18
กกกกกกกกกกกกกกกกกกกกกกกกกก protein tyrosine phosphatase กกกกกกกกกกกกกกกกกกกก บบบบบบบบ protein tyrosine phosphatase บบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ (signal transcuction pathway) บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTP บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ tyrosin phosphorylation (บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ) บบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTP บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTP บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTK บบบ บบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบ PTP บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTP บบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบ PTP บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTP บบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTP บบบบบบบ in vivo บบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTP1B บบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบ insulin บบบบบบบบบ integrin บบบบบบบบบบบบบบบ proteomic บบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTP บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ PPT บบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTP บบบบบบบบบบบบบบ activity-based PTP probe บบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบบ PTP D 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

Protein Tyrosine Phosphatases(2)

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

การศึ�กษากระบวนการทำ�างานของ protein tyrosine phosphatase ด้�วยกระบวนการทำางเคมี�

บทคั�ดย่�อ protein tyrosine phosphatase เป็�นเอนไซม์�สำ��คั�ญในกระบวนสำ�งสำ�ญญ�ณ ซ��งท��หน��ท �เป็�นตั�วกระตั"�นก�รท��ง�นท �สำ��คั�ญในว#ถี กระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณ (signal

transcuction pathway) ก�รบกพร�องหร&อม์ ก�รท��ง�นท �ผิ#ดป็กตั#อของเอนไซม์� PTP ม์�กน��ไป็สำ)�คัว�ม์บกพร�องของกระบวนก�ร tyrosin phosphorylation (ก�รเตั#ม์หม์)�ฟอสำเฟตัให�ก�บไทโรซ น) ซ��งสำ�ม์�รถีพ�ฒน�ไป็สำ)�ก�รเก#ดโรคัหร&อคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ในม์น"ษย่�ได� ในป็.จจ"บ�นม์ ก�รคั�นพบและจ��แนก PTP หล�ย่ซ��งม์ บทบ�ทในแง�ก�รเป็�นเป็2�หม์�ย่ของก�รร�กษ�โรคัหร&อคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#หล�ย่ชน#ด แตั�ด�วย่ธรรม์ช�ตั#ของ PTP ซ��งสำ�ม์�รถีท��หน��ท �สำ�งเสำร#ม์หร&อตั�อตั��นก�รท��ง�นก�รสำ�งสำ�ญญ�ณของ PTK ได� ซ��งเป็�นจ"ดสำ��คั�ญอ กจ"ดหน��งท �ตั�องคั��น�งถี�งในกระบวนก�รศึ�กษ�ก�รท��ง�นของ PTP และกระบวนก�รศึ�กษ�ก�รท��ง�นของ PTP โดย่เฉพ�ะในแง�ก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระด�บเซลล�ในสำภ�วะก�รท��ง�นป็กตั#และในกระบวนก�รเก#ดโรคัย่�งเป็�นป็ระเด8นท �ท��ท�ย่ของน�กว#จ�ย่หล�ย่กล"�ม์ และกระบวนก�รหน��งท �น�กว#ทย่�ศึ�สำตัร�ให�คัว�ม์สำนใจคั&อก�รศึ�กษ�ท�งเคัม์ เพ&�อคั�นห�ตั�วย่�บย่�9งก�รท��ง�นของเอนไซม์� PTP เพ&�อน��ไป็ป็ระย่"กตั�สำ��หร�บก�รคัวบคั"ม์และก�รร�กษ�โรคัท �เก#ดจ�กคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของ PTP และก�รศึ�กษ�ก�รท��ง�นของ PTP ในสำภ�วะ in vivo ในก�รศึ�กษ�คัร�9งน 9ม์ ว�ตัถี"ป็ระสำงคั�เพ&�อศึ�กษ�บทบ�ทของ PTP1B ในแง�ก�รคัวบคั"ม์เอนไซม์� insulin และโป็รตั น integrin โดย่ใช�กระบวนก�ร proteomic เพ&�อศึ�กษ�บทบ�ทของ PTP ในสำภ�วะป็กตั#และระหว��งกระบวนก�รเก#ดพย่�ธ#สำภ�พของโรคั จ�กข�อม์)ลก�รเป็ล �ย่นแป็ลงอ�นเก �ย่วเน&�องก�บก�รท��ง�นของ PPT น�9นจะช�วย่ให�ม์ คัว�ม์ก��วหน��ในก�รพ�ฒน�เป็2�หม์�ย่ของก�รร�กษ�คัว�ม์ผิ#ดป็กอ�นเก �ย่วเน&�องก�บกระบวนก�รท��ง�นของ

PTP รวม์ถี�งก�รพ�ฒน� activity-based PTP probe เพ&�อก�รว#เคัร�ะห�ก�รท��ง�นของ PTP

D 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. บทน��

กระบวนก�ร Protein tyrosine phosphorylation เป็�นกระบวนก�รด�ดแป็ลงโคัรงสำร��งของโป็รตั นในช�วงหล�งก�รแป็ลรห�สำ (post translation modification) ซ��งพบว��โป็รตั นด�งกล��วจะม์ motif ท �ม์ คัว�ม์สำ��คั�ญในด��นก�รเก#ดป็ฏิ#ก#ร#ย่�ระหว��งโป็รตั นก�บโป็รตั น รวม์ถี�งก�ร

Page 2: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

ก��หนดตั��แหน�งบนเซลล�ของโป็รตั น (cellular localization) ก�รคัวบคั"ม์คัว�ม์เสำถี ย่รของโป็รตั น และสำ#�งท �สำ��คั�ญท �สำ"ดคั&อก�รท��หน��ท �คัวบคั"ม์ก�รท��ง�นของเอนไซม์� ซ��งกระบวนก�ร tyrosine phophorylation ในอ�ตัร�ท �เหม์�ะสำม์จะน��ไป็สำ)�ก�รเป็ล �ย่นแป็ลงโคัรงสำร��งและก�รท��ง�นของโป็รตั นหล�ย่ชน#ด ระด�บก�รท��ง�นของเอนไซม์� PTP ท �เหม์�ะสำม์เป็�นก"ญแจสำ��คั�ญในก�รท��ง�นท �เหม์�ะสำม์ของโป็รตั นท �ม์ บทบ�ทสำ��คั�ญในสำร ระว#ทย่�ของเซลล� ซ��งกระบวนก�ร protein tyrosine phophorylation น 9จะถี)กคัวบคั"ม์โดย่เอนไซม์� protein tyrosine kinase (PTK) อ กตั�อหน��ง

ซ��งเอนไซม์�ด�งกล��วม์ หน��ท �ในก�รสำล�ย่หม์)� phosphoryl ให�ก�บ tyrosine และเอนไซม์� protein

tyrosine phosphatase (PTPs) จะม์ หน��ท �ก��จ�ดหม์)� phophoryl ซ��งกระบวนก�รท��ง�นของเอนไซม์�ท�9งสำองชน#ดน 9จะม์ ร)ป็แบบก�รท��ง�นท �สำอดคัล�องก�นในสำภ�วะป็กตั# และม์ บทบ�ทเก �ย่วข�องก�บกระบวนก�รท�งสำร ระว#ทย่�ท �สำ��คั�ญของเซลล� เช�น ก�รเจร#ญเตั#บโตัของเซลล�, ก�รพ�ฒน�ของเซลล�, กระบวนก�รเม์ตั�บอล#สำม์, และก�รด��เน#นของเซลล�ผิ��นว�ฏิจ�กรเซลล� (cell cycle), กระบวนก�รสำ&�อสำ�รระหว��งเซลล�, ก�รเคัล&�อนย่��ย่ของเซลล�, ก�รถีอดรห�สำย่ น, กระบวนก�รท��ง�นของระบบล��เล ย่งไอออน, ระบบภ)ม์#คั"�ม์ก�น

