PROTEÍNAS DE LA LECHE

Las proteínas lácteas son las que hace mucho más tiempo consumo el hombre. Así mimo, debido a la facilidad con que les pueda aislar de la leche, algunas poseen carácter hidrofílico y otras carácter hidrofóbico.

Han sido las proteínas más estudiadas e incluso se conoce la estructura primaria de casi todas, pero debido a la gran variedad estructural y diversas propiedades fisicoquímicas que presentan de acuerdo a cada especie su descripción comparativa es muy complicada.

La leche de vaca (bos taurus), es la más conocida y la más consumida, ella ha servido para reemplazar la leche materna en los casos en que se ha hecho necesario dicho reemplazo, también como alimento proteico esencial de los adultos. Además los derivado lácteos entran a formar parte de numerosos alimentos de uso casero como a nivel industrial, esta tendencia va en aumento.

Las investigaciones que día a día surgen en torno a las proteínas de origen lácteo van encaminada hacia el plano nutricional, biológico y tecnológico, dándole un valor agregado a los productos.

Composición de las Proteínas de la Leche de Vaca

La fracción proteica representa el 95% del nitrógeno de la leche, en promedio es de 30-35 g/L. Un 80% de las proteínas, se encuentran bajo la forma de complejos macromoleculares, conteniendo una parte mineral especialmente en forma de fosfato de calcio, conocida con el nombre de micelas.

Las caseínas están presentes fundamentalmente en esta forma y contienen hasta un 8% de minerales. Representando como Ca (calcio micelar) en un 27% del calcio total de la leche, con una concentración de 1.2 g/L. Las caseínas son fácilmente aisladas por centrifugación o por precipitación isoeléctrica a pH= 4.6, la fracción no sedimentable se conoce con el nombre de proteínas del lactosuero o proteínas globulares, tales como la a-lactoglobulinas, b-lactoglobulinas y las inmunoglobulinas, entre otras.

Composición de las Caseínas

En la leche se encuentran tres tipo de caseínas que son las a, b, k.

Son proteínas ácidas, ricas en ácido glutámico y aspártico, en la caseína b el contenido en prolinas es alto, y está repartido a lo largo de la cadena polipéctidica, por lo que no le permite a la misma tener ordenamiento en su estructuras, haciéndola suceptible a cambios en las condiciones del medio.

La a S1 y la caseína b no poseen cisteínas, mientras que la caseína a S2 y sus derivados, así como la k contienen dos residuos por molécula.

Estas proteínas globulares poseen una hidrofobicidad media, lo que les permite a las caseínas asociarxe muy fácilmente en complejos de elevada masa molar.

La caseína k contiene un grupo prostético de galactosa, formándo la N-acetilgalactosamina y ácido N-acetilneuraminico, a su vez la k del calostro contiene además glucosamina.

Composición de las Proteínas del Lactosuero

Poseen dos proteínas mayoritarias que son la b -galactoglobulina y la a -lactoalbúmina, contienen menos ácido glutámico y prolina que las caseínas pero son ricas en aminoácidos azufrados como la cisteína y la metionina. Además, la a -lactoalbúmina contiene importantes cantidades de triptófano. El lactosuero también contiene una fracción peptídica formada por las proteasas peptonas

Las proteínas de orgien sanguíneo (seroalbúmina e inmunoglobulinas) están presentes en pequeñas cantidades en la fracción soluble de la leche humana o del calostro, a veces su contenido es elevado.

Dosificación, Identificación y Fraccionamiento de las Proteínas de la Leche

Dosificación de las proteìnas totales y de las fracciones nitrogenadas:

En la industria quesera la base de pago de la leche lo constituye el contenido en proteínas totales. La determinación se funda en la determinación de nitrógeno total por el método de Kjeldahl; teniendo presente que el contenido medio en nitrógeno de las proteínas es de 15.65% (factor de conversión del nitrógeno/por proteína = 6.38), dado como nitrógeno total, en la actualidad el método utilizado para la determinación es el Kjldahl mejorado y se expresa como proteína total.

