalide lahuseid, mis annavad ainetega reageerides värvilisi ühendeid, või
ultraviolettkiirgust. (Kromatograafia 2015)
Antud uurimuses kasutati analüüsitavate ainete lahutumise jälgimiseks
fluorestsentsmärgistusega markerit (TAMRA-kemptiid), mida oli võimalik visualiseerida
fluorestsentsskanneriga (vt lisa 6). Paralleelselt inhibiitorite arendamisega on viimastel
aastatel ühe enam katsetatud ka uusi lähenemisviise fluoromeetriliste meetoditega. Oma
paindlikuse ja kiiruse tõttu pakuvad nad konkurentsi radioaktiivsust kasutavatele
protseduuridele, millega töötamisel kaasnevad nii isiklikud riskid, keskkonnaprobleemid kui
ka suur radioaktiivsete jäätmete hulk. TLC-l ja fluorestsentsskanneril põhinev analüüs
võimaldab samaaegselt jälgida paljusid reaktsioone ega kasuta seejuures radioaktiivsust. (Viht
et al. 2005: 165)
Joonis 8. TLC meetod
Allikas: Thin Layer Chromatography. University of Leeds
24
3. Eksperimentaalne osa
Käesoleva uurimuse raames läbiviidud katsed korraldati kahes osas: peptiidi süntees tahkel
faasil ja biokeemilised katsed. Tahkefaassüntees teostati paralleelkatsena, kus ühes
katseanumas lisati kasvatatavale peptiidijärjestusele L-lüsiin ja teisele D-lüsiin. Eelnevad ning
järgnevad etapid olid mõlema sünteesi puhul identsed. Valminud peptiid koosnes kolmest
osast: INCENP valgu järjestust jäljendavast lõigust, ATP-d jäljendavast lõigust ning neid
ühendavast linkerist. Kõik sünteesi etapid teostati toatemperatuuril.
3.1. Tahkefaassüntees
Kommertsiaalse teenusena sünteesitud derivatiseeritud vaik (ingl resin) (vt lisa 1) asetati
üleöö lahustisse punduma. Pundumise tulemusena absorbeerub osa lahustist resin'i
molekulide vahele, võimaldades edasise sünteesi käigus lisatavate ainete osakestel paremini
vaigu reaktiivtsentrite juurde pääseda. Fmoc-kaitserühma eemaldamiseks peptiidi N-
terminaalilt pesti kandjat esmalt DMF lahusega ja seejärel võeti N-terminaalne Fmoc maha
20% piperidiinilahusega DMF-s. Regulaarselt järgnes viiekordne pesemisprotseduur DMF
lahuses pärast iga atsüülimist või kaitserühma eemaldamisetappi (vt joonis 6). Mahavõtmise
täielikkust jälgiti Kaiser testi abil, mis võimaldab vaheetappides kontrollida vabade
aminorühmade olemasolu reaktsioonisegus.
D- ja L-lüsiini kaitserühmadega ivDde ja Fmoc (3 ekv vaigu loadingu ehk tsentrite arvu vaigu
pinnal suhtes) aktiveerimiseks kasutati HOBt (2,9 ekv), HBTU (2,9 ekv) ja NMM (9 ekv)
segu. Lüsiini karboksüülrühma aktiveerimise tulemusena moodustub aktiivne ester, mille
elektrofiilne tsenter on karbonüülrühma süsinik. Nii on eelmise aminohappe vabal
aminorühmal võimalik seda rünnata. Pärast 3 min inkubeerimist pipeteeriti ester vaigule, et
moodustuks peptiidside.
Lüsiini Fmoc-kaitserühma mahavõtmisele järgnes peptiidi peaahela lõpetamine. Selleks seoti
lüsiini vaba aminorühm etaanhappe anhüdriidiga (20 ekv). Vaigule lisati tekkiva happe
neutraliseerimiseks aluselist DIPEA-d (20 ekv). Järgnes inkubeermine 2,5 h.
25
Järgmise etapina teostati ivDde-rühma selektiivne mahavõtmine, võimaldamaks sünteesitava
ahela edasist jätkamist D- või L-lüsiini külgahela kaudu. Kuna uurimisrühmas puudus
eelnevalt optimeeritud metoodika hüdrasiiniga töötlemise ajalise pikkuse kohta, jälgiti ivDde-
rühma eemaldamist vaigult spektrofotomeetriliselt (ε301=7000 M-1cm-1 ). Vastavalt Beer-
Lambert’i seadusele peab eemaldatud ivDde maksimaalne neelduvus olema 8,7
(A=ε·l·c=15000M−1cm−1·0,1cm·5,8·10-3M=8,7) eeldusel, et ivDde hulk on võrdne resin'i
loading'uga. Kokku kasutati 5 ml lahust. 15 minuti möödudes koguti loksutilt 10% N2H4
lahus DMF-s. Kuna ivDde hulk selles oli endiselt liiga kõrge, osutus lahus mõõtmiseks
ebasobivaks ning aine UV-spektri piiki polnud võimalik graafikult välja lugeda, sest
neelduvus ületas graafiku maksimaalse skaalanäidu. Kuna UV-spektromeeter näitab
neelduvust vaid 1 AU piires, lahjendati 15 minutit loksunud lahust DMF-ga 10-kordselt, et
võimaldada graafikult kaitserühma neelduvuse jälgimine. Lahjendatud proov oli nähtav 300
nm juures ning arvutuste kohaselt sai selleks ajaks eemaldatud 50% maksimaalsest ivDde
hulgast. Hiljem teostatud proov 30 min inkubeerunud lahusega näitas neelduvuse alanemist
ligi kaks korda võrreldes eelmise mõõtmistulemusega, st ivDde hulk lahuses oli vähenenud ja
30 minutiga õnnestus eemaldada kokku 75% maksimaalsest ivDde hulgast.
Kõrvalahelale lisati Fmoc aminoheksaanhappe (3 ekv), HOBt (2,9 ekv), HBTU (2,9 ekv) ja
NMM (9 ekv) segu abil. Järgnes inkubatsioon üleöö.
Nukleosiidse fragmendina lisati peptiidile MLN8054 (0,5 ekv resin'i suhtes). MLN8054
kalliduse tõttu otsustati seda kokku hoida ja viimases etapis lisada vähem. Lisareagentidena
kasutati HSTU-d (1,2 ekv MLN8054 suhtes) ja DIPEA-d (5 ekv MLN8054 suhtes) ning
inkubeeriti üleöö (reaktsiooniaeg üle 12 h).
Produkti mahavõtmisele (ingl cleavage) tahkelt kandjalt eelnes pesu kolme solvendiga: DMF
(5 korda), isopropanool (5 korda) ja DCM (5 korda). Produktiga vaiku kuivatati vaakumis 1 h.
Produkti mahavõtmiseks resin'ilt ja ühtlasi happetundlike kaitserühmade eemaldamiseks
kasutati TFA, TIPS ja H2O segu (90/5/5, v/v/v). Lahus koguti vaigu kohalt kolbi, roteeriti
vaakumis ning lisati destilleeritud vett. Lahust roteeriti uuesti kuivamiseni.
Produkt puhastati kasutades RP-HPLC meetodit, fraktsioone kontrolliti mass-
spektromeetriga. Peptiidid lahustati esmalt vees ja dietüüleetris ning seejärel sisestati süsteemi
5 µL (ARC-3523) või 2 µL (ARC-3524) kaupa. Peptiidide analüüsis kasutatakse lahustunud
aine elueerimiseks kasvavas kontsentratsioonis orgaanilise solvendi (antud töös atsetonitriili,
26
ACN) lahust, mis sisaldab ka TFA-d. ACN-i kasvav sisaldus aitab muuta mobiilset faasi (vesi
ja TFA) vähem polaarsemaks, et soodustada hüdrofoobsemate ühendite väljumist kolonnist.
Peptiid puhastati C18 kolonnis ACN/TFA/H2O mobiilse faasiga. Lineaarse gradiendina
kasutati 3-29/20-80 (ARC-3523) või 3-27/40-80 (ARC-3524) voolukiirusi (esimesed arvud
tähistavad aega minutites, kaldkriipsuga on eraldatud vastav solvendi kontsentratsioon
süsteemis).
Ainete olemasolu sünteesisegudes tõestati molekulaarmasside kontrolliga
massispektromeetria abil. Selleks segati väike kogus uuritavaid ühendeid maatriksiga, mis
aitaks kaitsta proove võimaliku lagunemise eest. Peptiididest tekitati ioniseeritud gaas, kus
molekulid kannaksid ühte või mitut positiivset laengut. Analüüsides ühelaengulisi molekule
on seega võimalik mõõta uuritavate peptiidide massi. Analüüsitava aine massi-laengu suhte
(m/z) vastavust kontrolliti vastava algoritmi abil juba varasemalt olemasolevast
väärtustetabelist, võttes aluseks ainete teoreetilise molekulmassi (vt lisa 5). Mõlema aine
puhul leiti nende detekteeritud ioonidele vastavuses olevad täpsed massi-laengu väärtused.
Süntees oli õnnestunud ja ained suudeti puhastada HPLC süsteemis 100% (ARC-3523) ja
>95% (ARC-3524) puhtustega.
Puhastatud saadused külmkuivatati ehk lüofiliseeriti ja puhastati nii, et vabastada aine HPLC
solventidest.
