1

1.0 Les acides aminés

Introduction

"(...)La substance organique qui est présente dans toutes les parties du corps animal

et, comme nous allons le voir, du royaume végétal, pourrait être appelée protéine,

de πρωτειοσ (au premier rang) (...)"

Gerardus Johannes Mulder

Journal für praktische Chemie 16, 129 (1839)

Voilà, c'est ainsi que le mot protéine entra dans notre vocabulaire. À cause de leur

capacité d'adopter une infinité de formes et de leur synthèse à même les cellules, les

protéines sont l'outil à tout faire du monde vivant, le canif suisse de l'évolution, les

blocs Lego avec lesquels tout ce qui vit est bâti.

Des protéines structurales maintiennent la forme des cellules et des organismes.

Des protéines enzymatiques contrôlent des milliers de réactions qui s'entrecroisent

en un élégant ballet chimique d'anabolisme et de catabolisme. Des protéines

reconnaissent et détruisent les substances étrangères et nocives. Des protéines

assurent que le plan a partir duquel elles sont toutes construites (l'ADN) soit

reproduit pour les générations futures.

Nous nous nourrissons de protéines provenant de tous les royaumes du monde

vivant; nous nous en vêtons depuis que nous avons appris a apprécier la chaleur de

la laine, la douceur de la soie ou la résistance du cuir; nous en faisons des

médicaments; nous cherchons même a reproduire industriellement des fibres

protéiques plus solides que l'acier et aussi légére que la soie comme en fabriquent

nos congénères invertébrés. Plus que jamais, l'utilisation des protéines est au coeur

même de notre vie a tous.

Le cours BCM-514, biochimie des protéines, présuppose que vous en savez déjà

beaucoup sur ces molécules. Vous y aurez l'occasion de revoir, d'approfondir et d'y

mettre en contexte des notions acquises au cours de vos études. Ne vous étonnez

pas de vous sentir parfois en terrain familier; nous commencerons en effet par une

révision des notions physico-chimiques qui nous permettent de comprendre la

structure et le fonctionnement des protéines, afin de bien saisir un peu plus tard

comment ces paramètres influencent notre stratégie de purification ou d'analyse...

car l'essentiel du cours se consacre à l'utilisation de ces connaissances

biochimiques, que ce soit pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires de

la cellule ou pour produire et purifier les protéines à des fins analytiques ou

industrielles.

Nous parlerons donc de différentes techniques de purification et d'observation des

protéines, d'une part dans le contexte des travaux de recherche académique à petite

2

échelle et d'autre part dans le contexte de projets de plus grande envergure

auxquels on colle souvent l'étiquette de projets en protéomique.

Nous discuterons aussi des travaux de l'industrie privée sur différents aspects de la

biochimie des protéines, particulièrement dans le domaine pharmaceutique.

Mais tout d'abord, revenons-en aux sources et consacrons quelques pages aux

notions de base sur la biochimie protéique...

1.0 Les acides aminés

1.1 Les vingt acides aminés de base

3

Les protéines sont de longues chaînes composées d'une succession de maillons et

repliées dans l'espace. Les maillons de ces chaînes sont de petites molécules

appelés acides aminés. Comme leur nom l'indique, les acides aminés portent un

groupe acide (-COOH) et un groupe aminé (-NH2). Ils sont au nombre de vingt dans

les protéines (nous verrons quelques exceptions à cette règle un peu plus loin). On

retrouve plusieurs autres acides aminés dans l'organisme (l'ornithine, par exemple)

mais ils n'entrent pas dans la composition des protéines.

Les acides aminés retrouvés dans les protéines ont tous la même structure de base:

ils sont orientés autour d'un atome de carbone central, le carbone α, sur lequel

s'articulent le groupe carboxyl (-COOH), le groupe aminé (-NH2), un atome

d'hydrogène (-H) et un groupement latéral (noté -R). C'est la nature de ce

groupement latéral (on dit aussi chaîne latérale) qui différencie les acides aminés

entre eux.

Le carbone α central est donc asymétrique dans tous les cas mis à part celui de la

glycine (parce que la glycine a un hydrogène à la place d'une chaîne latérale). Cela

signifie qu'il est possible d'avoir deux conformations différentes d'un même acide

aminé, conformations qu'il est impossible d'interconvertir sans briser et réassembler

de liens covalents. On désigne ces conformations L et D. Bien que les deux puissent

être synthétisées dans une même réaction chimique, seule la forme L est utilisée

dans les protéines.

La façon de savoir si on a affaire à une forme L ou D dans la structure d'un acide

aminé est de le regarder le long de l'axe du lien qui lie son hydrogène au carbone α.

Dans la forme L, l'agencement des autres groupements sur le carbone central sera

le suivant dans le sens des aiguilles d'une montre: COOH, R, NH3 ou CORN.

On appelle ce truc la loi de CORN.

4

Les chaînes latérales des acides aminés permettent de classer ces derniers en

différents groupes partageant certaines caractéristiques. Certains sont polaires, et

donc hydrophiles, d'autres non-polaires et donc hydrophobes. Certains sont chargés,

d'autres non. Certains contiennent un cycle aromatique. Certains contiennent du

soufre, etc.

Deux acides aminés tranchent un peu parmi les autres: la glycine (G, Gly), le plus

petit acide aminé, n'a en guise de

chaîne latérale qu'un atome d'hydrogène. La proline (P, Pro), elle, a une chaîne

latérale en forme de boucle

(un anneau pyrrolidone) qui va contacter l'azote de son groupement aminé; le résultat

en est que la proline est techniquement un acide iminé (-NH-) plutôt qu'aminé.

L'impact de cette structure sur celle des protéines sera vu

plus loin.

Quatre acides aminés ont une chaîne latérale fortement ionisée et donc chargée à

pH neutre: il s'agit de l'acide aspartique (D, Asp) et de l'acide glutamique (E, Glu),

dont la chaîne latérale porte un groupement acide supplémentaire (COOH); et de la

lysine (K, Lys) et de l'arginine (R, Arg) dont la chaîne latérale porte un groupement

aminé (-NH3+ pour la lysine, =NH2+ pour l'arginine). Un cinquième acide aminé,

l'histidine (H, His), porte une charge positive plus faible à pH neutre.

5

Les deux acides aminés acides ont des dérivés dont le groupement acide (-COOH) est

changé pour un groupement

amide (-CONH2). Il s'agit de l'asparagine (N, Asn) pour l'acide aspartique et de la

glutamine (Q, Gln) pour l'acide glutamique. Ces deux acides aminés sont non-chargés à

pH neutre mais restent polaires et hydrophiles.

6

La sérine (S, Ser) et la thréonine (T, Thr) ont un groupement hydroxyl (-OH) dans leur chaîne latérale. Cela leur permet d'interagir avec l'eau et d'autres molécules en formant des ponts hydrogènes, ou d'être la cible de modifications utilisant ce site réactionnel.

Les acides

aminés

contenant des

cycles comme

la phénylalanine

(F, Phe), le

tryptophane (W,

Trp) ou la

tyrosine (Y, Tyr)

sont très

hydrophobiques

; c'est le cas

aussi de leurs

congénères

dont la chaîne

latérale consiste

en une

succession de

groupements

éthyl- et méthyl-

. On dit de ceux-

ci qu'ils sont

aliphatiques.

7

L'alanine (A,

Ala), la la valine

(V, Val), la

leucine (L, Leu),

L'isoleucine (I,

Ile) sont tous

des acides

aminés

aliphatiques.

On inclut généralement dans cette famille la méthionine (M, Met), dont la chaîne latérale

plutôt aliphatique contient un soufre non réactif. Notons que la tyrosine, malgré son

caractère hydrophobique dû au cycle benzénique, a tout de même un groupement -OH

qui, à l'instar de la sérine et de la thréonine, lui permet d'interagir avec l'eau ou d'être la

cible de réaction utilisant les groupements hydroxylés.

8

La cystéine (C, Cys) est un peu dans une classe à part, car elle a à l'extrémité de sa

chaîne latérale un groupement sulfhydryl réactif..

Certains acides aminés sont synthétisés à même nos cellules; d'autres doivent faire

partie de notre alimentation (d'où notre besoin de manger des protéines). Ces

derniers acides aminés sont dits essentiels; ce sont la thréonine, la lysine, l'histidine,

l'isoleucine, la leucine, la méthionine, la phénylalanine, le tryptophane et la valine:

TKHILMFWV (qu'une ritournelle mnémonique peut changer en "HoT MILK For VW"

Il faut juste se souvenir de ne pas prendre le r en considération. Le O, lui, ne code

pas pour un acide aminé impliqué dans la synthèse des protéines.).

Dans des conditions oxydantes, une cystéine forme fréquemment un pont disulfure avec une autre

cystéine pour donner un dimère qu'on appelle cystine. Les cystéines contribuent à maintenir la structure

tridimensionnelle de très nombreuses protéines grâce à cette faculté.

9

1.1.1 Les vingt acides aminés de base: quelques spécifications

Acide aminé

Code à

3

lettres

Code

à 1

lettre

Poids

(en

g/mol)

mutabilité

relative (a)

probabilité de

se trouver en

surface (b)

alanine Ala A 89,1 100 62

arginine Arg R 174,2 65 99

asparagine Asn N 132,1 134 88

aspartate Asp D 133,1 106 85

cystéine Cys C 121,2 20 55

glutamate Glu E 147,1 102 82

glutamine Gln Q 146,2 93 93

glycine Gly G 75,1 49 64

histidine His H 155,2 66 83

isoleucine Ile I 131,2 96 40

leucine Leu L 131,2 40 55

lysine Lys K 146,2 56 97

méthionine Met M 149,2 94 60

phénylalanine Phe F 165,2 41 50

proline Pro P 115,1 56 82

sérine Ser S 105,1 120 78

thréonine Thr T 119,1 97 77

tryptophane Trp W 204,2 18 73

tyrosine Tyr Y 181,2 41 85

10

valine Val V 117,1 74 46

(a) Probabilité qu'un résidu particulier soit muté ponctuellement pendant l'évolution.

La valeur de l'alanine a été arbitrairement fixée à 100.

(b) Probabilité que 5% ou plus d'un résidu particulier se trouve à la surface d'une

protéine.

Une règle informelle suggère d'utiliser un poids de 110 Daltons par résidu pour

calculer à vue de nez le poids d'une protéine (même si le poids moyen d'un acide

aminé est plutôt 136). Cette règle fonctionne étonnament bien dans la plupart des

cas. Ainsi, le poids réel de la protéine de BARD-1, qui compte 777 acides aminés est

de 86,6 kDa (poids calculé à l'aide du calculateur ScanSite du MIT, trouvé sur le site

d'ExPASy) alors que le poids estimé "au pif" est de 777 acides aminés X 110 = 85,4

kDa, ce qui est très proche de la valeur réelle.

1.1.2 Autres acides aminés et autres abréviations

En parcourant la littérature scientifique, on tombe parfois sur des acides aminés dont

le nom abrégé (Iva, Abu) n'est pas familier. Il s'agit souvent de résidus modifiés, ou

parfois de noms alternatifs pour les acides aminés de base. Le tableau qui suit en

désigne quelques-uns.

11

1.2 Charge des acides aminés

Les acides aminés individuels portent au moins deux groupes ionisables: le groupe -

NH2 et le groupe -COOH, ionisables en -NH3+ et -COO-. Ils ont donc un caractère

amphotère car ils peuvent être à la fois donneur ou accepteur d'électrons. Ils

peuvent par conséquent servir d'agent tampon. On appelle zwitterion une molécule

qui porte à la fois une charge positive et négative (c'est de l'allemand pour "ion

hybride"). La nature dipolaire des acides aminés a d'abord été remarquée parce que

leurs cristaux étaient beaucoup

plus stables à la chaleur que ceux de molécules organiques de taille similaire: c'est

que les interactions ioniques entre les charges différentes fortifient le réseau

cristallin.

Le pKa des acides aminés tourne autour de 2, ce qui est normal pour un acide; leur

pKb tourne autour de 9-10, ce qui est attendu pour une base. Les chaînes latérales

qui ont un pK ont des valeurs variables: le pKR de D et E tourne autour de 4 (ces

chaînes sont acides); le pKR de H, R et K est de 6, 12,5 et 10,5 respectivement (ce

sont des chaînes basiques). Ce qui compte en bout du compte n'est de toute façon

12

pas tant le pK de chaque acide aminé, mais celui, global, de la protéine qui les

contient!

L'effet tampon des acides aminés est maximal quand le pH ambiant est près du pKa

ou du pKb de la molécule, ainsi qu'on le devine en regardant la formule

pH= pKa/b + log ( [accepteur]/[donneur] )

Un effet tampon est maximal quand la concentration d'accepteur et de donneur sont

similaires, ce qui donne dans la formule ci-haut un ratio proche de 1. Comme le log

de 1 est zéro, pH = pKa ou pKb.

Quand toutes les charges portées par une protéine s'équivalent, on dit qu'elle atteint

son point isoélectrique. C'est aussi le point où une protéine a le moins d'interactions

avec les molécules d'eau, et donc le point où elle est le moins soluble.

Pour vous rappeler l'ordre dans lequel les groupes s'ionisent en fonction du pH,

rappelez-vous seulement qu'à pH bas, vous ajoutez tous les hydrogènes possibles

et qu'à pH élevé vous enlevez tous ceux que vous pouvez. Ainsi, à pH 2 les groupes

hydroxyls seront sous forme COOH et les groupes aminés sous forme NH3+, alors

qu'à pH 11 les groupes hydroxyls seront sous forme -COO- et les groupes aminés

sous forme NH2.

13

Acide aminé pK1 pK2 pK3 pI

(COOH) (NH2) (latéral)

Glycine (G, Gly) 2,35 9,6 5,97

Alanine (A, Ala) 2,34 9,69 6,01

Valine (V, Val) 2,32 9,62 5,97

Leucine (L, Leu) 2,36 9,6 5,98

Isoleucine (I, Ile) 2,36 9,68 6,02

Proline (P, Pro) 1,99 10,96 6,48

Phenylalanine (F, Phe) 1,83 9,13 5,48

Tyrosine (Y, Tyr) 2,2 9,11 10,07 5,66

Tryptophane (W, Trp) 2,38 9,39 5,89

Sérine (S, Ser) 2,21 9,15 5,68

Thréonine (T, Thr) 2,11 9,62 5,87

Asparagine (N, Asn) 2,02 8,08 5,41

Glutamine (Q, Gln) 2,17 9,13 5,65

Cystéine (C, Cys) 1,96 8,18 10,28 5,07

Methionine (M, Met) 2,28 9,21 5,74

14

Acide aspartique (D, Asp) 2,19 9,6 3,65 2,77

Acide glutamique (E, Glu) 2,19 9,67 4,25 3,22

Histidine (H, His) 1,82 9,17 6 7,59

Lysine (K, Lys) 2,18 8,95 10,53 9,74

Arginine (R, Arg) 2,17 9,04 12,48 10,8

1.3 Hydrophobicité

La chaîne latérale des acides aminés peut être plus ou moins hydrophobe. Les

cycles et les chaînes aliphatiques sont bien entendu plus hydrophobes que les

chaînes chargées ioniquement. Ces différences joueront un rôle dans les structures

supérieures des protéines. La phénylalanine est le plus hydrophobe; l'acide

aspartique le plus hydrophile.

Voici une liste du degré d'hydrophobicité des acides aminés. Comme il existe

plusieurs façons d'évaluer l'hydrophobicité, on n'en présentera qu'une ici. Cette

échelle se nomme OMH (optimized matching hydrophobicity), et son origine remonte

à l'article suivant :

Sweet R.M., Eisenberg D. (1983) J. Mol. Biol. 171:479-488.

Plus le chiffre est élevé, plus l'acide aminé est hydrophobe.

Phenylalanine 1,92

Tyrosine 1,67

Isoleucine 1,25

Leucine 1,22

15

Methionine 1,02

Valine 0,91

Tryptophane 0,5

Cysteine 0,17

Threonine -0,28

Alanine -0,4

Proline -0,49

Serine -0,55

Arginine -0,59

Histidine -0,64

Glycine -0,67

Lysine -0,67

Glutamine -0,91

Asparagine -0,92

Acide glutamique -1,22

16

Acide aspartique -1,31

1.4 Acides aminés un peu plus exotiques

Certains acides aminés ne se retrouvent pas dans les protéines, et certains acides

aminés protéiques subissent des modifications post-traductionnelles.

1.4.1 Acides aminés modifiés de façon post-traductionnelle

(Veuillez vous référer au chapitre 3 pour une couverture plus large des modifications

post-traductionnelle des protéines).

En dégradant des protéines pour obtenir les acides aminés qui les composent, on en

retrouve souvent qui varient par rapport au modèle de base. Ces acides aminés

modifiés jouent différents rôles importants dans la structure et la fonction des

protéines. On ne les ajoute pas à la liste des vingt, cependant, parce qu'ils ne sont

que des modifications d'acides aminés standards: une hydroxyproline, par exemple,

est une proline à laquelle un enzyme a été greffer un groupement hydroxyl.

Certains de ces acides aminés modifiés peuvent avoir une allure complexe: ainsi,

suite à une succession de pontages covalents, quatre lysines peuvent être réunies

en une molécule de desmosine (on la retrouve dans une protéine appelée élastine,

qui se retrouve dans les ligaments et le tissu conjonctif des grandes artères). La

desmosine aide à conférer à cette protéine ses vertus élastiques.

17

Quelques acides aminés modifiés qu'on retrouve dans les protéines.

Le gamma-carboxyglutamate qu'on voit dans cette figure est produit par une

modification d'un résidu glutamate. Cette modification est catalysée par la vitamine

K, qui tient son nom du mot allemand Koagulation. En effet, le gamma-

carboxyglutamate se retrouve dans plusieurs protéines impliquées dans la

coagulation sanguine, comme la prothrombine. Il aide à fixer un ion Ca2+.

1.4.2 Quelques acides aminés qu'on ne retrouve pas dans les protéines.

Des acides aminés peuvent avoir des rôles cruciaux sans être impliqués dans la

synthèse protéique. En voici quelques examples.

18

Les hormones thyroïdiennes, qui sont

responsables du contrôle du métabolisme

de l'organisme, sont appelées T3 et T4

(thyroxine et triiodothyronine). Ce sont des

modifications de la tyrosine portant un

cycle supplémentaire et des atomes d'iode.

C'est pour synthétiser ces deux hormones

que la glande thyroïde a besoin d'iode.

Par ailleurs, un autre dérivé d'acide aminé joue un rôle de premier plan dans le

contrôle de la production d' oxyde nitrique NO. Il s'agit de la diméthylarginine

asymétrique ou ADMA. L'ADMA est un inhibiteur de la réaction par laquelle l'oxyde

nitrique est synthétisé à partir de l'arginine:

NO est une molécule aux mutliples fonctions dans l'organisme. C'est un

neurotransmetteur avec de nombreuses fonctions dans le système nerveux

central; il joue un rôle, par exemple, dans la mémoire et la modulation de la

douleur; il relaxe les muscles lisses des bronches; il stimule l'inflammation.

Il aide aussi à la régulation de la pression sanguine et ce dernier effet fait du

dosage de l'ADMA une information très utile pour aider à prévenir les

accidents cardio-vasculaires, la pré-éclampsie chez les femmes enceintes et

même le diabète de type II; en outre, un niveau plasmatique élevé d'ADMA

peut être un signe avant-coureur d'athérosclérose.

Un acide aminé du nom de coprine présente un intérêt particulier pour les gourmets

amateurs de champignons. On le retrouve dans le coprin noir d'encre, Coprinus

atramentarius. La coprine n'est pas toxique en elle-même, et c'est pourquoi ce

coprin est considéré comestible (encore que pas particulièrement savoureux). Le

problème avec la coprine, c'est que sa dégradation produit deux composés, le 1-

Aminocyclopropanol et l'hydrate de cyclopropanone, qui agissent comme inhibiteurs

19

de l'enzyme aldéhyde déhydrogénase. Cet enzyme, en convertissant l'acétaldéhyde

en acide acétique et en CO2 aide à détoxifier l'ethanol. Cette inhibition qui peut durer

trois jours cause donc notre intoxication, non pas par le champignon lui-même, mais

par l'acétaldéhyde venant du catabolisme de l'ethanol! Ainsi, si on mange des

coprins noir d'encre, on ne doit absolument pas boire d'alcool sous peine de soufrir

d'une intoxication à l'acétaldhyde. Bonjour la migraine, les rougeurs, les maux de

coeur et tout le tralala.

1.5 Le code génétique

Les acides aminés sont assemblés en chaîne selon un ordre déterminé par une

séquence d'ADN. Chaque acide aminé est représenté sur l'ADN par un triplet de

bases appelé codon.

Puisqu'il existe quatre nucléotides dans l'ADN, il existe aussi une possibilité

maximale de 43 codons, ou 64. Il n'y a cependant que 20 acides aminés, qui se

partagent ces possibilités entre eux (et avec trois signaux d'arrêt de la traduction). La

distribution des codons n'est pas égale: il n'y a par exemple qu'un seul codon codant

pour le tryptophane mais six pour l'arginine.

20

Le code génétique. Chaque codon

(ou triplet de nucléotides) se lit du

centre vers l'extérieur. En plus des

codons désignant les 20 acides

aminés, il existe trois codons

STOP, qui marquent la fin de la

séquence d'une protéine: les

codons amber (TAG), ochre (TAA)

et opal (TGA)

1.5.1 Universalité relative du code génétique

Le code génétique est extrêmement conservé dans la nature. Des plus humbles

procaryotes aux plus massifs séquoias, les acides aminés et les codons stop sont

presque toujours les mêmes. Il existe cependant quelques mutations qui se sont

accumulées au cours de l'évolution, principalement chez certaines mitochondries qui

ont leur propre génome, et dont le code peut varier un peu face à celui utilisé par

l'ADN nucléaire.

21

Variations sur un thème: certains codons ont changé de signification dans certaines

organelles ou certains organismes au cours du temps. Les flèches indiquent des

mutations cumulatives qui peuvent refléter soit une conservation évolutive, soit une

évolution parallèle. Ainsi, les mitochondries des planaires cumulent les mutations

Stop(TGA)W, R(AGA)S, R(AGG)S, K(AAA)N et Stop (TAA)Y. Notez que chez les

plantes, noyaux et mitochondries utilisent le même code et peuvent donc s'échanger

des gènes. (Adapté des travaux de Weberndorfer, Hofacker et Stadler)

1.5.2 Utilisation préférentielle des codons

Il est utile en biotechnologie de se rappeller que différents organismes n'utilisent pas

avec le même enthousiasme tous les codons disponibles pour un même acide

aminé. Certains codons sont clairement favorisés par rapport à d'autres, ce qui se

reflète souvent dans l'abondance des ARNt correspondants. Ce phénomène est

probablement lié à des considérations économiques pour les organismes.

En exprimant une séquence d'ADN dans un système hétérologue (H. sapiens dans

E. coli, par exemple), mieux vaut donc être sûr d'utiliser une séquence qui sera

facilement traduite par les ARNt de l'hôte, quitte à changer par génie génétique des

codons défavorisés par des codons favorisés. Sinon, on risque de s'exposer à des

tracas du genre

- traduction retardée entraînant une baisse de la stabilité de l'ARNm;

- terminaison prématurée, pouvant mener à des protéines trop courtes ou instables;

- changements de cadre de lecture ou mauvaise incorporation;

- inhibition de la synthèse protéique.

22

Dans la liste ci-dessous, on compare trois organismes et leur préférence en fait de

codons codant pour l'arginine. Si tout était égal par ailleurs, on s'attendrait à ce que

chacun des six codons Arg soit représenté avec une fréquence d'environ 16,5% et

en effet, chez l'être humain, il n'existe qu'un léger biais qui défavorise le codon CGT.

Par contre, chez S.cerevisiae, les codons CGG, CGC et CGA ne représentent

respectivement que 2%, 4% et 5% des codons Arg du génome et la levure ne

fabrique que très peu des ARNt portant les anticodons appropriés. Une séquence

humaine exprimée dans la levure aurait intérêt à voir tous ses codons Arg changés

pour AGA, qui est fortement favorisé par cet organisme.

codon H. sapiens S. cerevisiae E. coli

AGG 21,5 17,0 3,2

AGA 21,0 54,0 4,3

CGG 18,2 2,0 9,0

CGA 10,7 5,0 5,0

CGT 9,1 17,0 36,0

CGC 19,5 4,0 40,0

1.5.2.1 Utilisation des codons: comparaison entre différentes espèces

(source: http://www.kazusa.or.jp/codon/

Homo sapiens (codon, acide aminé, fréquence sur 1).

UUU F 0.46 UCU S 0.18 UAU Y 0.44 UGU C 0.45

UUC F 0.54 UCC S 0.22 UAC Y 0.56 UGC C 0.55

UUA L 0.07 UCA S 0.15 UAA stop 0.28 UGA stop 0.5

UUG L 0.13 UCG S 0.06 UAG stop 0.22 UGG W 1.0

CUU L 0.13 CCU P 0.28 CAU H 0.41 CGU R 0.08

CUC L 0.20 CCC P 0.33 CAC H 0.59 CGC R 0.19

CUA L 0.07 CCA P 0.27 CAA Q 0.26 CGA R 0.11

23

CUG L 0.40 CCG P 0.11 CAG Q 0.74 CGG R 0.21

AUU I 0.36 ACU T 0.24 AAU N 0.46 AGU S 0.15

AUC I 0.48 ACC T 0.36

AAC N 0.54

AGC S 0.24

AUA I 0.16

ACA T 0.28

AAA K 0.42

AGA R 0.21

AUG M 1.0

ACG T 0.12

AAG K 0.58

AGG R 0.20

GUU V 0.18

GCU A 0.26

GAU D 0.46

GGU G 0.16

GUC V 0.24

GCC A 0.40

GAC D 0.54

GGC G 0.34

GUA V 0.11

GCA A 0.23

GAA E 0.42

GGA G 0.25

GUG V 0.47

GCG A 0.11

GAG E 0.58

GGG G 0.25

Saccharomyces cerevisiae Triplet, acide aminé, fréquence (sur 1)

UUU F 0.59 UCU S 0.26 UAU Y 0.56 UGU C 0.63

UUC F 0.41

UCC S 0.16

UAC Y 0.44

UGC C 0.37

UUA L 0.28

UCA S 0.21

UAA stop 0.47

UGA stop 0.3

UUG L 0.29

UCG S 0.10

UAG stop 0.23

UGG W 1.0

CUU L 0.13

CCU P 0.31

CAU H 0.64

CGU R 0.15

CUC L 0.06

CCC P 0.15

CAC H 0.36

CGC R 0.06

CUA L 0.14

CCA P 0.42

CAA Q 0.69

CGA R 0.07

CUG L 0.11

CCG P 0.12

CAG Q 0.31

CGG R 0.04

AUU I 0.46

ACU T 0.35

AAU N 0.59

AGU S 0.16

AUC I 0.26

ACC T 0.21

AAC N 0.41

AGC S 0.11

24

AUA I 0.27

ACA T 0.30

AAA K 0.58

AGA R 0.48

AUG M 1.0

ACG T 0.14

AAG K 0.42

AGG R 0.21

GUU V 0.39

GCU A 0.38

GAU D 0.65

GGU G 0.47

GUC V 0.21

GCC A 0.22

GAC D 0.35

GGC G 0.19

GUA V 0.21

GCA A 0.29

GAA E 0.71

GGA G 0.22

GUG V 0.19

GCG A 0.11

GAG E 0.29

GGG G 0.12

Escherichia coliTriplet, acide aminé, fréquence (sur 1)

UUU F 0.57 UCU S 0.15 UAU Y 0.57 UGU C 0.44

UUC F 0.43

UCC S 0.15

UAC Y 0.43

UGC C 0.56

UUA L 0.13

UCA S 0.12

UAA stop 0.63

UGA stop 0.29

UUG L 0.13

UCG S 0.15

UAG stop 0.08

UGG W 1.0

CUU L 0.1

CCU P 0.16

CAU H 0.57

CGU R 0.38

CUC L 0.1

CCC P 0.12

CAC H 0.43

CGC R 0.40

CUA L 0.04

CCA P 0.19

CAA Q 0.35

CGA R 0.06

CUG L 0.5

CCG P 0.53

CAG Q 0.65

CGG R 0.10

AUU I 0.51

ACU T 0.17

AAU N 0.45

AGU S 0.15

AUC I 0.42

ACC T 0.43

AAC N 0.55

AGC S 0.28

AUA I 0.07

ACA T 0.13

AAA K 0.76

AGA R 0.04

AUG M 1.0

ACG T 0.27

AAG K 0.24

AGG R 0.02

GUU V 0.26

GCU A 0.16

GAU D 0.63

GGU G 0.34

GUC V 0.22

GCC A 0.27

GAC D 0.37

GGC G 0.40

GUA V 0.15

GCA A 0.21

GAA E 0.69

GGA G 0.11

25

GUG V 0.37

GCG A 0.36

GAG E 0.31

GGG G 0.15

Les six codons les moins utilisés chez E.coli, et leur fréquence chez d'autres

organismes (nombre par millier de codons):

AGG AGA CGA CUA AUA CCC

R R R L I P

E. coli 1,4 2,1 3,1 3,2 4,1 4,3

H. sapiens 11 11,3 6,1 6,5 6,9 20,3

D. melanogaster 4,7 5,7 7,6 7,2 6,9 18,6

C. elegans 3,8 15,6 11,5 7,9 9,8 4,3

S. cerevisiae 9,3 21,3 3 13,4 17,8 6,8

P. falciparum 4,1 20,2 0,5 15,2 33,2 1

C. pasteurianus 2,4 32,8 0,8 6 52,5 8,5

P. honkoshii 30,3 20,4 1 18 44,9 10,1

T. aquaticus 13,7 1,4 1,4 3,2 2 43

A. thaliana 10,9 18,4 6 9,8 12,6 5,2

(Strategies Newsletter (2000) vol. 3 (1) p.31)

Les huit codons les moins utilisés:

E.coli Levure Drosophile Humain acide

aminé

AGG AGG

R

AGA

AGA

R

AUA

AUA

I

CUA

CUA L

CGA CGA CGA CGA R

26

CGG CGG CGG

R

CCC

CCG P

UCG

S

CGC

CGU R

CCG

P

CUC

CUU L

GCG

GCG A

ACG

ACG T

UUA UUA L

GGG

G

AGU

S

UGU

C

GUA V

UUG L

Certaines souches bactériennes commerciales contiennent des transgènes

exprimant les ARNt normalement sous-exprimés. De telles souches nous permettent

de contourner le problème sans avoir à optimiser les codons des protéines que l'on

veut faire exprimer.