La determianción de las fracciones nitrogenadas de la leche (caseina, proteínas solubles, y nitrógeno proteico), se realiza después de la precipitación de las caseínas a pH = 4.6 y la precipitación de las proteínas totales mediante tratamiento con ácido tricloroacético al 12%, dosificándose el nitrógeno en el sobrenadante y en la leche. Dicha técnica no es muy confiable para las albúminas y las proteasas-peptonas; no se pueden aplicar a las leches que han sufrido tratamientos térmicos aunque sean moderados, pues una buena parte de las proteínas solubles coprecipitan con las caseínas.

Aislamiento e identificación:

Los métodos clásicos de precipitación de las proteínas por sales conocida como precipitación fraccionada se utiliza cada vez menos, desde que se implementaron las técnicas de fraccionamiento electroforético y cromatográfico.

Efectos de los Tratamientos sobre el Comportamiento Proteíco

Efectos de los tratamientos térmicos:

Las caseínas micelares y las del lactosuero, sufren modificación cuando son sometidas a calentamiento, dichas modificaciones estarán sujetas a factores como pH, To , duración del tratamiento térmico, naturaleza y concentración de los constituyentes minerales y orgánicos presentes, entre otros.

A temperatura menores de 100oC, correspondiente a la alcanzada en el proceso de pasteurización y concentración de la leche, se observa una desnaturalización de la b-lactoglobulina. A partir de 80oC, la proteína en solución se polimeriza y puede formarse un gel; el grupo tiol libre, inicialmente englobado en el centro de la molécula, se liberan a causa del desdoblamiento de la estructura globular y puede reaccionar con otros grupos tiol o con enlaces disulfuro por intercambio intra o intermolecular. En la leche también son posibles los intermoleculares con otras proteínas que posean radicales cisteinil o cistinil (caseína K, caeína a S2, a -alcoalbúmina). También se pueden formar complejos entre la sproteínas solubles desnatulaizadas y los constituyentes azufrados de la micela.

A su vez si la temperatura se eleva por encima de 100oC, se pueden encontrar ligadas a las proteínas micelares proteínas del lactosuero. Presentándose una superficie modificada que impide la acción de las proteasas (en particular la quimosina). En cambio dichas reacciones se favorecen si la leche se mantiene en calentamiento a una temperatura de 90oC varios minutos durante las operaciones de precalentado. Por que el complejo de b-lactoglobulina-caseína K, así formado estabiliza las proteínas de la lechre frente a la posterior esterilización a 120-140oC, o frente a la coagulación enzimática. Se debe resaltar que o todas las proteínas estabilizan las micelas de caseína frente al calentamiento o la coagulación, algunas como la isozima, sensibilizan las micelas a la acción de la quimosina.

Entre 110-120oC, la estabilidad de la fase proteica depende casi exclusivamente del pH, por esta razón se pueden distinguir dos tipos de leches: las del tipo A que manifiestan un mínimo de estabilidad a 140oC, a pH cercano a 6.8 y las leches tipo B aumentan su estabilidad de forma continua a pH entre 4.4-5.0, este comportamiento frente a los tratamientos térmicos está influenciado por diversos factores como la alteración de la superficie micelar; el descenso del pH; modificación de las caseínas, entre otros.

Efecto de la Refrigeración:

El almacenamiento de la leche a baja temperatura (2-6oC), provoca en la leche específicamente dos tipos de modificaciones, la desestabilización de las micelas y una proteólisis limitada. Además el frío aumenta la degradación de la caseína b , dependiendo del tiempo y la temperatura de refrigeración.

Tratamientos Mecánicos:

La homogenización disminuye la estabilidad de las micelas en la leche entera en especial cuando el proceso se realiza a 60oC, pero solo tiene un mínimo efecto sobre las micelas de la leche desnatada.

Uso industrial de las Proteínas Lácteas

Las proteínas séricas, han sido muy estudiadas ya que pueden ser empleadas prácticamente en cualquier alimento, son la base para leches maternizadas, alimentos para infantes, bebidas energéticas, bebidas saborizadas, reemplazantes de grasas lácteas en la pafinicación y la repostería, en la industria de los dulces, entre otros tantos usos.