ก�รตั�ย่ของเซลล�แบบ apoptosis / ก�รอย่)�รอดขอเซลล� โดย่พบว��ป็.จจ�ย่ตั��งๆ (จ�กพ�นธ"กรรม์/สำ#�งแวดล�อม์) ล�วนสำ�ม์�รถีสำ�งผิลกระทบตั�อก�รคัวบคั"ม์ระด�บก�รท��ง�นของเอนไซม์�ชน#ดน 9ให�ม์ ระด�บก�รท��ง�นท �แป็รผิ�นและสำ�ม์�รถีท��ให�ม์ ก�รท��ง�นเก#นหร&อบกพร�องไป็จ�กเด#ม์ ซ��งคัว�ม์แตักตั��งของระด�บก�รท��ง�นของเอนไซม์� PTP

ระหว��งบ"คัคัล อ�นเป็�นเหตั"ให�เก#ดคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#หร&อโรคับ�งโรคั เช�น ก�รท��ง�นท �ผิ#ดป็กตั#ของ PTP ในเน&9อเย่&�อบ�งชน#ด ซ��งจะสำ�งผิลแตักตั��งก�นไป็ตั�ม์ชน#ดของเน&9อเย่&�อ ก�รท �ม์ ระด�บอ�ตัร� protein tyrosin phosphorylation สำ)งเก#นกว��ป็กตั#สำ�ม์�รถีสำ�งผิลให�เก#ดม์ะเร8งได�หล�ย่ชน#ด, และก�รท��ง�นท �ตั���กว��ป็กตั#สำ�ม์�รถีก�อให�เก#ดเบ�หว�นชน#ดท � 2

ก�รให�คัว�ม์สำนใจในกระบวนก�ร protein tyrosine phosphorylation เร#�ม์ตั�นจ�กก�รศึ�กษ�กระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล�ของ PTKs รวม์ถี�งผิลท �เก#ดข�9นจ�กก�รกระตั"�นก�รท��ง�นโดย่ PTK แตั�ในก�รศึ�กษ�คัร�9งน�9นพบว��อ�ตัร�ของกระบวนก�ร protein tyrosine

phosphorylation จะถี)กคัวบคั"ม์โดย่ก�รท��ง�นของ PTK อ กทอดหน��ง ซ��งน��ไป็สำ)�ก�รพย่�ม์ย่�ม์ศึ�กษ�และท��คัว�ม์เข��ใจกระบวนก�รท �เก �ย่วข�องก�บก�รท��ง�นของ PTP เพ&�อน��องคั�คัว�ม์ร) �ด�งกล��วไป็ใช�ร�วม์ก�บคัว�ม์ร) �ท �ได�จ�กก�รศึ�กษ�ก�รท��ง�นและหน��ท �ของ

Page 3: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

PTK เพ&�อเข��ใจคัว�ม์สำ��คั�ญและหน��ท �ของเอนไซม์�สำองชน#ดน 9ในระบบสำร ระว#ทย่�ของเซลล�ตั�อไป็ แตั�ในคัว�ม์เป็�นจร#งแล�ว เอนไซม์�หร&อโป็รตั นในกล"�ม์ PTP เป็�นเอนไซม์�กล"�ม์ใหญ� (>100) ซ��งม์ คัว�ม์ซ�บซ�อนท�9งโคัรงสำร��งและก�รท��ง�นเช�นเด ย่วก�บเอนไซม์�ในกล"�ม์

kinase แตั�ข�อแตักตั��งระหว��ง PTP ก�บเอนไซม์� protein kinase คั&อ Proteinkinase จะม์ คัว�ม์จ��เพ�ะตั�อไทโรซ นและม์ ล��ด�บกรดอะม์#โนท �ม์ คัว�ม์คัล��ย่คัล�งก�บเอนไซม์� serine/threonine specific kinase แตั�สำ��หร�บ PTK จะไม์�ม์ ล��ด�บกรดอะม์#โนด�งกล��ว และไม์�พบล��ด�บกรดอะม์#โนท �ม์ คัว�ม์คัล��ย่คัล�งก�บเอนไซม์� phosphatase ท �ม์ คัว�ม์จ��เพ�ะคั�อนข��งตั��� เช�น acid หร&อ alkaline phosphatase และจ"ดเด�นของเอนไซม์�ใน PTP superfamily คั&อก�รม์ ล��ด�บกรดอะม์#โน (H/V)C(X)5R(S/T) หร&อท �เร ย่กว�� PTP signature motif ซ��งเป็�น catalytic domain

(โดเม์นท �ท��หน��ท �เร�งป็ฏิ#ก#ร#ย่�) ซ��งล��ด�บกรดอะม์#โนด�งกล��ว รวม์ถี�งคัว�ม์จ��เพ�ะตั�อสำ�รตั�9งตั�นเป็�นล�กษณะอน"ร�กษ�ท �จะพบใน PTP superfamily เท��น�9น

จ�ก�รศึ�กษ�เก �ย่วก�บบทบ�ทและก�รจ��แนกโป็รตั นในกล"�ม์ PTP ม์�กว��สำ#บห��ป็< ด�วย่คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รก��จ�ดหม์)� phosphoryl จ�กสำ�วนท �เป็�น tyrosine บนโป็รตั น โดย่ PTP

สำ�ม์�รถีท��หน��ท � เป็=ด“ ” หร&อ ป็=ด“ ” สำว#ตัซ�ในกระบวนสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล�ได� ด�งเช�นในกรณ ก�รทดลองท �ท��ให�เก#ดก�รหล�ย่ของ SHP-1 ซ��งสำ�ม์�รถีน��ไป็สำ)�ก�รบกพร�องของระบบภ)ม์#คั"�ม์ก�นอย่��งร"นแรงซ��งน��ไป็สำ)�ก�รเพ#�ม์ข�9นของฟ<โนไทป็>ชน#ด moth-eaten ในหน)ทดลอง ด�งน�9นคั�ดว�� SHP-1 จ�งม์ หน��ท �ในก�รกดก�รท��ง�นของก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระบบไซโตัไคัน� ซ��งก�รท��ง�นท �บกพร�องด�งกล��วท��ให�เก#ดก�รสำ)ญเสำ ย่ก�รคัวบคั"ม์ระด�บ tyrosine phosphorylation อ�นสำ�ม์�รถีน��ไป็สำ)�ก�รเพ#�ม์อ�ตัร�ก�รแบ�งตั�วเพ#�ม์จ��นวน

โดย่ FAP-1 Fas-associated phosphatase 1) ซ��งเป็�น PTP ชน#ดท �อย่)�ภ�ย่ในเซลล� จะไป็จ�บก�บก�บหม์)�คั�ร�บอกซ#ลของ Fas ผิ��น PDZ domain และสำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รสำ�งสำ�ญญ�ณท �เก#ดจ�ก

Fas ซ��งจะน��ไป็สำ)�ก�รตั�ย่ของเซลล�แบบ apoptosis ได� และพบว��หน)ทดลองท �ข�ด PTP1B จะม์ คัว�ม์ไวตั�อระด�บอ#นซ)ล#นม์�กข�9นและจะท��ให�เก#ดก�รตั��นท�นตั�อคัว�ม์อ�วน จ�งสำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว�� PTP1B จะท��หน��ท �ในก�รกดก�รท��ง�นของกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณท �เก �ย่วข�องก�บระด�บของอ#นซ)ล#น และจ�กคัว�ม์สำ�ม์�รถีของผิล#ตัภ�ณฑ์�จ�กย่ น src, lck