BL21 (DE3) CodonPlus-RIL R (AGG, AGA), I(AUA) et L (CUA)

BL21 (DE3) CodonPlus-RP R (AGG, AGA) et P (CCC)

Rosetta ou Rosetta (DE3) R (AGG/AGA), R (CGG), I (AUA), L (CUA), P (CCC) et G

(GGA)

(Les bactéries CodonPlus sont des produits de la compagnie Stratagene; Rosetta

est un produit de la compagnie Novagen).

27

1.5.3 Le 21e et le 22e acide aminé

Après des décennies de travail avec nos vingt acides aminés familiers, il fut

surprenant de découvrir qu'il en existait finalement d'autres qui ne relevaient pas

d'une modification post-traductionnelle des résidus classiques mais qui étaient

insérés dans les protéines en tant qu'acides aminés originaux à part entière, avec

leur propre ARN de transfert. Le 21e acide aminé découvert (en 1986) est la

selenocystéine (Sec), le 22e (en 2002) est la pyrrolysine. Ils ne sont quand même

pas très courants.

Ces deux acides aminés sont codés par des codons STOP qui sont "contournés" par

des systèmes spéciaux. L'ARNt de la selenocystéine reconnait le codon UGA; celui

de la pyrrolysine le codon UAG. L'ARNt de la selenocysteine ne peut être

synthétisés que si la cellule a accès à une source de selenium.

En outre, on sait que la séquence de l'ARN en aval de l'UGA (sur environ 40 bases)

joue en rôle dans l'identité du UGA en tant que codon Sec plutôt que codon stop. Ce

n'est donc pas n'importe quel codon UGA qui codera pour une selenocystéine.

On a isolé la selenocystéine chez différents organismes eucaryotes et procaryotes;

elle se retrouve dans des enzymes ayant besoin de selenium pour fonctioner,

comme la glutathione peroxydase et la formate déhydrogénase chez les eucaryotes.

La pyrrolysine, elle, a tout d'abord été découverte dans la monométhylamine

méthyltransférase de l'archéa Methanosarcina barkeri.

La pyrrolysine est chargée directement sur son ARNt par une ARNt synthétase, mais

dans le cas de la sélénocystéine la situation est un peu plus complexe. Chez E. coli,

28

quatre gènes sont requis pour produire une selenoprotéine: SelA, SelB, SelC et

SelD.

SelA code pour une selenocysteine synthase qui catalyse la conversion de seryl-

tRNA en selenocysteyl-tRNA. SelB code pour un facteur d'élongation analogue à

EF-Tu mais avec une spécificité pour l'insertion de selenocysteine au codon UGA. Il

nuit à la terminaison de la traduction au codon UGA, permettant à la selenocystéine

de s'intégrer et à la traduction de se poursuivre le long de l'ORF étendu. SelD code

pour une selenophosphate synthetase qui catalyse la réduction du selenium en

selenium monophosphate. Ce phosphate est la source de métal pour la

selenocystéine. SelC code pour l'ARNt de la selenocystéine, avec un anticodon

UCA. Cet ARNt est d'abord chargé d'une sérine par la séryl-tRNA synthétase. C'est

le plus long des ARNt connus jusqu'ici chez E. coli. Cette exception à la règle des

vingt acides aminés souligne d'abord que rien n'est jamais coulé dans le béton en

biologie, et ensuite que la nature a toujours une surprise ou deux en réserve pour

nous quand nous croyons avoir tout compris.

1.5.4 Mutations au cours des siècles (et des millions d'années)!

Il est bien connu que des mutations s'accumulent dans le matériel génétique au

cours des éons, et ces mutations génétiques dirigent la synthèse de protéines

également mutées (et encore heureux, car sinon nous serions tous encore des

petites morves qui nagent et rien de plus).

29

La mutation d'un codon dans une protéine passe par deux filtres: celui de l'occasion

et celui de la sélection. Tout d'abord, plus une mutation est simple et plus elle a de

chance de se produire (AGG muté en AGC est plus fréquent que AGG muté en TTT,

parce qu'un seul nucléotide a été affecté). Ensuite, pour que la mutation soit

maintenue, il faut qu'elle confère un avantage quelconque à son hôte, ou au moins

qu'elle ne lui nuise pas.

La plupart de nos protéines sont là depuis très longtemps (le cytochrome C, par

exemple, est un modèle qui dure et dure et dure). Comme ces protéines ancestrales

remplissent très bien leur office, on n'y observe pas beaucoup de mutations d'une

espèce à l'autre; les mutations ont tendance à être conservatrices (celles n'ont pas

beaucoup d'impact). Si un résidu lysine joue un rôle important dans une protéine à

cause de sa charge positive, sa mutation en arginine (même charge) sera plus

facilement tolérée qu'une mutation en acide aspartique (charge inverse).

On peut utiliser le taux de mutations entre des protéines partagées par de nombreux

représentants du monde vivant pour aider à déterminer leur lien de parenté. Dans la

figure ci-dessous, on peut suivre les mutations les plus fréquemment observées

dans des protéines aparentées. La direction des flèches indique celle des mutations;

les flèches pointillées sont des mutations plus rares. Notez que pour ces mutations,

il est toujours possible de passer d'un codon codant pour un premier acide aminé à

un codon codant pour un deuxième en ne changeant qu'un seul nucléotide.

Parallèlement à cette relation qui explique que ces mutations soient plus fréquentes

parce que plus faciles à effectuer, on remarque que les chaînes latérales des

résidus mutés ont une certaine parenté avec celles des résidus originaux (petit

groupe pour petit groupe, comnme G vers A, ou encore charge négative pour charge

négative comme D vers E et vice-versa, ou encore aromatique pour aromatique

comme F vers Y et vice-versa); cela signifie probablement que la mutation n'a pas

introduit d'élément néfaste au bon fonctionnement de la protéine, et n'a donc pas

subi de pression évolutive tendant à la faire disparaître.

30

Les mutations les plus fréquemment observées.

1.6 Assemblage des protéines

1.6.1 Traduction de l'ARN par les ribosomes

Les ribosomes sont des usines moléculaires formées de protéines et d'ARN

structuraux, les ARN ribosomiques.

1.6.2 Synthèse peptidique non-ribosomique

Des polypeptides assemblés sans que les ribosomes ne soient solicités??? Et oui,

ça existe. Les peptides issus de la NRPS (non-ribosomal peptide synthesis) sont

31

généralement assez courts, de deux à environ 50 acides aminés. Ces peptides ne

sont pas codés par un gène, et ils ne sont pas limités aux vingt acides aminés de

base. On y retrouve parfois des acides aminés de forme D, des variantes méthylées

des acides habituels, des résidus hydroxylés ou glycosylés, des résidus jamais

retrouvés dans les protéines, etc. Il arrive que la chaîne peptidique y soit cyclique,

ou même branchée.

Ces peptides sont synthétisés par des synthétases massives organisées en chaînes

de montage; certaines sont des complexes multimériques, d'autres de grandes

protéines. Ces enzymes sont modulaires et contiennent une série d'unités

fonctionnelles qui peuvent lier un acide aminé libre, l'activer sous forme de thioester,

et le coupler au polypeptide grandissant. Chaque module a une taille de 1000-1200

acides aminés, rendant certains de ces enzymes vraiment énormes: une unique

protéine de 15 281 résidus (pour une masse de 1,7 MDal!!!) est responsable de la

synthèse de la cyclosporine, un immunorépresseur qui ne contient que... 11 résidus!

Structure de la cyclosporine A.

MeLeu: méthylleucine

MeVal: méthylvaline

MeBmt: (4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-méthyl-L-

thréonine

Abu: acide 2-aminobutyrique

Sar: Sarcosine

Dans la NRPS linéaire, la séquence de ces modules détermine la séquence du

peptide final. Les modifications sont introduites pendant la synthèse même ou après

la synthèse.

Ce système de synthèse des peptides produit plusieurs composés

pharmacologiquement importants. En plus de la cyclosporine A, on peut citer les

antibiotiques pénicilline et vancomycine comme étant issus de la NRPS. Pour en

savoir plus, vous pouvez consulter Chemical Reviews vol. 97, no 7, 1997.

32

2.0 Structure des protéines

n distingue quatre niveaux stades structuraux chez les protéines, de la structure primaire à la structure quaternaire.

(1) Structure primaire: ordre des acides aminés le long de la chaîne polypeptidique.

(2) Structure secondaire: repliement local des acides aminés en hélices, en feuillets, ou en

d'autres formes similaires.

(3) Structure tertiaire: agencement stable dans l'espace de ces hélices et feuillets.

(4) Structure quaternaire: agencement des sous-unités entre elles, quand la protéine est

constituée de plusieurs sous-unités indépendantes (comme l'est par exemple

l'hémoglobine).

2.1 Structure primaire

2.1 La plupart des protéines ont une structure primaire linéaire.

Chaque acide aminé est lié au suivant par un lien peptidique, qui se forme quand le groupement carboxylique d'un premier acide aminé réagit avec le groupement aminé d'un second, avec élimination d'eau. Quand les acides aminés sont incorporés dans une chaîne (qu'on appelle chaîne polypeptidique), on les appelle des résidus. La chaîne polypeptidique n'est pas branchée; elle forme un unique filament étiré. Par convention, on désigne le premier acide aminé de la chaîne comme étant celui dont le groupement aminé reste libre; on dit qu'il est en 5' ou encore qu'il constitue l' extremité N-terminale ou le N-terminus. On désigne comme étant le dernier résidu de la chaîne celui dont le groupement carboxylique reste libre; on le dit en 3', ou à l'extrémité C-terminale.

33

La figure ci-haut présente la conformation préférée du lien entre les résidus, soit en trans. Cette conformation est généralement plus stable car elle positionne les chaînes latérales loin l'une de l'autre. Qui plus est, les ribosomes synthétisent tous les liens peptidiques en trans.

Un effet de résonance cause le partage d'électrons entre les atomes du groupe carboxylique d'un résidu et l'azote du groupe aminé du résidu suivant. Cet effet de résonance coince le lien peptidique en une structure planaire, le plan amide.

Chaque lien peptidique est donc rigide, mais de part et d'autre les liens peuvent effectuer une rotation. L'angle de rotation d'un plan amide par rapport au carbone alpha en 5' est noté angle ψ; l'angle entre le plan amide précédent et ce même carbone alpha est noté angle υ. (Voir ci-dessous).

34

C'est la succession de ce genre de structures régulières, hélices, feuillets ou tours qu'on appelle la structure secondaire d'une protéine.

2.1.2 Il existe des protéines circulaires

En s'intéressant à l'agent actif d'un thé médicinal congolais qui facilite les contractions utérines, on découvrit dans les années 90 qu'il s'agissait d'une petite protéine de structure circulaire, assez stable pour résister à l'ébullition et à l'ingestion. Cette protéine, la kalata B1, n'était que la première d'une série de protéines circulaires que nous devions découvrir, et qui comptent maintenant plus d'une centaine de membres parmi leurs rangs (on pense qu'il pourrait même y en avoir plusieurs milliers). Leur structure leur confère une grande stabilité et plusieurs d'entre elles ont des activités insecticide ou antimicrobienne. (D'autres peptides non-protéiques circulaires existent, comme la cyclosporine dont nous avons parlé au point 1.6.2). Certaines ont en outre une structure topologique en noeud (c'est le cas de la kalata B1); on les appelle des cyclotides. Les protéines circulaires semblent être produites à partir de grands précurseurs linéaires, mais on connait mal encore les enzymes qui permettent leur maturation et leur cyclisation. Dans le cas de la défensine RTD-1 des mammifères, deux précurseurs indépendants sont coupés et ligués ensemble à leurs deux extrémités pour former un cercle. Dans le cas du kalata B1, deux parties séparées d'un même précurseur sont d'abord coupées, puis liguées à leurs deux bouts pour former un cercle. Mais dans le cas de la bactériocine AS-48, un seul précurseur est coupé et ses deux bouts réunis pour fermer le cercle. L'avantage d'être circulaire, pour uine protéine, est entre autres de ne pas offrir d'extrémité terminale aux exopeptidases. La stabilité en est donc accrue. Il est également plus difficile de les dénaturer de façon permanente par la chaleur ou les variations de pH.

35

2.2 Structure secondaire

La chaîne polypeptidique adopte plusieurs types de structures régulières, mais il n'en existe qu'un petit nombre qu'on retrouve souvent (on pourrait dire que ce sont des modèles éprouvés par la nature).

Le biologiste G.N. Ramachandran, qui

découvrit entre autres la structure en

triple hélice du collagène, se rendit

compte en travaillant avec des modèles

de polypeptides que certains angles ψ et

φ ne pouvaient pas être combinés parce

que certains groupements chimiques se

rentraient carrément dedans. Son

graphique (le graphique de

Ramachandran, ci-dessous), nous

permet de voir d'un seul coup d'oeil

quelles sont les combinaisons toujours

permises (en noir) et celles qui sont non-

favorisées mais possiblement tolérées

(en pointillés). Ces derniers angles

assument que les atomes du

polypeptide, qui ne sont pas réellement

des sphères solides, peuvent voir leurs

rayons de contact se superposer

légèrement. Les structures secondaires

les plus souvent retrouvées dans les

protéines sont l'hélice alpha et le feuillet

beta; on voit ci-bas quelles

combinaisons d'angles peuvent y

conduire.

Notez que le graphique de

Ramachandran prédit qu'on puisse

former une hélice alpha qui tourne à

gauche si elle n'est composée que de

glycines (angles ψ de 45o et φ de 60o,

par exemple). C'est une exception: les

hélices alpha tournent presque toujours

dans le sens de la main droite.

36

2.2.1 L'hélice alpha

Une hélice alpha résulte de la succession d'angles υ de -57o et d'angles ψ de -47o. Cette hélice est droitière; c'est à dire que si vous la saisissiez dans votre main droite, elle tournerait dans le sens de vos doigts en montant dans la direction du pouce (comme la double hélice de l'ADN, soit dit en passant). Notez que ceci reste vrai même si vous la tenez à l'envers, puisqu'une main droite ne devient pas une main gauche juste parce qu'elle est tournée vers le bas.

L'hélice alpha s'élève de 0,15 nm par résidu et de 0,54nm à chaque tour. Elle compte 3,6 résidus par tour. Elle est stabilisée dans sa forme hélicale par des ponts hydrogènes établis entre l'hydrogène d'un groupement aminé -NH et l'oxygène d'un groupement carboxylique -C=O et situé quatre résidus plus loin. Comme ces ponts hydrogènes vont dans la même direction que l'hélice, celle-ci est élastique: les ponts hydrogènes brisés lors de l'étirement de l'hélice se reformeront facilement quand la tension sera relâchée. Les chaînes latérales des résidus dans une hélice alpha pointent à l'extérieur de la structure. Une telle hélice peut facilement avoir une nature amphipathique si les chaînes

37

latérales se trouvant toutes du même côté ont une nature hydrophile et que celle se trouvant de l'autre côté ont une nature hydrophobe. Le domaine d'interaction protéine-protéine riche en leucine de la structure bZip (aussi appelée "leucine zipper") de plusieurs facteurs de transcription de type AP-1 est une telle hélice amphipathique.

Vue plongeante d'une hélice alpha amphipathique.

Les résidus chargés ou polaires sont en noir, les

résidus hydrophobiques en gris et les petits résidus

en blanc. Même si la structure primaire ne

révèlerait pas de région particulièrement

hydrophile ou hydrophobe, cette vue de l'hélice

nous montre qu'une de ses faces est plus

hydrophile et l'autre face plus hydrophobe.

Les domaines transmembranaires sont souvent constitués d'une ou de plusieurs hélices alpha d'une vingtaine de résidus pour la plupart hydrophobes. La bactériorhodopsine, par exemple, compte sept hélices alpha qui traversent la membrane cellulaire. Ces hélices forment un pore (à la manière d'un beigne qui serait inséré dans la membrane) par lequel les protons peuvent passer. La bactériorhodopsine est une pompe à protons activée par la lumière. La proline n'ayant pas d'hydrogène sur son goupe aminé, elle ne peut pas contribuer au pontage hydrogène. La proline déstabilise donc l'hélice alpha, et il est rare qu'on retrouve un résidu proline dans une telle hélice. (La proline se retrouve cependant dans un autre type d'hélice, l'hélice de collagène, dont nous parlerons plus tard).

2.2.1.1 L'hélice 310

L'hélice 310 ressemble à une hélice alpha tricotée serré. Elle compte 3 résidus par tour (au lieu de 3,6) et s'élève de 0,6nm pour faire un tour complet au lieu de 0,54nm. Chaque pont hydrogène ferme une boucle de dix atomes, d'où le nom de 310 (3 résidus par tour, 10 atomes dans la boucle).

38

Dans une hélice 310, les ponts hydrogènes se font entre le groupement -NH en position x et le groupement -C=O en position x+3. (Des ponts hydrogènes entre -NH en x et -C=O en x+5 sont parfois, bien que rarement, observés, dans une structure appelée hélice p).

2.2.2 Le feuillet β

Les feuillets beta (β-sheet en anglais) se forment quand des parties de la longue chaîne polypeptidique se replient et se longent l'une l'autre, côte à côte, en formant des pont hydrogènes avec la voisine. On parle de feuillets beta parallèles quand les chaînes vont dans le même sens et d'antiparallèles quand elles vont dans des directions opposées. La direction des angles Φ et Ψ alterne dans un feuillet beta (un positif, l'autre négatif), donnant à la chaîne une allure en zigzag.

On peut se représenter un feuillet beta comme une grosse croustille Ruffle, avec des chaînes latérales pointant en alternance en haut et en bas. La distance entre deux résidus est de 0,335nm; chaque chaîne est séparée de sa voisine de 0,465nm. Un feuillet beta est représenté, dans les modèles structuraux, par une grosse flèche plate qui indique sa direction. Puisque les ponts hydrogènes des feuillets beta pointent perpendiculairement à l'axe de la chaîne polypeptidique, ils ne donnent pas d'élasticité à la structure. On retrouve beaucoup de feuillets beta dans la soie de ver (Bombyx mori) et la toile d'araignée. Les feuillets beta sont représentés par des flèches, l'hélice alpha est représentée par une spirale.

39

2.2.3 Hélice vs feuillet

résidu

fréquence dans une

hélice α

(1=distribution

aléatoire)

résidu

fréquence dans un

feuillet β

(1=distribution

aléatoire)

E 1,59 V 1,87

A 1,41 I 1,67

L 1,34 Y 1,45

M 1,3 C 1,40

Q 1,27 W 1,35

K 1,23 F 1,33

R 1,21 L 1,22

F 1,16 T 1,17

I 1,09 M 1,14

H 1,05 Q 0,98

W 1,02 S 0,96

D 0,99 R 0,84

V 0,90 H 0,80

T 0,76 A 0,72

N 0,76 K 0,69

Y 0,74 G 0,58

C 0,66 E 0,52

S 0,57 N 0,48

G 0,43 D 0,39

40

P 0,34 P 0,31

Certains acides aminés ont une préférence marquée pour certaines structures: expérimentalement, on remarque qu'ils se retrouvent plus souvent dans une structure que dans une autre. Mais même si les hélices alpha et les feuillets beta sont les structures secondaires les plus courantes, il ne faut pas croire qu'un acide aminé soit nécessairement plus porté vers une hélice quand il n'est pas fréquent dans un feuillet, ou vice-versa (ce n'est pas comme si on parlait d'hydrophobicité).

En fait, si certains résidus comme l'acide glutamique préfèrent clairement les hélices alpha aux feuillets beta, et que la cystéine préfère clairement les feuillets beta aux hélices alpha, il y a des résidus comme la leucine qui se retrouve fréquemment dans les deux structures. Il y en a également d'autres (la proline par exemple) qui se retrouvent rarement et dans l'une et dans l'autre. Le tableau ci-haut vous indique la fréquence des acides aminés dans différentes structures. Une valeur de 1 indique une distribution aléatoire (ou ce à quoi on s'attendrait si les acides aminés étaient distribués au hasard); une valeur supérieure indique qu'on retrouve l'acide aminé plus souvent que ce que le hasard prédit; une valeur inférieure à 1 indique le contraire.

2.2.4 Autres structures secondaires

Il serait inconvenant de négliger les nombreuses autres structures protéiques qu'on retrouve dans la nature. Il en existe plusieurs autres que les feuillets beta et les hélices alpha, mais elles ne sont pas toutes aussi clairement définies ou aussi bien étudiées. De plus, certaines structures moins universellement connues peuvent se retrouver dans la littérature sous différents noms. Ne vous sentez donc pas embêtés si vous ne pouvez pas nommer toutes les structures possibles et imaginables; si jamais vous avez besoin de vous familiariser avec une structure ésotérique particulière, il existe plusieurs resources sur le web qui pourront vous y aider. Pour le moment, il suffit de réaliser qu'il existe un grand nombre de structures secondaires.

Voici quand même les paramètres structuraux de certaines autres structures secondaires, d'après Lesk, A.M. Introduction to protein architecture, Oxford University

Press, New York (2001), p.67 et d'après http://www.cryst.bbk.ac.uk/pps97/assignments/projects/szabo/pphelix.htm Différentes sources ne s'entendent pas toujours à l'unité près sur certaines valeurs, mais elles restent très similaires.

structure φ ψ n (résidus par

tour)

d (élévation en Å entre deux

résidus successifs

p (élévation en Å pour un

tour complet)

41

hélice α (à droite) -57 -47 3,6 1,5 5,5

hélice 310 (à droite) -49 -26 3 2 6

hélice β (à droite ou à

gauche) -57 -70 4,4 1,1 5

héline de polyproline PPI

(à droite) -75 +160 3,3 1,7 5,6

hélice de polyproline PPII

(à gauche)

-79 (-

75)

+149

(+145) -3 3,1 9,4

feuillet β parallèle -119 +113

3,2

feuillet β antiparallèle -139 +135

3,4

2.2.4.1 L'hélice beta

L'hélice β ressemble à un ressort qui aurait une section triangulaire plutôt que circulaire. Elle est composée de feuillets beta qui, au lieu d'être plus ou moins parallèles les uns par rapport aux autres, tournent en rond au lieu d'un axe. C'est une structure retrouvée, par exemple, dans plusieurs protéines antigel. La figure ci-contre, représentant une hélice β de la protéine antigel de Choristoneura fumiferana, est tirée de GRAETHER SP, KUIPER MJ, GAGNÉ SM, WALKER VK, JIA ZC,

SYKES BD & DAVIES PL: b-Helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect Nature 406, 325 - 328 (2000) © Macmillan Publishers Ltd.

42

2.2.4.2 Bourrelet β, tour β, et épingle à cheveux β

Ces termes traduisent les noms plus usuels de β-bulge, β-turn et β-hairpin. Le bourrelet β est une discontinuité locale dans la structure d'un feuillet β. Le tour β, lui, est comme un U-turn subit de la chaîne principale de la protéine; on en retrouve souvent à la jonction de deux segments de la chaîne formant un feuillet β antiparallèle. L'épingle à cheveux consiste également en un repli sur elle-même de la chaîne mais est plus étendue.

2.2.4.3 Hélices de proline

La proline étant un acide iminé dont

l'azote alpha fait partie d'un cycle

pyrrolidone. À cause de cela, la

chaîne latérale de la proline, au lieu de

s'étirer perpendiculairement à la

chaîne principale du polypeptide,

revient se coller dessus comme une

anse de tasse:

Cette structure restreint beaucoup la

rotation du lien N-Cα de la proline;

l'angle Φ est limité à environ -63 +/-

15 degrés. Cette restriction ne se prête

pas à une structure en hélice alpha ou

43

à un feuillet beta, chez qui elle peut

causer une distortion (un coude dans

une hélice alpha, par exemple), mais

permet par contre d'autres types de

structures: les hélices de proline.

La proline est pratiquement le seul

acide aminé qui peut adopter une

structure en cis de façon stable à

cause de la faible différence en

énergie entre ses formes cis et trans

(elle a deux carbones liés au N).

Les conformations préférées de la proline sont ψ= 160° et υ= -75° pour la configuration cis; une répétition de prolines en cis donne une hélice de polyproline de type I ou PPI. L'hélice PPI tourne a droite. La configuration trans a des angles de ψ= 145° et υ= -75°; une répétition de cette configuration donne une hélice de proline dite de type II (ou PPII); cette hélice tourne à gauche. Une hélice PPII peut tolérer d'autres acides aminés, le plus souvent Q, S, R ou A. On n'a pas encore rencontré d'hélice PPI dans les protéines. Par contre, les hélices PPII ont une importance biologique indéniable: le domaine SH3 (src-homology 3) de plusieurs récepteurs lie des ligands de conformation PPII.

2.2.4.4 L'hélice de collagène. Cette hélice qui tourne à gauche s'apparente à l'hélice PPII. Elle a une structure fort particulière: chaque troisième résidu y est une glycine, et près de la moitié des autres est une proline. Elle est aussi très riche en résidus modifiés comme l'hydroxylysine et l'hydroxyproline.

44

L'hélice de collagène est vue plus en détails à la section 3.7, car elle contient aussi plusieurs acides aminés modifiés et servira de modèle pour résumer les trois premiers chapitres.