Los caseínatos se producen por una precipitación ácida de la proteínas de la leche en presencia de calcio y son ampliamente usadas en la industria de alimentos, ya que poseen muchos de las propiedades funcionales requeridas para la elaboración de distintos productos, son altamente estables al calor, siempre y cuando el pH y la concentración de iones divalentes se controlen adecuadamente, no poseen sabor, y por lo tanto se usan en la formulación de alimentos no condimentados. Por presentar un alto porcentaje de amino ácidos hidrófobos e hidrofílicos, se utilizan como estabilizantes y espumantes, absorben agua, mejorando textura de productos cárnicos embutidos, por lo que controlan humedad de los mismos durante la operación de cocimiento y almacenamiento.

Las propiedades espumantes de las caseínas y de emulsificación son superiores a las que presentan las proteínas séricas. Por otro lado los caseínartos pueden ser el origen de muchas reacciones químicas indeseables que conducen a la producción de sabores desgradables durante el almacenamiento de los alimentos que los contengan

http://docencia.udea.edu.co/QcaAlimentos/contenido/leche3.html

Método de Kjeldahl

Fundamento

Se caracteriza por el uso de ebullición, ácido sulfúrico concentrado que efectúa la destrucción oxidativa de la materia orgánica de la muestra y la reducción del nitrógeno orgánico a amoníaco el amonio es retenido como bisulfato de amonio y puede ser determinado in situ o por destilación alcalina y titulación.

Dificultades químicas y prácticas

Digestión prolongada.

Conversión cuantitativa de nitrógeno a amoníaco.

Espumosidad excesiva.

Acción corrosiva de ácido sulfúrico sobre el sistema de extracción de humos.

Consideraciones ambientales respecto a descarga de humos y contaminación de aguas con catalizadores metálicos.

Soluciones

Aumentar relación sulfato de potasio/ácido sulfúrico (1 g.1 m1) t° 370-410°C.Uso de catalizadores metálicos.Uso de H2O2.

Catalizadores metálicos utilizados

a) Oxido de mercurio

Ventaja

Oprima recuperación de nitrógeno

Desventajas

Tóxico.Alto costo.Contaminación de aguas.

Formación de compuesto estable con amoníaco el que debe ser descompuesto con adición de tiosulfato de sodio.

b) Selenio o mezcla de sulfato de cobre y selenio

Desventaja

El selenio puede producir pérdida de nitrógeno.

c) Mezcla de sulfato de cobre y dióxido de titanio

Ventajas

Útil en análisis de cereales.Uso a gran escala como rutina.

Desventaja

Menos efectiva en recuperar nitrógeno.

Determinación de amonio

El amonio en el digestor puede ser determinado por diversos métodos:

a. Adición de exceso de álcali al digestor, destilación del amonio y titulación.b. Mezcla alcalina de fenol con hipoclorito de sodio que da una coloración azul

con amonio.c. Mezcla alcalina de salicilato de sodio, nitroprusiato de sodio e hipoclorito de

sodio que da una coloración verde esmeralda brillante con amonio.d. Determinación electrométrica usando un electrodo de ion específico y una

solución de hidróxido de sodio al 1 % .

Ventajas del método de Kjeldhal

Apropiado para varios tipos de productos.Alta fiabilidad.Usado como método de referencia.

Desventajas del método de Kjeldhal

Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.Uso de catalizadores tóxicos o caros.Elección del factor de conversión.

2. Método de Dumas

Fundamento

Se caracteriza por pirólisis completa de la muestra y medición del contenido de nitrógeno de los gases de combustión.

El nitrógeno puede ser medido con manómetro después de absorber el dióxido de carbono en una solución alcalina o por conductividad térmica en métodos automatizados.

Ventaja

Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el método de Kjeldahl en análisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores levemente mayores.

Desventajas

Incluye nitrógeno inorgánico.

Requiere pequeñas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente dividida y homogénea para minimizar el error de muestreo.

Este método no puede aplicarse a material húmedo por lo que debe efectuarse un secado previo.