Kaiser test
Valmistati lahused 5% n-inhüdriin etanoolis ja 80% fenool etanoolis. Väiksesse katseklaasi
kanti reaktsioonisegust spaatli abil mõned eelnevalt pestud vaiguterad. Teradele lisati 20 µL
mõlemat lahust ja soojendati seejärel soojal pliidil 105°C juures 5 minutit. Vabade
aminorühmade olemasolul ehk positiivse tulemuse korral värvuvad vaiguterad sinisteks.
Fmoc-kaitserühma mahavõtmine
Fmoc-rühma mahavõtmiseks valmistati 20% piperidiini lahus DMF-s. Puhastatud vaigule
lisati piperidiini lahus ja asetati inkubaatorile 20 minutiks.
ivDde-kaitserühma mahavõtmine
27
Lüsiini kaitserühma ivDde mahavõtmiseks valmistati 20% hüdrasiini lahus DMF-s. Lahus
kanti vaigule 1,5 ml ning asetati seejärel 15+15 minutiks loksutile. Kaitserühma
eemaldamisele järgnes spektromeetriline kontroll. Kaitserühma mahavõtmist loetakse
õnnestunuks, kui neelduvusspekter on kahe mõõtmise vahepeal vähenenud.
3.2. Biokeemilised katsed
Biokeemiliste katsete eesmärk oli välja selgitada, kas sünteesitud peptiid sobib Aurora B
inhibiitoriks. Võrdlusena kasutati proteiinkinaasi Aurora A ja tema inhibiitorit MLN8054 (vt
peatükk 1.4.). Mõlema proteiinkinaasi puhul kasutati mõningates katsetes ka nende
looduslikku aktivaatorit, milleks Aurora A-l on TPX2 ja Aurora B-l INCENP, et võrrelda,
kuidas nende juuresolek inhibiitori efekti mõjutab.
Kuna uurimisrühmas polnud selleks ajaks arendatud meetodit Aurora B poolt katalüüsitava
fosforüülimisreaktsiooni jälgimiseks, tuli kõigepealt optimeerida varasemalt arendatud
meetod, mida on kasutatud proteiinkinaaside PKAc ja Aurora A jaoks. Selleks jälgiti, millise
Aurora B kontsentratsiooni ja ajakulu juures on fosforüülimisreaktsioon efektiivseim (ning
kas see üldse toimub). Seetõttu teostati esimesed katsed (I-II) kahel erineval PK
kontsentratsioonil ja viie erineva reaktsiooniajaga, et välja selgitada kinaaside
fosforüülimiskiirused ja -efektiivsused. Võrdluseks kasutati proteiinkinaasi Aurora A, mille
võime fosforüülida TAMRA-kemptiidi sai varasemalt eksperimentaalselt kinnitatud.
Tulemuste põhjal valiti välja sobivad PK-de kontsentratsioonid ning ajamärgistused katseteks
inhibiitoritega. Valikus lähtuti tulemuste analüüsil põhinevatel andmetel, mille seast valiti
kõrgeima fosforüleerimisprotsendiga näitajad, mis võimaldaksid edaspidi jälgida, kas ja kui
suurel määral takistavad inhibiitorid fosforüülülekannet (mida suurem saadav signaal on, seda
mugavam on jälgida selle vähenemist inhibiitori toimel). Samuti tuli arvesse võtta graafiku
lineaarset ala, st vahemikku, kus reaktsioon sõltub lineaarselt nii PK kontsentratsioonist kui
ka reaktsiooniajast.
Puhverlahus, mis hoiab reaktsioonide käigus organismilähedast pH-taset (7,4), valmistati
deioniseeritud vee (MQ), DTT, HEPES, MgAc2 ja EDTA seguna. DTT on tugev redutseerija,
mis loovutab elektrone ja seob puhvris hapnikku; Mg2+ ioonid tõstavad ATP sidumise
afiinsust PK-le; HEPES on laialt levinud puhver, mis normaliseerib lahuse pH-taset; EDTA
seob aga raskmetalle, mis võivad lahuses esineda. Seejärel valmistati 10 mM ATP lahus ning
28
150 µM Tamra-kemptiidi lahus puhvris. Esimese katse proteiinkinaaside ja nende
aktivaatorite andmed, lõppkontsentratsioonid ja lisamise järjekord on toodud tabelis 1.
Tabel 1. Andmed fosforüülimisreaktsioonidest (I-II)
Aurora A Aurora B TPX2 Aurora B+ INCENP
ATP TAMRA-kemptiid
Firma Sigma-Aldrich
Merck-Millipore
Caslo (sünteesitud)
Merck-Millipore Sigma Molecular Probes
Amino-happeline järjestus
täis-järjestus
täis-järjestus
aminohap-pejäägid 1-43
PK täisjärjestus, INCENP aminohappe-jäägid 821-lõpp
- Kemptiidi täis-järjestus
Lõpp-kontsentrat-sioon (c; nM)
250/50 250/50 50 250/50 1000 15 000
Reakt-siooni-segusse lisamise jrk
I I II (koos Aur A-ga)
I II või III (AurA+ TPX2 puhul)
III või IV (AurA+ TPX2 puhul)
Fluorestsentsmarkerina kasutati katsetes fluorestseeruvat värvi TAMRA. TAMRA on
kinnitatud fosforüülitava peptiidi leutsiini (leucine, Leu) N-terminaalsele aminorühmale.
Peptiid sisaldab lisaks ka seriini (serine, Ser), mille kõrvalahelas asuv hüdroksüülrühm seob
end ATP ja kinaasi juuresolekul fosforüülrühmaga. TAMRA-kemptiid on kinaasi substraat,
mida kasutati fluorestsentsmärgistusena fosforüülimata jäänud proteiinkinaasi fragmendi
jälgimiseks selle fosforüülitud osast. Saadud signaali tugevus võimaldas määrata ka lineaarse
ala katseteks inhibiitoritega. Ühtlasi kasutati TAMRA-kemptiidi proteiinkinaaside
inhibiitorite efektiivsuse määramiseks – fluorestsentsmärgistusega substraat eraldub TLC
voolutamise käigus fosforüülitud vormist, võimaldades nii hinnata fluorestsentsskanneri abil
fosforüülimisreaktsiooni efektiivsust ning seega ka reaktsiooni takistava inhibiitori tõhusust.
TAMRA-kemptiidi lähtelahuse neelduvust kontrolliti UV-Vis spektrofotomeetriliselt,
tuginedes Beer-Lambert'i seadusele (TAMRA-kemptiid; ε555=80000 M-1cm-1).
Proteiinkinaasid, aktivaatorid ja puhver pipeteeriti mikroliiterplaadi süvenditesse (vt tabel 2).
Segud soojendati inkubaatoris 30°C-ni, et kiirendada reaktsiooni, kuid samas vältida
proteiinkinaaside kui valkude denatureerimist reaktsiooni käigus vale temperatuuri mõjul.
Reaktsioonid käivitati TAMRA-kemptiidi lisamisega 20-sekundiliste vahedega, et tagada
reaktsioonide täpne kestvus.
29
Tabel 2. Fosforüülimisreaktsioonide I ja II reaktsioonisegud. Kahe plussmärgiga ("++")
on märgitud kangemad lahused. Siin ja järgnevates tabelites ning joonistel tähistab lühend
‘Aur’ Aurora-perekonna kinaase.
I II III IV V VI VII VIII
Aur A ++ - ++ - - - - -
Aur A - + - + - - - -
TPX2 - - + + - - - -
Aur B - - - - ++ - - -
Aur B - - - - - + - -
Aur B + INCENP - - - - - - ++ -
Aur B + INCENP - - - - - - - +
ATP + + + + + + + +
TAMRA-kemptiid + + + + + + + +
Samale plaadile kanti eraldi süvenditesse fosforhape, millega lõpetati reaktsioonid 5, 10, 15,
30 ja 60 minuti möödudes (igast reaktsioonisegust tehti fosforhappesse 12,5 µM lahjendus).
Hapet lisati reaktsioonisegude pH-taseme häirimiseks, mis katkestas koheselt PK edasise
fosforüülimisvõime.
Kõik segud kanti TLC silikageel-plaatidele (Macherey-Nagel, SiO2xH2O), lähtudes jaotusel
reaktsiooniajast. Lisaks pipeteeriti tulemuste analüüsimise tarbeks positiivse kontrollina
juurde fosforüleerimata TAMRA-kemptiid. Kuivanud plaadid asetati 30-35 minutiks TLC
voolutisse, mis koosnes butanool/püridiin/äädikhape/vesi (10/15/3/12, v/v/v/v) kokteilist.
Sellele järgnes plaatide analüüsimine BioRad fluorestsentsskanneri abil.
Inhibeerimisreaktsioonid (III-IV) teostati lähtudes samadest etappidest nagu fosforüüliminegi,
kuid igasse reaktsioonisegude komplekti (4x4 süvendit), mis sisaldas erinevat PK-i, lisati ka
inhibiitor (vt tabel 3). Inhibiitori lõppkontsentratsioon reaktsioonisegus oli 10 µM. Kontroll-
reaktsioonidesse lisati inhibiitori asemel sama ruumala DMSO-d ilma inhibiitorita (DMSO
30
lõppkontsentratsioon 2% mahu järgi1). Inhibeerimisreaktsioone jälgiti TLC abil ning
analüüsiti taas BioRad skanneriga.