2.3 Structure tertiaire

La structure tertiaire d'une protéine fait référence à l'organisation dans l'espace de ses structures secondaires. La structure en 3D adoptée par tous ces feuillets et toutes ces hélices est la structure tertiaire de la protéine. Le NCBI (National Center for Biotechnology Information), l'une des meilleures utilisations de l'argent des taxes de nos voisins américains, offre de nombreuses bases de données dont une collection de structures en 3D. Vous pouvez aussi essayer celle-ci, la base de données PDBsum.

2.3.1 Maintien de la structure

Plusieurs interactions entre différents résidus de la chaîne polypeptidique repliée dans l'espace maintiennent la structure de la protéine.

Interactions électrostatiques: on les distingue en...

(a) interactions charge-charge entre résidus de charge inverse comme K et R d'une part et

D et E d'autre part ( -NH3+ vs COO-). Quand une telle interaction est enfouie dans une

protéine globulaire, à l'abri de l'eau, on dit qu'il s'agit d'un pont de sel (salt bridge).

(b) Interactions charge-dipôle quand une chaîne latérale ionisée interagit avec le dipôle

d'une molécule d'eau. Cette interaction aide aussi à l'hydratation et à la solubilisation de la

protéine.

(c) Pont hydrogène entre H d'une part et O ou N d'autre part (il n'y a pas de Fluor dans la

composition des acides aminés). Les protéines peuvent bien sûr former des ponts

hydrogènes avec des molécules de solvant comme l'eau, et de telles interactions peuvent

aussi contribuer à la stabilité de la structure globale.

Interactions hydrophobes : entre groupes hydrophobiques comme les groupements cycliques de la phénylalanine et de la tyrosine. De telles interactions excluent les molécules d'eau.

Forces de Van der Waals : il s'agit de dipôle temporaires de faible force.. Ceux-ci peuvent se former parce que les nuages électroniques des atomes individuels peuvent fluctuer, donnant naissance à des dipôles temporaires.

Ponts disulfures : Nous l'avons vu dans le chapitre un: une cystéine oxydée peut former un lien covalent avec une autre cystéine. Ces ponts ne peuvent se produire spontanément que dans des conditions oxydantes (ce qui n'est pas le cas dans le cytoplasme, qui est légèrement réducteur). Les ponts disulfures se forment donc

45

dans la lumière du réticulum endoplasmique chez les cellules eucaryotes, et dans l'espace périplasmique chez les bactéries. Le réticulum endoplasmique est également riche en une protéine facilitant la formation de ces ponts: il s'agit de la PDI, ou protein disulfide isomerase. Celle-ci peut oxyder des cystéines réduites et les forcer à former un pont disulfure. La PDI, sous sa forme réduite, peut également briser un pont disulfure déjà établi en formant un pont temporaire avec une des deux cystéines impliquées, ce qui permet à la deuxième cystéine d'établir un pont ailleurs. Ce processus permet de briser les ponts disulfures établis par accident entre deux cystéines qui n'auraient pas dû être pontées, et permet ainsi à la protéine de retrouver une structure tertiaire plus stable.

Type d'interaction Changement dans l'énergie libre (en kJ/mol)

lien covalent (carbone-carbone) -350 (très solide!)

interaction hydrophobique -10

interaction ionique (pont de sel) -4

pont hydrogène (entre H et F,O ou N) -3

forces de Van der Waals -1

2.3.2 Fibres et globules

On sépare souvent les protéines globulaires des protéines fibreuses.

2.3.2.1 Protéines globulaires

Les protéines globulaires ont une forme compacte, où on peut distinguer une surface en contact avec le solvant et un coeur qui en est isolé. Les résidus hydrophiles se retrouvent souvent à la surface; les résidus hydrophobes le plus souvent à l'intérieur. Les ponts disulfures peuvent se former plus facilement à l'intérieur des protéines globulaires, parce qu'ils nécessitent des conditions oxydantes et que le cytoplasme est généralement réducteur à cause de la présence de glutathione. À l'abri des molécules d'eau qui les hydrateraient, les acides aminés chargés enfouis dans les protéines globulaires peuvent former des ponts de sel entre eux. Les acides aminés hydrophobes peuvent aussi plus facilement s'y empiler pour former des régions dépourvues d'eau.

2.3.2.2 Protéines fibreuses

Puisque toutes les protéines sont à la base une longue chaîne polypeptidique, on peut se les représenter comme des spaghettis. Alors qu'une protéine globulaire est

46

une boule de spaghettis refroidis et figée, une protéine fibreuse s'étire en longueur. Voici quelques protéines fibreuses typiques: (a) la tropocollagène, la composante de base du collagène, qui est la protéine la plus abondante du corps humain. La structure secondaire la plus présente dans le tropocollagène est l'hélice de collagène, de type PPII et qui est gauchère. Cette hélice n'est pas stabilisée par des ponts hydrogènes internes. (b) la kératine et la tropomyosine, retrouvées dans la peau et les muscles, respectivement. Les deux consistent d'hélices alpha, qui sont droitières, et sont stabilisées par des ponts hydrogènes internes orientés dans le même sens que la fibre, ce qui leur permet d'être étirées. Les ponts hydrogènes des hélices peuvent se briser sous la traction sans qu'il y ait de bris de liens covalents; quand la tension se relâche les ponts hydrogènes se reforment. Suffisamment étirée, la kératine peut aussi adopter une structure en feuillet beta. Une protofibrille de kératine est formée par l'enroulement de deux ou trois hélices alpha les unes autour des autres, en tournant de façon gauchère. 11 protofibrilles forment une microfibrille de kératine; un grand nombre de telles microfibrilles forment une fibre de kératine.

(c) la fribroïne de la soie est composée de régions très rigides et riches en feuillets antiparallèles. Ces régions sont séparées par des régions moins structurées conférant une certaine élasticité à la soie.

On peut retrouver dans la fibroïne une répétition du genre Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser avec la chaîne latérale de Gly un atome d'hydrogène) occupant entièrement l'une surface du feuillet:

Les régions rigides riches en feuillets de la fibroïne sont peu élastiques parce que leurs nombreux ponts hydrogènes sont perpendiculaires à la direction de la chaîne polypeptidique. L’élasticité de la soie est conférée par les domaines amorphes séparant les feuillets beta.

47

2.3.3 Domaines

Il existe des structures tertiaires qui ont connu un tel succès que la nature les a utilisés comme domaines modulaires. Ces domaines peuvent se retrouver sur des protéines différentes pour y jouer le même rôle. Plusieurs types de domaines d'attache à l'ADN sont communs à de grandes familles de facteurs de transcription qui pourtant n'ont pas du tout les mêmes fonctions: les doigts de zinc, les domaines bZIP, les homéodomaines, les hélice-boucle-hélice, etc). La plupart des domaines ont une structure stable qu'on peut transférer dans un autre contexte protéique. On peut ainsi fabriquer des protéines chimériques consistant de domaines de différentes origines. Un facteur de transcription très utilisé en laboratoire pour l'étude de l'activation de la transcription est une fusion du domaine d'attache à l'ADN de la protéine de levure Gal4 et du domaine d'activation de la transcription de la protéine virale VP-16.

2.3.3.1 bZIP, ou leucine zipper

Cette structure consiste en une hélice amphipathique contenant des leucines répétées régulièrement. Deux hélices de ce type peuvent interagir entre elles de façon à permettre la dimérisation de protéines, particulièrement celle de facteurs de transcription comme les membres de la famille AP-1 ou (comme dans la figure ci-contre) GCN4. Un domaine basique à la base des hélices permet l'interaction avec l'ADN (chargé négativement). 2.3.3.2 bHLH (hélice-boucle-hélice)

48

Ce domaine d'attache à l'ADN présente deux hélices reliées par une boucle non structurée. La structure permet la dimérisation de facteurs de transcription et l'attachement à l'ADN sur une séquence de type E box, CANNTG.

Les facteurs de transcription Myc et MyoD contiennent des domaines bHLH.

2.3.3.3 Helix turn helix (ou hélice tourne hélice)

Voici le domaine hélice-tour-hélice du répresseur lambda.

Il s'agit de deux hélices alpha antiparallèles reliées entre elle par une simple boucle non structurée. Plusieurs protéines (et même plusieurs domaines) contiennent une telle structure. Le répresseur lac ou l'homéodomaine, par exemple, contiennent des domaines hélice-tourne-hélice.

2.3.3.4 Winged helix

Structure hélicale permettant la liaison à l'ADN pour certains facteurs de transcription, comme par exemple le facteur HNF-3.

2.3.3.5 Zinc finger

Domaine d'attache à l'ADN caractérisé

par une boucle à la base de laquelle se

trouve des histidines ou des cystéines

qui coordonnent un atome de zinc. La

présence de zinc stabilise la structure.

Les doigts de zinc sont des domaines

d'interaction avec l'ADN ou entre

protéines.

On retrouve des doigts de zinc dans de très nombreux facteurs de transcription (SP1, Récepteurs nucléaires...)

49

2.3.3.6 Homeobox

Ce domaine consiste en une séquence très conservée (chez les levures, les plantes aussi bien que chez les animaux) de 60 acides aminés formant trois hélices (voyez la partie homeobox du domaine POU, ci-dessous). Ce motif se retrouve dans un grand nombre de facteurs de transcription impliqués dans le développement embryonnaire. Il s'agit d'un domaine d'interaction avec l'ADN. 2.3.3.7 Domaine POU

POU est un acronyme de Pit-1, Oct-2 et Unc-86, trois

facteurs de transcription chez qui le domaine a

d'abord été identifié. Le domaine POU est lui-même

constitué de deux sous-domaines: un domaine

spécifique à la famille POU (le domaine POU-S), et

un homéodomaine (ou homeobox).

L'homéodomaine se retrouve chez un grand nombre de facteurs de transcription impliqués dans le développement. (Il a reçu son nom à cause de sa présence dans des facteurs de transcription dont l’inactivation entraînait des mutations homéotiques, du genre remplacement une antenne par une patte).

2.3.3.8 Domaine NFkB

Le domaine d'attache à l'ADN assez complexe de la famille NFkB/rel évoque la forme d'un papillon.

50

Contrairement à des domaines de petites taille comme le doigts de zinc, ces domaines-ci requièrent un grand échafaudage protéique pour se maintenir. On retrouve ce motif dans des facteurs de transcription tels p50, p65, rel, et NFAT.

2.3.3.9 La boîte MADS ou MADS box

La boîte MADS est un motif commun à certains facteurs de transcription. Son nom vient des quatre premiers facteurs dans lesquels on l'a identifiée: MCM1, Agamous, Deficiens et SRF. On compte au dessus de cent facteurs contenant des boîte MADS, particulièrement parmi les facteurs de transcription qui dirigent la morphogénèse des plantes.

2.3.3.10 domaine SANT

Domaine d'attache à l'ADN qui reconnaît la séquence YAAC(G/T)G. On retrouve des domaines SANT dans les facteurs de transcription v-myb, TFIIB" ainsi que d'autres protéines nucléaires comme Ada2, Swi3 et N-CoR.

2.3.3.11 PHD finger

Motif s'apparentant au doigt de zinc, le doigt PHD se retrouve dans des protéines comme p300, CBP, TIF1, ash-1 (une protéine du groupe trithorax), l'histone acétyltransférase Moz, etc.

2.3.3.12 RING finger

"Real Interesting New Gene": voilà

l'origine du nom "ring finger". Il s'agit

d'une forme particulière de doigt de zinc.

On retrouve un tel Ring finger, par exemple, dans la protéine BRCA1 (dont la mutation est associée au cancer du sein), dans la sous-unité MAT1 du facteur de transcritpion TFIIH, ou dans plusieurs membres des ubiquitine-transférases de la famille E3. Le domaine est donc impliqué dans certaines interactions entre protéines.

51

Une variété de RING finger est le motif RBCC, qui contient un RING finger, deux domaines supplémentaires de liaison de Zinc (les B-box), une hélice de leucine (Coiled Coil) et une région C-terminale variable). Ce domaine permet lui aussi une interaction protéine-protéine.

2.3.3.13 Bromodomaine

Le bromodomaine compte 110 acides aminés et se retrouve dans plusieurs protéines associées à la chromatine, des levures aux animaux; on le retrouve dans les acétyltransférases Gcn5, P/CAF, CBP, p300, TAFII250, etc. Certaines protéines contiennent des bromodomaines très modifiées, avec des parties manquantes ou remplacées par d'autres séquences. On croit le bromodomaine impliqué dans certaines interactions entre protéines et il pourrait jouer un rôle dans l'assemblage des complexes menant à l'activation de la transcription.

2.3.3.14 Chromodomaine

Identifié à cause d'une région d'homologie entre les protéines d'hétérochromatine HP1 et Polycomb, ce domaine a été ainsi nommé en raison de sa fonction présumée (qui serait de jouer un rôle dans la restructuration de la chromatine). Le chromodomaine consiste en une cinquantaine de résidus organisés sous forme de trois feuillets beta pressés contre une hélice alpha. Le chromodomaine de la protéine HP1 lui permet de se lier à une histone H3 méthylée sur la lysine 9. (Cette méthylation est effectuée par une autre protéine à chromodomaine, SUV39H1). On sait que dans certains cas, le chromodomaine peut interagir avec de l'ARN; on soupçonne d'ailleurs qu'une telle interaction ARN-chromodomaine joue un rôle dans l'établissement de régions hétérochromatiques par le système du RNAi (ou "RNA interference").

2.3.3.15 Domaine riche en glutamine, domaine riche en proline, domaine acidique

Vous rencontrerez probablement ces termes si vous étudiez les domaines d'activation des facteurs de transcription. Des facteurs comme SP1 ont en effet un domaine d'activation riche en glutamine (domaine qui, d,ailleurs, ne fonctionne pas chez un eucaryote primitif comme S. cerevisiae); des facteurs comme GAL4, VP16 ou GCN4 ont des domaines riches en acides aminés acides; des facteurs comme CTF1 ont des domaines d'activation riches en proline. On doit donc se souvenir de ces particularités quand on analyse une séquence en acides aminés et qu'on y cherche une région fonctionnelle.

52

2.3.3.16 Répétitions WD40

Les répétitions WD40 sont caractérisées par un motif Tryptophane-acide aspartique qui se répète à tous les 40 résidus environ. Ce dom aine semble permettre l'interaction entre certaines protéines. On le retrouve dans de nombreux types de protéines, incluant des facteurs de transcription (Taf72 chez S. pombe), des répresseurs (Hir1p de S. cerevisiae) ou même des cyclines (Cdc20 chez l'humain). C'est un motif assez courant.

2.3.3.17 T-box

La boîte T ou T-box a été caractérisée en raison de sa présence dans le facteur de transcription Brachyury (T). On la retrouve dans plusieurs facteurs de transcription impliqués dans le développement, les décisions précoces quant à l'identité cellulaire, l'établissement du plan corporel et l'organogénèse. La T-box est un domaine assez grand (17-26kDa), très riche en feuillets beta, et qui représente souvent une proportion considérable de la protéine totale. Les facteurs possédant une T-box lient la séquence TCACACCT. La structure de la T-box peut être visualisée sur ce site.

2.3.4 Les chaperones

Les protéines adoptent spontanément leur structure tertiaire. Certaines sont si stables que même après une dénaturation complète elles retrouvent spontanément et rapidement leur structure normale (c'est le cas de la RNAse A, une nucléase qu'on peut faire bouillir à volonté et qui retrouve toujours son activité par la suite).

53

Toutes les protéines ne sont pas dans ce cas, bien sûr: pour la plupart, un traitement dénaturant aura résulté en leur précipitation pure et simple ou du moins en une agrégation à cause d'interactions hydrophobiques entre résidus exposés par le dépliement de la protéine. Il existe cependant une classe de molécules qui aident les protéines à retrouver leur structure tertiaire si elles viennent à la perdre. Ces molécules sont les chaperones, qui protègent les protéines d'un repliement inadéquat ou de l'agrégation. Les protéines HSP (heat shock proteins) par exemple, servent à protéger les protéines des dégâts causés par un choc thermique. Elles peuvent aussi aider les protéines à retrouver leur forme momentanément perdue: c'est par exemple le cas de Hsp60, qui aide au transport de protéines dans la matrice mitochondriale. L'enzyme F1 ATPase est synthétisé sous forme d'un précurseur à partir d'un gène nucléaire. Ce précurseur contient un peptide signal lui permettant d'être reconnu par un récepteur membranaire des mitochondries afin de faciliter son importation. Cependant, la F1 ATPase sous sa forme repliée est trop grosse pour passer par le canal de transport mitochondrial. Elle doit d'abord être dépliée par l'action d'enzymes idoines. L'ATPase, maintenant dépliée, peut ensuite passer par le canal et se retrouver dans la matrice mitochondriale. Là, une protéase coupe son peptide signal et la Hsp60 l'aide à retrouver sa forme initiale. Sans Hsp60, l'ATPase ne réussit pas à reprendre sa structure tertiaire et à rejoindre le complexe où elle agit d'habitude.

Chez E. coli, on connait bien le système GroES-GroEL qui sert à replier correctement les structures diformes. GroES est un anneau de 10 KDa consistant en sept sous-unités; GroEL est aussi un anneau de sept protéines mais pesant 58 KDa.

54

En l'absence de GroES, deux anneaux GroEL s'empilent l'un sur l'autre. Le substrat mal plié entre dans la cavité centrale d'un des anneaux. GroES vient alors couvrir le trou, et induit dans la cavité un profond changement de conformation: elle passe de majoritairement hydrophobe à majoritairement hydrophile, ce qui facilite aussi un changement de conformation dans le substrat. Ce changement donne la chance au substrat de peut-être retrouver une conformation stable et appropriée. Après vingt secondes, quoiqu'il advienne, le substrat est relâché -qu'il soit bien replié ou non; il peut toujours, si ça n'a pas marché, recommencer le cycle. Voici un fait intéressant ayant rapport aux chaperones: dans le cas de la fibrose kystique, l'origine de la maladie est une (ou plusieurs) mutations dans le gène CFTR, qui code pour une pompe à ions Cl-. En bousculant la circulation des ions de part et d'autre de la membrane plasmique des cellules pulmonaires, la maladie entraîne un problème d'hydratation dans les poumons et facilite l'accumulation de mucus dans lequel poussent des bactéries opportunistes. Ces mutations dans le gène CFTR sont accompagnées par le remplacement de certains acides aminés par d'autres dans la protéine pendant sa traduction. Dans la majeure partie des cas, les mutations ponctuelles n'interfèreraient pas avec le fonctionnement de la pompe à ions, mais malheureusement les chaperones reconnaissent la protéine comme étant mal formée et ne lui permettent pas de se rendre jusqu'à la membrane. Les patients sont donc victimes de leur propre système de contrôle de la qualité protéique.

2.3.5 Quand la structure tertiaire cafouille

La maladie de la vache folle, une encéphalite spongiforme transmissible à l'homme, nous a sensibilisés à l'impact que peut avoir sur la santé la structure tertiaire d'une protéine.

L'hypothèse du prion, qui valut le prix Nobel à son inventeur, le Dr Stanley Prusiner, suggère que l'agent pathologique de cette maladie (comme celle d'autres encéphalites spongiformes, dont le nom vient du fait qu'elles changent le cerveau en véritable éponge pleine de trous, et qui incluent la maladie de Creutzfeld-Jakob, le syndrome de Gerstmann-Strausler-Scheinker et l'insomnie familiale fatale) n'est pas une bactérie, ni un virus, ni même quoique ce soit contenant un acide nucléique. Ce serait une protéine à laquelle on a donné le nom de prion.

La structure primaire du prion est codée par le gène PRNP (pour "PRIon Protein"). Chez un individu sain, la protéine codée par ce gène n'a rien de dangereux et fait partie de notre bagage habituel de protéines. On désigne cette protéine normale par le nom de PrPC; il s'agit d'une protéine extra-cellulaire fixée à l'extérieur de la membrane plasmique par une ancre de GLI (ou glycosyl-phosphatidylinositol. Chez une victime de la maladie, la séquence primaire ne change pas: c'est la structure tertiaire qui est profondément modifiée, passant d'une structure

55

principalement faites d'hélices alpha en une structure très riche en feuillets beta. Cette nouvelle structure est extrêmement stable et résiste à presque toutes les techniques de désinfection. La protéine ayant adoptée cette nouvelle structure est appelée PrPSC, pour "scrapie", le nom anglais de la tremblante du mouton, le pendant ovin de la maladie de la vache folle. Comment la structure passe-t-elle de PrPC à celle de PrPSC? C'est là que l'histoire devient vraiment bizarre: il semble que la conversion soit catalysée par PrPSC elle-même. À la manière d'un vampire, PrPSC entre en contact avec un PrPC sain et le convertit en PrPSC.

Le PrPC converti en PrPSC est indifférentiable du premier PrPSC et va à son tour convertir d'autre PrPC. On assiste alors à une réaction en chaîne de conversion vers PrPSC. PrPSC s'accumule dans les cellules, et il semble qu'il finisse par former de gros agrégats. Il détruit en tout cas les cellules du cerveau, entraînant les sévères troubles neurologiques que l'on connaît et éventuellement la mort. Il existe aussi une forme d'origine génétique de la maladie. En effet, certaines mutations dans le gène PRNP favorisent l'adoption de la conformation PrPSC plutôt que la conformation habituelle PrPC. Chez les individus porteurs de ces mutations, la traduction de l'ARNm de PRNP peut donner naissance à une particule PrPSC. Et dès que celle-ci est synthétisée par le ribosome, elle peut se mettre à convertir PrPC en plus de PrPSC.

Ce phénomène n'est pas limité aux mammifères: chez la levure, le produit du gène URE2 semble lui aussi avoir une forme PrPC comme une forme PrPSC. Les prions semblent donc être une forme extrêmement avancée de parasites moléculaires: non contents de puis er dans nos cellules le matériel requis à leur reproduction, comme le font les virus, ils ne se donnent même pas la peine d'emporter leur matériel génétique avec eux.

2.3.6 Épissage protéique

Il existe chez les protéines un phénomène analogue à celui de l'épissage chez les ARN messagers: une partie de la chaîne polypeptidique peut être enlevée quelque part entre ses deux extrémités, et les deux bouts restant être raccordées ensemble.

56

Les intéines et les extéines sont à ces protéines épissées ce que les introns et les exons sont à l'ARNm. (Mais ne nous mêlons pas: les exons ne codent pas pour des extéines, ni les introns pour des intéines! Il ne s'agit que d'un parallèle de principe). Ce sont les intéines elles-mêmes qui se chargent de leur excision à partir du précurseur avec lequel elles ont été synthétisées. On en a recensé au-dessus de 150 à ce jour, chez différents procaryotes et chez la levure.

Voici le mécanisme d'excision d'une intéine. On peut souligner une parenté avec le domaine

autocatalytique de la protéine de signalisation Hedgehog, qui se coupe en deux pour greffer

à sa partie N-terminale une molécule de cholestérol lui permettant de se fixer à la membrane

cellulaire.

57

Les Dr Chilkoti et Filipe (le dernier de l'université McMaster en Ontario) ont mis au point une technique de purification des protéines utilisant une intéine. Dans leur approche, la séquence d'une intéine est introduite entre celle de l'ELP (Elastin-like polypeptide) et celle de la protéine d'intérêt. La protéine de fusion finale, à cause de la présence de l'ELP, précipite en présence de sel ou à une température inférieure à 30-40°C, menant à un très grand enrichissement (puisque les autres protéines, elles, restent solubles). La protéine de fusion récupérée et resuspendue est ensuite incubée de façon à ce que l'intéine se coupe elle-même, libérant la protéine d'intérêt. À c e sujet, voir les références suivantes: Banki et al. (2005) Nat Methods 2: 659-62 et Ge et al. (2005) J Am Che Soc 127: 11228-9.

Une catégorie d'intéines a une particularité intéressante: une fois excisées du précurseur, ces protéines constituent des endonucléases qui reconnaissent des sites de restriction particulièrement longs. On les appelle des méganucléases. Il existe une certaine similarité entre ces méganucléases et l'endonucléase HO responsable de la recombinaison somatique entre les locus HML, HMR et MAT chez la levure. Un aspect encore plus intéressant de ces endonucléases est qu'elles jouent un rôle dans la propagation de leur propre séquence codante. Voici comment, en utilisant comme exemple la méganucléase PI-SceI, qui est une intéine retrouvée au beau milieu du polypeptide d'une ATPase de levure, Vma1. Il existe deux types d'allèle pour VMA1. L'une d'entre elles contient la séquence codante pour PI-SceI. L'autre allèle ne contient pas cette séquence codante, mais à la place contient le site de restriction reconnu par la méganucléase PI-Sce I:

5' ATCTATGTCGGGTGC GGAGAAAGAGGTAATGAAATGGCA 3'

3' TAGATACAGCC CACGCCTCTTTCTCCATTACTTTACCGT 5'

58

Quand la levure, dans sa forme diploïde, contient les deux allèles, l'une d'entre elles

conduit à la production de PI-Sce I. La nucléase une fois libérée de son précurseur,

Vma1, migre vers le noyau où elle va retrouver son site de restriction qui justement se

trouve dans l'allèle de VMA1 ne contenant pas l'insertion codant pour PI-Sce I. (Ce

voyage vers une cible précise explique le nom anglais de ce type de nucléases: homing

endonucleases).

La nucléase va couper ce site. Avec un chromosome coupé en deux, la levure va essayer de réparer les dégâts en utilisant l'autre allèle par recombinaison homologue. Cette réparation va dupliquer l'insertion codant pour PI-Sce I dans le site ouvert par la nucléase, et après la réparation son gène aura été introduit dans l'allèle qui auparavant n'en disposait pas. PI-Sce I agit donc comme une sorte de parasite moléculaire, qui veille à la propagation de sa propre séquence codante dans les génomes qui en sont dépourvus.

2.3.6.2 Épissage protéique par le protéasome

59

Nous verrons dans le chapitre 3 que le protéasome consiste en une usine moléculaire de dégradation des protéines. Cette usine est elle-même formée de plusieurs sous-unités protéiques formant un tunnel par lequel passent les protéines destinées à la dégradation.

Structure générale d'un protéasome. Les unités

régulatrices contrôlent l'accès à un tunnel formé

par les sous-unités catalytiques a et b. Chacune

de ces sous-unités sont elles-mêmes formées de

sept protéines formant un anneau. L'empilage

des quatre anneaux forment un tunnel dans

lequel ont lieu les réactions enzymatiques

catalysées par le protéasome.

On a récemment découvert que le protéasome était non seulement responsable de la

dégradation, mais qu'il pouvait aussi être impliqué dans une forme d'épissage protéique.

60

Les lymphocytes T de type CD8+ reconnaissent des antigènes que génèrent les cellules

présentant l'antigène (APC). Ces antigènes consistent en peptides de 8 à 10 résidus, et

proviennent des produits de dégradation des protéines- cibles par le protéasome. Ces

résidus se retrouvemt donc normalement à la queue-leu-leu dans la protéine originale.

On a cependant découvert il y a peu que ces peptides peuvent consister en deux courtes

séquences de résidus normalement séparées par une séquence intercalaire, et

fusionnées par le protéasome. Le mécanisme de cette fusion est décrit ci-contre et

correspond bien à une forme d'épissage protéique.

2.4 Structure quaternaire

Il existe des protéines complexes formées de plusieurs chaînes polypeptidiques. L'assemblage de ces sous-unités entre elles constituent la structure quaternaire de la protéine.

2.4.1 Hémoglobine

L'hémoglobine est la molécule qui, présente dans les globules rouges, permet le transport de l'oxygène vers les tissus. Elle contribue aussi, dans une moindre mesure, à l'évacuation des ions H+ et du CO2.