3. Métodos radioquímicos

Se han descrito dos métodos:

a) Activación neutrónica

Fundamento

Se irradia una cantidad pesada de muestra con neutrones lo que produce el paso de l4N a 13N. Este positrón tiene una vida media de 10 minutos y emite radiaciones gamma las que se registran en un contador de centelleo . Las cuentas se relacionan con el contenido de nitrógeno de la muestra.

Ventajas

Simple; rápido.Sin problemas de contaminación.Los valores encontrados presentanbuena correlación con el método deKjeldahl.

Desventaja

El costo de infraestructura es muy elevado.

b) Activación protónica

Fundamento

Similar al anterior con la variante de que la muestra se irradia con protones y se efectúa la conversión de 14N a 14O, un isótopo que decae con la emisión de un protón y de radiaciones gamma las que son registradas y relacionadas con el contenido de nitrógeno de la muestra.

METODOS DE DETERMINACION DE PROTEINAS

Existen diversos métodos alternativos para determinar proteínas:

1. Utilización del factor de conversión

a) Determinar el contenido de nitrógeno total y multiplicar por un factor de conversión de nitrógeno a proteína. Este factor se calculó considerando el porcentaje de nitrógeno que contiene la proteína en los alimentos.

Desventajas del uso del factor de conversión:

Para efectos de cálculo se considera el contenido de nitrógeno de la proteína principal y no de toda la mezcla.

La fracción analizada no necesariamente es proteína pura.

No se realizan correcciones de nitrógeno no proteico.

Se ha sugerido determinar el factor de conversión de nitrógeno a proteína utilizando la composición de aminoácidos del alimento a analizar, lo que se complica al combinar los alimentos, por lo cual se prefiere continuar con el uso de los factores tradicionales informando a su vez el factor utilizado.

b) Determinar el contenido de nitrógeno proteico y multiplicar por un factor de conversión de nitrógeno a proteína.

Se han utilizado diversos métodos para separar la proteína de compuestos nitrogenados no proteicos entre los que se señalan:

- diálisis y ultrafiltración por membrana;- coagulación por calor (no es efectivo para caseína y gelatina);- uso de agentes precipitantes como: ácido túngstico, ácido

tricloroacético, hidróxido de cobre, óxido férrico, acetato de plomo, ácido fosfotúngstico, ácido metafosfórico, ácido tánico, ácido sulfosalicílico, etanol, mezcla cloroformo y octanol (8:1), mezcla fenol, ácido acético y agua (1:1:1).

Desventajas

Diferencias en las fracciones proteicas obtenidas por los diversos métodos. Debe considerarse posibles retenciones sobre la proteína precipitada de pequeñas moléculas no proteicas por adsorción o intercambio iónico. Problemas relacionados con el uso del factor de conversión de nitrógeno a proteína.

2. Métodos químicos

Fundamento

Las proteínas presentan un amplio rango de comportamiento químico debido a la propiedad de los aminoácidos de tener diferentes tipos de grupos funcionales, a las reacciones químicas de estos grupos y a los enlaces peptídicos.

Consideraciones en la aplicación de los métodos químicos:

- Los alimentos son una matriz compleja por lo que se sugiere que estos métodos empíricos e indirectos sean calibrados con el método de Kjeldahl;

- se espera una buena correlación entre estos dos tipos de determinación de proteína cuando la relación N no proteico/N proteico es baja y constante; y

- son satisfactorios para leche y cereales e insatisfactorios para la mayoría de los vegetales y mezclas de alimentos.

a) Método de Biuret

Principio químico

La reacción se caracteriza por una coloración púrpura cuando los iones cúpricos son complejados por los enlaces peptídicos a pH alcalino. El matiz del color depende del tipo de proteína y su intensidad depende del contenido de proteína presente.

Reactivo utilizado

Solución alcalina conteniendo iones cúpricos complejados con tartrato de sodio y potasio.

Lectura

550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces.