และ neu, ซ�งเป็�น oncogen สำ�ม์�รถีกดก�รท��ง�นของ PTK ได� และด�วย่คัว�ม์สำ�ม์�รถีและก�รท��ง�นของ PTP ซ��งสำ�ม์�รถีกระตั"�นก�รสำร��งโป็รตั นท �สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รแสำดงออกของ oncoprotein ได� (หร&อท เร ย่กว�� tumor suppressor genes) และจ�กก�รทดลองในสำภ�วะท �

Page 4: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

เก#ดม์ะเร8งล��ไสำ�ใหญ�พบว��ม์ ผิลก�รทดลองหล�ย่ก�รทดลองท �บ�งช 9ว�� PTP ม์ คั"ณสำม์บ�ตั#ในก�รกดกระบวนก�รพ�ฒน�ของเซลล�ม์ะเร8งได�

นอกจ�กน�9นย่�งม์ ก�รศึ�กษ�พบว�� PTP หล�ย่ชน#ดม์ ก�รท��ง�นท �สำ�งเสำร#ม์สำ�ญญ�ณจ�กสำ�รกระตั"�นก�รแบ�งเซลล� (mitogen) ซ��งสำ�งเสำร#ม์ให�เก#ดกระบวนก�รเป็ล �ย่นแป็ลงของเซลล�ได�ง��ย่ข�9น เช�น ก�รสำน�บสำน"นก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น CD45 และน��ไป็สำ)�ก�ร

dephosphorylation และกระตั"�น srs family PTKs ซ��งม์ คัว�ม์สำ��คั�ญในก�รกระตั"�นก�รท��ง�นและพ�ฒน�ก�รของ T และ B lymphocyte จ�กก�รศึ�กษ�โป็รตั น SHP-2 และโป็รตั นท �เป็�น

homologue ในแม์ลงหว � (Drosophila) พบว��เป็�นตั�วกระตั"�นก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น growth

factor เม์&�อไม์�น�นม์�น 9ม์ ก�รคั�นพบว��ก�รเก#ดคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของ SHP-2 (โดย่ก�รกล�ย่) จะสำ�งผิลให�เก#ดโรคัท�งพ�นธ"กรรม์ท �ม์ ช&�อว�� Noonan syndrome และก�รศึ�กษ�ล��สำ"ดพบว��

PRL-3 ม์ คัว�ม์เก �ย่วข�องก�บกระบวนก�รแพร�กระจ�ย่ (metastasis) ของม์ะเร8งล��ไสำ� (colorectal cancer)

จ�กก�รคั�นพบท �กล��วม์�ในข��งตั�นได�แสำดงให�เห8นว�� PTP ม์ บทบ�ทในกระบวนก�รท�งช วภ�พท �หล�กหล�ย่ในสำภ�วะ in vivo ด�งน�9นก�รเก#ดคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของ PTP จ�งเป็�นสำ�เหตั"ของพย่�ธ#ก��เน#ดของโรคัไม์�ตั#ดเช&9อหล�ย่โรคัในม์น"ษย่� แตั�ในคัว�ม์เป็�นจร#ง จ�กข�อม์)ลจ โนม์ของม์น"ษย่�ท��ให�เร�ทร�บว��ในจ โนม์ของม์น"ษย่�ม์ ย่ นท �ก��หนดรห�สำโป็รตั นในกล"�ม์ PTP กว�� 100 ย่ น และย่�งไม์�สำ�ม์�รถีทร�บบทบ�ทของย่ นเหล��น 9อย่��งสำม์บ)รณ� ป็ระกอบก�บกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล�เป็�นกระบวนก�รท �ม์ คัว�ม์หล�กหล�ย่และซ�บซ�อน ด�งน�9นจ�งม์ คัว�ม์เป็�นไป็ได�ว��โป็รตั น PTP หน��งตั�วอ�จม์ หน��ท �เก �ย่วข�องก�บหล�ย่กระบวนก�ร และในท�งกล�บก�นก8เป็�นไป็ได�ว��ในหน��งกระบวนก�รอ�จตั�องใช� PTP

หล�ย่ชน#ดในก�รสำ�งสำ�ญญ�ณ นอกจ�กน�9น PTP ย่�งสำ�ม์�รถีท��หน��ท �กระตั"�นรวม์ถี�งกดก�รท��ง�นของกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระด�บเซลล�ได� น��นจ�งเป็�นอ"ป็สำรรคัอ กป็ระก�รหน��งในก�รศึ�กษ�บทบ�ทท�งสำร ระว#ทย่�ระด�บเซลล�ของ PTP ท�9งในสำภ�วะป็กตั#และสำภ�วะท �เก#ดโรคั

ในป็.จจ"บ�นกระบวนก�รศึ�กษ�ท �น#ย่ม์ใช�ในก�รศึ�กษ�บทบ�ทของ PTP คั&อก�รท��ให�เก#ด

gene knockout หร&อก�รท��ให�เก#ดก�ร over expression (ม์ ระด�บก�รแสำดงออกของย่ นม์�กกว��ป็กตั#) แตั�กระบวนก�รด�งกล��วก8ย่�งคังม์ ข�อจ��ก�ดหล�ย่ป็ระก�ร ด�งเช�นก�รศึ�กษ�ด�วย่ก�รท��ให�ย่ น over expression ม์�กจะเก#ดผิลข��งเคั ย่งอ�นไม์�พ�งป็ระสำงคั� และ

Page 5: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

ก�รกล�ย่แบบ gene knockout ในสำ�ตัว�ทดลองม์�กจะม์ ผิลข��งเคั ย่งท �ร"นแรงอ�นเก#ดจ�กคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ในกระบวนก�รพ�ฒน�ของตั�วอ�อน ด�งน�9นก�รศึ�กษ�โดย่กระบวนก�รท�งเคัม์ เช�น ก�รใช�สำ�รเคัม์ ท �ม์ อน"ภ�คัขน�ดเล8กแตั�สำ�ม์�รถีท��หน��ท �ในก�รย่�บย่�9งก�รท��ง�นของเป็2�หม์�ย่หร&อย่�บย่�9งกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล�ท �ตั�องก�รศึ�กษ�จ�งเป็�นอ กกระบวนก�รหน��งท �น��สำนใจในป็.จจ"บ�น ซ��งก�รศึ�กษ�โดย่กระบวนก�รด�งกล��วม์ ข�อด หล�ย่ป็ระก�ร ได�แก� ท��ได�ง��ย่ไม์�ซ�บซ�อน, รวดเร8ว, สำ�ม์�รถีป็ร�บระด�บได�และย่�อนกล�บได� นอกจ�กน�9นสำ�รย่�บย่�9งขน�ดโม์เลก"ลเล8กเหล��น 9สำ�ม์�รถีก�อให�เก#ดก�รเป็ล �ย่นแป็ลงของเป็2�หม์�ย่ได�โดย่ไม์�ตั�องม์ ก�รด�ดแป็ลงท�งพ�นธ"กรรม์ของสำ�ตัว�ทดลองเป็�นสำ�เหตั"ของก�รผิ#ดพล�ดของผิลก�รทดลองด�งท �ได�กล��วม์�แล�ว และจ�กก�รพ�ฒน�ขององคั�คัว�ม์ร) �เก �ย่วก�บสำ�รในก�รย่�บย่�9งก�รท��ง�นของเอนไซม์�กล"�ม์

protein kinase ท��ให�เร�สำ�ม์�รถีท��คัว�ม์เข��ใจเก �ย่วก�บสำ�รตั�9งตั�นและคัว�ม์สำ��คั�ญท�งสำร ระว#ทย่�ของโป็รตั นในกล"�ม์น 9ได�ด ย่#�งข�9น