Chez l'adulte, elle est constituée de deux sous-unités d' -globine et de deux sous-

unités de -globine. Ces sous-unités sont assemblées de telle façon qu'elles laissent une cavité au centre du tétramère. (Cette cavité ne sert pas à lier l'oxygène, mais elle a un rôle à jouer dans la régulation du rôle de l'hémoglobine, comme nous allons le voir à l'instant). Chaque unité globine est associée à un groupe hème, qui contient un atome de fer capable, quand il est bien enligné avec ce groupe, de s'associer à l'oxygène.

61

Les structures tertiaire et quaternaire de l'hémoglobine jouent un rôle primordial dans

son rôle comme transporteur. La protéine existe sous deux formes, la forme T (pour

tendue) qui a une faible affinité pour l'oxygène et la forme R (pour relaxée) de haute

affinité. Ces deux formes existent en un équilibre rapide qui dépend du pH ambiant et

de la présence d'oxygène. À pH élevé et en présence d'oxygène, la forme R est

privilégiée (et l'hémoglobine cherche donc à capturer de l'oxygène); à pH bas et quand

l'oxygène est rare, la forme T est privilégiée et l'hémoglobine relâche l'oxygène.

Lors d'une transition de T vers R, les sous-unités α1-β1 se rapprochent des sous-unités α2-β2, réduisant la taille de la cavité centrale entre les sous-unités. Ce changement de

structure quaternaire a d'abord été remarqué lors d'expériences de cristallisation de

déoxyhémoglobine: ces cristaux, mis en présence d'oxygène, se cassaient -indice que la

structure des composantes du cristal avaient changé et n'était plus compatible avec le réseau

cristallin initial.

En présence d'oxygène et à pH plus élevé, le mouvement de différentes hélices alpha de

l'hémoglobine fait que l'atome de fer se déplace par rapport au groupement hème et vient se

positionner sur le même plan (voir figure ci-bas). Cette configuration est propice à

l'association du fer à une molécule de O2. Quand le pH baisse, la réaction inverse se produit:

les hélices reprennent leur position typique de la forme T, la cavité centrale grandit, et l'atome

de fer est déplacé par rapport au groupe hème. Il relâche alors son oxygène.

62

La sensibilité de l'hémoglobine au

pH procède du fait que les

cellules contenant beaucoup de

CO2 ont un pH plus acide, parce

que CO2 + H2O -> H2CO3.

L'hémoglobine ayant déchargé sa

charge d'oxygène peut alors

contribuer à évacuer l'excédent

de CO2 et d'ions H+ des cellules.

Elle est responsable d'environ

20% de cette évacuation. Les

ions H+ ne se lient pas au groupe

hème: ils se lient à l'histidine 146

de la -globine et à deux autres

résidus dans l' -globine de la

forme T. Le CO2, lui, se lie à

l'extrémité N-terminale de

chacune des quatre chaînes de

globine pour former la

carbaminohémoglobine.

Contrairement au CO2, le monoxyde de carbone CO compétitionne directement avec O2 pour le lien libre sur l'atome de fer du groupe hème. Il a en outre une affinité 240 fois plus élevée. C'est pourquoi le CO est beaucoup plus toxique que le CO2: alors que le CO2 est libéré facilement (par simple compétition) quand le patient intoxiqué est mis en présence de O2, le CO, lui, reste fixé très longtemps sur le groupe hème, puisque l'équilibre entre le CO et O2 sur le groupe hème favorise grandement le premier.

La globine est une structure fort utile pour la capture de l'oxygène et on en retrouve une autre forme, la myoglobine, dans les cellules musculaires. La myoglobine n'est cependant pas un tétramère mais un monomère. En outre, elle ferait un pauvre transporteur d'oxygène parce que son affinité pour ce gaz est trop élevée (elle a tendance à le garder. Imaginez un laitier qui ne laisserait aller son lait qu'avec

63

réticence: il ferait un bien mauvais distributeur). La myoglobine sert donc à stocker l'oxygène dans les muscles. Chez l'hémoglobine, la capture d'oxygène par une première sous-unité entraîne une augmentation d'affinité pour les suivantes. Les sous-unités de l'hémoglobine pratiquent donc des interactions coopératives quand il s'agit de lier l'oxygène. La courbe de saturation en O2 en fonction de la pression partielle d'oxygène est sigmoïde, reflétant cette coopération.

Un autre agent joue un rôle important dans la régulation de la capture d'oxygène par l'hémoglobine: il s'agit du diphosphoglycérate.

Le diphosphoglycérate est présent à haute concentration dans les globules rouges. Il se lie à la cavité centrale de la déoxyhémoglobine (la forme T) en interagissant avec des chaînes latérales chargées positivement dans les sous-unités de beta-globine. La transition en forme R l'expulse de la cavité. Le diphosphoglycérate réduit l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène. Il est produit en plus grande quantité chez les individus fréquentant les hautes altitudes, là où la pression partielle d'O2 est plus faible, afin de faciliter la libération d'oxygène par les globules rouges.

64

2.4.2 Anémie falciforme

L'anémie falciforme est une

maladie sanguine causée

par une simple mutation:

celle de l'acide glutamique

en valine à la sixième

position de la structure

primaire de la beta-globine.

Cette mutation cause une

malformation de

l'hémoglobine (qu'on dit

"hémoglobine S"). À basse

concentration d'oxygène,

l'hémoglobine S précipite et

forme des fibres insolubles.

Ces fibres s'accumulent dans les globules rouges qui prennent une forme en faucille, d'où le nom de la maladie. De telles hématies ne peuvent pas transporter d,oxygène et peuvent boucher les capillaires. Ceci dit, les porteurs d'une seule allèle mutée ne souffrent que d'une forme atténuée de la maladie et gagnent un avantage: leurs globules rouges sont moins sujets à être affectés par Plasmodium, le vecteur de la malaria. pour cette raison, la mutation n'a pas été éliminée par l'évolution mais se maintient dans les régions du monde où sévit la malaria.

65

Les effets pléiotropiques d'une seule mutation dans la séquence de la beta-globine (Glu6Val) qui mène à l'anémie falciforme. (D'après Strickberger, MW,

Genetics (3e éd.) Prentice-Hall, Upple Saddle River, 1985).

2.4.3 Un peu plus sur le transport de l'oxygène... 2.4.3.1 Hemerythrine

L'hemerythrine est une protéine qui sert à véhiculer l'oxygène chez les brachiopodes, les sipunculides, les priapulides et un annélide (le Magelona). Elle est incolore dans son état désoxygéné et adopte une couleur rose en absorbant l'oxygène. Contrairement à l'hémoglobine, elle ne souffre pas d'empoisonnement au monoxyde de carbone.

Elle aussi utilise le fer pour fixer l'oxygène, mais pas sous forme de groupement hème comme le fait l'hémoglobine. Deux atomes de fer y sont liés aux anneaux imidazole de cinq histidines et au groupes carboxyliques d'un acide aspartique et d'un acide glutamique. Un atome d'oxygène est également positionné entre les deux atomes de fer. L'hemerythrine est le plus souvent trouvée sous forme d'un octamère de 108 000 Da, mais il

66

existe des formes dimériques, trimériques ou tétramériques chez certains organismes. La topologie de cette protéine est presque entièrement composée d'hélices.

2.4.3.2 Chlorocruorine

Ce sont des pigments respiratoires extracellulaires de couleur verte. On les retrouve dans le plasma de quatre familles de polychètes, parfois en même temps que de l'hémoglobine (à laquelle les chlorocruorines ressemblent énormément au point de vue moléculaire, différant seulement au niveau du groupement hème). Elles ont moins d'affinité pour l'oxygène que l'hémoglobine et la myoglobine.

2.4.3.4 Hémocyanine

Il n'y a pas que le fer qui puisse servir au transport de l'oxygène, il y a aussi le cuivre. Les hémocyanines sont des transporteurs d'oxygène utilisant ce métal. Il en existe deux types, associés à certains arthropodes (crustacés et arachnides, entre autres, et donc crabes, araignées, scorpions et limules) ou à certains mollusques (pieuvre, ormeau). La circulation chez ces organismes est très différente de ce qu'elle est chez les vertébrés: plutôt que d'être pompé à haute pression par le coeur dans des artères, le sang est distribué à basse pression dans des espaces et des sinus autour des organes internes. L'hémocyanine désoxygénée est presque incolore et elle devient bleue lors de l'oxygénation. Elle forme différents complexes selon les organismes et peut en former atteignant des tailles de 10 millions de Daltons. Elle n'est pas aussi efficace que l'hémoglobine pour le transport de l'oxygène, ce qui cause une fatigue assez rapide suite à un effort chez certains gros mollusques (comme les pieuvres).

L'hémocyanine d'un mollusque (le keyhole limpet en anglais, un animal du genre Diodora, ressemblant à une patelle) est utilisé en immunologie à cause de son grand caractère immunogénique. Vous la rencontrerez peut-être dans un labo sous le nom de KLH (keyhole limpet hemocyanin). On couple souvent de petits antigènes à la KLH pour augmenter la réponse immunitaire.

Vous savez maintenant qui sont les vrais sang bleu dans l’évolution!!!

67

3.0 Modifications post-traductionnelles

3.1 Généralités

Les protéines subissent d'abondantes modifications covalentes pendant et après leur synthèse. Celles-ci vont de la simple protéolyse contrôlée à l'ajout covalent de groupements énormes. Ces modifications peuvent servir... (a) à la régulation de l'activité des protéines (b) à leur étiquettage pour qu'elles soient reconnues par des partenaires métaboliques ou par des systèmes de dégradation (c) à les ancrer dans une membrane (d) à les faire participer à des cascades de signalisation (e) à leur adressage pour qu'elles se rendent au bon endroit dans la cellule (f) à définir une identité immunologique (comme les groupes sanguins) etc, etc. Voici une liste partielle des modifications post-traductionnelles qu'on peut rencontrer dans une protéine. Ajout ou retrait de groupements divers: - acétylation (p.e. sur les histones; sur le N-terminus ou sur une lysine) - amidation (plusieurs neuropeptides et hormones peptidiques; sur le C-terminus) - biotinylation (pyruvate carboxylase; sur une lysine) - carboxylation (prothrombine, sur un acide aspartique) - hydroxylation (collagène; sur une lysine, une proline) - méthylation (calmoduline, cytochrome C; sur une lysine) - phosphorylation (AP-1; surtout Y, S, T, mais aussi sur H et D) - sulfatage (gastrine; sur une tyrosine) Acylation, ou ajout d'acides gras divers: - glypiation: liaison entre une protéine destinée à la surface extracellulaire et une ancre de glycophosphatidylinositol (ou GPI). - isoprénylation: liaison entre un résidu cystéine C-terminal et l'un de deux composés isoprènes, le farnésyl ou le géranylgéranyl. - S-acylation: liaison entre une cystéine interne et un acide gras (acide palmitique ou acide myristique). La liaison oxyester simple entre l'acide gras et une sérine interne (O-acylation) est aussi observée - Myristoylation N-terminale: Modification co-traductionnelle d'une glycine N-terminale par formation d'un lien amide amide avec l'acide myristique sous forme de myristoyl-CoA. - Ancrage à la membrane par protéolyse contrôlée et ajout de cholestérol (comme avec le récepteur membranaire hedgehog). Ajouts de glucides, simples ou complexes: - c-mannosylation - poly-ADP-ribosylation - acétylglucosamination Ajout de polypeptides:

68

- ubiquitination (couplage à l'ubiquitine: histones, aussi toute protéine appelée à être dégradée par le sentier métabolique du protéasome 26S; sur une lysine). - sumoylation (couplage du small ubiquitin-like modifier, ou SUMO: se produit chez p53, IκB, PML; sur une lysine).

Modification Site Exemple

Acétylation K Histones

Gamma-carboxylation carbone en position gamma de E prothrombine

Amidation G terminale gastrine

Biotinylation K pyruvate

carboxylase

Carboxylation K, D, E Prothrombine

Glycosylation O-glycosylation sur S, T et

hydroxylysine; N-glycosylation sur N

Groupes sanguins

Collagène

Hydroxylation P, K, D et Y Collagène

Prénylation (farnesylation,

geranylgeranylation) C en C-terminal Ras

S-acylation C rhodopsine

Myristoylation G en N-terminal NADH-cytochrome

b5

Méthylation K, H, R, D, E Actine

Phosphorylation Y, S, T MAP kinases

Sulfatage Y APP, thyroglobuline

Ubiquitination K Histones H2A, H2B

3.2 Ajout ou retrait de petits groupements divers:

Dans cette section, nous effectuerons un survol de plusieurs modifications qui ajoutent ou enlèvent des molécules de petites tailles aux protéines. Plus tard, nous verrons l'ajout d'acides gras et de glucides complexes.

3.2.1 acétylation

L'ajout d'un groupement acétyl- (CH3-CO- ) est une acétylation. Cette modification post-traductionnelle des protéines est dirigée par des enzymes appelés acétyltransférases. Cet ajout est réversible par un autre type d'enzyme: les déacétylases. L'acétylation se produit sur un groupement aminé, qui peut se trouver soit à l'extrémité N-terminale d'une protéine ou à l'extrémité de la chaîne latérale d'une lysine.

69

L'acétylation de plusieurs lysines localisées dans la partie N-terminale des histones H3 et H4 est impliquée dans la régulation de l'expression des gènes. Ces régions sont à l'extérieur du domaine globulaire des histones, et comme leurs nombreuses lysines chargées positivement (-NH3

+ à pH neutre), elles peuvent se coller sur l'ADN qui, lui, est chargé négativement. L'acétylation des lysines neutralise leur charge positive, et les queues N-terminales n'interagissent plus avec l'ADN qui, par conséquent, est empaqueté de façon moins serrée par les histones. Les acétyltransférases chargés d'acétyler les lysines N-terminales des histones sont recrutées par des facteurs de transcription au promoteur d'un gène -cible. Les histone déacétylases, elles, sont recrutés au promoteur d'un gène-cible par des répresseurs de la transcription. On retrouve des acétyltransférases dans le cytoplasme (comme Hat1) ainsi que dans le noyau (comme Gcn5). L'acétylation des histones dans le cytoplasme aide à l'assemblage de la chromatine (une fois qu'elles ont rejoint le noyau) et l'acétylation qui fait suite à cet assemblage a un rôle de régulation de l'expression des gènes.

Modifications covalentes des histones, d'après Lee et Young (2000) Ann. Rev. Genet. 34:77-137. Certaines lysines peuvent être soit acétylées,soit méthylées. Ac=acétylation; Met=Méthylation; Ub= Ubiquitination; P= Phosphorylation

Comme la combinaison de l'acétylation, de la méthylation et de la phosphorylation de certains sites a des résultats qui varient et qui ne sont pas toujours associés soit à une activation soit à une répression de la transcription, le Dr. David Allis a suggéré

70

que ces modifications reflétaient un nouveau système de signalisation, qu'il a appelé le "code des histones". Ce code est bien entendu encore bien mystérieux, si tant est qu'il existe réellement.

Exemple de "code des histones:"

Histone H3

Pas de modification répression

K14 acétylée transcription

S10 acétylée + S28 phosphorylée mitose

S10 phosphorylée + K14 acétylée transcription

K4 méthylée transcription

K9 méthylée répression de la transcription

Histone H4

K8 acétylée + K16 acétylée transcription

K5 acétylée + K12 acétylée dépôt des histones

K20 méthylée répression

Une hypothèse alternative à celle du code des histones permettrait d'expliquer le rôle de l'acétylation. En faisant un recensement du statut de l'acétylation des histones partout dans le génome de levure, le laboratoire du docteur Michael Grunstein a relevé une association significative entre certains patrons précis d'acétylation/déacétylation et la régulation commune de groupes de gènes. Ainsi, des gènes appelés à répondre à des stimuli communs pourraient voir leurs histones partager un même profil d'acétylation. Un tel profil spécifique servirait de site de reconnaissance pour des facteurs de transcription particuliers.

3.2.2 amidation

Plus de la moitié des neuropeptides actifs sont amidés en C-terminal (chez les insectes, ce chiffre atteindrait 90%). C'est le cas par exemple de l'hypocretin-1 et -2, de la galanine, ou de la calcitonine de saumon; la gastrine et la cholŽcystokinine sont Žgalement amidŽes. L'amidation est une réaction enzymatique qui a besoin de vitamine C comme cofacteur. La source du groupement amide est une glycine placée à l'extrémité C-terminale, et chez les vertébrés cette réaction est catalysée par un enzyme bifonctionnel appelé PAM (peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase).

71

3.2.3 biotinylation

La biotine est une molécule qui peut être ajoutée à la chaîne latérale de certaines lysines pour former la biocytine, le groupement actif d'enzymes telle la pyruvate carboxylase, qui carboxyle le pyruvate pour donner de l'oxaloacétate. Dans ces réactions, la biotine agit comme transporteur temporaire de groupements -COO-.

La biotine est une vitamine et est par définition essentielle dans la diète. L'ingestion d'une trop grande quantité de blanc d'oeuf cru peut causer une carence en biotine, car son affinité pour l'avidine, une protéine du blanc d'oeuf, est si élevée que la biotine ne peut plus être absorbée par les intestins. (En fait, l'afinité avidine-biotine a la réputation d'être la plus forte des liaisons non-covalentes connues). Une carence en biotine est mortelle.

3.2.4 carboxylation

La carboxylation consiste à ajouter un groupement -COOH. Elle peut se produire sur une lysine, comme dans le cas de la OXA-1 b-lactamase, sur un acide aspartique, comme cela se produit dans le facteur IX (un facteur de coagulation) ou sur un acide glutamique. Cette dernière réaction, qui donne de l'acide g-carboxyglutamique, se

72

produit dans de nombreuses protéines impliquées dans la coagulation sanguine (Facteur II ou prothrombine, facteur VII, facteur IX, facteur X), de même que dans d'autres protéines (protéines anticoagulantes C, S et Z; ostéocalcine; certaines protéines ribosomiques). La prothrombine, par exemple, a 10 résidus glutamates dans sa région N-terminale qui sont carboxylés. Cette modification du glutamate semble aider les protéines à coller aux surfaces membranaires. Elle permet aussi de chélater du calcium, et celui-ci aide à former des réseaux entre les groupes glutamates et les groupements phosphates des phospholipides membranaires (pour aider à boucher les trous par où le sang s'écoule). Un pont dépendant du Ca2+ peut aussi se former entre deux groupes glutamates, une situation qui ressemble un peu à un pont disulfure.

Plusieurs carboxylases ont besoin de Vitamine K comme co-facteur pour permettre la gamma-carboxylation du glutamate.

3.2.5 déimination

Certaines arginines ou méthylarginines des histones peuvent être la cible d'enzymes appelés peptidylarginine deiminases. Ces enzymes vont changer le =NH2+ de la chaîne latérale de l'arginine en =O. Cette réaction joue probablement un rôle dans la régulation de l'expression génique passant par les modifications covalentes des histones. La transformation d'une méthylarginine, particulièrement, permettrait de jouer au niveau de la régulation épigénétique de l'expression de certains gènes: en effet, alors que jusqu'ici on avait identifié plusieurs histone méthyltransférases, on ne connaissait pas encore d'activité enzymatiques capables de renverser la méthylation des histones.

73

3.2.6 hydroxylation

Cette modification consiste à ajouter un groupement hydroxyl (-OH) à une protéine. On retrouve plusieurs résidus hydroxylés: les lysines et les prolines, l'acide aspartique, la tyrosine...

L'hydroxylation de la lysine et de la proline est particulièrement importante parce que ces résidus modifiés comptent pour une grande part dans la stabilité du collagène, une protéine essentielle du tissu conjonctif. L'hydroxylation de la proline par la prolyl hydroxylase, une réaction qui requiert de la vitamine C, est la réaction dont l'inhibition cause le scorbut.

74

3.2.7 méthylation

La méthylation consiste à ajouter un groupement -CH3 sur une lysine, une histidine, un acide aspartique ou glutamique, ou une arginine. Elle peut aussi se produire aux NH2 ou COOH terminaux. La méthylation des lysines des queues N-terminales des histones est associée à la répression de la transcription (voir le tableau en section 1.1).

3.2.8 phosphorylation

La phosphorylation est la modification la plus étudiée des protéines et joue un rôle majeur dans la signalisation cellulaire. Elle consiste en l'ajout d'un groupement phosphate sur un groupement -OH d'une protéine. Il existe un très grand nombre de Protéines kinases (les enzymes qui ajoutent des groupements phosphates) qui appartiennent à différentes voies de signalisation. La mutliplication de ces voies permet... (a) Une amplification de signal

(b) Une activation simultanée de plusieurs sentiers, comme dans le cas du contrôle de la dégradation du glycogène.

75

Les kinases ne doivent évidemment pas phosphoryler toutes les protéines contenant au moins un tyrosine, une sérine ou une thréonine, car alors aucune transmission de signal spécifique ne serait possible. Voici quelques sites-cibles de protéines-kinases:

Kinase Séquence consensus Ref.

CaM II R-X-X- S/T -X 3,4

CK I Sp/Tp-X 2-3 -S/T -X 2

CK II X- S/T -X-X-D/E 1

GSK3 X- S/T -X-X-X-Sp 3

MLCK X-K-K-R-X-X-S-X 2,4

p34cdc2 X- S/T -P-X-R/K 3

p70s6k K/R-X-R-X-X- S/T -X 2

PKA R-X 1-2 -S/T -X 3

76

PKC X- S/T -X-R/K 1

PKG (R/K) 2-3 -X- S/T -X 3

References:

1- PROSITE pattern.

2- Pinna, L.A. and Ruzzene M. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1314 :191-225.

3- Kennelly, P.J. and Krebs, E.G. (1991) J. Biol. Chem. 266 :15555-15558.

4- Kemp, B.E., and Pearson, R.B. (1990) Trends Biochem. Sci. 15 :342-346.

La phosphorylation est une modification réversible, ce qui permet d'activer ou

d'inactiver les voies de signalisation au besoin. La déphosphorylation est assurée

par des phosphatases.

La phosphorylation réversible des protéines peut aussi jouer un rôle dans la modulation de l'activité de facteuyrs de transcription, soit en les activant directement (comme c'est le cas pour le facteur AP-1) ou en jouant sur leur localisation dans la cellule (comme c'est le cas pour les facteurs NFkB ou NFAT).

NFAT: une famille de facteurs de transcription dont l'activité est contrôlée par la déphosphorylation.

77

La phosphorylation du facteur NFAT le garde inactif dans le cytoplasme. Un message membranaire permet l'influx de calcium dans la cellule, ce qui stimule la phosphatase calcium-dépendante calcineurine. Celle-ci déphosphoryle NFAT qui peut migrer dans le noyau et activer la transcription de gènes cibles. Ce système est intéressant au point de vue médical, car NFAT est impliqué dans la différentiation de cellules du système immunitaire (les lymphocytes T). Les drogues cyclosporine et FK506 sont des inhibiteurs de l'activité de

78

la calcineurine, et par effet indirect empêchent NFAT d'aller activer les gènes requis par la réponse immune. C'est pourquoi la cyclosporine et FK506 sont utilisés comme immunosuppresseurs chez les patients porteurs d'une greffe hétérologue. Pour en revenir au thème de la phosphorylation, notons qu'elle se produit surtout sur une tyrosine, une sérine ou une thréonine. On a aussi occasionnellement rapporté l'existence de phosphorylation d'autres résidus comme l'acide aspartique ou l'histidine. Les procaryotes n'ont que peu de gènes codant pour des sérine/thréonine kinases (entre 1 et 10). Il faut s'en souvenir quand on veut faire exprimer des protéines dans un système hétérologue: une sérine ou une thréonine se trouvant dans une protéine eucaryote qu'on fait s'exprimer dans une bactérie a peu de chances d'être phosphorylée.

3.2.9 sulfatage (ou sulfatation)

L'ajout d'un groupement sulfate à une tyrosine se fait par une sulfotransférase. La gastrine et la cholecystokinine sont deux protéines sulfatées. Cette modification sert apparement à activer ces enzymes.

3.3 Ajout d'acides gras ou de composés hydrophobiques.

Qu'il s'agisse d'une chaîne organique hydrophobique, d'un acide gras simple ou d'un complexe glycophosphatidylinositol, on retrouve de nombreuses "ancres" qui permettent à des protéines de rester attachées aux membranes biologiques. Cette section décrit les principales:

(a) le GLI, ou glycosylphosphatidylinositol; (b) les composés isoprénoïdes que sont le farnesol et le géranylgéranol; (c) les acides palmitiques et myristoïques.

79

Nous parlerons aussi du cholestérol, même s'il ne s'agit pas d'un ajout fréquent.

3.3.1 Glypiation, ou ajout de GLI

Le nom de glypiation vient de GLYcosyl Phosphatidyl Inositol. Il s'agit d'une modification rare en général, mais qui se retrouve dans plusieurs protéines ancrée dans la membrane par un acide gras couplé à leur extrémité C-terminale. La molécule entière pourrait avoir la structure suivante:

(N- PROTÉINE -C) - phosphoethanolamine- mannose- glucosamine- phosphatidylinositol- (phospholipides)

mais la nature de la chaîne liant le PI à la protéine peut varier et compter de nombreux sucres. De telles protéines n'ont pas de domaine transmembranaire et sont exclusivement trouvées à la surface des cellules.

Les protéines avec une ancre GPI se divisent en enzymes, marqueurs, molécules d'attachement et en protéines de transport non-catalytiques. La protéine PrPc, le précurseur de la protéine PrPsc associée à la maladie de la vache folle, possède une telle ancre de GPI.

Vous voyez ici l'ancre de GPI de la protéine neuronale Thy-1.

L'ancre de GPI est préformée et est ancrée dans la membrane. Elle est ajoutée à une protéine en remplaçant une des extrémités de la chaîne; c'est à dire qu'une partie de la protéine est perdue quand l'ancre est ajoutée. La cible du GPI sur la protéine est une séquence de 3-5 petits acides aminés suivis de 8-12 acides aminés hydrophiles, puis de 8-20 acides aminés hydrophobes; l'ancre de GPI s'intercale entre les petits acides aminés et les aa hydrophiles.

80

3.3.2 Isoprénylation ou prénylation

Liaison entre un résidu cystéine C-terminal et l'un de deux composés poly-isoprènes,

le farnésyl-diphosphate ou le géranylgéranyldiphosphate

L'isoprénylation permet à des protéines de se fixer dans une membrane. C'est le cas des protéines G impliquées dans la transduction du signal. Les membres de la famille Ras s'accrochent aussi à la membrane plasmique par une ancre farnésylée. En plus, N-Ras, K-RASA sont palmitoylés une fois et H-Ras l'est deux fois.

L'ajout d'un groupement isoprénoïde à une protéine se fait sur une séquence cible CAAX, où C est une cystéine, A représente un acide aminé aliphatique et X est Ser, Met, Ala ou Glu. (On retrouve aussi parfois des cibles Cys-Cys ou Cys-X-Cys, selon la farnesyl transférase impliquée dans la réaction).

L'ajout du groupement se fait sur le -SH de la cystéine de la séquence cible; par la suite, la protéine est coupée juste après cette cystéine et un groupement méthyl y est ajouté à l'extrémité C-terminale.

L'ajout du groupement se fait sur le -SH de la cystéine de la séquence cible; par la suite, la protéine est coupée juste après cette cystéine et un groupement méthyl y est ajouté à l'extrémité C-terminale.

On a dit que la farnésylation permet à la protéine Ras de se positionner dans la membrane; c'est pourquoi plusieurs drogues anticancéreuses en voie de développement sont des inhibiteurs de farnesyltransférase, qui empêchent Ras de se retrouver à la

81

membrane et de véhiculer les signaux extracellulaires pro-mitotiques.

3.3.3 Palmitoylation et myristoylation

Les deux acides gras les plus souvents ajoutés aux protéines sont l'acide palmitique et l'acide myristique.

Ils servent eux aussi à ancrer les protéines dans une membrane, et parfois à les diriger vers le bon compartiment cellulaire.