Tabel 3. Inhibeerimisreaktsiooni reaktsioonisegud. Kõik reaktsioonisegud sisaldasid ka
puhvrit, mis pipeteeriti igasse süvendisse kõige esimesena.
1 Tüüpiliselt kasutatakse bioloogilistes süsteemides DMSO kontsentratsiooni alla 1%, kuid antud juhul oli suurem kontsentratsioon vajalik, tagamaks inhibiitorite lahustumist. Nagu näha tulemustest allpool, olid PK-d antud DMSO kontsentratsiooni juures siiski aktiivsed.
Lisa-
mise
jrk.
I II
II
I IV
V
VI
VII
VII
I
IX
X
XI
XII
XII
I
XIV
XV
XV
I
2. Aur A + + - - + + - - + + - - + + - -
2. Aur B - - + - - - + - - - + - - - + -
2. Aur B+
INCENP
- - - + - - - + - - - + - - - +
3. TPX2 - + - - - + - - - + - - - + - -
4. ATP + + + + + + + + + + + + + + + +
5. DMSO + + + + - - - - - - - - - - -
6. ARC-3523 - - - - + + + + - - - - - - - -
7. ARC-3524 - - - - - - - - + + + + - - - -
8. MLN8054 - - - - - - - - - - - - + + + +
9. TAMRA-
kemptiid
+ + + + + + + + + + + + + + + +
31
4. Tulemuste analüüs
4.1. Inhibiitorite disain
Inhibiitori disainil lähtuti kolmest osast:
1) nukleosiidi jäljendajast (MLN8054);
2) INCENP järjestust sisaldavast osast;
3) linkerist.
Kõigi eelduste kohaselt peaks moodustunud konjugaat täitma kinaasimolekuli Aurora B
nukleosiidse saidi ja suunama INCENPi järjestust sisaldava lõigu PK-l õigesse punkti. Linker
kinnitati peptiidahelale lüsiini kõrvalahela aminorühmale. Kuna Lys enda külgahel ei ole väga
pikk, kasutati lisaks Ahx. Linkeri kaugus ja pikkus optimeeriti Aurora B sidumistaskutesse
seostumise jaoks, lähtudes Aurora B ja Aurora A olemasolevatest kristallstrukutuuridest
(Aurora B kompleks INCENPiga ning Aurora A kompleks MLN8054-ga, vt joonis 2).
Arvestades, et kompleksi moodustamise käigus võivad proteiinkinaasidel esineda
konformatsioonilised muutused, siis otsustati linkeri koosseisus kasutada kiraalsete
elementidena kas L-lüsiini või D-lüsiini (vastavad inhibiitorid ARC-3523 ja ARC-3524).
Aminohappe stereokonfiguratsioonilise muutuse rakendamine võib seega aidata parandada
sidumise selektiivsust ja efektiivsust.
4.2. Inhibiitorite süntees ning RP-HPLC ja MS
4.2.1. Tahkefaassüntees
Biligandne inhibiitor sünteesiti tahkel faasil. Tahkefaassüntees teostati eksperimentaalses osas
kirjeldatud sünteesiskeemi põhjal. Kuigi SPPS-meetodil on pikaahelalise peptiidi sünteesil
palju eeliseid (nt suur saagis, kerge puhastamisvõimalus ja analüüs vaheetappides), ei ole see
sugugi täiuslik. Kommertsiaalse teenusena toodetud peptiid sai tootjapoolse (CASLO ApS)
32
kinnituse toote puhtuse osas, kuid seegi pole enne katselist proovimist täielikult
usaldusväärne. Seega ei saanud esialgu välistada sünteesi kõrvalproduktide teket peptiidi
ahela vale järjestuse tõttu. Sünteesitud aine struktuuri õigsuse lõplik analüüs toimus alles
pärast ühendi mahavõtmist vaigult (vt peatükk 2.2.).
Probleemid võivad tekkida ka pundumisel – vähepundunud vaigu korral kannatab aine
transport reaktsioonitsentrite juurde ja seeläbi ka saagikus. Käesolevas töös tõendasid aga
kõik vaheetappides läbi viidud analüüsid (Kaiser test, UV-Vis), et taolisi probleeme ei
esinenud.
Kõige murettekitavamaks osutus produkti mahavõtmise etapp, kus ainet roteeriti vaakumis.
Antud aine puhul esineb pikas ahelas nii polaarseid kui mittepolaarseid regioone. Seetõttu
käitub ta pindaktiivsuse tõttu kohati detergendina. Vaakumis tekkisid lahuse pinnale
õhumullid, mis ettevaatamatul käsitlemisel kippusid lõhkema. Tagajärjena vähenes aine
saagis, sest koos vedelikuga pritsitakse süsteemi ka kuivatatavat lõpp-produkti.
4.2.2. RP-HPLC ja MS
Produktide olemasolu identifitseeriti analüütiliselt RP-HPLC meetodil eksperimentaalses osas
toodud kirjelduse põhjal ja kontrolliti MS detektori (teoreetiliselt arvutatud monoistoopne
Mw=4380 Da) ja UV-Vis detektoriga (λmax=300 nm, MLN8054) (vt lisa 4). Produkti A
(ARC-3523) puhastamisel alustati analüütilisest süstist, kust muude ainete vahelt paistis ka
õige aine (λ=300 nm, m/z) (vt joonis 9A). Molekulmasse kontrolliti ESI-MS detektoriga (vt
joonis 9B). Sellele järgnesid suuremad preparatiivsed süstid (gradient 3-29/20-80, st et
ajamärgistuste 3' ja 29' juures oli ACN sisaldus voolutis vastavalt 20% ja 80%). Preparatiivse
kromatograafia ajal loobuti massispektromeetri kasutamisest, sest piik oli juba eelnevates
analüüsides kindlaks tehtud. Massispektromeetrias võivad molekuli ioniseerimisel tekkida eri
laenguga ioonid (z=1, 2 jne) ja molekulid saavad gaasifaasis moodustada ioonpaare TFA-ga
(eluenti lisatud lenduv hape). Seega esineb molekuli mass-spektris tõenäoliselt mitu massi-
laengu suhte väärtust. Võimalikud m/z väärtused arvutatakse algoritmist (vt lisa 5), mis
arvestab erinevaid aine z-väärtusi ja sellega interakteeruvate TFA molekulide arvu. ARC-
3523 mass-spektri (joonis 9B) kolm kõrgeimat tuvastatud piiki (1461, 1096 ja 877) sobisid
vastavalt 3-, 4- ja 5-kordsetele laengutele (vt lisa 5). Põhjus, miks pole võimalik lugeda
ühekordselt laetud ühendit, on molekuli suures molekulmassis (kasutatud aparatuur
võimaldab detekteerida ioone m/z väärtusega alla 2000).
33
Viimasena tehti süst juba kogutud puhastatud fraktsioonist. Kromatogramm lainepikkusel 300
nm näitas selget ja sümmeetrilist piiki. Preparatiivse kromatograafia käigus kogutud ARC-
3523 fraktsiooni puhtuse analüüsimisel selgus, et aine suudeti eraldada 100% puhtusega.
Joonis 9. ARC-3523 UV-VIS detektori (A) ja ESI-MS detektori (B) andmed
kromatograafilises analüüsis
Produkti B (ARC-3524) puhastamisel lähtuti samasugusest protokollist nagu ARC-3523
puhul, kuid sisestuskogust alandati 2 µL-ni ja vooluti gradient muudeti 3-27/40-80. Seega
erinevad ARC-3523 ja ARC-3524 kogumispunktid (vastavalt tR=23,5 min ja tR= 17,5 min).
Mass-spekter tuvastas (nagu ARC-3523 puhulgi) piigid 1461,1096 ja 877, kuid lisaks ka piigi
1753 juures, mis ei kattu ka mõõtemääramatuse (±1) korral ühegi algoritmi abil arvutatud
väärtusega (vt lisa 5). Preparatiivse kromatograafia käigus kogutud ARC-3524 fraktsiooni
puhtuse analüüs näitas, et aine eraldati puhtusega >95%.
Pikaahelalise aine puhastamisel RP-HPLC meetodil võib esineda mitmeid komplikatsioone:
ootamatute kõrvalproduktide teke, piikide rohkus, probleemid aine lahustuvusega kolonnis
jm eripärad. SPPS õnnestumist kinnitasid kromatograafilisel analüüsil olulised näitajad:
sümmeetriline piik õige kontsentratsiooni juures ja mõlema aine väljumine kolonnist sama
ACN kontsentratsiooni juures (65%). Viimane on käesolevas töös oluline, sest ARC-3523 ja
ARC-3524 olid enantiomeerid (nende erinevus seisnes vaid ruumilises konfiguratsioonis) ja
ainetel pidigi olema sarnane polaarsus (ja seega ka kolonnist väljumise aeg). ARC-3523 ja
A
B
34
ARC-3524 struktuuride õigust kinnitasid ka UV-Vis spektri kuju ning MS abil saadud m/z
väärtused.
Elueeritud ained külmutati vedelas lämmastikus ja kuivatati seejärel vaakumis, mis aitas
vabaneda HPLC käigus kogunenud solventidest, kuna viimased võivad häirida edasistel
katsetel PK-de aktiivsust.