และตั�อไป็น 9ข��พเจ��จะกล��วโดย่สำร"ป็เก �ย่วก�บกระบวนก�รท��ง�นของสำ�รเคัม์ และก�รคั�ดเล&อกสำ�รเคัม์ ในก�รศึ�กษ�คัว�ม์สำ��คั�ญเช#งพ�นธ"ศึ�สำตัร�ของ PTP1B โดย่กระบวนก�รด�งกล��วท��ให�ก�รศึ�กษ�บทบ�ทของ PTP ในกระบวนก�รเจร#ญของเซลล�ในสำภ�วะท �แตักตั��งก�น (เซลล�ป็กตั#และผิ#ดป็กตั#หร&อเป็�นโรคั) เป็�นสำ#�งท �เป็�นไป็ได�

2. กระบวนการศึ�กษาด้�วยสารเคมี�และการศึ�กษาบทำบาทำของ PTP1B ในการส�งส�ญญาณ

PTP1B เป็�นโป็รตั นท �จ�ดอย่)�ในกล"�ม์ PTP family ซ��งม์ พบในเน&9อเย่&�อหล�ย่ชน#ด จ�กก�รศึ�กษ�ก�อนหน��พบว��ห�กหย่"ดก�รแสำดงออกของย่ นท �ก��หนดรห�สำโป็รตั น PTP1B จะสำ�งผิลให�เก#ดคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของหน)ทดลอง และพบว��ก�รย่�บย่�9งก�รท��งนของ PTP1B ช�วย่ให�ก�รร�กษ�เบ�หว�นและโรคัอ�วนได�ผิลด ย่#�งข�9น โดย่จะพบว��ระด�บกล)โคัสำในเล&อดหล�งก#นอ�ห�รในหน)กล"�ม์ท �ท��ก�ร knockout ย่ นด�งกล��วจะม์ ระด�บกล)โคัสำตั���กว��หน)ป็กตั# จ�งสำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว��ก�รท��ง�นของ PTP1B ม์ ผิลตั�อคัว�ม์ไวของระด�บน�9�ตั�ลในเล&อดและกระบวนก�รด&9อตั�อฮอร�โม์นอ#นซ)ล#น ซ��งคั�ดว��เก#ดจ�กกระบวนก�ร tyrosine

phosphorelation บนตั�วร�บอ#นซ)ล#นในตั�บและกล��ม์เน&9อในระย่ะเวล�ท �น�นเก#นป็กตั#

Page 6: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

จ�กก�รคั�นพบว��หน)ท �ม์ ก�รท��งน�ของ PTP1B ด�อย่กว��ป็กตั#จะม์ ระด�บไตัรกล เซอไรด�ตั���กว��หน)ป็กตั# และม์ อ�ตัร�ก�รเพ#�ม์ของน�9�หน�กตั�วน�อย่ม์�กเม์&�อได�ร�บอ�ห�รท �ม์ ไขม์�นสำ)ง

จ�กป็ร�กฏิก�รณ�ด�งกล��วสำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว��ตั�วย่�บย่�9ง PTP สำ�ม์�รถีท��หน��ท �ได�ท�9งก�รลดคัว�ม์อ�วนและสำ�ม์�รถีแก�ไขก�รด&9อตั�อฮอร�โม์นอ#นซ)ล#นซ��งน�บว��เป็�นโอก�สำใหม์�ในก�รร�กษ�อ�ก�รโรคัอ�วนและเบ�หว�น ด�วย่คัว�ม์ร) �คัว�ม์เข��ใจด�งกล��วท��ให�โป็รตั น

PTP1B เป็�นท �สำนใจอย่��งกว��งขว�งในวงก�รเภสำ�ชกรรม์ในฐ�นะเป็2�หม์�ย่ในก�รร�กษ�โรคัและคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ท �พบม์�กท �สำ"ดในม์น"ษย่� อ�นได�แก�โรคัอ�วนและเบ�หว�น type2

น��นเอง

แตั�อย่��งไรก8ตั�ม์นอกเหน&อจ�กบทบ�ทในก�รสำ�งสำ�ญญ�ณของอ#นซ)ล#นและเลป็ตั#น (leptin) แล�ว PTP1B ย่�งม์ หน��ท �ในกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณอ&�นๆ อ กหล�ย่ระบบ เช�น ก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระบบ growth factor และ integrin โดย่กระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณท �เก �ย่วเน&�องก�บ Integrin น�9นจะน��ไป็สำ)�ก�รเป็ล �ย่นแป็ลงโคัรงสำร��งของ actin ซ��งเป็�นสำ�วนท �ท��หน��ท �เป็�นโคัรงร��งคั�9�จ"นของเซลล� และม์ บทบ�ทเก �ย่วข�องก�บก�รเคัล&�อนท �, ก�รเจร#ญเตั#บโตัของเซลล� และก�รแพร�กระจ�ย่ของเซลล�ม์ะเร8ง รวม์ถี�งคัว�ม์สำ�ม์�รถีของเซลล�ในก�รหลบเล �ย่งจ�กกระบวนก�รตั�ย่แบบ apoptosis (ก�รตั�ย่ของเซลล�โดย่ไม์�ก�อให�เก#ดพย่�ธ#สำภ�พ) นอกจ�กน�9นกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณของ growth factor ย่�งสำ�ม์�รถีท��ง�นร�วม์ก�บกลไกก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระบบ integrin ด�วย่ ด�งเช�นกรณ ก�รร�บสำ�ญญ�ณเพ&�อตัอบสำนองตั�ออ#นซ)ล#น, platlet-derived growth factor, epidermal growth factor,

fibroblast growth factor และ vascular endothelial growth factor แตั�จ�กก�รศึ�กษ�ก�อนหน��ท �พบว��ม์ คัว�ม์ข�ดแย่�งก�นระหว��งองคั�คัว�ม์ร) �เก �ย่วก�บหน��ท �ของ PTP1B ในแตั�ละก�รศึ�กษ� และเป็�นไป็ได�ท �ว��ก�ร knockout หร&อก�ร over expression ของย่ นท �เก �ย่วข�องก�บ

PTP1B จะให�ผิลก�รทดลองท �สำร"ป็ออกม์�ได�แตักตั��งก�น ซ��งเก#ดจ�กก�รสำ�งสำ�ญญ�ณข��ม์ระหว��งระบบ growth factor และ integrin-mediated signaling pathway ซ��งม์ คัว�ม์เก �ย่วข�องก�บกระบวนก�รคัวบคั"ม์และก�รท��ง�นของระบบสำร ระว#ทย่�ของเซลล� เช�น

ก�รเจร#ญเตั#บโตัของเซลล�, ก�รร"กร�นและก�รเคัล&�อนท �ของเซลล� ซ��งเป็�นผิลจ�กระบบก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น integrin

เม์&�อไม์�น�นม์�น 9เร�ได�คั�นพบสำ�รเคัม์ ท �สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTP1B ได�อย่��งจ��เพ�ะ (compound 1, ภ�พท � 1) โดย่ม์ คั�� Ki เท��ก�บ 2.4 nM สำ��หร�บ PTP1B และพบว��สำ�ม์�รถี