La liaison entre une cystéine interne et un acide gras est une S-acylation; ce lien peut être renversé à cause de la fragilité de la liaison thioester (sensible à la réduction). Une liaison ester simple entre un acide gras et une sérine interne (O-acylation) est aussi parfois observée.

L'acide myristique peut aussi se retrouver dans une position particulière: sur une glycine localisée à l'extrémité N-terminale d'une protéine. C'est une modification courante des protéines membranaires virales. La myristoylation N-terminale n'est pas réversible. La protéine gag de HIV est ainsi myristoylée; sans cette modification, le virus ne peut pas produire de particules infectieuses.

La protéine BID impliquée dans l'apoptose est un exemple de transit intracellulaire régulé par la myristoylation: pour participer à la réponse apoptotique, BID doit être localisé sur la membrane de la mitochondrie. Or, sa forme inactive reste bêtement dans le cytoplasme. Lors du déclenchement de la réponse apoptotique, la caspase 8 vient couper BID en deux morceaux, p7 et p15, qui restent cependant associés par

82

une interaction hydrophobes. Cependant, même si les deux morceaux restent collés, l'extrémité N-terminale fraîchement coupée de p15 est maintenant GSQSAR, et cette glycine N-terminale est une cible pour les enzymes qui transfèrent l'acide myristique. p15 se fait myristoyler, et cette nouvelle ancre d'acide myristique permet de diriger le BID activé vers la membrane de la mitochondrie. Même des protéines possédant des domaines transmembranaires peuvent utiliser une ancre hydrophobique pour arrimer une partie hydrophilique de leur structure à la membrane: c'est le cas de la rhodopsine, qui même si elle possède sept domaines transmembranaires utilise quand même une ancre S-palmitoylée pour attacher son extrémité C-terminale (cytoplasmique et hydrophile) à la membrane plasmique.

3.4 Ajouts de glucides, simples ou complexes

3.4.2 Structure pyranosique

3.4.3 Quelques sucres fréquemment retrouvés dans les modifications post-traductionelles

83

3.4.4 Glycosylation en N et en O

Les glycoprotéines sont composées de protéines liées de façon covalente à des sucres, qui peuvent contribuer à leur stabilité, leur adressage, leur solubilité ou faciliter l'adoption d'une structure (ce qui est le cas du trimère d'hémagglutinine du virus de l'influenza, permettant à ce pathogène de fusionner avec la membrane de sa cellule-cible). Le sucre situé le plus à l'extérieur d'une chaîne glucidique liée à une protéine est souvent l'acide N-acétylneuraminique, chargé négativement, qui aide à tenir les protéines éloignées les unes des autres (par répulsion de charges). La glycosylation des protéines est présente dans toutes les cellules eucaryotes. Elle se retrouve aussi chez les bactéries, une découverte assez récente d'ailleurs. La majeure partie des glycoprotéines se trouve sur la face externe de la membrane plasmique, avec la partie glycosylée pendouillant dans le milieu extracellulaire; il existe cependant aussi des glycoprotéines intracellulaires, comme les facteurs de trannscription SP1ou YY1 qui sont O-glycosylés par le N-acétylglucosamine. Les chaînes glucidiques des glycoprotéines sont dites liées en N ou en O selon leur site d'ancrage.

84

Liées en O: sucres ancrés sur l'oxygène du groupement hydroxyl de la sérine, la thréonine, l'hydroxylysine (dans le collagène). Le sucre accroché à la sérine ou la thréonine est GalNAc. Le sucre accroché à l'hydroxylysine est le galactose.

Liées en N: sucres ancrés sur l'azote du groupement amide de l'asparagine. Le sucre qui contacte l'asparagine est le N-acetylglucosamine (GlcNAc).

Les structures liées en N ou en O sont très différentes. Les chaînes liées en O sont plus courtes et plus variables que celles en N, et ne contiennent la plupart du temps

85

qu'un, deux ou trois résidus glucidiques. Les chaînes en N peuvent former de véritables arborisations.

Le site d'attachement des chaînes liées en N a un consensus N-X-S(T), où X peut être n'importe quel acide aminé sauf la proline. Les chaînes liées en N contiennent toutes une structure de base consistant en deux GlcNAc et trois mannoses; sur cette structure viennent se greffer d'autres glucides.

Selon la nature de ces autres glucides, on divise les arborisations glucidiques liées en N en trois familles:

- Type riche en mannose, qui ne contient que des résidus mannose en plus de la structure de base; - Type hybride, qui contient différents sucres et sucres aminés; - Type complexe, qui ressemble au type hybride mais contient aussi du NANA.

La plupart des protéines sécrétées ou attachées à la membrane plasmique sont glycosylées.

3.4.5 Mécanismes de glycosylation des protéines

la glycosylation en N commence en même temps que la traduction, dans le lumen du réticulum endoplasmique, et se continue jusque dans le Golgi. L'attachement de sucres en O se fait dans le Golgi, grâce à l'action de glycoprotéines glycosyltransférases. Liaison en N: ce type de glycosylation requiert un intermédiaire, le dolichol phosphate. Ce polymère hydrophobe est inséré dans la membrane et est relié par un groupe diphosphate au précurseur glucidique de l'arborisation liée en N. (Même si la structure et la composition finale de cette chaîne glucidique change d'une protéine à l'autre, le précurseur est toujours le même).

Lorsque le polypeptide portant un signal N-X-S(T) entre dans la lumière du réticulum endoplasmique, une oligosaccharide protéine transférase décroche la chaîne glucidique du dolichol et la greffe sur l'asparagine-cible.

86

La chaîne glucidique n'est pas au bout de ses peines, cependant: elle continue d'être modifiée dans le réticulum et dans le Golgi. On peut inhiber la glycosylation des protéines. La tunicamycine, par exemple, est un agent inhibiteur de la N-glycosylation. Elle empêche la glycosylation du résidu Asn initial. Elle arrête en plus le cycle cellulaire en G1. Liaison en O: Ici, les résidus sont ajoutés un par un (s'il y en a plus d'un). Les sucres ajoutés sont sous forme "activée", c'est à dire liés à un nucléotide, et les glycoprotéines transférases les ajoutent directement sur les acides aminés cibles. Les groupes sanguins ABO résultent d'une glycosylation effectuée avec les mêmes enzymes que pour la O-glycosylation, même s'ils ne sont pas toujours associés à des protéines. Ils viennent de ce que trois conformations possibles d'un oligosaccharide greffé sur une protéine membranaire des globules rouges donnent naissance à trois antigènes: l'antigène H (ou O), l'antigène A et l'antigène B.

Ces épitopes, A, B et O, sont entièrement glycosidiques: ils peuvent être portés par une glycoprotéine (comme la bande 3, la bande 4.5 ou d'autres) ou même par un lipide. La bande 3 contient aussi une unique chaîne glycosylée liée en N, pointant vers l'extérieur de la cellule, et qui porte elle-même plus de la moitié des épitopes antigéniques du système ABO.

87

Ces épitopes, A, B et O, sont entièrement glycosidiques: ils peuvent être portés par une glycoprotéine (comme la bande 3, la bande 4.5 ou d'autres) ou même par un lipide. La bande 3 contient aussi une unique chaîne glycosylée liée en N, pointant vers l'extérieur de la cellule, et qui porte plus de la moitié des épitopes antigéniques du système ABO.

L'épitope "de base" du système ABO consiste à la base d'un groupe de cinq sucres: le glucose, le galactose, le N-acétylglucosamine, le galactose et le fucose. Ces sucres constituent l'antigène O (ou H) qui est -théoriquement- partagé par tout le monde. Chez les individus de type A, on retrouve un enzyme (la Fucosylglycoprotein alpha-n-acetylgalactosaminyltransferase EC 2.4.1.40 ) qui ajoute un N-acétylgalactosamine à l'a ntigène O. Chez les individus de type B, on retrouve un autre enzyme (la Fucosylglycoprotein 3-alpha-galactosyltransferase EC 2.4.1.37) qui ajoute un galactose à la place. Les individus qui possèdent une allèle de chaque type pour ces enzymes ont des cellules portant un antigène A et un antigène B, et ils sont dits AB (puisque leur système immunitaire a appris à n'attaquer ni l'une ni l'autre des deux formes A et B). Les individus dépourvus des deux enzymes sont de type O, et leur système immunitaire attaque les antigènes A et B. Il existe une mutation empêchant la synthèse de l'antigène O (le fucose manque); les individus porteurs de cette mutation sont dits appartenir au groupe de Bombay. Comme les tests pour déterminer les groupes sanguins sont basés sur une reconnaissance immunitaire (le sang de type A réagit avec les anticorps anti-A, le sang de type B réagit avec les anticorps anti-B, le sang de type AB réagit les deux alors que le sang O ne réagit pas du tout), le sang du type de Bombay peut passer

88

pour du sang O (puisqu'il ne réagit ni avec A ni avec B). Ces individus sont donc passibles de recevoir une transfusion qui peut leur être fatale. Pour échapper à une réponse immunitaire trop sévère de son hôte (l'être humain, par exemple), la bactérie entérique Shigella flexneri est équipée d'une structure lipopolysaccharidique qui contient plusieurs répétitions de l'antigène O. Ce polymère d'antigène O s'étend bien au-delà de la surface de la bactérie.

3.4.6 Adressage par le biais d'une glycosylation

Les protéines destinées à l'exportation où à certains compartiments dans la cellule ne sont pas traduites dans le cytosol mais dans la lumière du réticulum endoplasmique, à la surface duquel les ribosomes sont attachés et lui donnent un aspect rugueux en microscopie électronique. Les protéines qui entrent dans le RE doivent ensuite être acheminées vers leur destination correcte.

Les enzymes qui doivent se rendre dans les lysosomes y sont dirigés par une glycosylation spécifique: ils portent un mannose-6-phosphate. Le phosphate est ajouté à la protéine (qui est déjà une glycoprotéine, bien entendu) selon le processus décrit dans la figure qui suit. Cette réaction se produit dans le Golgi.

Deux récepteurs de mannose-6-phosphate sont présents sur la membrane interne de l'appareil de Golgi et permettent de diriger les protéines vers les lysosomes.

89

3.4.7 Glycosylation et infection

Beaucoup de virus et d'autres agents pathogènes ont évolué de façon à reconnaître les sucres présents à la surface des cellules et s'en servent comme points d'arrimage. - Le virus VIH entrent dans les cellules du système immunitaire en s'attachant à des récepteurs tels CXCR4 et CXCR5, qui sont des glycoprotéines. - La glycoprotéine membranaire Dystroglycan est une composante du complexe de la dystrophine. Deux protéines sont issues du gène de dystroglycan (suite à une maturation enzymatique): a-DG et b-DG. Le a-DG présent sur les cellules de Schwann est le récepteur de Mycobacterium leprae, ainsi que des arénavirus (causant des fièvres hémorrhagiques, telle la fièvre de Lhassa). - Les rhinovirus (qui causent le rhume) utilisent la glycoprotéine ICAM-1 comme point d'entrée. - Le virus de la rage se lie à la glycoprotéine N-CAM. - L'agent malarial Plasmodium vivax utilise le récepteur de l'interleukine 8 pour entrer dans les érythrocytes. - Plasmodium falciparum, lui, utilise les sucres portés par la glycophorine à la surface des éryhtrocytes. G. La glycophorine sert aussi de point d'entrée pour le virus de l'influenza. (Les sucres de la glycophorine contribuent à établir le système de groupe sanguin dit MNS:ce sont des antigènes propres à l'être humain mais attaqués par le système immunitaire d'autres animaux).

3.5 Ajout de polypeptides

3.5.1 ubiquitination

Voir les revues suivantes sur l'ubiquitination: Pickart CM. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem. 2001;70:503-33 ainsi que Voges D, Zwickl P, Baumeister W. The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis. Annu Rev Biochem. 1999;68:1015-68 et Hershko A, Ciechanover A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 1998;67:425-79.

L'ubiquitine est une petite protéine de 76 acides aminés, extrêmement conservée dans le monde vivant. Son rôle principal consiste à marquer une protéine pour la dégradation par le protéasome 26S. Son importance a valu à ses découvreurs le prix Nobel de chimie en 2004.

90

L'ubiquitine est ajoutée par sa propre extrémité C-terminale à des résidus lysine des protéines-cibles ou, parfois, à l'extrémité N-terminale de certains facteurs (MyoD ou LMP-1 de EBV, p.e.). D'autres molécules d'ubiquitine peuvent ensuite être ajoutées par leur C-terminal à la lysine K48 de la précédente pour former une longue chaîne qui permet l'accostage de la protéine sur des sites de reconnaissance localisés sur la particule régulatrice du protéasome 26S.

Au protéasome 26S, la protéine est déroulée par des ATPases et est dégradée en peptides de 8 acides aminés environ.

Trois familles d'enzymes sont requises pour ubiquitiner les protéines (E1 à E3); un nouvel enzyme, E4, semble faciliter l'allongement de la chaîne poly-ubiquitine. Au moins quatre ubiquitines sont nécessaires pour signaliser la destruction de la protéine. Les membres des familles E2 et E3 forment des complexes qui s'associent avec la protéine-cible; E3 fournit l'association à la cible et E2 fournit l'ubiquitine.

91

Il existe un enzyme E1, une vingtaine d'enzymes E2, et encore plus d'enzymes E3. Cette variété permet une multiplicité de spécificités. L'enzyme E1 est d'abord conjugué à l'ubiquitine (sur un résidu cystéine), qu'il transfère à l'enzyme E2, également sur un résidu cystéine. E3, le partenaire de E2, permet de recruter la protéine-cible et permet le transfert de l'ubiquitine sur cette dernière. Beaucoup de membres de la famille E3 contiennent un RING finger, une forme de doigt de zinc de séquence CXXCX(n) CX(1-3) HX(2-3) C/HXXCX (n)CXXC.

Un "ring finger".

Le signal d'ubiquitination des protéines cibles n'est pas très bien défini, quoiqu'on ait décrit une "destruction box" qui en fait office chez les cyclines. Sa séquence est très dégénérée et ressemble à ceci: R (A/T) (A) L (G) X (I/V) (G/T) (N), où les résidus entre parenthèses sont présents 50% du temps ou plus. En outre, certaines modifications post-traductionnelles (comme la phosphorylation) peuvent changer une séquence peptidique inactive en signal de reconnaissance pour le système de dégradation; c'est ce qui se passe dans le système IkB-NFkB illustré plus bas.

3.5.2 La règle du N-terminal (ou "N-end rule") et le dégron.

La "règle du N-terminus" (ou "N-end rule"), spécifie que certains résidus, quand ils occupent la place N-terminale d'un peptide, peuvent donner un signal de destruction. Les acides aminés concernés, qu'on peut identifier dans la table ci-dessous, se combinent avec une lysine située légèrement en aval pour former une cassette appelée N-degron. Le N-degron est reconnu par un complexe protéique E2-E3 qui ajoute des ubiquitines à la lysine. La protéine est ensuite détruite par le protéasome comme nous venons de le voir.

Demi-vie d'une fusion Ubiquitine-Résidu-β-

Galactosidase (en minutes)

Résidu E.coli S.

cerevisiae

Arginine, Arg, R 2 2

Lysine, Lys, K 2 3

Phenylalanine, Phe, F 2 2

92

Leucine, Leu, L 2 2

Tryptophane, Trp, W 2 2

Tyrosine, Tyr, Y 2 10

Histidine, His, H Plus de 600 3

Isoleucine, Ile, I Plus de 600 30

Acide aspartique, Asp, D Plus de 600 3

Acide glutamique, Glu, E Plus de 600 30

Asparagine, Asn, N Plus de 600 3

Glutamine, Gln, Q Plus de 600 10

Cysteine, Cys, C Plus de 600 Plus de

1200

Alanine, Ala, A Plus de 600 Plus de

1200

Serine, Ser, S Plus de 600 Plus de

1200

Threonine, Thr, T Plus de 600 Plus de

1200

Glycine, Gly, G Plus de 600 Plus de

1200

Valine, Val, V Plus de 600 Plus de

1200

Proline, Pro, P On ne sait pas, puisque la proline ne

participe pas au dégron.

Methionine, Met, M Plus de 600 Plus de

1200

(D'après Varshavsky, PNAS 93: 12142-12149, 1996)

On a utilisé ce dernier phénomène pour développer un système d'auto-destruction qui permet d'étudier le fonctionnement de certaines protéines en forçant leur dégradation à des moments donnés. Ce système repose sur le clonage, en phase avec le cadre de lecture de la protéine d'intérêt, d'une cassette (appelée dégron, un petit nom très technologique) qui peut recruter le système d'ubiquitination en réponse à un choc thermique.

93

Le dégron de levure représenté ci-bas contient (a) la séquence de l'ubiquitine, (b) une arginine, et (c) la séquence d'une dihydrofolate réductase (DHFR) thermosensible.

L'ubiquitine située en N-terminus est enlevée pendant ou tout juste après la traduction, un phénomène normal et attribuable à des Ubiquitines-protéases. Ces protéases coupent juste après la séquence de l'ubiquitine, laissant exposé l' acide aminé suivant (sauf s'il s'agit d'une proline). Dans le cas qui nous occupe ici, la coupure de l'ubiquitine expose une arginine N-terminale. Cette arginine est reconnue par un complexe E2-E3 (Ubc2-Ubr1, ce dernier produit s'appelant aussi N-recognin) qui ne peut pas ubiquitiner les lysines de la DHFR voisine tant que la température reste basse. Lors d'un choc thermique, la DHFR subit un changement conformationnel et les lysines-cibles sont exposées, menant à leur ubiquitination puis à la dégradation de la protéine entière. L'ubiquitine ne sert pas qu'à marquer les protéines pour la dégradation. De courtes chaînes d'ubiquitine jouent probablement un rôle différent (Les histones H2A, H2B et H1 peuvent être ubiquitinées dans leur partie C-terminale sans être condamnées à la destruction). Par exemple, on sait que la protéine de réparation de l'ADN Rad26 aide à ubiquitiner la lysine 123 de l'histone H2B. Cette ubiquitination semble être un pré-requis à la méthylation de la lysine 4 de l'histone H3, et on soupçonne que cela est dû au recrutement de la sous-unité 19S du protéasome (la sous-unité régulatrice) par H2B-K123-Ubi. La méthylation de H3K4 permet le recrutement de SAGA via sa sous-unité Chd1, et SAGA peut ensuite procéder à l'acétylation de

94

l'histone H3 via sa sous-unité Gcn5. Le facteur de transcription NFkB est contrôlé par un système d'ubiquitination et de phosphorylation. NFkB est normalement maintenu dans le cytoplasme par son association avec un répresseur appelé IkB (inhibiteur de kappa B) riches en répétitions ankyrines ou avec des formes immatures de NFkB contenant ces répétitions. Suite à un signal pro-inflammatoire approprié , IkB est phosphorylé; cette modification le rend apte à être ubiquitiné. Le protéasome dégrade alors le répresseur et NFkB est libre de migrer vers le noyau et son site d'attache sur l'ADN.

3.5.2 Sumoylation

Il existe des protéines apparentées à l'ubiquitine, soit par leur séquence, soit par leur capacité d'être greffée à des protéines déjà existentes. C'est le cas des protéines SUMO ( small ubiquitin-like modifier).La sumoylation est une variante de l'ubiquitination. Elle implique l'attachement de SUMO à une lysine présente dans divereses cibles comme p53, IκBα, ou PML. Elle ne mène pas à l'assemblage de

95

longues chaînes de SUMO et ne mène pas non plus à la dégradation. La sumoylation est réversible. SUMO semble augmenter la stabilité de ses cibles et moduler leur compartimentalisation cellulaire. Pour les facteurs inhibiteurs IκB et Mdm2, SUMO semble faire compétition à l'ubiquitine et pourrait agir comme stabilisateur. AOS1 et UBA2 agissent de concert comme enzyme E1 pour la sumoylation. Ces deux protéines présentent une homologie avec les parties N-terminale et C-terminale de UBA1, l'enzyme E1 impliquée dans l'ubiquitination.

3.6 Maturation protéolytique

La dégradation des protéines est une des étapes majeures de la régulation de leur activité. La dégradation peut être partielle, comme quand un zymogène est partiellement dégradé pour libérer un enzyme actif, ou totale pour complètement éliminer la molécule.

Il existe deux principaux systèmes de dégradation protéique dans la cellule: le protéasome 26S et les lysosomes. Le protéasome est un gros complexe protéique ressemblant à l'empilement de quatre anneaux, bouché à chaque extrémité par deux autres complexes protéiques. Le tunnel au centre des anneaux contient le site actif de plusieurs protéases. L'unité régulatrice qui coiffe l'empilement reconnaît les chaînes d'ubiquitine (et donc les protéines marquées pour la destruction par ce système) et déroule la chaîne polypeptidique qu'elle fait passer dans le canal des unités catalytiques, où la chaîne est découpée en fragments d'environ huit résidus.

96

Les lysosomes, eux, sont des vésicules d'origine golgienne. Les enzymes lysosomiques sont glycolsylés et portent un mannose-6-phosphate, qui est reconnu à la surface interne du réticulum trans golgien par un récepteur qui dirige ces enzymes vers les lysosomes en maturation. Les lysosomes contiennent une soupe à pH 5 contenant une grande variété d'enzyme de dégradation. Phosphatase, RNAse, DNAse, collagénase, cathepsine, peptidase, glucosidase, polysaccharidase lysozyme, hyaluronidase... tout c'qui y a de pas bon pour la santé, ce qui est normal puisque le lysosome est supposé dégrader tout ce qui y est introduit. Ces enzymes fonctionnent préférablement à pH acide, ce qui veut dire que si un lysosome vient à se briser dans la cellule ils n'iront pas tout bouffer autour d'eux (le pH du cytoplasme étant plus élevé que le pH de prédilection des enzymes lysosomaux). Il vaut quand même mieux, quand on purifie les protéines, s'assurer d'avoir un bon système tampon. Exemple de l'insuline, activée par dégradation protéolytique à partir d'un précurseur:

Préproinsuline avec peptide signal |

Vésicules de sécrétion des cellules B des ilôts de Langherans (coupure du peptide signal) (1)

| proinsuline

| Activation par un signal cellulaire

| Coupure du peptide C (2)

| Insuline active, maturation du peptide C.(3)

Les chaînes A et B sont reliées par des ponts disulfures dans l'insuline mature. Le rôle métabolique du peptide C n'est pas encore clair, mais il est sécrété en quantité équimolaire à l'insuline.(Il peut être utilisé pour quantifier la production d'insuline).

97

3.7 Le collagène, protéine très modifiée

Consultation suggérée: Darnell, Lodish & Baltimore: Molecular Cell Biology (2nd ed). Scientific American Books, New York, 1990, pp. 906-915. Le collagène est une protéine fibreuse insoluble de la matrice extracellulaire et du tissu conjonctif. C'est la protéine la plus abondante du règne animal. Sa famille compte jusqu'à présent 23 types de collagènes, assemblés à partir de 38 chaînes a génétiquement distinctes. (Voir le site suivant pour un exposé récent sur les différents types de collagène). Le collagène de type I, qui nous intéresse aujourd'hui, se retrouve dans la plupart des tissus conjonctifs; il est abondant dans le derme, les os, les tendons, les ligaments et la cornée.

3.7.1 Structure primaire du collagène

La structure primaire, ou séquence en acides aminés, du collagène est caractérisée par une très grande abondance en glycine et en proline, des acides aminés qu'on ne retrouve presque jamais dans les hélices a ou les feuillets b. Chaque 3e position dans la séquence d'une chaîne de collagène est une glycine.

... Gly-Pro-Met-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Arg-Gly-

Leu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Hyp-Gly-Pro-Gln-Gly-

Phe-Gln-Gly-Pro-Hyp-Gly-Glu-Hyp-Gly-Glu-Hyp-Gly-

Ala-Ser-Gly-Pro-Met-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Hyp-Gly-

Pro-Hyp-Gly-Lys-Asn-Gly-Asp-Asp...

Séquence primaire de la chaîne a1(I) de

collagène, qu'on retrouve dans le collagène de

type I, du 13e au 66e acide aminé. Notez que la

glycine se retrouve régulièrement tout le long de la

séquence, séparée des ses voisines par deux

acides aminés. Notez aussi la très grande

richesse en proline et la présence

d'hydroxyproline, une proline hydroxylée post-

traductionnellement.

98

La glycine est un petit acide aminé. Sa chaîne latérale ne consiste en effet que d'un atome d'hydrogène. La

proline est un cas spécial: sa chaîne latérale se replie et vient rejoindre son groupement aminé: la chaîne

latérale dépasse alors de l'axe principal de la chaîne polypeptidique comme une anse de tasse. Cette

conformation inhabituelle et rigide rend la proline incapable de participer à l'élaboration d'une hélice a.

L'hydroxyproline est produite après la traduction de l'ARNm du collagène en chaîne polypeptidique: elle résulte

d'une hydroxylation d'un résidu proline par l'enzyme prolyl hydroxylase, avec comme co-facteurs O2, Fe2+, l'α-

cétoglutarate et l'acide ascorbique.

3.7.2- Structure secondaire du collagène

Hélice de collagène. Cette hélice est de pas gauche (elle tourne

en montant dans le sens des aiguilles d'une montre). À chaque

trois acides aminés on tombe sur une glycine; l'hélice est aussi

très riche en proline et en hydroxyproline. Notez qu'au contraire

de ce qui se passe dans une hélice α, on ne retrouve pas de

ponts hydrogènes stabilisants entre les résidus d'une même

hélice de collagène. L'hélice de collagène s'élève de 0,29nm par

résidu et elle compte un peu moins de trois résidus par tour

alors que l'hélice α ne s'élève que de 0,15nm par résidu et

compte 3,6 résidus par tour.

99

3.7.3 Structure quaternaire du collagène

La molécule de collagène est une microfibrille consistant de trois sous-unités: trois hélices comptant chacune 1050 acides aminés et tournant l'une autour de l'autre en une super-hélice orientée dans le sens de la main droite. (L'hélice de collagène individuelle tourne dans le sens de la main gauche, mais les trois hélices tournent l'une autour de l'autre dans l'autre sens). La forme mature de cette triple hélice longue de 300nm s'appelle tropocollagène. La structure en triple hélice du tropocollagène est stabilisée par des ponts hydrogènes entre les hélices. Elle est très dépendante de la présence d'hydroxyproline. En l'absence d'hydroxyproline, la triple hélice est très instable à température de la pièce et ne se forme pratiquement pas à la température du corps. Puisque l'hydroxylation de la proline, qui a lieu dans le réticulum endoplasmique pendant la maturation du collagène, dépend de l'acide ascorbique (un cofacteur de l'enzyme prolyl hydroxylase), une carence en cette vitamine (il s'agit bien sûr de la vitamine C) conduit à une très mauvaise synthèse de collagène, ce qui conduit à la fragilité des vaisseaux sanguins, des tendons, et de la peau -les symptômes caractéristiques du scorbut.

En plus de l'hydroxylation des prolines, on note une hydroxylation de certaines lysines (donnant des résidus d'hydroxylysine) qui serviront à stabiliser les structures supermoléculaires des microfibrilles de collagène (voir ci-dessous). Certaines de ces hydroxylysines sont O-glycosylées alors que le propetide de la partie C-terminale du procollagène est N-glycosylé. Chacune des trois chaînes, de façon concomitante à sa traduction, est transférée dans le lumen du réticulum endoplasmique. À cette étape précoce, elle consiste La région contenant la triple hélice est flanquée d'un peptide signal et d'un propeptide N-terminal, ainsi que d'un propeptide C-terminal; ces deux dernières parties aideront la maturation de la protéine.

100

Une fois dans le réticulum

endoplasmique, le peptide signal est

coupé (étape 1 de la figure ci-dessous).