Desventaja

Se ha encontrado poca aplicación en análisis de alimentos debido a la presencia de interferentes como azúcares reductores que reducen el ion cúprico en medio alcalino produciendo resultados insatisfactorios. Ejemplo: leche.

b) Método "dye-binding"

Principio químico

Se caracteriza por la formación de un coágulo de proteína, coloreado e insoluble producto de la reacción de la proteína con una solución coloreada de ácido sulfónico a pH 2. El anión coloreado se une por asociaciones electrostáticas a los sitios básicos de la proteína, por ejemplo a los grupos M-amino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y aminos terminales. Además se producen atracciones intermoleculares por interacciones hidrofóbicas entre la proteína y la mitad no iónica del anión y entre el anión unido a proteína y la mitad no iónica del anión en solución.

El coágulo se separa por filtración y se mide colorimétricamente el exceso de tintura en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de proteína.

Lectura

A595nm

Consideraciones

El método es empírico por lo que se debe buscar la concentración de tintura ideal que sature la proteína y forme el coágulo pero que no pierda sensibilidad.

Ventajas

Util en análisis de rutina de muestras similares.Económico y rápido.Preciso como el método de Kjeldhal.Usado como método de referencia.

Desventajas

Dificultad en encontrar tinturas puras.

Desuniformidad en la calidad de las tinturas de un lote de fabricación a otro, por lo que se require la calibración del método con cada lote.

No es aplicable a alimentos que varíen su contenido en grupos aminos (proteólisis, pardeamiento).

c) Método de destilación alcalina

Fundamento

La hidrólisis de las amidas en medio alcalino fuerte da origen a amoníaco el cual es destilado y su valor es relacionado con el contenido de proteína.

Se ha encontrado que el rendimiento de amonio es altamente reproducible para una proteína dada.

d) Método de Lowry

Reactivo

Acido fosfomolíbdico-fosfotúngstico

Fundamento

Cuando se agrega reactivo de Folin a una proteína, ésta se reduce a un complejo azul de molibdeno por la oxidación de los aminoácidos tirosina, triptófano, cistina, cisterna e histidina.

Lectura

A750 nm

Ventajas

Alta sensibilidad y simple de operar.

Desventajas

La respuesta del color varía de acuerdo al tipo de proteína.La intensidad del color no es estrictamente proporcional a la concentración de proteína.Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de carbono interfieren en la reacción.

e) Método de titulación con formol

Fundamento

A la muestra neutralizada con álcali se le agrega formaldehido en exceso el cual reacciona con cada grupo básico de lisina y arginina. El exceso de formaldehido se neutraliza con un exceso de álcali estándar el cual se titula, y se relaciona con el contenido de proteína.

Desventaja

Su reproducibilidad es menor a la de otros métodos alternativos.

3. Métodos físicos

Consideraciones

Son más simples, rápidos y el costo por análisis es menor aunque el costo de los equipos es elevado. La exactitud de estos métodos se relaciona con las características del material a analizar. La concordancia con nitrógeno total depende de que el material no varíe de muestra en muestra.

a) Espectroscopía infrarroja

Fundamento

Se aprovecha la absorción del grupo amida del enlace peptídico a 6,46 Tm.

Ventajas

Rápido, análisis de multicomponentes No destructivo.

Desventajas

Interferido por agua.Proceso de calibración complejo.

b) Espectroscopía infrarroja reflectante

Fundamento

La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiación infrarroja (0,75-2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada.

Consideración

Es necesaria la calibración contra un conjunto de muestras estadísticamente significativas, analizadas por métodos de referencia tradicionales.

Ventajas

Rápido, análisis de multicomponentes. Aplicable a materiales sólidos. Cuantifica proteína en presencia de agua.

Desventajas

Interfieren almidones y lípidos.Desplazamiento de espectro de reflectancia por humedad contenida en las partículas.Proceso de calibración complejo.

c) Espectrofotometría ultravioleta

Fundamento

Mide proteínas en solución con absorción máxima a 280 nm atribuible a los anillos aromáticos de tirosina y triptófano y entre 180-220nm.

Ventajas

Rápido, no destructivo.

Util para monitorear eluentes en columnas cromatográficas.