4.3. Biokeemilised katsed
4.3.1. Inhibiitorite emalahuste ning vahelahjenduste valmistamine
Külmkuivatatud inhibiitorid lahustati katsete jaoks 50 µL DMSO-s. Kuna DMSO-s pole UV-
Vis spektri mõõtmine lainepikkustel 300 nm ja alla selle soovitav lahusti enda tugeva
neeldumise tõttu, siis tuli teha ainete emalahustest lahjendused vette. Antud juhul osutus
probleemiks asjaolu, et ainete hüdrofoobsuse tõttu oli nende lahustuvus puhtas vees üpris
kehv. Proovimise järel lahustati ained lõpuks 20% DMSO lahuses (20/80, v/v). Seejärel
mõõdeti NanoDrop UV-Vis süsteemiga ainete ARC-3523 ja ARC-3524 20-kordsete
lahjenduste konsentratsioonid ja tehti tagasiarvutus (vastavalt cARC-3523=663 µM ja cARC-
3524=1,67 mM). Sünteesisaagise kontsentratsioonide arvutamisel võeti arvesse produktide
mahavõtmise, lüofiliseerimise ja HPLC kontrolli käigus esinenud kadusid ning lähtuti
MLN8054 neeldumiskoefitsendist (arvutatud Beer-Lamberti seadusest).
Hiljem, katsete käigus (peale sügavkülmutamisi ja korduvsulatamisi) oli näha, et ained polnud
lahuses täielikult lahustunud ja andsid häguseid suspensioone, mis ei olnud biokeemilise katse
jaoks kõlblikud, kuna ei võimalda piisavat pipeteerimistäpsust. Seega otsustati tõsta DMSO
lahuse kangust 25%-ni ning tehti vahelahjendused kontsentratsiooniga 125 µM.
4.3.2. Fosforüülimisvõime määramine
Käesoleva töö eesmärk oli leida sobiv biligandne inhibiitor, mis pidurdaks proteiinkinaasi
Aurora B tööd. Selleks kasutati fosforüülimisel võrdlusena PK Aurora A, mille võime
fosforüülida TAMRA-kemptiidi on varasemalt juba kinnitust leidnud. Võrdleva inhibiitorina
kasutati MLN8054, mille omadused Aurora A inhibiitorina on samuti eksperimentaalselt
kinnitatud. Katsed sooritati mõlema PK puhul ka nende loodusliku aktivaatori juuresolekul.
35
Ostetud ja -80°C juures säilitatud PK-de katalüütilist aktiivsust kontrolliti TLC meetodiga
viiel erineval ajatähistusel ja kahe erineva kontsentratsiooni juures. Mida intensiivsem on
plaadil eraldunud fosforüülitud produkti tähistav laik, seda aktiivsem kinaas on. Saadud
tulemused võimaldavad langetada valikut optimaalseteks ajapunktide ja kinaaside
kontsentratsioonide jaoks edasiste katsete käigus.
Esmalt sooritati fosforüülimisreaktsioon PK Aurora A ja Aurora B ning nende aktivaatoritega
viiel erineval ajamärgistusel. Kuna antud tüüpi meetodit pole varem PK Aurpra B-ga
proovitud, oli lähenemine täiesti uudne ja polnud garanteeritud, et see antud kinaasidega ka
töötab. Teoreetiliselt võib juhtuda, et kemptiid substraadiks ei sobi ja kinaas tema
juuresolekul ei toimi (substraati pole võimalik varieerida). See tähendaks seda, et laigud ei
lahutu TLC plaadil, kuna TLC vooluti on optimeeritud just TAMRA-kemptiidi järjestuse
jaoks. Fosforüülitud substraadi kontsentratsioon arvutati fosforüülitud produkti ning
substraadi ja fosforüülitud produkti laikude summaarse intensiivsuse suhtest. Tulemused
kinnitasid ootuspäraselt, et pikem fosforüülimisreaktsiooni kestus (30 ja 60 min) on tõhusam
ja seda just eriti PK-de kõrgema kontsentratsiooni (25 nM) juures. Korduskatses otsustati
proovida PK-del kõrgemat kontsentratsiooni (50 nM), sest suurem signaal võimaldab paremat
ja objektiivsemat tulemuste kontrolli ning lisaks oli tegemist ka vanade lahustega (kõrgem
kontsentratsioon tõstab PK aktiivsust).
Nii Aurora A kui Aurora B puhul toimus fosforüülimine intensiivsemalt kõrgemal
kontsentratsioonil. Loogiliselt tõusis fosforüülitusprotsent aktivaatorite juuresolekul. Aurora
A fosforüülitus oli võrreldes Aurora B-ga 60 min möödudes samal kontsentratsioonil üle 20
korra kõrgem, mistõttu andis proovitud 25 nM kontsentratsioon juba piisavalt adekvaatseid
tulemusi edasisteks katseteks. Aurora B kontsentratsiooni pidi võrdluse võimaldamiseks
tõstma (70 nM). Aurora A fosforüülitust mõjutas enam kontsentratsiooni muutmine kui TPX2
lisamine. Kuigi viimane tõstis kinaasi fosforüülimisvõimet, olid tulemused nii Aurora A kui
ka Aurora+TPX2 puhul sarnaste suhetega kontsentratsiooni muutuse suhtes (vt joonis 10).
Aurora B fosforüülitusprotsent oli mõlemal kontsentratsioonil kõrgem INCENPiga kui ilma
selleta (vt joonis 11). Seega on valgu INCENP juuresolek Aurora B fosforüülimisvõime
suurendamisel määrava tähtsusega ja annab ka madalama kontsentratsiooni juures (10 nM)
vajaliku signaali.
36
Uuritavate ainete (ARC-3523 ja ARC-3524) kontrollimise jaoks valiti katsetest I-II
reaktsioonide ajapunktid ja PK-de kontsentratsioonid, mis asuksid lineaarsel alal, et tagada
võimalikult arusaadav inhibeerimisefekt.
Joonis 10. Aurora A ja Aurora A+TPX2 fosforüülimisreaktsiooni tulemused kahel
kontsentratsioonil
Joonis 11. Aurora B ja Aurora B+INCENP fosforüülimisreaktsiooni tulemused kahel
kontsentratsioonil
Uuritavate ainete (ARC-3523 ja ARC-3524) jaoks valiti ajapunktid ja kontsentratsioonid, mis
asuksid linaarsel alal, kuhu jääb kõige rohkem fosforüülitud produkti, et tagada (loodetavasti)
võimalikult arusaadav inhibeerimisefekt.
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 30 60
Fosf
orüü
litud
prd
ukt (
%)
Aeg (min)
50 nM AurA
25 nM AurA
50 nM AurA+TPX2 25 nM AurA+TPX2
0
10
20
30
40
50
60
70
0 5 10 15 30 60
Fosf
orüü
litud
pro
dukt
(%)
Aeg (min)
50 nM AurB
25 nM AurB
50 nM AurB+INCENP 25 nM AurB+INCENP
37
4.3.3. Katsed inhibiitoritega
Katseskeem I
Inhibiitoritest ARC-3523 ja ARC-3524 valmistati 125 µM lahused, mis reaktsioonisegudesse
pipeteeriti lõppkontsentratsiooniga 10 µM. Võrdlusühendina kasutati Aurora A inhibiitorit
MLN8054, mis on oma inhibeerivaid omadusi juba varasemates katsetes tõestanud.
Ajapunktideks valiti taaskord 30 min ja 60 min. Paraku ei saa antud katse tulemustele siiski
täielikult toetuda: enne inhibiitorite reaktsioonisegudesse pipeteerimist tsentrifuugiti neid ning
selgus, et tõeliste lahuste asemel oli tegemist hoopis suspensioonidega. Lahused vorteksiti (st
segati Vortex masinal kuni segude ühtlustumiseni) seejärel uuesti ning tööd jätkati vastavalt
esialgsele protokollile, kuid kuna suspensioonist pipeteerimine ei ole täpne, siis oli ka
inhibiitori kontsentratsioon lahuses tõenäoliselt plaanitust väiksem.
Peale 30 min inhibeerimisaega oli näha, et MLN8054 oli osutunud fosforüülülekande
takistamisel siiski kõige efektiivsemaks (vt lisa 6). Sünteesitud inhibiitorid töötasid, kuid
efekt oli oodatust väiksem. AurA+TPX2 fosforüülimise takistamisel osutus neist edukamaks
ARC-3524, AurB ja AurB+INCENP puhul jällegi ARC-3523.
Katseskeem II
Katse teostati sarnaselt eelnevale, kuid seekord tehti inhibiitoritele uued vahelahjendused
(12,5 µM) ning võeti lõppkontsentratsiooniks lahuses 1 µM (lahjem). Samades tingimustes
toimus ka korduskatse. Graafikutel liideti mõlema katse tulemused koos ajapunktidega ning
määrati andmete standardhälve. Inhibiitorite tulemused normaliseeriti inhibiitorita kontrolli
suhtes (DMSO).