Ensuite, plusieurs prolines et lysines du

polypeptide sont hydroxylés. Le

propeptide C-terminal est modifié par N-

glycosylation. Certaines hydroxylysines

sont O-glycosylées (étape 2). Les

différentes modifications et la formation

de ponts disulfure entre les propeptides

C-terminaux de trois chaînes permettent

ensuite leur alignement (étape 3). Une

fois sa base bien alignée, la triple hélice

s'enroule alors comme une fermeture

éclair, en direction du N-terminus. (étape

4). Dans l'appareil de Golgi, étape qui suit

le voyage dans le réticulum

endoplasmique, la triple hélice est

flanquée de part et d'autre de régions

non-hélicales qui ont aidé à sa maturation

(étape 5). Le propeptide est alors éjecté

par exocytose dans l'espace

extracellulaire, où des procollagène

peptidases coupent les propeptides N- et

C-terminaux et libèrent une triple hélice

mature de tropocollagène de 1050 a.a. ou

300 nm de longueur (étape 6).

101

Les molécules de tropocollagène s'assemblent côte à côte

mais avec un décallage de 67 nm. Des lysines de la partie N-

terminale d'une molécule sont pontées de façon covalente à

d'autres lysines de la partrie C-terminale d'une voisine par

l'action de la Lysyl oxydase.

Cela permet aux molécules de tropocollagène de s'assembler en une fibrille de 50 nm de diamètre. Ces fibrilles s'aggrègent en une fibrille d'ordre supérieur de 500nm, qui peuvent à leur tour former une fibre de collagène de 1 à 10 um de diamètre.

102

Tannage:

Le tannage est le processus qui permet de transformer une peau de bête en matériau imperméable et résistant à la putréfaction. Ce qui est utile dans une telle peau au point de vue structurel, c'est sa haute teneur en collagène qui la rend très solide. Pour la rendre utilisable, évidemment, il faut en tout premier lieu la débarasser de sa graisse à cause de l'odeur déplaisante qu'elle dégagerait en se dégradant; il faut aussi empêcher aussi vite que possible l'action des bactéries qui auraient tôt fait de changer la peau en vulgaire charogne. Le dégraissage est exécuté mécaniquement, par grattage des couches adipeuses situées sous la peau. La peau est aussi salée dans un premier temps. Elle est ensuite incubée dans une substance caustique pour l'épiler. La peau est par la suite neutralisée par trempage dans un acide (des conditions basiques, en ionisant les groupements hydroxyls, empêcheraient la suite du procédé) et est rendue imperméable et résistante à la putréfaction par une incubation subséquente dans une substance appelée tannin. (De nos jours, plutôt qu'un tannin, on utilise plutôt un sel comme le sulfate de chrome). Traditionnellement, les tannins sont des polyphénols extraits de source végétale (l'écorce du chêne, de l'acacia, du bouleau, du saule, sont toutes des sources de tannins). La figure ci-bas montre la structure d'un tel tannin. Vous voyez que le nom de polyphénol n'est pas une exagération. Pendant le trempage, en s'intercalant entre les fibres de collagène, les très nombreux cycles aromatiques en chassent les molécules d'eau. Des interactions hydrophobiques entre les cycles aromatiques et les chaînes de collagène, de même que les ponts hydrogènes formés entre les très nombreux groupements hydroxyls du polyphénol avec les prolines, permettent de former un réseau très dense de fibres de collagène qui est à toutes fins utiles imperméable à l'eau. Puisque ce réseau protéique est pratiquement dépourvu d'eau, la putréfaction bactérienne ne peut y avoir lieu. Le tannage doit se faire avec une concentration pas trop élevée de tannin pour éviter que les surfaces externes du cuir ne se "ferment" trop vite, empêchant le traitement d'atteindre les couches plus profondes du cuir -qui ne serait alors pas tanné et risquerait, lui, de se dégrader avec le temps.

103

4.0 Les enzymes

Les enzymes sont des catalystes biologiques qui permettent d'augmenter la vitesse d'une

réaction chimique jusqu'à plusieurs milliards de fois. Ce sont principalement des protéines,

quoique les travaux des Drs Thomas Cech et Sydney Altman, justement récompensés par le

prix Nobel de chimie en 1989, nous ait permis de découvrir que certains ARNs ont aussi une

activité catalytique.

Les enzymes sont généralement beaucoup plus grosses que les molécules sur lesquelles elles

agissent et qu'on appelle "substrat". Leur activité peut être modulée, et c'est principalement

sur la compréhension de la façon dont l'activité enzymatique est régulée dans la cellule que

repose l'essentiel de la recherche en biologie cellulaire et moléculaire.

Il existe plusieurs ressources sur les enzymes. Voici quelques lectures recommandées sur le

sujet:

(1) Lehninger, A.L. Principles of Biochemistry, Worth Publishers Inc., New York, 1982

(chapitre 9).

(2) Le site du Dr Michael King, très bien fait, très recherché, et surtout assez concis pour être informatif sans nous perdre en cours de route.

(3) Deux pages du site du Dr John Kimball, sur les enzymes en général et sur la cinétique en particulier. Le Dr Kimball a la réputation d'être l'un des professeurs de biologie les plus appréciés de ses étudiants aux États-unis. Son site est très informatif.

Quand à nous, nous pouvons parcourir les pages suivantes (elles s'ouvriront chacune dans une nouvelle fenêtre):

4.2 Nomenclature

Étant déjà familiers avec plusieurs enzymes, vous aurez remarqué que le nom de la plupart d'entre eux se termine par le suffixe "-ase" et que le reste du nom nous donne une idée générale de ce que fait cete enzyme -et c'est très bien ainsi. De cette manière, nous avons une assez bonne idée de ce que va faire une DNA polymérase même si nous n'avons jamais travaillé avec ou même lu quoi que ce soit à son sujet.

Des noms comme polymérase, phosphatase, kinase etc. sont cependant des noms familiers, ou usuels, et non des noms systématiques. La nomenclature officielle des enzymes, elle, a été établie par la Commission des Enzymes (EC), un organisme tributaire de l'union Internationale de Biochimie et de Biochimie Moléculaire (IUBMB). Cette nomenclature officielle nous permet d'avoir une référence unique à l'échelle mondiale pour la désignation des enzymes. L'histoire du développement de cette nomenclature est en elle-même une épopée que vous pouvez lire sur le site de l'IUBMB.

104

Là où la nomenclature officielle diffère sensiblement de la nomenclature usuelle, c'est qu'elle désigne les enzymes en fonction des réactions qu'ils catalysent et non en fonction de la molécule qui possède l'activité enzymatique. Ainsi, les ARN polymérases I, II et III, que nous distinguons en biologie parce que ce sont trois complexes moléculaires différents qui sont responsables, respectivement, de la transcription de l'ADN en ARN ribosomique (I), en ARN messager (II) ou en ARN de transfert, ARN ribosomique 5S et autres petits ARNs (III). Pour la Commission des Enzymes, ces trois entités ne sont qu'une seule et même activité enzymatique, responsable du transfert de nucléotides triphosphates sur une chaîne de nucléotides:

EC 2.7.7.6

Common name: DNA-directed RNA polymerase

Reaction: nucleoside triphosphate + RNAn = diphosphate + RNAn+1

Other name(s): RNA polymerase; RNA nucleotidyltransferase (DNA-directed); RNA polymerase I; RNA polymerase II; RNA polymerase III; RNA nucleotidyltransferase (DNA-directed); C RNA formation factors; deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase; DNA-dependent ribonucleate nucleotidyltransferase; DNA-dependent RNA nucleotidyltransferase; DNA-dependent RNA polymerase; ribonucleate nucleotidyltransferase; ribonucleate polymerase; C ribonucleic acid formation factors;ribonucleic acid nucleotidyltransferase; ribonucleic acid polymerase; ribonucleic acid transcriptase; ribonucleic polymerase; ribonucleic transcriptase; C RNA formation factors; RNA nucleotidyltransferase; RNA transcriptase; transcriptase

Systematic name: nucleoside-triphosphate:RNA nucleotidyltransferase (DNA-directed)

Comments: Catalyses DNA-template-directed extension of the 3'- end of an RNA strand by one nucleotide at a time. Can initiate a chain de novo. In eukaryotes, three forms of the enzyme have been distinguished on the basis of sensitivity to a-amanitin, and the type of RNA synthesized. See also EC 2.7.7.19 (polynucleotide adenyltransferase) and EC 2.7.7.48 (RNA-directed RNA polymerase).

Le code qui permet de désigner un enzyme de façon systématique a la forme

EC (chiffre de 1 à 6) . (chiffre). (chiffre). (chiffre)

"EC" désigne la commission des enzymes. Le premier chiffre classe l'enzyme dans l'une des six classes d'enzymes:

1: Les oxydoréductases, qui catalysent des transferts d'électrons;

2: Les transférases, qui catalysent les transferts de groupements;

3: Les hydrolases, qui catalysent des réactions d'hydrolyse;

105

4: Les lyases, qui catalysent l'addition de groupes à des liens doubles ou l'inverse;

5: Les isomérases, qui catalysent le transfert de groupes dans une même molécule pour produire des formes isomères (la conversion d'un acide aminé L en acide aminé D' par exemple);

6: Les ligases, qui forment des liens C-C, C-S, C-O et C-N lors de réactions de condensation couplées à l'utilisation d'ATP.

Les autres chiffres désignent des sous-classes pour chaque enzyme; ils permettent de savoir que telle transférase ajoute un groupement hydroxyl à une molécule de glucose, par exemple.

En toute honnëteté, on n'utilise pas très souvent le noms systématique d'un enzyme en biologie. Il est quand même bon de savoir que cette référence existe.

4.3 Utilisation des enzymes à travers l'histoire

Nous avons utilisé le pouvoir de catalyse des enzymes pour favoriser notre mieux-être depuis les temps les plus reculés, même si c'était parfois à notre insu. Dans l'industrie alimentaire, par exemple, il n'est probablement pas possible de savoir quand exactement nous avons commencé à utiliser les enzymes glycolytiques des levures de type Saccharomyces pour faire fermenter la bière et faire lever le pain. Les Sumériens brassaient déjà de la bière et comme ils ont inventé l'écriture, il est difficile de chercher plus avant.

Quelques organismes parmi les très nombreux dont les enzymes nous facilitent la vie:

Organisme Enzymes utiles Utilisation

Hordeum sp. (orge) α-amylase

β-amylase

endo-1,3-β-D-glucanase

Dégradation de l'amidon

permettant aux levures de

faire fermenter la bière.

Saccharomyces cerevisiae oligosaccharidases diverses

enzymes glycolytiques

Fermentation (bière, pain)

Saccharomyces

carlsbergensis

oligosaccharidases diverses

enzymes glycolytiques

Fermentation à basse température (bière)

Streptococcus lactis

Streptococcus cremoris

Penicillium roqueforti

enzymes lipolytiques Dégradation partielle des lipides (yaourt, fromage)

106

Même si les enzymes étaient utilisés depuis l'âge de bronze au moins, leur étude n'a commencé à se faire qu'assez récemment.

Une réjouissante description des querelles sévissant au XIXe siècle au sujet des enzymes se trouve sur ce site: http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/buchner4.htm ; nous nous limiterons ici à quelques considérations historiques.

Le mot "enzyme" a été inventé n 1876 par le professeur Willy Kühne de l'université de Heidelberg (à qui nous devons aussi les noms de la myosine et de la trypsine). Le mot vient vient du grec "en zume", et signifie, de façon assez appropriée, "dans la levure". Et si vous avez la chance de goûter à la bière de Heidelberg, vous trouverez pertinent l'intérêt de ce chercheur pour la fermentation alcoolique!

Le mot enzyme cherchait à donner à ces mystérieux catalystes biologiques qu'on savait se

trouver dans les microorganismes une connotation chimique. En effet, suite aux travaux de

Louis Pasteur sur la fermentation alcoolique, l'opinion généralement partagée était que cette

fermentation est un processus inséparable des organismes vivants. Des chercheurs comme

Berthelot et Kühne suspectaient bien que ce que Pasteur appelait "ferments" devaient être un

genre de composé qu'on pouvait extraire des microorganismes -seulement, à cette époque, les

techniques d'extraction cellulaire étaient encore à découvrir et les tentatives faites jusque là

n'avaient livré aucun ferment actif.

C'est finalement le scientifique allemand Eduard Buchner qui put produire un extrait cellulaire aux propriétés enzymatiques indéniables. Sa zymase, un enzyme qui permettait la fermentation du sucre en alcool en l'absence de levures vivantes, lui valut le prix Nobel de chimie en 1907.

La première activité enzymatique à être suffisamment purifiée pour être cristallisée fut celle de l'uréase, par James Sumner en 1926. Sumner ayant établi que ses cristaux d'uréase consistaient de protéines, il en conclut que les enzymes étaient des protéines -une opinion contestée pendant quelques années par d'autres éminents chercheurs, jusqu'à la démonstration de la nature également protéique de la trypsine et de la chymotrypsine.

4.4 Apoenzyme, coenzyme, holoenzyme, etc.

Les enzymes protéiques ne sont pas toujours homogènement composés d'acides aminés. Certains (en fait, beaucoup!) recquièrent aussi des composantes chimiques supplémentaires appelées cofacteurs.

Un cofacteur peut être inorganique, tels que le sont les ions Fe2+, Mn2+, Zn2+ ou Mg2+, des cofacteurs fréquents. Il peut aussi être de nature organique, comme la biotine ou le coenzyme A. La plupart des vitamines sont des cofacteurs enzymatiques. Quand un cofacteur est une molécule organique complexe, il porte le nom de coenzyme. La partie protéique de l'enzyme, elle, s'appelle apoenzyme et l'union de l'apoenzyme et de son coenzyme (ou de son cofacteur) est un holoenzyme.

107

Le cofacteur, qu'il soit petit comme un ion ou complexe comme un coenzyme, peut être attaché de façon transitoire à l'apoenzyme ou encore y être fixé de façon covalente; c'est alors un groupement prosthétique.

Finalement, un enzyme qui est synthétisé sous une forme inactive qui demande à être activée par protéolyse partielle est un zymogène.

4.4 Réactions chimiques et catalyseurs

L'énergie individuelle des molécules dans une population varie beaucoup de part et d'autre d'une valeur moyenne. L'énergie d'une molécule particulière pourrait être suffisamment élevée pour lui faire passer le niveau d'une barrière d'énergie d'activation qui sépare cette molécule d'un autre état plus stable:

Le niveau d'énergie final est plus bas que le niveau initial; la réaction a donc fort peu de chances de se faire en sens inverse. Cependant, elle ne sera pas non plus systématiquement spontanée parce qu'entre le niveau d'énergie initial et le niveau d'énergie final (plus bas) il y a un niveau d'énergie de transition (l'énergie d'activation) qui est plus haut que les deux.

L'état dans lequel une molécule se trouve quand elle est au sommet de la colline (c'est à dire avec assez d'énergie pour changer d'état) et dit "état de transition", parce que la molécule pourrait soit franchir la barrière, soit revenir à son état antérieur. une fois la barrière franchie, le retour est extrêmement défavorisé.

Voici un exemple: un ballon au sommet d'une pente va rouler vers le bas sans nécéssiter d'aide, parce que son niveau d'énergie potentielle en haut de la pente est plus élevée qu'en bas. À moins qu'on lui fournisse activement de l'énergie, une réaction va toujours du niveau d'énergie le plus élevé au niveau le plus bas. L'énergie d'activation dans cet exemple pourrait être représentée par un caillou qui tiendrait le ballon en place: ce dernier a besoin d'un léger coup de pied pour franchir cette barrière. Après la réaction se déroule spontanément.

Dans le graphique ci-haut, le niveau d'énergie initial pourrait être celui de l'hydsrogène et de l'oxygène gazeux (H2 et O2). Ces deux gaz coexistent sans problème à cause de la barrière d'énergie d'activation qui les empêche de se convertir spontanément en une molécule d'eau. il suffit cependant de l'énergie d'une étincelle pour atteindre et franchir cette barrière, et la formation de l'eau est alors si rapide et exothermique qu'elle est utilisée pour mettre la navette spatiale en orbite.

108

Il existe deux façons de permettre une réaction qui fait face à une barrière énergétique d'activation: fournir de l'énergie (en chauffant, par exemple) ou en utilisant un facilitateur chimique, un catalyseur. Avec un catalyseur, le niveau d'énergie d'activation d'une réaction est abaissé: celle-ci a donc moins besoin d'un apport externe d'énergie pour se dérouler.

Un catalyseur peut ainsi accélérer une réaction d'un facteur de plusieurs millions de fois.

Les enzymes sont des catalystes biologiques. Ils augmentent la vitesse de réactions chimiques en en abaissant le niveau d'énergie d'activation; eux-mêmes ne sont pas affectés par la réaction proprement dite.

Enzyme + Substrat -------> Enzyme + Produit

4.6 Structure et fonction

Un enzyme est beaucoup plus volumineux que son substrat. Il semble qu'on ait besoin d'une architecture fort complexe pour permettre à quelques acides aminés de se trouver juste dans la position qu'il faut pour servir de catalyseur à une réaction. La structure de l'enzyme sera donc déterminante pour sa fonction.

Plusieurs facteurs entreront en ligne de compte pour le bon fonctionnement d'un enzyme. Comme la rencontre entre l'enzyme et son substrat dépend du mouvement moléculaire, l'activité d'un enzyme croîtra avec la température (puisque la température est le reflet du mouvement moléculaire). Cependant, cela ne sera plus vrai quand la température sera assez haute pour affecter la structure tertiaire de l'enzyme: il pourrait alors perdre rapidement son activité. Un enzyme dénaturé (c'est à dire qui a perdu sa structure tertaire) ne peut pas fonctionner.

Le pH aura le même effet. L'état d'ionisation des différents acides aminés d'une protéine aura une grande influence sur sa structure, et indépendamment de la structure on doit aussi considérer l'état d'ionisation des acides aminés du site actif.

109

Les enzymes auront par conséquent des pH optimaux différents, selon leur structure et la nature de leur site actif. La pepsine a un pH optimal de 1,5, approprié pour un enzyme gastrique; la trypsine intestinale a plutôt un pH optimal de 7,7).

La forme du site actif de l'enzyme va lui permettre de reconnaître un substrat particulier: le substrat est la clef dont le site actif est la serrure. Certains enzymes sont extrêmement spécifiques et ne fonctionneront que sur un seul et unique substrat; d'autres ont un large spectre et fonctionnent sur une structure partagée par de nombreuses molécules qui peuvent toutes lui servir de substrat. Le site actif consiste d'au moins deux parties fonctionnelles, qui peuvent ou non être voisines sur la chaînes polypeptidique (si non, la structure tertiare les amène près l'une de l'autre). Ce sont le site de reconnaissance du substrat et le site catalytique. Le premier permet à l'enzyme de reconnaître son substrat; le second de lui faire subir son traitement catalytique. La liaison du substrat implique souvent de nombreuses liaisons non-covalentes de type hydrophobique, des ponts hydrogènes, ou des interactions de van der Waals.

On retrouvera souvent une activité enzymatique associée à un domaine d'une protéine, et ce domaine peut parfois être transporté par ingénierie génétique sur une autre protéine. La nature a probablement favorisé la conservation de tels domaines au cours des nombreuses recombinaisons de gènes qui ont accompagné notre évolution.

De même, il n'est pas rare qu'une même protéine ait plusieurs activités enzymatique. Le facteur de transcription basal TFIID contient une polypeptide, TAFII250, qui combine des activités kinase, acétylase et ubiquitinyl-transférase.

4.6.1 Un exemple: la chymotrypsine.

La chymotrypsine, comme sa comparse la trypsine, est synthétisée dans le pancréas et sécrété dans l'intestin grêle sous forme d'un zymogène, la chymotrypsinogène. Sa forme active est une protéase à très large spectre: elle coupe le lien peptidique qui suit les acides aminés dotés d'une grosse chaîne latérale hydrophobique comme Trp, Tyr, ou Phe; elle peut aussi, plus faiblement, faire de même après Leu, Ile et la méthionine (avec une affinité décroissante dans l'ordre cité) et peut aussi agir avec une très faible affinité après une Histidine.

Le délai dans l'activation de la chymotrypsinogène protège le pancréas de la protéolyse par la chymotrypsine. L'activation se produit quand deux dipeptides sont retirés au chymotrypsinogène: Ser14-Arg15 et Thr147-Asn148.

110

Le mécanisme réactionnel de la chymotrypsine a été partiellement déduit à partir de sa structure. L'enzyme compte trois chaînes polypeptidiques (A, B et, sans surprise, C) reliées entre elles par des ponts disulfures ainsi que vu dans la figure ci-haut. Le site d'attache du substrat dans la chymotrypsine consiste en une région ressemblant à une crevasse bordée d'acides aminés hydrophobiques. La conformation de cette crevasse permet à ces acides aminés hydrophobes d'interagir avec les chaînes latérales hydrophobiques de W, F et Y présentes dans les substrats. Les petites chaînes latérales hydrophobiques (comme celle de la valine ou de l'alanine), de même que les chaînes latérales hydrophiles (toutes celles qui sont polaires) ne permettent pas les liaisons non-covalentes nécessaires à la liaison au site actif de l'enzyme.

Les protéines globulaires protègent la plupart de leurs résidus hydrophobiques à l'intérieur de leur structure; la chymotrypsine aurait donc du mal à aider à la digestion des aliments si ceux-ci ne transitaient pas d'abord dans l'estomac. Là, le pH très acide (entre 1 et 2) dénature la plus grande part des protéines, exposant leurs "entrailles", si l'on peut dire... entrailles qui sont partiellement dégradées par la pepsine et les autres enzymes gastriques. Ce sont donc des protéines déjà partiellement dégradées qui arrivent dans l'intestin pour être la cible de la chymotrypsine.

111

Mécanisme du site actif de la chymotrypsine. Le substrat, une chaîne polypeptidique avec une chaîne latérale hydrophobique comme W, F ou Y, est logé dans le site de reconnaissance de telle façon que le lien à être hydrolysé se retrouve près de la sérine 195. La chymotrypsine est une sérine protéase en raison du rôle que joue cet acide aminé dans son activité; le terme sérine protéase ne désigne pas une protéase coupant les sérines! Un transfert d'électrons initié sur l'aspartate 102, induisant l'histidine 57 à voler un hydrogène à la sérine active.

Le O - qui reste à la sérine attaque le carbone du substrat, formant un lien covalent temporaire. L'hydrogène volé à la sérine, maintenant sur l'histidine, est attiré par le doublet électronique libre de l'azote du substrat (deuxième figure).

Cet azote vole à son tour l'hydrogène (en italique), ce qui brise le lien C-N du substrat et libère une moitié de la chaîne en train d'être digérée. Une molécule d'eau entre alors en jeu; un pont hydrogène avec l'histidine la met en présence du reste du substrat (troisième figure). La molécule d'eau réagit avec le substrat après que l'histidine lui eut elle aussi volé un hydrogène (figure quatre); le lien entre la sérine et le substrat est conséquemment hydrolysé et l'enzyme retrouve sa forme initiale. Le reste du substrat est libéré (figure cinq).

112

4.7 Cinétique enzymatique

En présence d'une certaine quantité de substrat, un enzyme va donc catalyser une réaction chimique pour donner un produit. La mesure de son efficacité est donnée par sa vitesse de réaction dans les conditions initiales de la réaction. Cette vitesse de réaction est dite "vitesse initiale" et est notée Vo.

Plus il y a de substrat, et plus

l'enzyme pourra travailler vite:

avec suffisamment de substrat, il

devrait éventuellement atteindre

une vitesse maximale (le point où

son site actif est totalement saturé

en substrat). Une telle vitesse est

cependant une vue de l'esprit: un

enzyme tend vers sa vitesse

maximale en proportion directe à

la quantité de substrat mais il ne

l'atteind jamais. Le graphique ci-

dessous montre qu'alors que

l'enzyme travaille de plus en plus

vite avec de faibles augmentations

initiales de substrat, il parvient

rapidement à un point où son

rendement est tel qu'il faut

énormément plus de substrat pour

lui faire gagner juste un peu de

vitesse supplémentaire.

Il y a donc une relation entre la concentration de substrat et la vitesse de réaction d'un enzyme. Cette relation est exprimée sous forme mathématique par l'équation de Michaelis-Menten:

Vo = VMax [S] / ( KM + [S] )

où Vo est la vitesse initiale, VMax la vitesse maximale, [S] la concentration en substrat et KM une constante propre à une réaction dans des conditions données, et qui est la concentration de substrat nécessaire pour que l'enzyme atteigne (1/2) VMax (voir graphique ci-haut).

La réciproque de la réaction de Michaelis-Menten est également très utile:

1 / Vo = ( KM + [S] ) / ( VMax [S] )

qu'on peut aussi écrire

1 / Vo = Km / (VMax [S]) + [S] / (VMax [S])

et qui se simplifie en

113

1 / Vo = Km / (VMax[S]) + (1 / VMax)

qu'on appelle aussi équation de Lineweaver-Burke.

L'avantage de cette

transformation

mathématique est qu'elle

permet de tracer un

graphique 1/Vo vs 1/[S]

dont la courbe est en fait

une droite pour les

enzymes obéissant à la

relation michaélienne

entre vitesse de réaction et

concentration du substrat.

À une concentration de

substrat infinie, à laquelle

la vitesse de notre enzyme

serait vraiment maximale,

la valeur de 1 / [S] sera de

0. Ce graphique nous

permet donc de trouver

facilement la valeur de 1 /

Vmax, qui correspond à 1

/ Vo quand l'axe des x est

à zéro.

Plusieurs enzymes catalysent des réactions à plus d'un substrat. L'hexokinase, par exemple, a l'ATP et le glucose comme substrats et l'ADP et le glucose-6-phosphate comme produits. Pour un tel enzyme à deux substrats, on observera un comportement dit de déplacement simple ou de déplacement double.

114

Le cas de l'hexokinase serait un déplacement double, car seul un groupement phosphate a changé de place.

4.8 Changements de conformation

Le modèle clef et serrure du substrat et de l'enzyme doit être pris avec un peu de souplesse: en effet, certaines de ces clefs ont la capacité de changer la forme de la serrure. L'hexokinas est un tel cas. Une fois que son site de reconnaissance a permis au glucose de se fixer au site actif, l'enzyme subit une profonde modification de conformation qui permet aux différentes composantes du site actif de trouver leur position appropriée dans l'espace pour catalyser le transfert d'un groupement phosphate sur le glucose. D'autre molécules peuvent entrer dans le site de reconnaissance (le ribose, le glycérol, par exemple) mais comme ils n'induisent pas un tel changement de conformation, ils ne sont pas de vrai substrats pour l'hexokinase.

Des changements de conformation peuvent être à l'origine d'une forme de régulation pour les enzymes. Prenons un enzyme possédant deux sites actifs, l'un ayant une plus forte affinité que le second pour le substrat. Après la capture d'une première molécule de substrat, le changement de conformation de l'enzyme pourrait faire en sorte que l'affinité du second site soit augmentée: il y aurait alors coopération entre les deux sites actifs. À l'inverse, il peut arriver que le second site ait une faible activité enzymatique et cause un changement de conformation nuisant au premier site; dans le cas où le substrat serait assez abondant pour que le site de faible affinité et de faible activité soit bien fourni en matériel, on assisterait à une baisse de l'activité globale de l'enzyme (c'est ce qu'on appelle une inhibition par le substrat).

Nous verrons plus loin comment les enzymes allostériques sont régulés par un changement de conformation.

4.9 Régulation de l'activité enzymatique

Pratiquement toutes les réactions chimiques dignes de mention dans la cellule sont catalysées par des enzymes. La cellule a donc besoin d'un système fiable de régulation pour gérer toute cette activité bourdonnante. Imaginez seulement une cellule dont tous les enzymes seraient en action en même temps. Ce serait comme une grande ville dont tous les feux de circulation seraient au vert.

