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PROTEÍNAS G Y SUS CORRELACIONES GLICÓMICAS, PROTEÓMICAS,

METABOLÓMICAS Y ANTOCIANÍNICAS EN NANOFEMTOFISIOLOGÍA

VEGETAL PARA AGRICULTURA PROTEGIDA

Luis Alberto Lightbourn Rojas. PhD

1*, Dra. Josefa Adriana Sañudo Barajas

1,2, Dra. Josefina

León Félix1,2

, Dr. José Basilio Heredia1,2

, IBQ. Rubén Gerardo León Chan1, MC. Luis Alfonso

Amarillas Bueno1, MC. Talia Fernanda Martínez Bastidas

1, Biol. Gisela Jareth Lino López

1.

1División de Generación, Excogitación y Transferencia de Conocimiento. Bioteksa S.A de C.V.

(Bionanofemtotecnología en Sistemas Agrológicos). www.bioteksa.com. Carretera Las Pampas Km. 2.5, Col.

Industrial, CP 33981. Jiménez, Chihuahua México. lalr@bioteksa.com. 2 Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Unidad Culiacán Carret. a Eldorado Km. 5.5 Campo El Diez, Culiacán, Sin., 80129 México.Tel: (667) 7605536.

Palabras claves: Bionanofemtofisiología, Nutrición Genomática Epigenética, Modelo Bioquímico

Lightbourn, In cerebrum.

INTRODUCCIÓN

La característica principal del metabolismo de las plantas es su capacidad de adaptación y

respuesta a los cambios del medio ambiente, como temperatura, salinidad, los niveles de

luminosidad, deficiencia de nutrientes y sequía (Lloyd y Zakheleniuk, 2004). El

crecimiento y desarrollo de las plantas es mediado por una gran diversidad de vías de

señalización, coordinadas por factores exógenos que regulan todos los procesos fisiológicos

como división y diferenciación celular, fotosíntesis y respiración.

Las proteínas G están constituidas por tres diferentes subunidades (α, β y γ), las cuales

tienen una estructura altamente conservada y usualmente se encuentran unidas a un receptor

especifico de membrana (Trusov et al., 2009). Este receptor reconoce un amplio rango de

ligandos como agentes biogénicos, pigmentos, péptidos, feromonas de insectos, hongos y

cambios ambientales, lo cual permite a la planta responder ante una extensa variedad de

estímulos. Además, las proteínas G participan en la germinación, defensa ante el estrés

oxidativo, desarrollo, regulación de apertura de canales iónicos, respuesta a fitohormonas y

apertura de estomas (Millner, 2001; Nilson y Assmann, 2010). Sin embargo, a pesar de las

diversas investigaciones relacionadas, aun no es claro como las proteínas G pueden realizar

funciones tan diversas en las plantas.

En agricultura protegida, la nutrición implica la consideración de variables de trascendental

importancia, se trata del equilibrio suelo-planta-agua-atmósfera en sus aspectos biológicos,

físicos y químicos pero en condiciones limitantes. Por lo anterior, se debe considerar la

intensidad lumínica, la temperatura y la húmedad relativa como factores que definen la

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termodinámica de los procesos ligados directamente al metaboloma y secretoma

delimitados por los fenómenos fotosintéticos y respiratorios.

La producción de biomasa, vista como la tasa de formación de tejido, es directamente

proporcional al trabajo ejercido por la planta para sobrevivir y producir. Por lo que la

nutrición en ambientes protegidos requiere de moléculas específicamente diseñadas en

función de la arquitectura de las células y en sinergia con los delicados y precisos procesos

metabólicos que logran que el genoma se exprese en proteoma, que el metaboloma y el

secretoma funcionen en sincronía con los cambios, flujos y ritmos de las diversas fases

propias de las oscilaciones metabólicas y la difusión molecular de la nutrición genomática

epigenética.

La tautocronía del rayo de luz hacia la superficie foliar en condiciones de cobertura, es de

fundamental importancia no sólo para la fotosíntesis sino también para la respiración. Las

vibraciones transversas del rayo luminoso a través de los materiales filtro usados en la

agricultura protegida generan espacios de constricción en los organelos especializados para

capturar esta intensidad lumínica, afectando en forma directa todos los procesos de manejo

de energía tanto generativa como vegetativa. Lo que genera una propuesta diferente para la

nutrición en agricultura protegida.