Kõigi eelduste kohaselt oleks valgu INCENPi järjestust jäljendavad inhibiitorid ARC-3523 ja
ARC-3524 olema konkurentsivõimelised katses Aurora B ja INCENPiga. Inhibeerimise
tulemused tähelepanuväärset erinevust ei näidanud võrreldes reaktsiooniga, mis toimus ilma
INCENPita (vt joonis 12). Seega oli inhibiitorite afiinsus oodatust madalam. Inhibiitorite
kontsentratsiooni vähendamine lahuses suuri muutusi kaasa ei toonud, mis on positiivne märk
ainete efektiivsusest ja ühtlasi vähendab edasisel käsitlusel materjalikulu. Mõlemad Aurora B
fosforüülimisreaktsioonid takistati ligi 50% ulatuses. Võib oletada, et reaktsioonides ei
toimunud peptiidi sidumine Aurora B substraadi sidumistaskusse ja nukleosiidse fragmendi
MLN8054 sidumine ATP-saiti samaaegselt, mis vähendas inhibeerimisreaktsiooni. Märgatav
38
efekt annab aga lootust, et ühendite struktuure ja reaktsioonitingimusi optimeerides paraneks
inhibiitorite afiinsus Aurora B suhtes.
Katsetulemuste hajuvus oli enamikel Aurora A ja Aurora A+TPX2 katsetel väike. See-eest on
reaktsioonides Aurora B-ga märgata kõrget standardhälvet. Põhjuseks võib olla asjaolu, et
kõikidest kasutatud proteiinkinaasidest oli Aurora B puhul fosforüülimisreaktsiooni
efektiivsus kõige madalam ka inhibeerimata kontrollis (st ka 60 min järel oli fosforüülitud
vaid väike protsent TAMRA-Kemptiidist) ning seetõttu oli inhibiitorite efekti raske väga
täpselt kvantifitseerida. Selle vastu aitaks tõenäoliselt PK kontsentratsiooni tõstmine, kuid
antud töö raames soovitiAurora B-d võimalikult kokku hoida.
Kõige efektiivsemaks osutus inhibiitoritest siiski juba kasutusel olev MLN8054. Sünteesitud
ühenditest ei tõusnud kumbki inhibiitor oluliselt esile, suurim erinevus paistis silma vaid
Aurora A inhibeerimisel, mis polnud aga antud uurimuse eesmärk. Erinevate kiraalsete
elemendi kasutamine ühendite linkeris ootustele vastupidiselt ei avaldanud efekti
inhibeerimise karakteristikutele, mis annab samuti märku asjaolust, et inhibiitori kahe
fragmendi seostumine Aurora B vastavatele sidumistaskutele ei toimunud tõenäoliselt
samaaegselt.
0 20 40 60 80
100 120
Nor
mal
isee
ritu
d ak
tiivs
us
DM
SO k
ontr
olli
suht
es Aurora A
0 20 40 60 80
100 120
Nor
mal
isee
ritu
d ak
tiivs
us
DM
SO k
ontr
olli
suht
es Aurora A+TPX2
39
Joonis 12. Inhibeerimiskatsete tulemused
4.4. Võimalikud arengusuunad
Kuigi töös sünteesitud ühendid osutusid planeeritust tagasihoidlikemaks Aurora B
inhibiitoriteks, on siiski lootus nende struktuursete analoogide sünteesil saavutada biligandne
inhibeerimine. Näiteks võimaldaks linkeri struktuuri muutmine ja edasine optimeerimine
ühenditel saavutada efektiivsemaid tulemusi Aurora B inhibeerimisel.
Töö käigus arendati ka uudne biokeemiline meetod Aurora B aktiivsuse ning sellele suunatud
inhibiitorite efektiivsuse hindamiseks. Antud meetodiga saaks edaspidistes uuringutes
keskenduda Aurora B katalüütilise mehhanismi uurimisele INCENPi juuresolekul ja mitte.
Näiteks saaks määrata INCENPi, ATP ja TAMRA-Kemptiidi seostumise parameetreid ning
metalliioonide mõju katalüüsile. See annaks kokkuvõttes väärtusliku informatsiooni
proteiinkinaaside kui rakusiseste katalüsaatorite funktsioneerimise kohta.
Üheks huvipakkuvaks edasiarenduseks võiks olla ka inhibiitorite sisse viimine rakkudesse, et
kontrollida, kas esineb efekt, mis vihjaks Aurora B inhibeerimisele. Ühtlasi võimaldaks see
testida nii ühendite bioloogilist aktiivsust kui võimet siseneda rakku (kuigi tegemist on suurte
peptiididega, võib nende hüdrofoobsus aidata kaasa inhibiitorite läbiminekule raku
plasmamembraanist).
0 20 40 60 80
100 120
Nor
mal
isee
ritu
d ak
tiivs
us
DM
SO k
ontr
olli
suht
es
Aurora B
0 20 40 60 80
100 120
Nor
mal
isee
ritu
d ak
tiivs
us
DM
SO k
ontr
olli
suht
es Aurora B+INCENP
40
Kokkuvõte
Rakusisestes protsessides on tähtis roll ensüümidel, nendevahelisel koostööl ja loodavatel
signaaliradadel. Üheks sellistest ensüümidest on proteiinkinaasid, mis katalüüsivad rakkudes
valkude fosforüülimist, reguleerides ja kontrollides nii valgu aktiivsust. Vead taolises
kontrollitud süsteemis häirivad raku normaalset toimimist ja võivad pikas perspektiivis olla
põhjuseks erinevatele haigustele, nende hulgas Alzheimeri tõvele ja mitmetele kasvajatele.
Ravimitööstuses on probleemile pakutud potentsiaalseks lahenduseks inhibiitorid – ained, mis
blokeeriksid üleekspresseritud proteiinkinaaside tööd.
Aurora B on proteiinkinaas, mis osaleb aktiivselt kogu rakujagunemistsükli vältel selle
reguleerimises. Aurora B-d aitab aktiveerida regulaatorvalk INCENP. Käesolevas töös töötati
välja sellised biligandsed inhibiitorid, mis sisaldavad INCENP järjestust ning tagavad seega
Aurora B sidumistaskustesse seostumisel selektiivsuse ja afiinsuse antud proteiinkinaasi
suhtes. Biligandse inhibiitori tööpõhimõte seisnebki seostumises korraga kahe kinaasitaskuga.
Fmoc-tahkefaassünteesil sünteesitud ühendid sisaldasid lisaks INCENP järjestusele
nukleosiidset fragmenti ning abistava linkerina lüsiini, mille kõrvalahelale kinnitati
aminoheksaanhape. Nukleosiidse ATP-d jäljendava fragmendina kasutati MLN8054, mis
seostus seega ATP sidumistaskuga. Linkerites kasutati kiraalset elementi (D- või L-lüsiini) ja
pikemat alküülahelat (Ahx), võttes arvesse valgu ja inhibiitori kompleksi tõenäoliselt
geomeetriat. Mõlemad sünteesid õnnestusid ning HPLC-ga eraldati puhtad ühendid.
Uurimistöö käigus kasutati Aurora B-ga esmakordselt fluorestentsil põhinevat meetodit
kinaasi aktiivsuse hindamiseks ja inhibiitorite efektiivsuse määramiseks. Selleks lisati
reaktsioonisegudesse substraadina fluorestseeruv TAMRA-kemptiid, mis võimaldas jälgida
fosforüülitud ja fosforüülimata jäänud substraadi eraldumist TLC plaadil. Kuigi üldiselt on
teada, et kemptiid on basofiilse Aurora B jaoks sobiv substraat, pole TAMRA-ga märgistatud
kemptiidi teadaolevalt Aurora B substraadina kasutatud. Seega oli raske ennustada, milliseks
kujuneb fluorestsentsmarkeri mõju kinaasile substraadi fosforüülimises. Uurimuse
41
tähelepanuväärseima osakaalu moodustab sobiva mitte-radioaktiivse inhibeerimismeetodi
väljaarendamine Aurora B aktiivsuse jälgimiseks ning sellele suunatud inhibiitorite
efektiivsuse hindamiseks INCENPi juuresolekul ja ilma. Näiteks on sellist meetodit võimalik
hiljem kasutada Aurora B-le suunatud ravimikandidaatide esialgsetes biokeemilistes
uuringutes.
Sünteesitud inhibiitorid osutusid eeldatust veidi tagasihoidlikemaks, kuid siiski toimisid ja
omasid inhibeerivat efekti. Sellega sai uurimistöö eesmärk ka täidetud. Sünteesitud ainete
struktuure ja karakteristikuid edasi optimeerides on potentsiaalselt võimalik välja arendada ka
veelgi kõrgemat afiinsust ja selektiivsust omavad inhibiitorid, mida kasutada in vivo Aurora B
aktiivsuse jälgimiseks ja mõjutamiseks.