Le systèmes de régulation sont nombreux; on pourrait les classer de différentes façons selon leur rôle, leur importance ou leur pertinence en biologie moléculaire. Nous allons faire un survol des aspects qui suivent, certains pouvant se recouper: (1) inhibition ou activation par des macromolécules; (2) disponibilité de cofacteurs; (3) rétroaction et allostérie; (4) inhibitioncompétitive, non-compétitive, et par le substrat; (5) modifications covalentes.

4.9.1 Régulation par des macromolécules

Il existe de nombreuses protéines dont le rôle est d'inhiber l'action de certains enzymes. Ces inhibiteurs peuvent agir sur l'activité enzymatique proprement dite, ou

115

dissimuler son site actif, ou séquestrer l'enzyme dans une partie de la cellule où il ne peut pas tenir son rôle,. À l'inverse, certaines interactions avec d'autres protéines vont permettre aux enzymes de se trouver là où leur activité peut avoir un rôle à jouer dans la régulation du métabolisme; qu'on pense seulement aux nombreux co-activateurs de la transcription qui possèdent une fonction acétyltransférase; ils n'ont pas beaucoup d'utilité tant qu'ils n'ont pas été recrutés au niveau de promoteurs de gènes particuliers.

4.9.2 Disponibilité de cofacteurs

Qu'il s'agisse de coenzymes, de groupements prosthétiques ou de simples ions, les cofacteurs sont nécessaires à tous les apoenzymes. La cellule a beaucoup recours à l'échange de cofacteurs, permettant d'activer ou d'inactiver rapidement un enzyme selon le cofacteur auquel il se lie.

La présence d' ions métalliques comme le Zn2+, le Fe2+, le Mn2+, le Mg2+ est aussi très souvent primordiale pour la fonction enzymatique. C'est pourquoi les cellules ont des sytèmes permettant à ces métaux de pénétrer le cytoplasme, malgré le risque qu'il peuvent aussi lui faire courir (la plupart des métaux lourds sont rapidement mortels pour une cellule),

En purification protéique, l'une des plus élémentaires mesures de précaution pour protéger nos protéines des protéases est d'ajouter une certaine quantité de comnposé chélateur (EDTA, EGTA) aux tampons pour priver les protéases de leurs cofacteurs métalliques.

4.9.3 Rétroaction et allostérie

La rétroaction est l'action qu'a le produit d'une réaction sur cette dernière.

S'il s'agit d'une inhibition, nous parlons d'une rétroaction négative. Par exemple, la conversion de la thréonine en isoleucine est le fruit de l'activité de cinq enzymes en séquence, le premier étant la thréonine déhydratase. Le produit de cette conversion, l'isoleucine, est un inhibiteur de cet enzyme; ainsi, quand la réaction a donné le résultat attendu, la production d'isoleucine est arrêtée (n'utilisant pas plus de thréonine que nécessaire).

Le cas de la thréonine déhydratse est un bel exemple de régulation allostérique. Un enzyme allostérique contient plus d'un site: en plus de son site actif, il a un site régulateur (le nom allostérique vient d'ailleurs du grec allos (autre) et stereos (espace ou site). La molécule qui vient se fixer au site régulateur est appelé effecteur ou modulateur. Tout comme le site catalytique de l'enzyme est spécifique pour son substrat, le site allostérique est spécifique pour son modulateur.

On peut bien entendu observer un effet allostérique positif. Le modulateur dans un tel cas va favoriser l'activité de l'enzyme au lieu de lui nuire. C'est ce qu'on observerait dans une boucle de rétroaction positive dans laquelle le produit d'une cascade enzymatique irait stimuler un ou plusieurs enzymes y étant impliqués.

116

Un enzyme allostérique qui est modulé par son propre substrat est dit homotrophique; s'il est modulé par une autre substance il est dit hétérotrophique.

Les enzymes allostériques dévient de la règle michaélienne de comportement face au substrat. Un enzyme allostérique homotrophique stimulé par la présence de son propre substrat, au lieu d'avoir une relation hyperbolique comme celle de la figure ci-dessous,

donnera plutôt une courbe de type sigmoïde.

Cela s'explique par le fait qu'une très faible augmentation du substrat, dans la partie à pic de la courbe, résulte en une grande stimulation de l'enzyme.

117

Parce que cette courbe n'obéit pas à la cinétique michaélienne, on ne peut pas définir de KM en fonction de 1/2 Vmax. On note quand même une concentration de substrat équivalent à 1/2Vmax, valeur qu'on désigne par K0,5.

Une telle courbe est aussi typique de la dynamique de capture de l'oxygène par l'hémoglobine: le premier oxygène est le plus difficile à attraper, parce que sa liaison induit un changement conformationnel qui facilite la capture des trois suivants. Ainsi qu'on pourrait s'y attendre, la myoglobine (qui comme l'hémoglobine capture de l'oxygène, mais n'a qu'une seule sous-unité globine au lieu de quatre) donne, elle, une courbe hyperbolique plutôt que sigmoïde.

4.9.4 inhibition comnpétitive, non-compétitive, et par le substrat

La forme la plus extrême de l'inhibition de l'activité d'un enzyme par une autre substance (à part, peut-être, la destruction de l'enzyme!) est l'inhibition irréversible. Cette inhibition, le plus souvent causée par la formation d'un lien covalent entre l'enzyme et l'inhibiteur, cause la perte définitive de l'activité enzymatique de l'enzyme.

L'insecticide malathion, par exemple, est un inhibiteur irréversible de l'acétylcholinestérase des insectes. Il se lie de façon covalente au groupement hydroxyl de la sérine du site actif de l'enzyme, l'inactivant pour de bon. Le PMSF, un agent fréquemment utilisé dans la préparation des protéines, inhibe les sérine et cystéine protéase en sulfonylant leur site actif. Lui aussi est irréversible.

Un inhibiteur réversible, comme vous le devinez, permet à l'enzyme de retrouver son état normal quand l'inhibiteur est retiré. Un tel inhibiteur peut être compétitif, c'est à dire qu'il compétitionne avec le substrat pour le site actif, qu'il occupe de façon à perturber la réaction, ou non-compétitif, c'est àa dire qu'il agit à un autre niveau. Un inhibiteur non-compétitif pourrait se lier à l'enzyme sur un autre site et interférer d'une manière ou d'une autre avec son activité, ou il pourrait avoir une action secondaire telle que la chélation d'un cofacteur essentiel à l'enzyme (ce que fait l'EDTA, un inhibiteur de protéase également fréquent).

Pour un enzyme de type michaélien, la différence entre une inhibition compétitive et non-compétitive se voit bien avec le graphique de Lineweaver-Burke:

118

Dans le cas d'une inhibition compétitive, le problème est que le site de l'enzyme est souvent occupé par un obstacle. La vitesse maximale de l'enzyme n'est cependant pas affectée, puisque l'enzyme, lui, fonctionne très bien: c'est l'accessibilité du substrat qui est mise en cause. À une concentration suffisemment élevée de substrat, la concentration de compétiteur deviendrait négligeable et la vitesse maximale serait atteinte. Cependant, plus il y a d'inhibiteur, plus il faut de substrat pour compenser; par conséquent, la concentration de substrat pour atteindre la moitié de la vitesse maximale est aussi plus élevée et le KM augmente avec la concentration d'inhibiteur.

Dans le cas d'une inhibition non-compétitive, quelque chose empêche l'enzyme de fonctionner correctement, indépendamment du substrat. La concentration de substrat requise pour atteindre 1/2 Vmax reste inchangée; c'est juste que le Vmax de l'enzyme baisse proportionnellement à la concentration d'inhibiteur non-compétitif.

L'inhibition par le substrat se présente quand il existe deux sites dans un enzyme pour le même substrat, mais quand l'un des deux sites a une faible activité catalytique et une faible affinité. La vitesse de l'enzyme devrait croître quand on augmente la quantité de substrat. Dans le cas qui nous occupe, cependant, il arrive un moment où la concentration de substrat est telle que même le site de faible affinité finit par avoir accès au substrat. Comme ce second site n'est pas très efficace, cependant, il peut nuire à l'action du premier sans lui-même compenser par sa propre activité. Quoiqu'un modèle intéressant, ce n'est pas un cas très courant.

4.9.5 modifications covalentes

Nous avons vu comment un précurseur inactif peut être activé quand on lui fait subir une protéolyse limitée (exemple de la chymotrypsine).

D'autres modifications incluent le transfert de groupements chimiques. Il existe des systèmes de phosphorylation / déphosphorylation, méthylation / déméthylation, acétylation / déacétylation qui justement activent ou inactivent plusieurs enzymes.

119

5.0 La purification des protéines

Peu importe le type de projet biochimique que nous poursuivons, il est fort probable qu’à un moment ou à un autre nous aurons besoin d’une protéine sous une forme raisonnablement pure. (Je dis "raisonnablement", parce qu’une protéine absolument et totalement pure est probablement une vue de l’esprit. On peut s’estimer déjà très heureux d’obtenir une protéine assez enrichie pour que tout contaminant puisse y être tenu comme valeur négligeable).

La purification d’une protéine consiste en sa séparation des autres constituants de la cellule, ni plus ni moins. Il y a gros à parier que votre protéine de prédilection sera une entité noyée dans la masse de toutes les composantes cellulaires, un peu comme dans le jeu "où est Charlie?"

La purification se fera en plusieurs étapes, chaque étape visant à éliminer telle ou telle classe de contaminant. À chacune de ces étapes, votre protéine sera enrichie par rapport aux autres substances (même si, en termes absolus, la quantité totale de votre protéine va probablement baisser à chaque étape).

En bout de course, cependant, vous aurez entre vos mains une protéine extrêmement enrichie (allez, ne soyons pas modestes et disons-la purifiée) qui vous permettra de vous livrer à vos expériences, qu’il s’agisse de cinétiques enzymatiques si c’est l’activité de la protéine qui vous intéresse, ou qu’il s’agisse d’études structurales si l’architecture moléculaire est votre passion.

Pour être d'une quelconque utilité, notre protéine purifiée devra avoir conservé une certaine intégrité; il faut donc lui éviter autant que possible les différents traumatismes qui pourraient l’endommager pendant la purification. Pour une activité enzymatique, nous voulons surtout préserver la fonction de la protéine, même si sa structure a un peu pâti; à l’inverse, pour des études structurelles, nous voulons une structure intacte même si l’activité n’y est plus. L’idéal reste évidemment de tout préserver! Heureusement, plusieurs précautions peuvent nous aider à atteindre ce but. Les sections suivantes vous permettrons d'en savoir un peu plus sur les méthodes utilisées pour purifier les protéines.

5.1 Les différentes étapes d'une purification

5.1.1 Paramètres

Ce sont ses caractéristiques intrinsèques, celles qui rendent une protéine unique, qui vous

permettront de la séparer de ses congénères cellulaires. Une protéine a une masse, une forme,

des structures primaire, secondaire, tertiaire et peut-être quaternaire; elle a une certaine

charge à un pH donné, elle présente une certaine densité; elle possède un certain degré

d’hydrophilicité ou d'hydrophobicité. Elle a peut-être des isoformes suite à un épissage

alternatif. Elle se retrouve peut-être dans une certaine région de la cellule ou dans une

organelle donnée. Elle a peut-être été nantie, par génie génétique, d’un quelconque marqueur

facilitant son identification. Tous ces critères peuvent être utilisés dans votre démarche: votre

stratégie de purification n’est réellement régie que par l’augmentation de vos chances de

succès.

120

L’équipement disponible dans votre laboratoire sera un des facteurs les plus importants dans

le choix de cette stratégie. Supposez que vous ayez à retrouver Carlos Sanchez dans une

foule. Carlos est un Paraguayen de petite taille, avec une moustache et des cheveux noirs; il

porte une cicatrice au genou gauche, il boit son café noir et fume des Gitanes. Votre

instrument de travail est un téléphone et vous devez travailler dans l'obscurité. Il y a gros à

parier que votre stratégie d’identification reposera davantage sur l’accent paraguayen de

Carlos que sur son goût en fait de café. C’est la même chose avec les protéines : si vous

disposez des appareils vous permettant d’utiliser la charge comme moyen de séparation,

allez-y; c’est la même chose avec la taille ou la densité. Ne vous croyez pas obligé d'utiliser

tous les paramètres en même temps.

Paramètre Technique

Taille Filtration sur gel

Solubilité Précipitation séquentielle au

sulfate d'ammonium

Charge Chromatographie d'échange

d'ions

Densité Centrifugation sur gradient;

ultracentrifugation

Hydrophobicité Chromatographie en phase

inverse

Marqueur ajouté Chromatographie d'affinité

5.1.2 Exemple simulé d’une purification protéique

Etape Quantité de votre

protéine (unités

arbitraires)

Proportion de

votre protéine

matériel brut 4000 1 : 2 000 000

1 1000 1: 500 000

2 500 1: 100 000

3 200 1: 1 000

4 10 1: 100

5 5 1: 2

Le tableau ci-haut simule une purification protéique. Dans le matériel brut (un extrait

cellulaire, par exemple) disons que nous avons 4000 unités arbitraires de notre protéine. Pour

chaque unité de cette protéine, on compte 2 millions d’unités d’autres protéines (en plus de

121

beaucoup de matériel non-protéique). Comme vous le voyez, nous avons affaire à une

aiguille dans une botte de foin (ou dans une très grande boîte d’aiguilles). Une première étape

de purification, qui d’habitude vise à éliminer le matériel non-protéique présent dans l’extrait,

nous fait perdre les trois quarts de notre matériel (oups!) tout en en augmentant la pureté par

un facteur de 4, puisque maintenant pour chaque unité de notre protéine on ne retrouve plus

que 500 000 unités d’autre chose.

La deuxième étape décrite ci-haut nous coûte moins cher en matériel, puisque nous ne

perdons que la moitié du matériel qui nous reste. En plus, elle permet d’augmenter le facteur

de pureté de cinq fois.

Pourquoi ne pas avoir adopté cette seconde étape en premier lieu, demanderez-vous,

puisqu’elle a clairement un meilleur rendement? Les réponses peuvent être multiples. Il se

peut que l’étape 2 ne puisse pas être réalisée avant l’étape 1 à cause de la sensibilité de

l’étape 2 aux contaminants éliminés par l’étape 1; il se peut que l’étape 1 livre l’ échantillon à

une concentration de sels qui permet de pratiquer l’étape 2 tout de suite, alors que

l’échantillon livré par l’étape 2 a besoin d’être dialysé avant d’être propre à passer par l’étape

1... L’expérimentateur doit considérer toutes ces options et faire un choix en conséquence. Un

des critères à respecter pendant une purification est que plus on fait vite, meilleures sont nos

chances d’avoir du bon matériel à la fin. Mieux vaut donc autant que possible limiter les

étapes en nombre et en durée.

L’étape 3 qui suit l’étape 2 a un très bon rendement : pour une perte d’un peu plus de la

moitié du matériel, notre pureté augmente d’un facteur 100!!! À l’inverse, l’étape 4 présente

un rendement pitoyable puisque nous perdons 95% de notre matériel pour un gain de pureté

de 10 fois seulement. Une telle étape serait certainement à reconsidérer dans un exercice réel!

Finalement, l’étape 5, qui nous coûte encore la moitié de notre matériel, nous donne une

protéine presque pure puisqu’elle constitue la moitié du matériel qui nous reste.

5.2 Planification

Chaque heure de planification vous sauvera dix heures d’effort. Avant d’entreprendre quoi

que ce soit, assurez-vous d’abord que tous les appareils soient disponibles, en état de marche,

et pas réservés par quelqu’un d’autre (réservez-les vous-même tout de suite). Soyez sûr que

toutes vos solutions soient préparées et refroidies à 4°C; que votre matériel soit prêt et que

vous ayez mis assez de temps de côté pour vous concentrer à la tâche. Ce sont là des

considérations terre-à-terre à l'extrême, mais vous seriez surpris de constater à quel point

elles peuvent être négligées même par des scientifiques chevronnés. (Un bon truc en passant:

gardez toujours une grande quantité d'eau stérile à 4°C. On ne sait jamais quand on aura à

préparer une solution en catastrophe... et si dissoudre une poudre se fait en un tournemain,

refroidir un litre de solution peut prendre des heures)!

Votre planification doit inclure les étapes suivantes , que nous allons explorer une à une.

1- Essai. Comment allez-vous suivre votre protéine pendant sa purification? Rappelez-vous,

dans la vraie vie une protéine en solution ressemble pas mal à un peu d’eau malodorante dans

un tube. Vous devrez disposer de moyens pour savoir si votre protéine est là ou non à chaque

étape de sa purification.

122

2- Choix de la source de matériel. Source native vs source recombinante; source dispendieuse

mais idéale vs source moins idéale mais peu chère; impératifs scientifiques vs impératifs

pratiques... vous aurez parfois à faire des choix déchirants.

3- Choix d’une technique d’extraction. Elles sont nombreuses, et présentent toutes des

avantages et des inconvénients.

4- Séparation et enrichissement. D’une masse de protéines et de cochonneries cellulaires,

vous devrez extraire la pépite d’or. Les techniques de séparation utilisent différents aspects

physico-chimiques des protéines, telles que leur charge (chromatographie d'échange d'ions),

leur masse (filtration sur gel, gradients de densité) et leur solubilité (précipitation

différentielle au sulfate d'ammonium).

5.3 Essai

Vous aurez compris à la lecture de ce qui précède que la purification est un processus

étapiste. Une purification peut prendre plusieurs jours et nous voulons savoir à chaque étape

où en est notre protéine.

Il est possible de vérifier la présence aussi bien que l'activité d'une protéine, le choix se

faisant selon la nature de la protéine recherchée, la faisabilité du test et l'étape à laquelle nous

en sommes dans la purification. Les premières étapes se contentent généralement de vérifier

la présence de protéines (n'importe lesquelles) par spectroscopie; c'est plus tard pendant la

manoeuvre qu'on commencera à se soucier de vérifier la présence d'une protéine particulière

ou de son activité.

Quoiqu'il en soit, il est impératif de toujours, toujours garder des aliquots de matériel à

chaque étape! De cette manière, on peut retracer après coup le déroulement de la purification,

comprendre quelles en sont les étapes les plus utiles ou les plus dommageables, et améliorer

notre protocole pour l'avenir.

5.3.1 Critères

Sensibilité Parce que la protéine risque d'être très diluée à certaines

étapes, particulièrement les premières.

Spécificité Nous cherchons une aiguille dans une grosse boîte d'aiguilles,

et comme rien ne ressemble plus à l'une d'entre elles que sa

voisine, il vaut mieux que nous sachions vraiment reconnaître

la nôtre.

Disponibilité des réactifs Si votre protéine n'est qu'un des facteurs impliqués dans une

réaction in vitro requérant huit autres protéines purifiées,

mieux vaut déjà avoir ces derniers si vous comptez utiliser un

essai réactionnel. Sinon, optez pour un essai que vous pouvez

vraiment effectuer.

Coût Ce facteur se présente souvent.

Temps requis Plus votre purification est rapide et mieux ce sera. Votre essai

123

devrait donc vous permettre d'obtenir rapidement une idée de

ce qui se passe avec votre purification; si vous pouvez

l'effectuer à chaque étape PENDANT la purification, encore

mieux.

5.3.2 Exemples d'essais

5.3.2.1 Présence de protéines (en général)

(A) Par mesure de l'absorption aux UV.

Ce type d'analyse est très pratique pour suivre la course de protéines sur une série de

colonnes de chromatographie. Tous les systèmes de chromatographie sont équipés d'une

cellule spectrophotométrique pour mesurer l'absorption des rayons UV par le matériel qui

sort des colonnes. C'est cependant une méthode simple dont le type de réponse est "oui, il y a

des protéines" ou "non, il y a eu un os quelque part". On ne peut pas sérieusement s'attendre à

pouvoir faire une relation exacte entre la densité optique d'un mélange protéique en cours de

purification et sa concentration réelle. (On utilise parfois un coefficient d'extinction très

approximatif pour dire qu'une densité optique à 280nm, dans une cuvette de 1 cm, correspond

à 1 mg/mL de protéines...Mais c'est comme de dire que la population de la Terre s'élève à

quelques milliards. C'est une idée générale, rien de plus).

En outre, n'oublions pas que l'ADN et l'ARN absorbent dans le coin de 250-260nm, ce qui

risque de nous causer des soucis de précision! (D'habitude, on a plutôt le problème inverse,

celui des protéines qui contaminent notre ADN. Mais tout finit par nous arriver si on vit assez

longtemps).

On peut utiliser le spectro pour détecter la présence de protéines parce que le tryptophane

(Trp, W) absorbe la lumière UV avec un pic à 280 nm. La tyrosine (Tyr, Y) le peut aussi,

quoiqu'à un degré moindre, et un troisième acide aminé cyclique, la phénylalanine, le peut

aussi très faiblement. Tous les peptides pourraient absorber l'UV aux environs de 190-200nm,

mais la plupart des tampons absorbent aussi massivement dans cette région qui n'est donc pas

très commode pour nous.

Notez que le coefficient d'extinction de chaque protéine variera selon sa richesse en W et Y.

Une protéine dépourvue de ces acides aminés passerait devant la cellule optique comme un

fantôme, à peine percue.

(B) Par Méthodes colorimétriques.

Ces techniques demandent un traitement de l'échantillon à mesurer par une substance

chimique qui, au contact des protéines, produira un changement de couleur que l'on peut

quantifier par spectrophotométrie si on dispose d'une courbe standard fiable.

Comme dans le cas de l'absorbance à 280nm, les méthodes colorimétriques réagissent de

façon inégales aux différentes protéines. pour une analyse brute, une courbe standard faite

avec des quantités connues de BSA convient tout à fait, mais pour des protéines plus pures il

124

vaut mieux s'assurer de disposer d'une courbe standard dont le comportement représente bien

celui de notre protéine.

Exemple de courbe standard: la mesure de la densité

optique (DO) de plusieurs échantillons avec une

concentration croissante en protéines donne à chaque

fois une DO plus élevée. On peut ainsi tracer une

droite qui nous permet de déterminer la concentration

en protéines d'un échantillon inconnu grâce à sa

propre DO.

Toujours avoir plusieurs points sur notre courbe standard: on limite ainsi l'effet de ceux qui

auraient eu une mauvaise réaction. C'est comme avec des fonds mutuels, vraiment.

Voici trois méthodes colorimétriques; la méthode de Bradford est probablement la meilleure

et la plus utilisée aujourd'hui, mais il en existe plusieurs autres.

Méthode du

biuret

Basée sur la réduction du cuivre Cu2+ en Cu+.

Cu+ réagit avec le tryptophane (Trp, W), la tyrosine (Tyr, Y) et la cystéine

(Cys, C). Il leur donne une couleur bleue. Le pic d'absorption pour un test

du biuret est à 550nm.

Ce test est peu sensible.

Il résiste assez bien aux différents composés présents dans les tampons

mais est sensible aux sels d'ammonium, ce qui en fait un mauvais choix

pour doser les protéines venant d'être précipitées par ce sel.

Méthode de

Lowry

Basée sur la réaction du biuret, elle utilise aussi la réduction du Cu2+ en

Cu+. Depuis 1951, la méthode de Lowry est la plus citée de toutes dans la

littérature scientifique.

Dans la méthode de lowry, le Cu+ est utilisé pour réduire le réactif de

Folin (une solutiuon phénolique contenant des composés de tungstène et

de molybdène) qui change sa couleur du jaune au bleu. On lit la réaction à

750 nm.

Plus sensible que la réaction du biuret, la méthode de Lowry est utilisée

125

pour des quantités de 2 — 100 ug.

Elle est sensible à plusieurs agents, dont l'EDTA, le DTT, le -mercapto,

l'Hepes, le Tris, le triton X-100, le NP-40, etc.

Méthode de

Bradford

Le bleu de Coomassie se

lie à l'arginine (Arg, R),

la tyrosine (Tyr, Y), le

tryptophane (Trp, W),

l'histidine (His, H) et la

phénylalanine (Phe, F)

(surtout à R; huit fois plus

qu'aux autres en fait).

Il est assez insensible aux

agents des tampons, mais

est sensible aux

détergents.

En solution, il a une

forme cationique rouge

qui absorbe à 470nm. Lié

aux protéines, il a une

forme anionique bleue

qui absorbe à 595nm.

Parce que les deux

spectres d'absorption se

chevauchent un peu, une

courbe standard de

Bradford n'est pas

parfaitement linéaire sur

toute sa distance

(quoiqu'en disent les

commerçants!), un point

souligné par Brafdord lui-

même dans son papier

original. Elle l'est quand

même suffisament pour

nos besoins.

La méthode de Bradford

est encore plus sensible

que celle de Lowry (0,2

— 20 ug de protéines).

5.3.2.2 Présence de protéines particulières

126

L'absorption aux UV et les méthodes colorimétriques c'est bien, surtout si on veut juste savoir

par où passent les protéines durant la purification. Il vient cependant un temps où, confiants

de ne pas avoir flushé nos protéines aux égoûts, on veut savoir si parmi elles se trouvent la

protéine qui nous intéresse.

Un critère utile de notre protéine pour la reconnaître parmi les autres est sa taille; un autre tel

critère est sa charge.

5.3.2.2.1 Gel de SDS

Le système le plus utilisé pour l'analyse de la taille des protéines d'un mélange est le gel de

SDS (ou SDS-PAGE, pour sodium docecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis).

La séparation électrophorétique d'une protéine, tout comme celle de n'importe quelle

molécule chargée d'ailleurs, est l'effet de son mouvement sur ou dans une matrice appropriée

soumise à un courant électrique. Plus une molécule est massive ou biscornue, plus elle se

déplacera lentement; plus elle sera petite, plus elle ira vite.

Il serait avantageux, comme ce l'est pour l'ADN, de pouvoir séparer les protéines les unes des

autres par une simple séparation électrophorétique ne dépendant que de la taille des

molécules. Mais alors que l'ADN est uniformément chargé et que sa structure est

essentiellement la même quand il est sous forme linéaire, les protéines, elles, varient

énormément non seulement en poids mais aussi en charge et en forme. Pour les séparer selon

leur masse uniquement, il faut contrecarrer l'effet de leur charge et de leur forme.

Ce tour de passe-passe est accompli en mettant 1% de SDS dans le gel d'électrophorèse et

dans le tampon de migration. On utilise aussi 0,1M β-mercaptoethanol (HO-CH2-CH2-SH)

dans le tampon de largage des échantillons, et ceux-ci sont bouillis de surcroît avant la

migration sur gel.

Le sodium dodecyl sulfate (SDS) est un détergent anionique qui dénature les protéines en

enveloppant la chaîne polypeptidique selon un ratio de masse de 1,4 pour 1. Le SDS confère

aux protéines une charge négative proportionnelle à leur longueur; plus elles sont longues,

plus il y a de SDS. Les polypeptides deviennent donc des chapelets de charges négatives

partageant une même densité de charge par unité de longueur.

Le β-mercaptoethanol, lui, (un agent réducteur qui ne sent pas bon), en combinaison avec la

chaleur, brise les ponts disulfures internes des protéines que la chaleur ont dénaturées. Il brise

aussi les éventuels ponts disulfures inter-protéiques.

Les protéines ainsi dépliées et uniformément chargées en fonction de leur masse peuvent dès

lors être séparées par électrophorèse, de la cathode (-) à l'anode (+). Puisqu'elles sont

uniformément chargées par le SDS, leur vitesse de migration sur gel sera proportionnelle à

leur seule masse, les petites protéines étant les plus rapides.

On utilise d'ordinaire un gel discontinu: c'est à dire qu'en haut du gel de séparation

proprement dit, (le "running gel;" en bon franglais) se trouve une bande plus petite

d'acrylamide de composition différente, le gel de concentration ou stacking gel.

127

Alors que le gel de séparation a des pores petits et un pH de

9, le stacking gel a des pores plus grands et un pH de 6,8. La

taille des pores dans un gel de polyacrylamide est fonction

du degré de pontage entre les chaînes d'acrylamide, pontage

qui est proportionnel à la quantité de N,N,N',N',-méthylène

bisacrylamide dans le gel; plus il y en a, plus les chaînes sont

pontées et plus petits sont les pores.