Según el Modelo Bioquímico Lightbourn (MBL), la eficiencia y eficacia en la asimilación

de los nutrientes aportados por las moléculas usadas para alimentar a las plantas, responden

directamente a su arquitectura femtológica, la cual es determinada y determinante por la

arquitectura nanológica de la membrana celular (Lightbourn, 2011).

Los pasos fundamentales para un diseño arquitectónico nano-femto son los siguientes: 1.

Estudio topológico de la membrana celular, 2. Consideraciones termodinámicas y

estereoquímicas, 3. Ingeniería metabólica, 4. Diseño de la molécula, 5. Producción de la

molécula, 6. Trazabilidad exo- endógena del nutriente, 7. Una nueva forma de interpretar

los análisis de suelo, agua y planta, 8. Glicobiología correlacional, 9. Programa de nutrición

ad hoc, 10. Resultados precisamente proyectables, 11. Resultados confiablemente

cuantificables y, 12. Economía: energética, de recursos y de bajo impacto ambiental que

equivalen a una mayor sustentabilidad.

La profundidad del análisis va de acuerdo a las necesidades prácticas y propósitos

específicos, siendo aconsejable la valoración de la mayor cantidad de parámetros de

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relación. En el presente trabajo de investigación se presentan los análisis glicomicos y

proteómicos correlacionado con proteínas G en nonofemtofisiología de plantas producidas

en agricultura protegida.

METODOLOGÍA

La presente investigación integra un análisis in vivo, un in vitro y un in cerebrum.

In vivo

Esta etapa se desarrolló en la agrícola Paralelo 38, ubicada en el valle de Culiacán Sinaloa,

con la siguiente ubicación geográfica: Oriente-norte latitud 24°35´23", longitud

107°30´54", Oriente-sur latitud 24°34´53", longitud 107°31´01", Poniente-norte latitud

24°35´23", longitud 107°31´24", Poniente-sur latitud 24°34´53", longitud 107°31´24".

In vitro

La parte in vitro se desarrolló por el grupo de investigación BIOTEKSA RESEARCH

TEAM realizando las siguientes actividades:

Extracción de proteínas. Se realizó una extracción de proteínas de peciolo de acuerdo a la

metodología de Mechin et al. (2007), que consiste en la trituración del tejido en un mortero

y la precipitación de las proteínas con ácido tricloracético (TCA) y 2-mercaptoetanol en

acetona fría. La concentración de proteínas se determinó con el método de Bradford usando

albumina de suero bovino (BSA) como estándar.

Electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes (SDS-PAGE). Las proteínas

se separaron electroforéticamente en geles SDS-PAGE al 12 % de acuerdo a la metodología

de Laemmli (1970) y se corrieron en una cámara de MiniProtean (BIO-RAD), con buffer

de corrida de Tris-HCl 25 mM, pH 8.3, a 70 V por 3 h. Se tiñeron con azul de Coomassie

R-250 [azul de Coomassie 0.04% (p/v) en metanol 40% (v/v), ácido acético 10% (v/v),

agua 50% (v/v)] y se desteñieron con la misma solución pero sin el colorante (Garfin,

1990).

Electroforesis en dos dimensiones. El análisis en geles de segunda dimensión (2-DE) se

realizó utilizando tiras de IPG (Immobilized pH gradient, BIORAD) de 3 a 10 y de 4 a 7 de

pH. Las tiras se hidrataron con 300 µg de proteínas en 125 µL de buffer de rehidratación

(Urea 8 M, CHAPS 2 %, azul de bromofenol 0.02 %, DTT 0.56 %, IPG buffer 0.5 %) por

16 h a 20 °C. La separación isoeléctrica de las proteínas se realizó en el equipo Protean IEF

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Cell (BIO-RAD) durante 7.5 h a 20 °C. Después, las tiras se equilibraron por 10 min con

buffer de equilibrio [urea 6 M, SDS 2% (p/v), Tris-HCl 0.05 M, pH 8.8, glicerol 20% (v/v)

conteniendo] I con DTT [2% (p/v)] y II con iodoacétamida [2.5% (p/v)]. Posteriormente las

proteínas isoeléctroenfocadas se separaron en geles de SDS-PAGE al 12 % por 3 h a 70 V.