Page 7: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

ย่�บย่�9ง PTP1B ได�อย่��งจ��เพ�ะเม์&�อทดสำอบเป็ร ย่บเท ย่บก�บ PTPs ชน#ดอ&�นๆ โดย่หม์)� difluorophosphonate ท �ม์ ป็ระจ"เป็�นลบ ซ��งม์ คัว�ม์จ��เพ�ะก�บ active site ของ PTP1B สำ)ง เพ&�อเพ#�ม์คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รแทรกเข��สำ)�เซลล�ของสำ�รท �สำ�งเคัร�ะห�ข�9น เร�ได�ท��ก�รเพ#�ม์เตั#ม์ penetrating peptide (D) Arg8 โดย่เพ#�ม์ disulfide bridge ซ��งเร ย่กสำ�รชน#ดน 9ว�� compound II และชน#ดท �เตั#ม์ lipophilic fatty acid (compound III)

จ�กก�รทดสำอบคัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รแทรกตั�วผิ��นเซลล�ของ compound II และ III นอกจ�กน�9นย่�งพบว�� compound II และ III ม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รกระตั"�นระด�บกระบวนก�ร tyrosine phosphoerylation บนตั�วร�บอ#นซ)ล#นชน#ด h (Insulin receptor h; IRh) และ insulin receptor substrate 1 (IRS-1) ให�สำ)งข�9นเป็�น 2 เท�� และในก�รทดสำอบสำ�รท�9งสำองชน#ดในเซลล�เพ�ะเล 9ย่งท �ม์ คัว�ม์ไวตั�ออ#นซ)ล#น (insulin-sensitive cell line) พบว��ตั�วย่�บย่�9งท�9งสำองชน#ดน 9สำ�ม์�รถีกระตั"�นระด�บก�ร phosphorylation ของ IRh และ IRS-1, ก�รกระตั"�น Akt และ Erk1/2, ก�ร translocation ของ Glut4, ก�รขนสำ�งกล)โคัสำเข��สำ)�เซลล�, ก�รกระตั"�น transcription

ของ Elk1 และก�รแบ�งเซลล�ซ��งเป็�นผิลจ�กก�รกระตั"�นของอ#นซ)ล#น และสำ#�งท �สำ��คั�ญท �สำ"ดคั&อคัว�ม์สำ�ม์�รถีของตั�วย่�บย่�9งตั�อกระบวนก�รท�งสำร ระว#ทย่�ในเซลล� (เช�น ก�รเพ#�ม์�ข�9นเป็�นสำองเท��ของก�ร phosphorylation ของ IRh และ IRS-1) ซ��งสำอดคัล�องก�บผิลก�รศึ�กษ�โดย่กระบวนก�ร antisense –mediated reduction ใน PTP1B และ PTP1B knockout ในหน)ทดลอง

ซ��งพบว��ม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รลดอ�ตัร�ก�รเก#ดเบ�หว�นและก�รอ�วน จ�กผิลก�รทดลองด�งกล��วจ�งสำร"ป็ได�ว��ตั�วย่�บย่�9งท�9งสำองชน#ดสำ�ม์�รถีท��หน��ท �เล ย่นแบบกระบวนก�รกระตั"�นโดย่อ#นซ)ล#น และม์ แนวโน�ม์ในก�รใช�เป็�นสำ�รตั��นเบ�หว�นได� และนอกจ�กน�9นข�อม์)ลจ�กก�รศึ�กษ�ขอเร�ย่�งบ�งช 9ว��คัวรใช�ตั�วย่�บย่�9งด�งกล��วเพ&�อศึ�กษ�กระบวนก�รท��ง�นและบทบ�ทของ PTP1B ในระบบก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระบบอ&�นเพ#�ม์เตั#ม์

Page 8: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

จ�ก�รศึ�กษ�บทบ�ทของ PTP1B ในกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��นกระบวนก�ร Integrin-

mediated signaling pathway ด�วย่ compound II และ compound III พบว��ก�รย่�ดเก�ะระหว��ง

integrin และ fibronectin สำ�ม์�รถีกระตั"�นกระบวนก�ร focal adhesion และก�รก�อตั�วของ actin

fiber เพ&�อตัอบสำนองตั�อคัว�ม์เคัร ย่ด ซ��งสำ�งผิลให�เก#ดก�รแผิ�ขย่�ย่ของเซลล�และก�รเคัล&�อนท �ของเซลล� ก�รให� L cell ได�ร�บ compoundII และ compound III สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รเคัล&�อนท �ของเซลล�ได�ตั�ม์ระด�บคัว�ม์เข�ม์ข�นของตั�วย่�บย่�9งโดย่ก�รข�ดขว�งกระบวนก�รก�รก�อโคัรงร��งของ fibronectin จ�กผิลก�รทดสำอบด�งกล��วสำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว�� PTP1B ม์ ทบ�ทในก�รคัวบคั"ม์แบบ positive regulation ในก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น integrin ซ��งจ��เป็�นตั�องอ�ศึ�ย่ก�รท��ง�นของ PTP1B

นอกเหน&อจ�กก�รกระตั"�นผิ��น integrin แล�ว ย่�งสำ�ม์�รถีท��ให�เก#ดก�ร kinase ของโป็รตั นใน Src family และ focal adhesion kinase (FAK) ร�วม์ก�นหร&อเป็�นอ#สำระตั�อก�น ก�ร phosphorylate

ของโป็รตั น Src และ FAK ย่�งสำ�ม์�รถีกระตั"�นโป็รตั นชน#ดอ&�นๆ เช�น p130Cas (Crk associated

substrate) สำ�งผิลให�เก#ดก�รกระตั"�นของระบบสำ�งสำ�ญญ�ณท �ป็ล�ย่ท�ง เช�น extracullular

signal-regulated kinase (ERK) 1 และ 2 ด�งน�9นจ�งคัวรท��ก�รศึ�กษ�ผิลก�รย่�บย่�9งโป็รตั น PTP1B

ด�วย่ตั�วย่�บย่�9ง compound II ตั�อกระบวนก�ร phosphorylation ของ Src, FAK, p130C และ ERK

Page 9: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

ในก�รศึ�กษ�ผิลของ compound II ตั�อก�ร phosphorylation ของ Src คัร�9งแรกของพวกเร�

พบว�� Src สำ�ม์�รถีถี)กคัวบคั"ม์ระด�บก#จกรรม์ได�จ�กกระบวนก�ร phosphorylation ถี�งได� ณ tyrosine residue สำองตั��แหน�ง ได�แก� autophophorylation ของ kinase domain ของตั�ว Src เอง

และก�ร kinase บน Tyr527 ท �ป็ล�ย่ C-terminal โดย่ C-terminal Src kinase (CSK) inactive Src ซ��งก�ร phosphorylation ของ Ty527 น 9เป็�นผิลจ�กก�รศึ�กษ�กระบวนก�รย่�บย่�9งโดย่ Compound

II น��นเอง เม์&�อ Ty527 ถี)กเตั#ม์หม์)�ฟอสำเฟตัแล�วจะท��ให�เก#ดก�รท��ป็ฏิ#ก#ร#ย่�ก�บ SH2 domain

บน Src ซ��งสำ�งผิลให�โม์เลก"ลของ Src ซ��งอย่)�ในร)ป็แบบป็=ด (closed comformation) ซ��งเป็�นสำ�เหตั"ท��ให� active domain ไม์�สำ�ม์�รถีสำ�ม์ผิ�สำก�บสำ�รตั�9งตั�นได� จ�กน�9นก�รกระตั"�นของ SH2

domain โดย่ก�รเตั#ม์ฟอสำเฟตัจะสำ�งผิลให�เก#ดก�รขจ�ดฟอสำเฟตัท �ป็ล�ย่ C-terminal ของโป็รตั นโดย่เอนไซม์� PTPs ท �ม์ คัว�ม์จ��เพ�ะ ด�งแสำดงในภ�พท � 2 และก�รให�เซลล�ได�ร�บ