42
Kasutatud materjalid
Adachi, J., Kishida, M., Watanabe, S., Hashimoto, Y., Fukamizu, K., Tomonaga, T. (2014)
Proteome-Wide Discovery of Unknown ATP-binding Proteins and Kinase Inhibitor Target
Proteins Using an ATP Probe. Journal of Proteome Research, nr 13 (12), lk 5461-5470
Adams, J.A. (2001) Kinetic and Catalytic Mechanisms of Protein Kinases. Chemical
Reviews, nr 101 (8), lk 2271-2290
Adams R.R., Wheatley, S.P., Gouldsworthy A.M., Kandels-Lewis S.E., Carmena M., Smythe
C. et al. (2000) INCENP binds the Aurora-related kinase AIRK2 and is required to target it to
chromosomes, the central spindle and cleavage furrow. Current Biology, nr 10, 1075-1078
Carmena, M., Wheelock, M., Funabiki, H., Earnshaw, W.C. (2012) The Chromosomal
Passenger Complex (CPC): From Easy Rider to the Godfather of Mitosis. Nature Review
Molecular Cell Biology, nr 12(13), lk 789-803
Chan, W.C., White, P.D. (2000) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. Oxford: Oxford
University Press
Chauhan, J.S., Mishra, N.K., Raghava, G.P.S. (2009) Identification of ATP binding residues
of a protein from its primary sequence. BMC Bioinformatics, nr 434
Cohen, P. (2002) Protein kinases – the major drug targets of the twenty-first century? Nature
Reviews Drug Discovery, nr 1 (4), lk 309-315
Fu, J., Bian, M., Liu, J., Jiang, Q., Zhang, C. (2009) A single amino acid change converts
Aurora-A into Aurora-B-like kinase in terms of partner specificity and cellular function.
Proceedings of the National Academy of Sciences, nr 108, lk 6939-6944
43
Geneetika sõnastik. Loetud: http://geneetika.ee, 27.12.2016
Goldenson, B., Crispino, J.D. (2015) The Aurora Kinases in Cell Cycle and Leukemia.
Oncogene, January 29, nr 34(5), lk 537-545
Grossman, D., Kim, P.J., Schechner, J. S., Altieri, D.C. (2001) Inhibition of melanoma tumor
growth in vivo by Survivin targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, nr 98, lk 635-640
Hans, F., Skoufias, D.A., Dimitrov, S., Margolis, R.L. (2009) Molecular Distinctions
Between Aurora A and B: A Single Residue Change Transforms Aurora A into Correctly
Localized and Functional Aurora B. Molecular Biology of the Cell, nr 20, lk 3591-3502
HPLC Basic Course [joonis 7]. (2014) Hitachi High-Technologies Corporation. Loetud:
http://www.hitachi-hightech.com/global/products/science/tech/ana/lc/basic/, 01.10.2016
Hitachi High-Technologies Corporation (2014) HPLC Basic Course. Loetud:
http://www.hitachi-hightech.com/global/products/science/tech/ana/lc/basic/, 01.10.2016
Katz, E.D. (1997) High Performance Liquid Chromatography: Principles and Methods in
Biotechnology. Norwalk.
Kim, H.J., Kwon, H.R., Bae C.D., Park, J., Hong, K.U. (2010) Specific primary sequence
requirements for Aurora B kinase-mediated phosphorylation and subcellular localization of
TMAP during mitosis. Cell Cycle, nr 9 (10), lk 2027-2036
Lavõgina, D. (2006) Proteiinkinaaside efektiivsete inhibiitorite konstrueerimine ja süntees.
[bakalaureusetöö]
Lavõgina, D., Enkvist, E., Uri, A. (2010) Bisubstrate Inhibitors of Protein Kinases: from
Principle to Practical Applications. ChemMedChem, nr 4, lk 23-34
Lavõgina, D., Enkvist, E., Uri, A. [joonis 4] (2010) Bisubstrate Inhibitors of Protein Kinases:
from Principle to Practical Applications. ChemMedChem, nr 4, lk 23-34
Lehninger, A.L., Nelson, D.L. Cox, M.M. (2005) Lehninger Principles of Biochemistry
Fourth Edition. New York: W.H. Freeman
44
Lehninger, A.L., Nelson, D.L. Cox, M.M. (2012) Lehninger Principles of Biochemistry 6th
Edition. New York: W.H. Freeman
Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C. A., Krieger, M., Scott, M.P., Bretscher, A., Ploegh, H.,
Matsudaira, P. (2007) Molecular Cell Biology 6th Edition. New York: W. H. Freeman
Ma, H.T., Poon, R.Y.C. (2011) How protein kinases co-ordinate mitosis in animal cells.
Biochemical Journal, nr 435, lk 17-31
Manfredi M.G., Ecsedy, J.A., Meetze K.A., Balani, S.K., Burenkova, O., Chen, W., Galvin,
K.M., Hoar, K.M., Huck, J.J., LeRoy, P.J., Ray, E.T., Sells, T.B., Stringer, B., Stroud, S.G.,
Vos, T.J., Weatherhead, G.S., Wysong, D.R., Zhang, M., Bolen, J.B., Claiborne, C.F. (2007)
Antitumor activity of MLN8054, an orally active small-molecule inhibitor of Aurora A
kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences, nr 104 (10), lk 4106-4111
Manning, G., Whyte, D.B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. (2002) The protein
kinase complement of the human genome. Science, nr 298, lk 1912-1934
Marumoto, T., Zhang, D.W., Saya, H. (2005) Aurora-A - A Guardian of Poles. Nature
Reviews Cancer, nr 5, lk 42
Massispektroskoopia. (2016) Tartu Ülikooli Keemia instituudi kodulehekülg. Loetud:
http://tera.chem.ut.ee/~ivo/ak2/ak2_ms.pdf, 05.01.2017
Meditsiiniline keemia (2015) Kromatograafia. Loetud:
http://tera.chem.ut.ee/~koit/arstpr/krom.pdf, 02.10.2016
MLN8054, Barasertib (AZD1152-HQPA) [joonis 5] Selleckchem kodulehekülg. Loetud:
http://www.selleckchem.com, 08.02.2017
Oke, A., Pearce D, Wilkinson, R.W., Crafter, C., Odedra, R., Cavenagh, J. et al. (2009)
AZD1152 rapidly and negatively affects the growth and survival of human acute myeloid
leukemia cells in vitro and in vivo. Cancer Research, nr 69 (10), lk 4150-4158
Open Biology kodulehekülg. Loetud: http://rsob.royalsocietypublishing.org, 13.01.2017
45
Petsalaki, E., Akoumianaki, T., Black, E.J., Gillespie, D.A., Zachos, G. (2011)
Phosphorylation at serine 331 is required for Aurora B activation. The Journal of Cell
Biology, nr 195 (3), lk 449-466
Roskoski Jr., R. (2015) A historical overview of protein kinases and their targeted small
molecule inhibitors. Pharmacological Research, nr 100, lk 1-23
Ruchaud, S., Carmena, M., Earnshaw, W.C. (2007) Chromosomal passengers: conducting cell
civision. Nature Review Molecular Cell Biology, nr 8 (10), lk 798-912
Selleckchem kodulehekülg. Loetud: http://www.selleckchem.com/products/MLN8054.html,
27.12.2016
Protein Data Bank. Structures 4AF4, 2X81 [joonis 2] Loetud:
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do, 08.02.2017
Swinney, D.C. (2004) Biochemical mechanisms of drug action: what does it take for success?
Nature Reviews Drug Discovery, nr 3, lk 801-808
Terada, Y. (2001) Role of chromosomal passenger complex in chromosome segregation and
cytokinesis. Cell Structure and Function, 26 (6), lk 653-657
Thin Layer Chromatography [joonis 8] University of Leeds. Loetud: http://www.virtual-
labs.leeds.ac.uk/brewing/TLCtheory.php, 08.02.2017
Van der Waal, M.S., Hengeveld, R.C.C., van der Horst, A., Lens, S.M.A. (2012) Cell
Division Control by the Chromosomal Passenger Complex. Experimental Cell Research, nr
318, lk 1407-1420.
Viht, K., Vaasa, A., Raidaru, G., Enkvist, E., Uri, A. (2005) Fluorometric TLC assay for
evaluation of protein kinase inhibitors. Analytical Biochemistry, nr 340, lk 165-170
Walsby, E., Walsh, V., Pepper, C., Burnett, A., Mills, K. (2009) Effects of the aurora kinase
inhibitors AZD1152-HQPA and ZM447439 on growth arrest and polyploidy in acute myeloid
leukemia cell lines and primary blast. Haematologica, nr 93, lk 662-669
46
Wang, Z., Cole, P.A. (2014) Catalytic mechanisms and regulation of protein kinases. Methods
in Enzymology, nr 548, lk 1-21
What is HPLC (High Performance Liquid Chromatography)? [joonis A] Waters
kodulehekülg. Loetud: http://www.waters.com/waters/en_EE/HPLC---High-Performance-
Liquid-Chromatography-Explained/nav.htm?locale=en_EE&cid=10048919, 04.02.2017
47
Lisa 1 Tellitud dervatiseeritud vaigu andmed
\/0/6a,f49 lF
-'--
oO
\J
;CASLOCertificate of Analvsis
For rgsearch use onlv!
Product: Synthetic peptide
Lot No.: P150416-01-01
Manufacturing date: May l3th 2015
Peptide Sequence: Fmoc-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Ala-Ile-Ile-His(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu) -Hi s(Trt)-Pro-Pro-Asn(Trt) -Leu-Leu-Glu(tBu)-Leu-Phe-Gly- Thr(tBu) - Ile-Leu-Pro -Leu-Asp(tBu) -Leu-
Glu(tBu) -Asp(tBu)-Ile-Phe-Lys (Boc)-amide resin
Modifications: Fully protected and resin bound peptide.
Format: Resin bound.