Desventaja

Interferencia de otros compuestos (ácidos nucleicos, nucleótidos).

d) Métodos refractométricos

Fundamento

Mide la refracción directa de la proteína en solución o el cambio de índice de rafracción causado por la remoción de la proteína de la solución.

e) Método turbidimétrico

Fundamento

Mide la reducción de la intensidad de la luz al pasar por una suspensión de partículas de proteínas. Este cambio se relaciona con el contenido de proteína.

f) Espectroscopía electrónica

Fundamento

Irradiación del material con rayos X y cuantificación de los fotoelectrones liberados característicos al átomo de N del grupo amida de la proteína.

Ventaja

Buena correlación con contenido de N total.Pueden determinarse simultáneamente otros grupos de interés (grupos sulfuras de aminoácidos).

g) Polarografia

Determina trazas de proteína.

METODOS DE DETERMINACION DE AMINOACIDOS

Los aminoácidos constituyen la estructura primaria de la proteína y le confieren el valor nutricional a los alimentos.

Para el análisis de los aminoácidos es necesario romper los enlaces peptídicos de las proteínas por medio de hidrólisis que puede ser ácida, alcalina o enzimática. La hidrólisis ácida se realiza con ácido clorhídrico de concentración 6N. El reactivo debe ser puro y no debe dejar residuos por lo que se recomienda una hidrólisis en fase gaseosa. Para que la hidrólisis de las proteínas sea completa es necesario tener en cuenta factores como la razón ácido/proteínas, la temperatura y el tiempo de hidrólisis y evitar la presencia de oxígeno en el medio aplicando vacío y nitrógeno para minimizar la oxidación de los aminoácidos.

Consideraciones de la hidrólisis ácida

La hidrólisis ácida afecta la estructura de ciertos aminoácidos, como:

a. Destrucción parcial de treonina, serina, cistina, cisterna, metionina y tirosina.La destrucción de cistina, cisteína y metionina se evita oxidando primero la muestra con ácido perfórmico y se determinan en su lugar el ácido cisteico y metionina sulfona.El triptófano se destruye totalmente con el ácido clorhídrico por lo que para su determinación es necesario realizar una hidrólisis alcalina.

b. Conversión de: tirosina a un cloro- derivado; asparagina a ácido as- pártico; y glutamina a ácido glutámico.

c. Liberación lenta de isoleucina y valina.

Para compensar las pérdidas producidas en los aminoácidos y además para cuantificar los aminoácidos presentes se puede adicionar a la muestra antes de la hidrólisis, una cantidad conocida de un estándar interno que puede ser el ácido 2-aminobutírico.

Los aminoácidos libres se derivatizan por métodos precolumna o postcolumna y se separan aplicando la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía líquida de alta resolución o la cromatografía gas-líquido.

Requisitos de una derivatización precolumna:

Condiciones de reacción suave y rápida.Que forme derivados estables y de respuesta lineal.Que los factores de respuesta sean similares para todos los aminoácidos.Que sea reproducible.Alta resolución de los derivados de aminoácidos.Que reaccione con aminoácidos primarios y secundarios.

BIBLIOGRAFIA

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http://www.fao.org/docrep/010/ah833s/ah833s17.htm

S. P. L. SørensenDe Wikipedia, la enciclopedia libre

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Para el futbolista danes, véase Jens-Kristian Sørensen.

Sørensen

Søren Peter Lauritz Sørensen (9 de enero de 1868 - 12 de febrero de 1939), nacido en Havrebjerg (Dinamarca), fue un químico danés. Su gran aportación es la de introducir el concepto de pH.

Desde 1901 hasta 1938, era el jefe del prestigioso Laboratorio Carlsberg, de Copenhague. Trabajando en el Laboratorio Carlsberg estudió el efecto de la concentración de los iones sobre las proteínas, y por qué el ion H+ era particularmente importante. Fue el introductor de la escala de pH como un modo simple de expresión de ello en 1909. En el artículo en el cual él introdujo la escala (usando el pH de notación), describió dos nuevos métodos para medir la acidez. El primer método estaba basado en electrodos, mientras el segundo implicado la comparación de los colores de muestras y un juego preseleccionado de indicadores. El se encargó de obtener la formula para poder manejar números enteros en el PH.Se subdividia en alcalinas, neutras y dulces