Compound II ในอ�ตัร� 5 nM ซ��งท��ให�ม์ คั�� Ki เป็�นสำองเท��ของ Ki ป็กตั#ของม์�น จะสำ�งผิลให�เก#ดก�ร phosphorylation ของ Tyr527 สำ)งข�9นแตั�ไม์�สำ�งผิลใดๆ ตั�อ Tyr416 แสำดงให�เห8นว��ท �อ�ตัร�คัว�ม์เข�ม์ข�นด�งกล��วจะท��ให� Compound II สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTPs ได�อย่��งจ��เพ�ะ และไม์�สำ�งผิลตั�อก�ร dephosphorylation ณ tyrosine ตั��แหน�งอ&�น ซ��งแสำดงให�เห8นถี�งคัว�ม์จ��เพ�ะในก�รย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTPs ท �ม์ คัว�ม์จ��เพ�ะ และก�รย่�บย่�9ง

PTPs โดย่ compound II สำ�ม์�รถีรบกวนกระบวนก�รแพร�กระจ�ย่และก�รเคัล&�อนท �ของเซลล�ผิ��นก�รกระตั"�นของ Integrin ได�

หล�งจ�กน�9นเร�ได�ท��ก�รทดสำอบผิลของ compound II ในก�รย่�บย่�9ง PTP1B ตั�อระด�บ

phosphorylation ของ FAK และ 130Cas และพบว��ห�ก FAK และ/หร&อ p130Cas เป็�นสำ�รตั�9งตั�นโดย่ตัรงของ PTP1B คัวรจะพบว��ระด�บ phosphorylation ของโป็รตั นท�9งสำองชน#ดตั 9เพ#�ม์ข�9นเม์&�อเซลล�ได�ร�บ compound II และห�กโป็รตั นเหล��น 9ไม์�ได�เป็�นสำ�รตั�9งตั�นของ PTP1B

โดย่ตัรง จะสำ�ม์�รถีสำ�งผิลท �อ�จจะเก#ดข�9นได�สำองกรณ คั&อ กรณ แรก จะไม์�พบก�รเป็ล �ย่นแป็ลงในระด�บ tyrosine phosphorylation ของโป็รตั นสำองชน#ดน 9 หร&อป็ระก�รท �สำอง

จะม์ ระด�บ tyrosine phosphorylation ของโป็รตั นเหล��น 9ลดลง ซ��งก�รคั�ดก�รณ�เหล��น 9เป็�นผิลม์�จ�กก�รทดลองก�อนหน�� ซ��งพบว��ระด�บก�ร phosphorylation ของ FAK และ p130C

เพ#�ม์ข�9นจ�กก�รท��ง�นของ Src ซ��งถี)กกระตั"�นโดย่ PTP1B

ด�งน�9นก�รย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTP1B โดย่ compound II จ�งคัวรสำ�งผิลให�เก#ดก�รลดลงของอ�ตัร�ก#จกรรม์ kinase ของ Src ซ��งคัวรสำ�งผิลให�เก#ดอ�ตัร�ก�ร phosphorylation ของ

Page 10: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

สำ�รตั�9งตั�นของ Src ลดลง และจ�กผิลก�รทดลองพบว��ก�รย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTP1B

น�9นจะเก#ดข�9นตั�ม์ระด�บคัว�ม์เข�ม์ข�นของตั�วย่�บย่�9ง (compound II) ซ��งสำ�ม์�รถีสำ�งผิลให�อ�ตัร�ก�ร phosphorylation ของ FAK และ p130Cas ลดลงแบบ dose-dependent (ภ�พท � 2)

ซ��งสำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว��ท�9ง FAK และ p130Cas น�9นไม์�ใช�สำ�รตั�9งตั�นโดย่ตัรงของ PTP1B และในข�9นตัอนตั�อไป็ เร�ได�ทดสำอบผิลของตั�วย่�บย่�9ง (compound II) ตั�อระด�บก�ร tyrosine

phosphorylation ของ ERK kinase ซ��งม์ หน��ท �ในก�รสำ�งสำ�ญญ�ณป็ล�ย่ท�งของกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณท �ได�ร�บก�รกระตั"�นจ�ก Integrin ห�ก PTP1B ม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รกระตั"�นก�ร kinase ของ Src จะสำ�งผิลให�ม์ phosphor-ERK ลดลงเม์&�อได�ร�บ compound II และให�ผิลเช�นเด ย่วก�น (ภ�พท � 2) เม์&�อทดสำอบด�วย่ compound III ซ��งบ�งช 9ว�� compound II สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งก�รท��ง�นของ PTP1B ได�แบบไม์�จ��เพ�ะ

จ�กผิลก�รทดสำอบใน compound II, III สำ�ม์�รถีสำร"ป็ได�ว�� phosphorelated Tyr527 บน Src

สำ�ม์�รถีถี)กได�ร�บก�ร phosphorylation ได�โดย่ Tyr527 ได�โดย่ตัรง ซ��งสำม์ม์ตั#ฐ�นด�งกล��วได�ร�บก�รสำน�บสำน"นจ�กก�รทดลอง “substrate-binding” ใน mutant ของ PTP1B พบว��สำ�ม์�รถีป็2องก�นก�ร phosphorylation ให�ก�บ Src ได� และสำ�ม์�รดป็2องก�นก�รเก#ด dephosphorylation

จ�ก endogenous PTP1B จ�กผิลก�รศึ�กษ�ท�9งหม์ดล�วนย่&นย่�นอย่��งหน�แน�นว�� PTP1B

Page 11: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

ม์ หน��ท �สำ�งเสำร#ม์กระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น intergrin โดย่ก�รกระตั"�น Src ผิ��นก�รขจ�ดฟอสำเฟตับน pTyr527

กล��วโดย่สำร"ป็คั&อ จ�กก�รศึ�กษ�โดย่ตั�วย่�บย่�9งท �ม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รเล&อกจ�บก�บ

PTP1B น�9น จะม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รย่�บย่�9ง PTP1B ได�ตั�ม์สำภ�วะแวดล�อม์ของเซลล� และ PTP1B สำ�ม์�รถีท��หน��ท �เป็�นตั�วสำ�งเสำร#ม์ (positive effecter) (เช�น ในกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��น intergrin) หร&อตั�วย่�บย่�9ง (negative modulator) (เช�น ในก�รร�บสำ�งสำ�ญญ�ณผิ��นอ#นซ)ล#น) ในกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล� ซ��งสำ�ม์�รถีบ�งช 9ถี�งคัว�ม์สำ�ม์�รถีของสำ�รเคัม์ ในก�รคัว�ม์คั"ม์กระบวนก�รท��ง�นของ PTP ได�ในสำภ�วะ in vivo นอกจ�กน�9นตั�วย่�บย่�9ง PTP1B เช�น compound II และ compound III เป็�นเคัร&�องม์&อท �ม์ ป็ระสำ#ทธ#ภ�พสำ)งในก�รศึ�กษ�กระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระด�บเซลล�ในหล�ย่ๆ กระบวนก�ร ซ��งสำ�ม์�รถีพ�ฒน�ไป็สำ)�กระบวนก�รศึ�กษ�ด�วย่ isozime-specific inhibitor ชน#ดอ&�นๆ และเป็2�หม์�ย่สำ)งสำ"ดของเร�คั&อก�รพ�ฒน�ตั�วย่�บย่�9ง PTPs ท �ม์ คัว�ม์จ��เพ�ะตั�อก�รท��ง�นของ PTP ในกระบวนก�รสำ�งสำ�ญญ�ณระด�บเซลล� ซ��งสำ�ม์�รถีพ�ฒน�ไป็สำ)�แนวท�งก�รร�กษ�โรคัจ�กตั�วย่�บย่�9งท �พ�ฒน�ข�9น