Theoretical M.W.ofpeptide: 3860.56 (measured on a sample of cleayed deprotected peptide, but
with Fmoc side chain protection on)
,J M.W. (M.W. +Na)Measured by MS: 3883.17
M.W. Measured bv MS: 3860.17
Match: Approved.
purity: 57.24%o (meastxed on a sample of cleaved deprotected peptidewithout Fmoc Protection grouP)
Delivered quantity: 0.5 g resin (coreesponding to approx 200 mg crude peptide)
HPLC results: Enclosed.
Mass sPec. results: Enclosed.
CASLO ApS, Diplomvej 381, DK-2800 Lyngby, DenmarkTel: +45- 70 23 28 60, pa1; +45- 70 23 29 90
e-mail: [email protected] Web page: www.caslo.com
48
Lisa 2 Sünteesitud peptiidi struktuur
Peptiidi MLN fragment on ümbritsetud punase kastiga ja linker sinise kastiga.
49
Lisa 3 Kasutatud mõisted ja definitsioonid2
Kinetohoor - Kromosoomi tsentromeerse piirkonnaga asuv valguline struktuur eukarüootsete
rakkude mitoosil/meioosil, kuhu rakkude jagunemisel kinnituvad käävi mikrotuubulid.
Kromatiin - Eukarüootse organismi rakutuumas paiknev kromosoomide DNA-st ja valkudest
histoonidest koosnev kompaktne kompleks.
Kromosoom - Eukarüootsetes rakkudes valkudega komplekseerunud suur DNA molekul;
normaalse inimese sugurakkudes on 23 kromosoomi ning keharakkudes 46 (=2×23)
kromosoomi.
Mikrotuubulid - Seest õõnsad kõige suuremad tsütoskeleti elemendid raku tsütoplasmas, mis
koosnevad valgust tubuliinist ning millel on suur tähtsus raku kuju muutmumise ning
rakusisese transpordi tagamises.
Polüploidsus - Üle kahe kromosoomikomplekti organismi rakkudes (st 3×23 või enam).
Sait - Ensüümi sidumistasku, kuhu tavaliselt seostub substraat ning mille läheduses toimub katalüüsitav reaktsioon.
Tsentromeer - Koht, kus kaks tütarkromatiidi on teineteisega seotud. Tsentromeeri piirkonda
tekib ka kinetohoorne kompleks, kuhu raku jagunemisel seostuvad kääviniidid.
Tsütokinees - Tsütoplasma ja rakuorganellide lõplik jagumine pärast rakutsükli lõppemist.
Toimub mitoosis ja meioosis.
2 Mõistete defineerimiseks kasutati virtuaalset üldgeneetika õpikul "Geneetika" põhinevat sõnastikku
50
Lisa 4 RP-HPLC tulemused ja puhtusesüstid
ARC-3523 esialgne kromatograafiline analüüs koos UV-Vis ja ESI-MS andmetega
Musta kastiga on ümbritsetud antud aine teoreetiliste m/z väärtustega ühtivad väärtused.
3.08.2016 10:26:31 Page 1 / 1
C:\Users\kasutaja\Desktop\Data\Project1\DL20160801_Mirel_MS2.lcd
Analysis Report
Sample Name : DL20160801_Mirel_MSSample ID : 3-29/20-80Data Filename : DL20160801_Mirel_MS2.lcdMethod Filename : Darja MS-ga.lcmBatch Filename : Vial # : -1 Sample Type : UnknownInjection Volume : 5 uLDate Acquired : 8/1/2016 1:48:06 PM Acquired by : System AdministratorDate Processed : 8/1/2016 3:30:16 PM Processed by : System Administrator
<Chromatogram>
<Sample Information>
Datafile Name:DL20160801_Mirel_MS2.lcdSample Name:DL20160801_Mirel_MSSample ID:3-29/20-80
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
mAU
0,0
25,0
50,0
75,0
MPaB.Conc300nm,4nm
200 300 400 500 600 700 nm
0
250
500
750
mAU 23,734/ 1,00
201
300
658
796
260
649
777
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000110012001300140015001600170018001900m/z0,00
0,25
0,50
0,75
1,00Inten.(x10,000,000)
1461
1096
877 175382 432 13591211 1608226 805 933 1304 18611688619 1928493
51
ARC-3523 puhtuse kromatograafiline kontroll pärast preparatiivset kromatograafiat
5.08.2016 16:20:14 Page 1 / 3
C:\Users\kasutaja\Desktop\Data\Project1\DL20160802_Mirel_A_purity1.lcd
Analysis Report
Sample Name : DL20160802_Mirel_A_puritySample ID : 3-25/40-80Data Filename : DL20160802_Mirel_A_purity1.lcdMethod Filename : Darja MS-ta.lcmBatch Filename : Vial # : -1 Sample Type : UnknownInjection Volume : 15 uLDate Acquired : 8/3/2016 3:09:36 PM Acquired by : System AdministratorDate Processed : 8/3/2016 3:39:55 PM Processed by : System Administrator
<Chromatogram>
<Sample Information>
Datafile Name:DL20160802_Mirel_A_purity1.lcdSample Name:DL20160802_Mirel_A_puritySample ID:3-25/40-80
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 min
0
5
10
15
20
25
30mAU
0,0
25,0
50,0
75,0
MPaB.Conc300nm,4nm
Peak TablePDA Ch1 300nm
Peak# 1
Total
Ret. Time 16,985
Area 309020 309020
Height 29502 29502
Conc. 100,000
Unit
Mark
Name
PDA Ch2 200nmPeak#
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14
Ret. Time 0,678 0,847 0,960 1,021 1,205 1,333 1,409 1,729 1,852 1,888 1,994 2,132 2,175 2,353
Area 441846 166670 127383 151760 213226 232450 231779 723154
71610 220520 126517 342945 304682 796317
Height 18094 20902 22865 23770 26653 28798 30098 35630 37339 37970 39743 42109 42803 45419
Conc. 0,541 0,204 0,156 0,186 0,261 0,285 0,284 0,885 0,088 0,270 0,155 0,420 0,373 0,975
Unit
Mark V V V V V V V V V V V V V
52
ARC-3524 esialgne kromatograafiline analüüs koos UV-Vis ja ESI-MS andmetega
Musta kastiga on ümbritsetud antud aine teoreetiliste m/z väärtustega ühtivad väärtused.
5.08.2016 9:22:03 Page 1 / 1
C:\Users\kasutaja\Desktop\Data\Project1\MM20160805_Mirel_B_MS1.lcd
Analysis Report
Sample Name : MM20160805_Mirel_B_MSSample ID : 3-27/40-80Data Filename : MM20160805_Mirel_B_MS1.lcdMethod Filename : Darja MS-ga.lcmBatch Filename : Vial # : -1 Sample Type : UnknownInjection Volume : 2 uLDate Acquired : 8/5/2016 8:31:26 AM Acquired by : System AdministratorDate Processed : 8/5/2016 9:03:13 AM Processed by : System Administrator
<Chromatogram>
<Sample Information>
Datafile Name:MM20160805_Mirel_B_MS1.lcdSample Name:MM20160805_Mirel_B_MSSample ID:3-27/40-80
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 min
0
100
200
300
400
500
600
700
800
mAU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
MPaB.Conc300nm,4nm
200 300 400 500 600 700 nm
0
250
500
750
mAU 17,980/ 1,00
201
300
484
656
726
260
468
743
705
785
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 m/z0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
Inten.(x1,000,000)
14611096
175387782
142 761 1845694 194315451301342 14141222610 971 1671485
53
ARC-3524 puhtuse kromatograafiline kontroll pärast preparatiivset kromatograafiat
5.08.2016 16:18:58 Page 1 / 1
C:\Users\kasutaja\Desktop\Data\Project1\MM20160805_Mirel_B_purity1.lcd
Analysis Report
Sample Name : MM20160805_Mirel_B_puritySample ID : 3-21/40-70Data Filename : MM20160805_Mirel_B_purity1.lcdMethod Filename : Darja MS-ta.lcmBatch Filename : Vial # : -1 Sample Type : UnknownInjection Volume : 10 uLDate Acquired : 8/5/2016 3:50:46 PM Acquired by : System AdministratorDate Processed : 8/5/2016 4:16:53 PM Processed by : System Administrator
<Chromatogram>
<Sample Information>
Datafile Name:MM20160805_Mirel_B_purity1.lcdSample Name:MM20160805_Mirel_B_puritySample ID:3-21/40-70
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 min
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110mAU
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
MPaB.Conc300nm,4nm
Peak TablePDA Ch1 300nm
Peak# 1 2 3
Total
Ret. Time 14,076 16,370 17,683
Area 23368 30141
1125655 1179163
Height 3172 3315
104860 111347
Conc. 1,982 2,556
95,462
Unit
Mark
Name
54
Lisa 5 Massi-laengu suhte väärtused massispektromeetrias
laeng\hape 0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 4 380 4 494 4 608 4 722 4 836 4 950 5 064 5 178 5 292
1 4 381 4 495 4 609 4 723 4 837 4 951 5 065 5 179 5 293
2 2 191 2 248 2 305 2 362 2 419 2 476 2 533 2 590 2 647
3 1 461 1 499 1 537 1 575 1 613 1 651 1 689 1 727 1 765
4 1 096 1 125 1 153 1 182 1 210 1 239 1 267 1 296 1 324
5 877 900 923 945 968 991 1 014 1 037 1 059
6 731 750 769 788 807 826 845 864 883
7 627 643 659 676 692 708 724 741 757
8 549 563 577 591 606 620 634 648 663
Punasega on näidatud tulemused, millega mass-spektris nähti mõlema aine – ARC-3523 ja
ARC-3524 – piike. Detektori m/z väärtuste ülemine piir on 2000 ja alumine 50.