Inmunodetección de proteínas G por Western blot. Previo al Western blot, las proteínas

fueron separadas en geles de SDS-PAGE en 1 y 2 dimensiones. Las proteínas se

transfirieron a membranas de PVDF (Difluoruro de polivinilideno, BIO-RAD) en un

sistema de transferencia húmedo (Mini Trans-Blot Cell BIO-RAD) por 1.25 h a 100 V con

buffer de Tris-HCl 25 mM, pH 8.3, glicina 0.192 M, isopropanol 7.5% (v/v) (Villanueva,

2008). La membrana de PVDF se sometió a bloqueo con 25 mL de leche descremada tipo

Svelty (Nestle) al 5% (p/v) en buffer de Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, NaCl 0.5 M (TBS) por 2

h a 20 °C. Posteriormente se adicionó el anticuerpo Anti-Gα-Subunit Internal en TTBS

(1:5,000) y se incubó durante 12 h a 4 °C. En seguida se incubó la membrana con un

segundo anticuerpo anticonejo (goat anti-rabbit IgG, BIO-RAD) (1:30,000 en TTBS) a 20

°C por 2 h. Finalmente, la membrana de PVDF se colocó en 20 mL de buffer de revelado

de Tris 0.1 M, pH 9.5, MgCl2 0.5 mM y con los sustratos BCIP (sal de 5-bromo-4-cloro-3-

indolfosfato p-tolouidina) y NBT (cloruro de p-nitro azul de tetrazolio) por 1 h.

Análisis de Carbohidratos

Extracción de Savia. La savia se obtuvo por centrifugación, se retiraron los extremos de

los peciolos de hojas y se colocaron dentro de mallas Miracloth y posteriormente en un

tubo filtro falcón (sin membrana) se llevó a centrifugación a 10,000 rpm por 10 min a 4 °C.

Análisis de carbohidratos. De la savia obtenida se analizaron los azúcares totales por el

método de antrona (Yemm y Willis, 1954) y el contenido de azúcares neutros por el método

de acetatos de alditol que consiste de una hidrólisis con ácido trifluoroacético (TFA) 2 N

por 1 h a 120 ºC, una reducción con borohidruro de sodio (20 mg/mL) y una posterior

acetilación con anhidro acético e imidazol (10:1), finalmente se inyecta para su análisis a

un cromatografo de gases equipado con un detector FID (250 °C), una columna capilar DB-

23 (30 m X 0.25 mm) (210 °C), helio como gas acarreador a flujo constante (3 mL/min),

empleándose mio-inositol (100 µg/mL) como estándar interno (Albersheim et al., 1967;

Blakeney et al., 1983).

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También se obtuvieron los azúcares solubles (azúcares libres, solubles en acetona) e

insolubles (azúcares de polisacáridos, insolubles en alcohol) y neutros. Los insolubles se

obtuvieron adicionándole a la savia 4 volúmenes (v) de etanol e incubación por 12 h a 4 ºC.

Los azúcares solubles se obtuvieron de la adición de acetona fría (4:1 v/v) e incubación a -

20 ºC por 12 h. Los azúcares insolubles se obtuvieron por centrifugación a 3,000 rpm por 5

min, mientras que los solubles se centrifugaron a 10,000 rpm por 15 min a 4 ºC.

De los azúcares insolubles se determinó los extremos reductores (Gross, 1982) y glucosa

(Gluc), sacarosa (Sac) y fructosa (Fruc) por método enzimático que consiste en la toma de

tres absorbancias (Abs) a 340 nm: Abs1, incubación de la muestra (100 µL) con invertasa

10 min, seguida de la adición de la enzima NADP+

más ATP e imidazol e incubación 10

min más. Abs2, incubación con hexoquinasa más glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6P)

por 10 min. Abs3, incubación con la enzima PGI (fosfoglucosa isomerasa) por 10 min.

Todas las incubaciones se realizaron a 30 ºC.