Page 12: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

3. การพั�ฒนา Activity-based probes เพั!"อเป็$นเคร!"องมี!อศึ�กษาก%จกรรมีของ PTP ในเชิ%งกว�าง

จ�กคัว�ม์ร) �ท �ว�� PTP ม์ บทบ�ทสำ��คั�ญในกระบวนก�รคัวบคั"ม์ก#จกรรม์ภ�ย่ในเซลล� แตั�เน&�องจ�กคัว�ม์หล�กหล�ย่และคัว�ม์ซ�บซ�อนในก�รท��ง�นของ PTP ซ��งเป็�นอ"ป็สำรรคัสำ��คั�ญในกระบวนก�รศึ�กษ�ท �สำ��คั�ญ และด�วย่คัว�ม์ซ�บซ�อนของกระบวนก�รท�งช วภ�พในเซลล� รวม์ถี�งก�รท��ง�นก�รทดแทนของ PTP ท �ม์ อย่)�หล�ย่ชน#ดในเซลล�ท��ให�ก�รแป็ลผิลก�รทดลองเก �ย่วก�บ phenotype ท �เก#ดจ�กก�รกล�ย่ของย่ น PTP ได�ย่�ก แตั�ด�วย่เทคัน#คัท �เร�พ�ฒน�ข�9นใหม์�น 9 ท��ให�เร�สำ�ม์�รถีศึ�กษ�กระบวนก�รท��ง�นของ PTP ได�โดย่ไม์�จ��เป็�นตั�องท��ให�เก#ดก�รกล�ย่ของย่ น และม์ ข�อได�เป็ร ย่บกว��ก�รศึ�กษ�โดย่กระบวนก�รท�งพ�นธ"ศึ�สำตัร�ได�หล�ย่ป็ระก�ร และสำ�ม์�รถีแก�ไขป็.ญห�ท �เก#ดข�9นจ�กกระบวนก�รท��ง�นท �ซ�บซ�อนและก�รท��ง�นทดแทนก�นของโป็รตั นใน proteome

จ�กคัว�ม์สำ�ม์�รถีในก�รว#เคัร�ะห�ก�รเป็ล �ย่นแป็ลงของระด�บก�ร transcription ในระด�บ

genome-wide ท��ให�เร�สำ�ม์�รถีจ�ดจ��แนกกล"�ม์ของย่ นท �ท��หน��ท �ร �วม์ก�นหร&อม์ กระบวนก�รคัวบคั"ม์ร�วม์ก�นได� แตั�อย่��งไรก8ตั�ม์ ก8ย่�งไม์�สำ�ม์�รถีย่&นย่�นได�เตั8ม์ท �ว��ระด�บ mRNA ท �เป็ล �ย่นแป็ลงไป็น�9นจะม์ คัว�ม์สำ�ม์พ�นธ�โดย่ตัรงก�บก�รท��ง�นและก#จกรรม์ของโป็รตั นน�9นๆ หร&อไม์� ด�งน�9น ก�รศึ�กษ�ในระด�บ proteomic ซ��งเป็�นก�รศึ�กษ�ก�รเป็ล �ย่นแป็ลงของโป็รตั นท�9งหม์ดจ�งเป็ร ย่บเสำม์&อนเคัร&�องม์&อท �สำ�ม์�รถีเตั#ม์ช�องว��งของก�รศึ�กษ�แบบ genomic ได� แตั�อย่��งไรก8ตั�ม์ จ�กป็ระสำ#ทธ#ภ�พของกระบวนก�รศึ�กษ�ท �เก#ดข�9นใหม์�ในป็.จจ"บ�น เช�น activity – based proteomics ท��ให�สำ�ม์�รถีศึ�กษ�ระด�บก#จกรรม์ของโป็รตั นได�ในระด�บ proteome ซ��งน�บว��เป็�นเป็2�หม์�ย่สำ)งสำ"ดของก�รศึ�กษ�โป็รตั นท"กชน#ด ซ��งสำ�ม์�รถีพ�ฒน�ให�เก#ดข�9นได�โดย่ก�รคั#ดคั�น probe ท �เป็�นสำ�รเคัม์ (chemical probe) ซ��งสำ�ม์�รถีจ�บก�บ active site ของเอนไซม์�ได�ด�วย่ก�รด�ดแป็ลงพ�นธะโคัว�เลนตั�และม์ ระด�บก�รจ�บท �ข�9นก�บระด�บของก#จกรรม์ หร&อท �เร ย่กว�� activity – based probe

โดย่สำ�ม์�รถีแย่ก, และว�ดระด�บก�รจ�บของ probe ก�บโป็รตั นได�โดย่กระบวนก�รท�ง

chromatography, electrophoresis หร&อ mass spectrometry ซ��งในป็.จจ"บ�นสำ�ม์�รถีพ�ฒน� probe

สำ��หร�บว�ดก#จกรรม์ของเอนไซม์� serine และ cysteine hydrolases ซ��ง probe ด�งกล��วท��ให�น�กว#จ�ย่สำ�ม์�รถีว�ดระด�บและตั#ดตั�ม์ระด�บก�รท��ง�นของโป็รตั นในเซลล�ได�โดย่ตัรง ไม์�ว��จะเป็�นสำภ�วะใดๆ ก8ตั�ม์

Page 13: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

เป็�นท �ทร�บก�นด ว��ก�รท��ง�นของ PTP น�9นจะข�9นก�บก#จกรรม์ก�รสำล�ย่สำ�รตั�9งตั�น (catalytic activity) ห�กเร�สำ�ม์�รถีพ�ฒน� activity-based probe ท �สำ�ม์�รถีตั#ดตั�ม์ก�รท��ง�นของ PTP ได� ก8จะท��ให�เร�สำ�ม์�รถีตั#ดตั�ม์ระด�บก#จกรรม์ของ PTP ได�ในระด�บ proteome

ด�วย่คัว�ม์คั#ดด�งกล��ว เร�จ�งพ�ฒน� activity - based probe ซ��งป็ระกอบด�วย่ หน�วย่ท �ม์ คัว�ม์จ��เพ�ะตั�อ active site ของ PTP และสำ�ม์�รถีเช&�อม์ตั�อก�บ active site ได�ด�วย่พ�นธะโคัว�เลนตั� และตั#ดฉล�กสำ�รด�งกล��วด�วย่ biotin และระบบก�รร�ย่ง�นผิลอ&�นๆ เพ&�อให�สำ�ม์�รถีคั�ดแย่กและตั#ดตั�ม์ก#จกรรม์ของเอนไซม์�ได� (ภ�พท � 3) จ�กก�รศึ�กษ�พบว��

activity-based probe ท �พ�ฒน�ข�9น หร&อ a-bromobenzyl phophonate ม์ คัว�ม์สำ�ม์�รถีเป็�นตั�วย่�บย่�9ง PTP ของ Yersenis pestis (YopH) แบบไม์�ย่�อนกล�บ ซ��งสำ�รด�งกล��วป็ระกอบหน�วย่หม์)� phenyl phosphonate ซ��งสำ�ม์�รถีเล ย่นแบบ pTyr และสำ�ม์�รถีจ�บก�บ active site ของเอนไซม์�เป็2�หม์�ย่ได�ด และผิลก�รทดสำอบบ�งช 9ว�� probe ด�งกล��วจ�บก�บ PTP ด�วย่พ�นธะโคัว�เลนตั�

จ�กก�รทดลองพบว�� PTPprobe สำ�ม์�รถีย่�บย่�9งป็ฏิ#ก#ร#ย่�ของ PTP ในร)ป็แบบท �ข�9นก�บเวล�และคัว�ม์เข�ม์ข�น (time & concentration dependent manner) และสำ�ม์�รถีจ�บก�บ active site

ของ PTP ได�โดย่ตัรง ม์ กระบวนก�รย่�บย่�9งแบบแข�งข�น (competitive inhibitor) โดย่ก�รแย่�งจ�บก�บสำ�รตั�9งตั�นบน active site ด�วย่พ�นธะโคัว�เลนตั� (จ�กก�รทดสำอบด�วย่ก�รกล�ย่ของย่ น PTP) และเน&�องจ�ก probe ได�ร�บก�รตั#ดฉล�กด�วย่ biotin ท��ให�สำ�ม์�รถีตั#ดตั�ม์

probe ได�โดย่ก�รใช� anti--biotin หล�งจ�กแย่กโป็รตั นจ�กตั�วอย่��งด�วย่ SDS-PAGE ในภ�พท � 4 เป็�นผิลก�รทดลองก�บ probe ท �พ�ฒน�ข�9น พบว��สำ�ม์�รถีจ�บก�บ PTP หล�ย่ชน#ดด�วย่พ�นธะโคัว�เลนตั� และสำ�ม์�รถีตั#ดฉล�กเพ&�อตั#ดตั�ม์ระด�บก�รท��ง�นของ PTP ได� และผิลจ�ก MS ก�รสำ)ญเสำ ย่อะตัอม์โบรไม์ด�ออกจ�ก probe จะท��ให�เก#ดก�รสำร��งพ�นธะโคัว�เลนตั�ก�บหม์)� thiol ของ probe และพบว�� probe จะไม์�สำ�ม์�รถีท��ง�นได�ห�กอย่)�ในสำภ�วะท �ม์ สำ�รในกล"�ม์ nucleophilic agent เช�น DDT sodium azide และ cysteine

Page 14: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

เร�ได�ท��ก�รทดสำอบว�� probe จะไม์�เก#ดป็ฏิ#ก#ร#ย่�ก�บโป็รตั นชน#ดอ&�น พบว�� probe ไม์�ท��ป็ฏิ#ก#ร#ย่�ก�บเอนไซม์�อ&�น เช�น alkaline phosphatase, E phosphatase, PP1 และ PP2B

serine/threonine phosphatase, serine protease และ cycteine protease papain และนอกจ�กน�9นย่�งไม์�เก#ดป็ฏิ#ก#ย่�ก�บ prostatic acid phosphatase จ�กม์�นฝร��ง, SH2 domain (Grb2), PTB domain

(Shc & SNT1), Src kinase, serein protease chymotrypsin, metalloprotease thermolysin, cystein

protease calpain, glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase และ glutathione S trasferase

(เน&�องจ�กม์ คั�� pKa ตั���), bovine serum albumin และ lysozyme และทดสำอบด�วย่ก�รบ�ม์ probe

ร�วม์ก�บ alkaline lysate ของ E. coli ท �ได�ร�บก�รถี��ย่ย่ น YopH และกล"�ม์คัวบคั"ม์ (ไม์�ได�ร�บก�รถี��ย่ย่ น) และเม์&�อน��ม์�ว#เคัร�ะห�ด�วย่ Western-blot สำร"ป็ได�ว�� probe จะตั#ดเฉพ�ะเอนไซม์� YopH เท��น�9น

เม์&�อทดสำอบซ�9�ในเซลล�เพ�ะเล 9ย่งท �ได�จ�กม์น"ษย่� hTERT, MCF-7 (เป็�นเซลลท �ได�จ�กเซลล�เย่&�อบ"เตั��นม์และเซลล�ม์ะเร8งเตั��นม์ตั�ม์ล��ด�บ) พบว��เม์&�อใช� probe และน��ม์�ย่�อม์สำ จะได�ผิลด�งภ�พท � 5 โดย่พบว��ม์ PTP อย่��งน�อย่ 4 ชน#ดท �ม์ ระด�บก�รแสำดงออกท �แตักตั��งก�นในสำองสำภ�วะ (เน&9อเย่&�อป็กตั#และม์ะเร8งเตั��นม์) โดย่ PTP 2 ชน#ด (ม์วล 230 และ 100 kDa) ม์ ก�รแสำดงออกใน MCF-7 ตั���กว�� hTERT และ พบว�� PTP อ กสำองชน#ด (60, 70 kDa) ม์ ก�รแสำดงออกใน MCF-7 สำ)งกว�� hTERT หล�ย่เท��ตั�ว ซ��งก�รทดลองด�งกล��วท��ให�เร�สำ�ม์�รถีเช&�อม์โย่งคัว�ม์สำ�ม์พ�นธ�ระหว��ง PTP ก�บม์ะเร8งได�

กล��วโดย่สำร"ป็แล�ว พวกเร�สำ�ม์�รถีพ�ฒน� activity-based probe ท �สำ�ม์�รถีตัรวจว�ดระด�บก#จกรรม์ของเอนไซม์� PTP ได�ในระด�บเซลล�หร&อเน&9อเย่&�อ ซ��งสำ�ม์�รถีน��ไป็ใช�ในก�รศึ�กษ�

Page 15: Protein Tyrosine Phosphatases(2)

เก �ย่วก�บระบบก�รสำ�งสำ�ญญ�ณในระด�บเซลล�ได� และสำ�ม์�รถีน��ไป็ศึ�กษ�หน��ท �ของ PTP

แตั�ละชน#ดในแง�พย่�ธ#ก��เน#ดของโรคัท �เก#ดจ�กคัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของ PTP ได� และสำ�ม์�รถีน��ไป็ป็ระย่"กตั�ใช�เป็�นเคัร&�องม์&อในก�รตัรวจคั�ดกรองและห�แนวโน�ม์ท �จะเก#ดโรคัได�

ป็ระก�รสำ"ดท��ย่ probe ท �พ�ฒน�ข�9นน 9เป็�นเคัร&�องม์&อท �ก�อให�เก#ดก�รเป็ล �ย่นแป็ลงของร)ป็แบบก�รตั#ดตั�ม์ก#จกรรม์ของ PTP, ก�รร�กษ�ด�วย่ย่�, ก�รศึ�กษ�คัว�ม์ผิ#ดป็กตั#ของย่ น,

หร&อกระบวนก�รเก#ดโรคั (เช�น ภ�วะด&9อตั�ออ#นซ)ล#น) ก�รศึ�กษ�ร�วม์ก�นระหว��งกระบวนก�รท�ง chemical genetics ก�บ activity-based proteomics จะช�วย่ให�น�กว#จ�ย่สำ�ม์�รถีท��คัว�ม์เข��ใจถี�งบทบ�ทของ PTPs ในกระบวนก�รท�งสำร ระว#ทย่�และพย่�ธ#ก��เน#ดของโรคัในม์น"ษย่�ได�อย่��งถี�องแท�ม์�กข�9น

ก%ตต%กรรมีป็ระกาศึ

ก�รทดลองในห�องป็ฏิ#บ�ตั#ก�รของผิ)�แตั�งได�ร�บคัว�ม์สำน�บสำน"นจ�กเง#นท"น CA69202,

DK68447, และ 1U54 AI57158 จ�ก the NIH และ ม์)ลน#ธ# G. Harold และ Leila Y. Mathers Charitable