55
Lisa 6 Fosforüülimisreaktsiooni tulemused TLC plaadil
Fotol on kujutatud TLC plaadil eraldunud fosforüülitud (märgitud sinise noolega) ja
fosforüülimata (märgitud punase noolega) substraadid. Numbritega 1-4 on vastavas
järjestuses tähistatud Aurora A, Aurora A+TPX2, Aurora B ja Aurora B+INCENP, 5-8
tähistavad vastavaid katseid DMSO (kontroll), ARC-3523, ARC-3524 ja MLN8054-ga.
TAMRA-kemptiidi täielikul üleminekul fosforüülitud produkti (ehk täielikul fosforüülimisel)
oleks laik algsetest segudest (ülemine rida) kadunud.
0
5
10
15
20
25
30
DMSO ARC-3523 ARC-3524 MLN8054
Fos
forü
ülit
ud k
empt
iid
(%)
30 min AurA AurA+TPX2 AurB AurB+INCENP
30 min
60 min
1 2 3 4
5 6 7 8
56
0
5
10
15
20
25
30
35
40
DMSO ARC-3523 ARC-3524 MLN8054
Fosf
orüü
litud
kem
ptiid
(%)
60 min AurA AurA+TPX2 AurB AurB+INCENP
57
Resümee
Proteiinkinaasidel on organismis tähtis ülesanne tagada rakkude normaalne elutegevus: nad
koordineerivad rakutsükli tööd, käivitavad valkude transkriptsiooni ning tagavad vajadusel
mitoosi ja apoptoosi toimumise. Katalüüsides rakkudes valkude fosforüülimist, on neil võime
muuta ja seeläbi kontrollida valkude bioloogilist aktiivsust. Proteiinkinaaside kõrgendatud
aktiivsuse ja üleekspresseeritusega rakus on leitud seoseid mitmete tõsiste haigustega, muu
hulgas ka mitmete kasvajavormidega. Lahendusena probleemile nähakse inhibiitoreid –
ühendeid, mis seostuvad proteiinkinaasi sidumistasku(te)sse ja otseselt takistavad
fosforüülülekannet. Inhibiitorid on tõusnud viimase kahe aastakümne jooksul farmakoloogias
ühtedeks huvipakkuvamateks ravimiarendusobjektideks.
Võimalikult selektiivsed ja kõrge afiinsusega ühendid on defektsetest proteiinkinaasidest
põhjustatud haiguste ravimi leidmiseks esimene samm. Inhibiitorite disainis ja sünteesis tuleb
lähtuda proteiinkinaaside struktuurilistest eripäradest, et takistada selle poolt katalüüsitavat
fosforüülrühma ülekannet. Mida rohkem kinaasitaskuid inhibiitor korraga täidab, seda
rohkem vastasmõjusid tal kinaasiga tekib – seega on inhibiitoril ka suurem efektiivsus.
Lisaks, kuna erinevate kinaaside taskud on mõnevõrra erineva struktuuriga, siis on võimalik
inhibiitori disainis seda ära kasutada ja luua võimalikult selektiivsed ühendid. Ühendeid, mis
sisaldavad endas kahe substraadi struktuurseid elemente, nimetatakse biligandseteks
inhibiitoriteks.
Käesoleva töö eesmärgiks oli luua kõrge efektiivsuse ja selektiivsusega ühendid
farmakoloogiliselt huvipakkuva mitootilise kinaasi Aurora B jaoks. Biligandsete inhibiitorite
sünteesil kasutati Fmoc-tahkefaassünteesi ja ainete puhastamisel kõrgefektiivset
vedelikkromatograafiat. HPLC meetodil suudeti eraldada puhtad ühendid, mille struktuurset
korrektsust tõestati UV-Vis spektroskoopiliselt ja ESI-MS mass-spektromeetriliselt.
Biokeemiliste katsete käigus proteiinkinaasiga Aurora B ning sellele struktuurselt lähedase
võrdluskinaasiga Aurora A arendati välja uudne inhibeerimismeetod, mis kasutab õhukese
58
kihi kromatograafia eeliseid ja fluorestsentsmärgistust. Esmakordselt kasutati Aurora B
substraadina TAMRA-kemptiidi, mille fosforüülitud ja fosforüülimata vormide lahutamiseks
kasutati planaarkromatograafiat. Sel viisil sai võimalikuks inhibeerimisreaktsiooni jälgimine
fluorestsentsi detekteerimise kaudu. Meetodi eeliseks on asjaolu, et reaktsioonide tulemusi
saab vaadelda ilma radioaktiivsust kasutamata, nagu seda on teinud paljud varasemad
kasutusel olevad protseduurid.
Tulemustest selgus, et sünteesitud inhibiitoritel oli küll eeldatust nõrgem inhibeerimisefekt
(Aurora B ning Aurora B/INCENP ligi 50% inhibeerimine saavutati 1 µM inhibiitori
kontsentratsiooni juures), kuid täiustamisel võiksid ühendid siiski realiseerida oma biligandset
iseloomu. Uurimistöö käigus välja arendatud mitte-radioaktiivne inhibeerimismeetod võib
edasist rakendust leida Aurora B jaoks arendatavate inhibiitorite, aktivaatori ning isegi
ravimikandidaatide esmasel biokeemilisel iseloomustamisel.
59
Abstract
The Development of Biligand Inhibitors and Non-radioactive Inhibition Assay for
Protein Kinase Aurora B
Protein kinases have one of the most important tasks in the regulation of the cellular
signalling. Among other roles, these enzymes are responsible for coordination of the cell
cycle, and progression of the cell through mitosis or apoptosis. These tasks are accomplished
by protein kinases via catalysis of a reaction termed phosphorylation. During
phosphorylation, a donor (commonly ATP) transfers a phosphoryl group to the acceptor,
resulting in conformational changes of the phosphorylated protein. It has been found that the
abnormally amplification and/or overexpression of protein kinases is connected to various
diseases, including several types of cancer, Alzheimer's disease and diabetes. Inhibitors are
compounds that interfere with the phosphorylation reaction by binding to protein kinases,
therefore preventing binding of the natural substrates. As protein kinases have evolved as a
major class of drug targets, the inhibitors targeting these enzymes have become a subject of
extensive research in pharmacology over the last few decades.
The two most important features of inhibitors are high affinity and high selectivity. The
affinity of inhibitor towards its target depends on the number of interactions between the
inhibitor and the enzyme. The selectivity of inhibitor reflects its ability to recognize
specifically its target and not other enzymes. The structural and conformational differences of
protein kinases should be considered and taken as advantage in the design and synthesis of the
compounds. Protein kinases have two binding sites for the substrates and mostly some extra
binding pockets for the activating/localizing proteins. Thus, inhibitors can be developed that
target simultaneously different regions of the protein kinase catalytic domain.
The aim of this work was to develop effective and selective inhibitors of the mitotic protein
kinase Aurora B. In order to achieve higher selectivity towards Aurora B, three fragments
were included in the inhibitor: INCENP-like fragment, nucleoside analogue (MLN8054) and
a connecting linker. INCENP is a natural activator and substrate of Aurora B; in the structure
60
of inhibitor, a fragment of INCENP was used that is responsible for the correct localization of
Aurora B in vitro. MLN8054 binds to the ATP-binding site of Aurora family protein
kinases.Next, the purification of the compounds with HPLC was performed successfully , and
the structural analysis of the synthesized compounds was carried out by the UV-Vis
spectroscopy and by ESI-MS mass-spectrometry.
In addition, during the biochemical characterization of compounds with Aurora B and a
closely related control kinase Aurora A, a new inhibition assay was developed. The assay
used fluorescently labeled TAMRA-Kemptide as a substrate and took advantages of TLC for
separation of the phosphorylated and non-phosphorylated substrate forms. The
phosphorylation reaction in the presence or absence of inhibitors and activators could be
monitored by both the generation of the phosphorylated product and the disappearance of the
substrate. Furthermore, no radioactive reagents were required for the assay.
Although both synthesized compounds showed lower inhibitory efficiency than expected
(50% inhibition of Aurora B and Aurora B/INCENP at 1 µM concentration of compounds),
upon further modification those could still take full advantage of their biligand nature. The
fluorometric non-radioactive inhibition assay developed during the project could be well
applicable for further screening of selective activators, inhibitors or even drug candidates
targeting Aurora B.
61
Kinnitusleht
Kinnitan, et
• koostasin uurimistöö iseseisvalt. Kõigile töös kasutatud teiste autorite töödele ja
andmeallikatele on viidatud;
• olen teadlik, et uurimistööd ei edastata teistele tulu teenimise eesmärgil ega jagata
teadlikult plagieerimiseks.
…………………………………………….…………………………
kuupäev / nimi / allkiri
Tunnistan uurimistöö kaitsmisvalmiks.
Juhendaja
………………………………………….……………..……………..
kuupäev / nimi / allkiri