In cerebrum

Esta parte consiste en la integración de todos los resultados y observaciones obtenidos y la

aplicación del Modelo Bioquímico Lightbourn.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En las Figuras 1A, B y C, se muestran los perfiles proteicos de plantas de chile morrón en

tres etapas fenológicas, mostrando variación en el contenido de proteínas. En la Figura 1D

se muestra el perfil de reconocimiento, por inmunodetección, con el anticuerpo contra la

subunidad alfa de la proteína G (Anti-Gα-Subunit Internal), encontrándose la detección de

bandas con pesos moleculares de 57, 46 y 37 kDa, pesos moleculares reportados para

proteínas G en otras especies de plantas.

En la Figura 2, se muestra el perfil en geles de 2-DE de proteínas de chile morrón y su

inmunodetección por Western blot, donde se observa el reconocimiento de una proteína de

57 kDa con un punto isoeléctrico de 5.9.

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A B C

Figura 1. Perfil electroforético de proteínas de chile en etapas de floración (A)

fructificación (B) y producción (C) y Western blot (D). MPM, marcador de peso molecular

en kDa; 1, Malla 1; 2, Malla 2.

A B

Figura 2. Perfil de proteínas de chile en gel 2-DE (A) e inmunodeteccion tipo western blot

de proteínas Gα (Anti-Gα-Subunit Internal). MPM, marcador de peso molecular en kDa.

También se analizaron las proteínas de savia de chile por SDS-PAGE (Figura 3A) y

Western blot (Figura 3B). Se encontró el reconocimiento en mayor intensidad de una banda

de 67 kDa en los carriles 1, 3 y 4 correspondiente a las etapas de trasplante, fructificación y

fructificación/producción. En la etapa de floración se detectaron 2 proteínas de 28 kDa y 24

kDa. Además, en la etapa de producción (carril 5) se encontró el reconocimiento de las

proteínas de 67 y 28 kDa con mayor intensidad, además de otras bandas.

D

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Figura 3. Perfil electroforético de proteínas de savia de chile en distintas etapas (A) y su

inmunodetección por Western blot (B). MPM, marcador de peso molecular en kDa; 1,

Trasplante en mallas; 2, Floración; 3, Fructificación; 4, Fructificación/Producción; 5,

Producción.

En la Figura 4A, se muestran las concentraciones de glucosa, fructosa y sacarosa, de chile

morrón en distintas etapas producido en agricultura protegida. Se puede observar que en la

etapa de floración se presentó la menor cantidad de dichos azúcares con 0.36, 0.05, 0.06 y

0.66 mg/mL de savia, respectivamente. Mientras que los mayores resultados se encontraron

al inicio del trasplante de las plantas a las mallas.

En los azúcares neutros libres (Figura 4B), se encontró que la glucosa fue el azúcar

predominante, seguido por galactosa, manosa, ramnosa, arabinosa, xilosa y fucosa. En los

azúcares neutros de polisacáridos obtenidos de su precipitación con alcohol, se encontró el

siguiente orden de mayor a menor abundancia: galactosa, arabinosa, xilosa, glucosa,

manosa, ramnosa y fucosa (Figura 4C).

A B

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Figura 4. Contenido de azúcares en savia de chile a diferentes etapas desarrollo en agricultura protegida.

A B

C

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In cerebrum

Figura 5. Aplicación del Modelo Bioquímico Lightbourn en la nutrición coloidal

bionanotecnológica (Lightbourn, 2011).

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Figura 6. Diagrama general del “Science Driven” del instituto Lightbourn.

PERSPECTIVAS

El presente trabajo representa el inicio de una investigación integral que involucra las disciplinas de

proteómica, glicómica y metabolómica, en la cual se pretende realizar el análisis de moléculas

predictivas del estado fisiológico de las plantas, con el propósito de establecer un sistema teórico de

biometría homológica que funcione en la práctica para la formación de biomasa y con ello, lograr

una producción con mayor consistencia, mejor calidad y mayor rendimiento unitario en períodos

más amplios de cosecha. Por ello, el objetivo inicial de la investigación es conocer e implementar

las técnicas para identificar y caracterizar las proteínas G, una de las principales moléculas

reguladoras del metabolismo de las plantas.

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BIBLIOGRAFIA

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