De plus, les ions des deux gels au moment du dépôt des protéines sont des ions chlorure alors

que ceux du tampon sont des ions glycine. Les ions glycine qui entrent dans le gel de

concentration à pH 6,8 sont près de leur point isolélectrique et ont une très faible mobilité.

Les ions chlorure, eux, conservent une grande mobilité. Les protéines chargées par le SDS

sont plus lentes que le chlorure mais plus rapides que la glycine.

128

Quand le courant est

appliqué, les ions chlorures

filent vers l'anode, laissant

derrière elles un vide ionique

temporaire qui n'a qu'une

faible conductivité.

Manquant d'électrolytes dans

leur entourage immédiat, les

protéines dans le gel de

concentration ne peuvent pas

migrer vers l'anode. En fait,

elles ne peuvent bouger que

quand le front d'ions glycine

finit par les rattraper, parce

que ces ions remplacent alors

les ions chlorure comme

électrolytes. Même alors,

parce que les grands pores du

gel de concentration

permettent aux protéines

d'être aussi rapides que les

ions glycine, elles ne se

séparent pas les unes des

autres mais sont toutes

ramassées au passage par le

front d'ions.

(Imaginez que les protéines

sont des barques échouées

sur la grève, nez pointé vers

la terre ferme, et qu'elles sont

soudain poussées par une

vague (le front d'ions). Vous

aurez une idée assez correcte

de ce qui se passe dans cette

partie du gel. Même les

barques les plus rapides ne

peuvent pas aller plus vite

que la vague, parce qu'elles

manqueraient tout

simplement d'eau pour les

porter).

Ce front d'ions qui pousse et

empile les protéines devant

lui induit la concentration de

toutes les protéines en une

mince bande qui migre avec

129

le front jusqu'au bout du gel

de concentration.

Quand le front d'ions atteint

la discontinuité de pH et de

porosité entre le gel de

concentration et le gel de

séparation, le pH soudain

plus élevé permet aux ions

glycine de prendre leur envol.

Ils deviennent beaucoup plus

chargés et rapides et

dépassent les protéines.

Maintenant qu'il y a assez d'électrolytes en avant d'elles, les protéines peuvent migrer

librement en fonction de leur masse. (La porosité du gel, qui est plus faible dans le gel de

séparation que dans le gel de concentration, assure que les ions glycine seront plus rapides

que les protéines).

Soyons honnêtes avant de continuer: il nous faut avouer que la mobilité des protéines dans un

gel de SDS n'est pas absolument proportionnelle à leur masse. En effet, on peut observe une

variation de vitesse de migration par rapport à la masse dans une majorité de protéines, allant

de très petites variations jusqu'à des résultats franchement désarçonnants. La cause peut en

être variable: par exemple, certaines protéines ont naturellement une faible affinité pour le

SDS et le ratio masse/charge s'y trouve modifié. Certaines modifications post-

traductionnelles peuvent aussi jouer un rôle: la glycosylation interfère avec la liaison au SDS.

Il convient donc de ne pas se désespérer si nos protéines purifiées ont sur gel de SDS une

taille apparente différente de ce à quoi on s'attendait!

Les très petites protéines (moins de 15 kDa), en outre, courent de façon très aléatoires dans

les gels de glycine. C'est qu'elles peuvent être capturées dans des micelles de SDS qui se

tiennent près du front de migration. On peut les en libérer en utilisant la tricine à la place de

la glycine dans le tampon de migration. La tricine aide à la libération de ces petites protéines.

On offre commercialement des gels de SDS Tris-tricine pour l'étude des protéines de plus

petit poids moléculaire.

Une fois les protéines dûment séparées selon leur taille, il reste à révéler leur présence. Les

deux approches les plus courantes sont de les colorer, ou d'utiliser un anticorps spécifique qui

permette de localiser une réaction chimique quelconque (mais donnant un résultat visible) là

où se trouve une protéine particulière (voir à ce sujet la technique de l'immunobuvardage de

type western, un peu plus loin).

On peut colorer les protéines directement sur le gel, ou les colorer après les avoir transféré

sur une membrane (quoique dans ce dernier cas, il ne s'agisse d'ordinaire que d'un rapide

contrôle pour vérifier la qualité du transfert; on colore presque toujours les protéines

directement dans le gel).

Les techniques les plus courantes sont la coloration au bleu de Coomassie et au nitrate

d'argent. Le bleu de Coomassie servait jadis à colorer les chandails de laine en bleu; son nom

130

commémore la prise de la ville Ashantie de Kumasie, au Ghana, pendant l'époque coloniale.

Le bleu de Coomassie colore les protéines de façon à peu près égale mais est de dix à cent

fois moins sensible que la technique de coloration au nitrate d'argent.

Cette dernière repose sur la réduction, facilitée par la présence des protéines, de sels d'argent

en argent métallique (qui précipite). Il existe plusieurs protocoles de coloration au nitrate

d'argent (choisissez la vôtre en fonction de sa facilité d'exécution et du temps qu'elle

requiert)! Cette technique est cependant sensible à plusieurs facteurs et ne colore pas toutes

les protéines de façon égale.

5.3.2.2.2 Gel non-dénaturant "Blue native".

Une variante du gel SDS permet de greffer une charge aux protéines ou aux complexes

protéiques sans les dénaturer. À la place du SDS, un détergent, on utilise le bleu de

Coomassie qui donnera une charge négative aux protéines en se collant (principalement) sur

ses résidus arginine. La distrubution des charges ne permet pas de définir un ratio

charge/masse aussi constant qu'avec le SDS, mais au moins les protéines natives migrent

dans le même sens. Cette technique est appelée "blue native electrophoresis". (Schagger H,

von Jagow G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in

enzymatically active form. Anal Biochem. 1991 Dec;199(2):223-31).

5.3 Essai (suite)

5.3.2.2.3 Electrofocalisation et gel 2D

L'électrofocalisation ou focalisation isoélectrique utilise avantageusement la charge que

possède chaque protéine à un pH donné.

Elle consiste en une migration, induite par un courant électrique, des protéines dans un

gradient de pH jusqu'à ce qu'elles atteignent un pH équivalent à leur pI -moment auquel elles

cessent de migrer, puisque leur charge nette est nulle.

Cette technique, qui sépare les polypeptides en fonction de leur charge plutôt que de leur

masse, est très sensible: elle peut distinguer des protéines dont la différence de pI est aussi

faible que 0,01 unité de pH.

On génère le gradient en soumettant un mélange d'ampholytes à un courant électrique. Des

tampons d'électrophorèse contenant de grandes quantités d'ampholytes sont disponibles

commercialement, précisément pour utilisation en électrofocalisation.

Les ampholytes sont de petites molécules à caractère amphotère; le mélange utilisé en

focalisation isoélectrique contient un très grand nombre de molécules ayant des pI différents,

ce qui leur permet de se distribuer entre l'anode et la cathode et de maintenir entre elles un

gradient de pH.

131

Focalisation isoélectrique.

Dans cet exemple, l'échantillon protéique est

déposé dans un large puits au centre du gel.

Évidemment, peu importe où l'échantillon est

déposé puisque les protéines migreront dans une

direction ou dans l'autre jusqu'à ce qu'elles

rencontrent leur point isoélectrique, point où elles

cessent de migrer.

On peut combiner la séparation isoélectrique avec la séparation selon le poids moléculaire

que permet le gel de SDS. Cette combinaison est appelé "gel 2D", pour deux dimensions.

Après l'électrofocalisation, une bande

longitudinale contenant toutes les protéines

séparées est coupée du gel. Cette bande ne doit

pas être trop large pour que les résultats de

l'étape suivante ne soient pas trop flous. Elle va

servir de "puits", si l'on peut dire, pour un gel

SDS, ainsi que décrit dans la figure ci-dessous.

Observez que chaque bande du gel

d'électrofocalisation peut contenir plusieurs

protéines de poids moléculaire différent. Si on

effectuait le processus à l'envers, c'est à dire si

on faisait courir un gel de SDS avant de

soumettre une de ses pistes à la focalisation

isoélectrique, on verrait que plusieurs protéines

de même poids moléculaire ont des pI très

différents.

Le gel 2D est très utilisé dans les analyses

protéomiques parce qu'il sépare les protéines

selon deux paramètres distincts et permet l'étude

d'un plus grand nombre d'entre elles en même

temps.

132

5.3.2.2.3 Western blot et Dot blot

Il existe un outil extrêmement précieux peut nous renseigner sur la présence ou l'absence de

notre protéine: un anticorps.

Les anticorps sont des protéines complexes fabriquées par les plasmocytes, des lymphocytes

B stimulés pendant une réponse immunitaire. Les anticorps circulent dans le sang comme des

missiles à tête chercheuse; ils sont sélectionnés pour reconnaître avec une grande spécificité

une structure chimique particulière qu'on appelle antigène, qui se retrouve sur les corps

étrangers. (Toute partie d'un corps étranger qui sert de base à la sélection d'un anticorps par le

système immunitaire est par définition un antigène).

On peut immuniser différents animaux pour les induire à fabriquer des anticorps contre les

protéines qui nous intéressent. Le sérum de ces animaux fournit alors le matériel dont nous

avons besoin pour identifier, au milieu d'une soupe de protéines, celle que nous voulons en

particulier.

Alternativement, si notre protéine est le fruit du génie génétique, nous lui aurons peut-être

greffé un petit bout de séquence antigénique qui sera reconnu par un anticorps commercial.

C'est ainsi que l'étiquette FLAG de Sigma (DYKDDDDK) ou la série d'histidines

(HHHHHH) parfois utilisée pour faciliter la purification par chromatographie d'affinité pour

un métal immobilisé (IMAC, pour immobilized metal affinity chromatography) sont

reconnues par des anticorps commerciaux; toute protéine qui les porte sera identifiée par les

anticorps respectifs.

Un anticorps spécifique à notre protéine, ou spécifique à une étiquette que nous lui avons

greffée, peut être utilisé pour révéler la présence de la protéine sur une membrane après un

transfert à partir d'un gel (SDS ou de focalisation isoélectrique) ou, plus rapidement, une

membrane sur laquelle on a directement déposé un certain volume de solution contenant la

protéine. Dans le premier cas on parle de western blot (un jeu de mots sur la technique du

Southern blot, développée par le Dr Southern, et qui est basée sur le transfert d'ADN sur une

membrane). Dans le second cas, on parle de dot blot ou de slot blot parce que le dépôt de la

protéine sur la membrane se fait souvent avec l'aide d'un masque n'exposant que de petites

parties de la membrane, avec des trous de forme ronde (dot blot) ou en forme de fentes (slot

blot).

Dans la figure ci-dessous, on représente le transfert des protéines d'un gel SDS à une

membrane pouvant être ensuite traitée avec un anticorps. L'anticorps va coller sur sa

protéine-cible. Un deuxième anticorps, qui reconnaît la partie Fc du premier, est alors

appliqué pour révéler la présence de ce dernier. Ce second anticorps est d'ordinaire couplé à

un enzyme quelconque dont l'activité est facilement décelable: il s'agit le plus souvent d'une

phosphatase alcaline dont l'action sur des substrats adéquats causera la production de photons

(lumière!) ou l'apparition locale d'une coloration foncée.

De tels anticorps secondaires de même que les systèmes pour révéler leur présence sont

disponibles chez de très nombreux fournisseurs de réactifs biologiques.

133

Il est très utile de faire un double

de notre gel de SDS, en faisant

courir les mêmes échantillons, dans

le même ordre, sur un autre gel

qu'on fait courir en parallèle. Alors

que le premier gel sert au western

blot, le deuxième est coloré au bleu

de Coomassie ou au nitrate

d'argent (beaucoup plus sensible)

afin de juger du degré

d'enrichissement de la protéine

révélée par l'anticorps.

5.3.2.3 Essai d'activité enzymatique: méthode continue.

Nous pouvons avoir plusieurs raisons de nous intéresser à l'activité de ce que nous purifions.

D'une part, il est possible que nous soyons sur la piste de quelque chose qui a une activité

particulière, et que nous supposons être une protéine, mais sans en être sûrs. D'autre part, il

est possible que ce soit l'activité de notre protéine qui nous intéresse et que nous n'ayons

absolument pas besoin d'elle si elle a perdu cette activité. Dans les deux cas, nous devrons

faire un test d'activité.

Le choix de notre essai repose une fois de plus sur la nature de notre protéine: si c'est une

kinase, nous testerons sa capacité à phosphoryler un substrat; si c'est une polymérase, à

synthétiser des polymères.

On distingue des méthodes dites continue, discontinue et couplée pour les essais

enzymatiques, selon que la détection de l'activité enzymatique nécessite ou non des

manipulations supplémentaires.

Dans la méthode continue, le produit de l'enzyme est différent du substrat. Il n'est donc pas

besoin de les séparer avant de quantifier l'activité de l'enzyme. La méthode continue peut

s'effectuer directement dans la solution où se retrouve l'enzyme purifié. Un exemple en est la

quantification de l'activité de la luciférase, un enzyme qui hydrolyse la luciférine (son

substrat) en provoquant la libération d'un photon. C'est le système enzymatique qui permet

134

aux lucioles de s'envoyer des messages lumineux. Ici, le substrat est la luciférine alors que le

produit à quantifier est un photon. Rien ne saurait être plus différent! On peut donc ajouter de

la luciférine directement à une solution contenant la luciférase purifiée et compter les

photons. Le substrat qui n'a pas été utilisé par l'enzyme n'interfère en rien avec la mesure.

C'est le cas aussi de différentes phosphomonoestérases. On les teste en les incubant avec le 4-

nitrophényl phosphate, un composé incolore. L'action de ces enzymes convertit ce substrat en

nitro phénol de couleur jaune. Comme la couleur finale est distincte de la couleur initiale, on

peut l'évaluer directement.

5.3.2.4 Essai d'activité enzymatique: méthode discontinue

Il peut arriver que notre substrat ne puisse se distinguer du produit par la méthode de

quantification utilisée. Le cas le plus flagrant est celui des méthodes utilisant des isotopes

radioactifs.

Un test de kinase, par exemple, peut recquérir l'utilisation d'ATP radioactif; la kinase, en

utilisant cet ATP, transfère un groupement phosphate isotopique sur son substrat. Il est

cependant impossible de distinguer, dans le mélange réactionnel, le substrat nouvellement

phosphorylé de l'ATP se trouvant dans la solution, puisque tous les deux sont radioactifs. Il

faut donc d'abord les séparer.

5.3.2.5 Essai d'activité enzymatique: méthode couplée Qu'advient-il quand le produit d'une réaction particulière n'a pas de résultat facilement

observable?

On a recourt à une deuxième réaction qui utilise le produit de la première comme carburant!

La figure ci-dessous nous résume une telle méthode, telle qu'utilisée pour doser l'activité de

l'aspartate aminostransférase. Cet enzyme convertit le 2-oxoglutarate et l'aspartate en

glutamate et en oxaloacétate.

L'oxaloacétate ne se distingue pas particulièrement dans un tube: il ne dégage pas de photons,

il ne change pas de couleur et il ne danse pas à claquettes. il faut donc une deuxième réaction

pour révéler sa présence.

Le NADH absorbe la lumière de longueur d'onde 340nm, ce que ne fait pas le NAD+. On

utilise donc l'action de l'enzyme malate déhydrogénase, qui convertit l'oxaloacétate et le

NADH en malate et en NAD+. Cette réaction est accompagnée par une chute d'absorbance à

340nm, et n'aurait pas pu se produire si l'oxaloacétate n'avait pas été formé lors de la

première réaction.

135

Bien que la mesure que nous prenons ne soit pas reliée à l'activité directe de l'aspartate

aminotransférase, c'est tout de même cette dernière qui est responsable de la baisse

d'absorbance observée. Une telle méthode couplée nous permet donc de mesurer

indirectement l'activité d'un enzyme dont le produit immédiat ne se prêterait pas à une mesure

plus directe.

5.3.2.6 Purification d'un enzyme: définir l'unité.

En assumant que ce soit l'activité d'un enzyme qui vous intéresse, il ne sera pas suffisant de le

quantifier uniquement en termes de masse. L'activité devra être définie en termes d'unités.

Par exemple, on pourra définir une unité de nucléase EcoR I comme étant la quantité

d'enzyme requise pour digérer complètement 1 ug d'ADN de phage lambda en une heure à

37°C dans un volume de 50 uL. La notion d'unité permet de comparer les activités de

différentes préparations d'enzymes (on peut comparer l'activité spécifique de plusieurs

préparations indépendantes).

Voici un exemple de calcul de l'activité d'une préparation d'ARN polymérase II. Cet enzyme

catalyse la polymérisation de ribonucléosides phosphates en utilisant un brin d'ADN comme

gabarit. Une unité utile serait définie par la quantité de ribonucléosides phosphates qui sont

incorporés dans un polymère par unité de temps.

Nous définierons pratiquement notre unité en utilisant

136

(a) une quantité connue de polymérase II purifiée, et

(b) une concentration connue de nucléotides triphosphates radioactifs, avec une activité

spécifique déterminée.

Test d'incorporation de GTP radioactif dans l'ARN par la polymérase II: un exercice à

vous faire dresser les cheveux sur la tête!!!

Stock de mélange réactionnel (mélange 2X):

140 mM TrisHCl pH8

6 mM MnCl2

80 mM (NH4)2SO4

10 mM DTT

1 mM GTP

0,1 mg/mL poly riboC

6 uL de GTP-32

P 10 uCi/uL (3000 Ci/mmol)

dans 3 mL de volume total.

Les sels divers sont là pour assurer des bonnes conditions de pH et de salinité à la polymérase

II. Le poly riboC est un polymère de cytosine phosphate; il servira de gabarit à la réaction (la

polymérase II est particulièrement efficace pour initier la transcription sur un simple brin de

C répétés).

Réaction:

- Faire la réaction dans 100 uL. Mélanger 50uL de mélange réactionnel 2X, 30 uL H20, et 20 uL de polymérase

purifiée.

- (pour distinguer la réaction spécifique de la Polymérase II de celles des Polymérases I et III, on peut répéter

l'expérience en y ajoutant 10ug/mL d' -amanitine, qui inhibe l'activité de la pol II beaucoup plus rapidement

que celle des deux autres polymérases).

- Incuber 20 minutes à T/P, derrière un écran de plexiglas. Le 32

P est un émetteur de particules beta, des

électrons de haute énergie, qui doivent être bloqués par une couche épaisse d'une matière molle plutôt que par

une masse solide comme du plomb. 1 cm de plexiglas fait très bien l'affaire.

- Prendre 45 uL de réaction et spotter sur un filtre rond de papier chargé DE81 (qui lie l'ARN et l'ADN). Faire

de même sur un deuxième filtre pour avoir un duplicat. (On utilise 45 uL plutôt que 50 uL pour compenser pour

les pertes inévitables pendant le pipettage).

- Laver les filtres 3 fois avec un tampon phosphate (250 mL de Na2HPO4 5% à chaque fois). Il est pratique de le

faire dans une unité de filtration Nalgene de 500mL; on peut ainsi aspirer le liquide chaque fois sans avoir à le

137

manipuler (contenant le GTP radioactif non-incorporé, il est lui aussi très radioactif)!

- Après trois lavages, les filtres devraient être débarassés du GTP non incorporé. Rincer à l'éthanol et laisser

sécher à l'air. Compter par scintillation.

Activité de l'isotope:

On vient d'obtenir des comptes en CPM. Mais attention! Pour pouvoir comparer ces comptes

avec ceux obtenus lors d'autres préparations, il faut s'assurer de comparer les pommes avec

les pommes!

Pour ce faire, il faut d'abord établir l'activité spécifique exacte de l'isotope utilisé dans la

réaction. Le tube nous dit GTP-32

P, 10uCi/uL, 3000 Ci/mmol avec une date de référence.

L'activité d'un isotope s'éteint avec le temps; il faut en tenir compte dans nos calculs. Pour le 32

P, qui a une demi-vie assez courte de 14 jours, la baisse d'activité est la suivante:

Jours

Jours

0 1 2 3 4

0 1.000 0.953 0.906 0.865 0.824

5 0.785 0.748 0.712 0.678 0.646

10 0.616 0.587 0.559 0.532 0.507

15 0.483 0.460 0.436 0.418 0.396

20 0.379 0.361 0.344 0.328 0.312

Il est préférable de ne pas utiliser un isotope trop vieux. En fait, la plupart des fournisseurs

nous les livrent avant la date de référence (qui correspond au jour 0 sur le tableau ci-haut). À

la date de référence, l'activité spécifique par volume est réellement de 10 uCi/uL.

Si on utilise l'isotope avant la date de référence, 3 jours plus tôt par exemple, on aura une

activité spécifique réelle supérieure à 10 uCi/uL. En fait, si on utilise le tableau ci-haut, on

établira que l'activité spécifique dans trois jours d'ici, à la date de référence, équivaudra à

0.865 de l'activité réelle d'aujourd'hui. Une simple règle de trois nous apprendra alors que

l'activité de notre isotope est aujourd'hui de

10 uCi/uL divisé par 0,865 = 11.56 uCi/uL.

Nous avons mis 6 uL de ce pastis dans notre mélange réactionnel; cela correspond à 69,36

uCi.

138

Activité spécifique du GTP dans notre mélange réactionnel:

Nous venons d'établir de façon précise l'activité spécifique de notre isotope; cependant, il ne

faut pas oublier que la majeure partie du GTP dans notre réaction n'est pas radioactive

(regardez la liste des sels dans le mélange réactionnel: nous y avons mis 1 mM de GTP). Le

GTP radioactif sera donc dilué par le GTP froid, et l'activité spécifique du GTP total dans

notre réaction sera donc moindre que celle trouvée dans notre pot de GTP radioactif (et

heureusement, sinon nous brillerions dans le noir).

L'activité spécifique du GTP dans le mélange réactionnel correspond à l'activité totale du

GTP divisé par la quantité totale de GTP.

L'activité totale, nous l'avons calculée à l'étape précédente, est de 69,36 uCi. La concentration

de GTP dans notre tampon 2X (dont nous avons préparé 3 mL ci-haut) est de 1 mM; cela

signifie 3 micromoles dans 3 mililitres. Il y a donc 3 micromoles de GTP dans notre mélange

réactionnel 2X.

L'activité spécifique du GTP dans le mélange réactionnel est de 69,36 uCi divisé par 3

micromoles, ou 23,12 Ci/mol.

À ce point, il faut préciser deux choses. D'abord, nous parlons ici de l'activité spécifique du

GTP, pas de celle du mélange réactionnel. Il n'est donc pas important que le mélange soit un

stock 2X, puisque le GTP froid sera dilué en même temps que le chaud; il y aura donc

toujours autant de froid que de chaud, proportionnellement, et l'activité spécifique du GTP ne

changera pas.

Ensuite, vous noterez que je n'ai pas considéré l'apport de l'isotope radioactif à la quantité

totale de GTP: c'est que la quantité de GTP froid est si grande par rapport à celle du GTP

chaud que cette dernière devient négligeable. (Mais si vous tenez vraiment à le savoir, petits

curieux, en ajoutant la quantité de GTP chaud à celle du froid on obtient 3,00000002

micromoles au lieu de 3 micromoles).

Tous les CPMs ne sont pas nés égaux.

Mais nous ne sommes pas encore sortis de l'auberge! Les comptes que nous ont donnés le

compteur à scintillation sont des cpm, ou comptes par minute. Chaque compte est

l'enregistrement, par le compteur, d'un évènement de désintégration d'une particule

radioactive. Cependant, un compteur ne peut pas enregistrer toutes les désintégrations. En

plus, il peut arriver que son efficacité baisse avec le temps. Et puis tous les compteurs ne sont

pas aussi bons les uns que les autres. À cause de tout cela, le cpm n'est pas une valeur très

utile pour définir l'unité, car cette dernière ne serait alors utilisable qu'en utilisant toujours le

même compteur. On cherchera plutôt à établir à combien de désintégrations par minute

(dpm) nos cpm correspondent. Et c'est justement pour cela qu'un compteur est d'ordinaire

accompagné de ses fioles à calibration.

Ces fioles ont été remplies à une date précise (marquée sur la fiole) d'une quantité donnée

d'un isotope radioactif de longue demi-vie. L'étiquette de la fiole vous indique exactement le

139

nombre de dpm qu'on pouvait y enregistrer à la date de référence.

En utilisant un tableau comme celui du 32

P ci-haut et la date de référence, on mettre la fiole

dans notre compteur et déterminer quelle est son efficacité aujourd'hui. De façon générale, un

bon compteur enregistre environ 1 cpm par 2 dpm.

Supposons que ce soit le cas chez nous. Mettons que notre expérience ait donné 10 000 cpm.

10 000 cpm équivaudra à 20 000 dpm. On transforme ensuite les dpm en Ci selon le rapport

2,22 x 1012

dpm = 1 Ci

et 20 000 dpm= 9 x 10-9

Ci

Comme notre activité spécifique pour le GTP est de 23,12 Ci/mol, notre polymérase a donc

incorporé

9 x 10-9

Ci / 23,12 Ci/mol = 3,9 x 10-10

mol ou 0,39 nmol.

Définition de l'unité:

Nous savons combien de polymérase purifiée nous avons mis dans chaque réaction, et grâce à

notre gymnastique arithmétique nous savons aussi quelle est l'activité spécifique du GTP

présent dans la réaction. Nous pouvons maintenant définir avec précision notre unité

d'enzyme comme étant "la quantité de polymérase requise pour incorporer 1 nanomole de

GTP en ARN pendant une réaction de 20 minutes à T/P".

Nous avions 20 uL de polymérase dans notre mélange réactionnel. Nous n'avons compté que

45 uL sur 100, ce qui correspond à 9 uL d'enzyme. Ces 9uL d'enzyme ont incorporé 0,39

nmol de GTP dans les conditions décrites. Pour incorporer 1 nmol de GTP, on aurait eu

besoin de 23 uL d'enzyme. Notre enzyme a donc une concentration de 1 unité / 23 uL, ou de

0,043u/uL. (Comme ce chiffre est bas, on peut aussi l'écrire 43 unités/mL, ça paraît mieux)!

Cette unité a l'avantage de permettre de comparer une préparation de polymérase à une autre,

peu importe où et quand celle-ci a été préparée, ni sur quel compteur à scintillation on l'a

évaluée.

5.3.2.7 Essais d'activité non-enzymatique

Il peut arriver (et même il arrive fréquemment) que l'activité que nous cherchions ne soit pas

enzymatique. C'est le cas, par exemple, de la recherche de protéines se liant à l'ADN. De

telles protéines peuvent être des enzymes, mais ce n'est pas un pré-requis; de plus, leur liaison

à l'ADN n'est pas un processus enzymatique.

Nous verrons dans un chapitre subséquent différentes techniques d'interaction ADN-

protéines; pour le moment, mentionnons qu'il est possible d'utiliser de telles techniques pour

suivre la présence et la spécificité d'une protéine pendant sa purification.

140

Les essais les plus simples pour une protéine liant l'ADN sont la migration retardée EMSA,

pour electromobility shift assay) et l'empreinte à la DNAse (ou footprinting).

5.4 Source de matériel

5.4.1 Généralités

La source de notre matériel peut ne pas être sujette à discussion. Si nous étudions des

protéines dans leur contexte naturel, nous n'avons d'autre choix que d'aller les y chercher.

Cependant, si nous pouvons sans conséquences fâcheuses utiliser une source alternative, nous

devrions sérieusement le considérer si cette alternative se révèle plus disponible, moins

onéreuse ou plus commode à utiliser.

Autant que faire se peut, pour obtenir de grandes quantités de protéines, nous devrions opter

pour une méthode quelconque de surexpression. Alors qu'une protéine dans son contexte

naturel ne représente qu'une fraction infime du pourcentage de la masse totale des protéines,

une protéine surexprimée peut en représenter une fraction impressionante.

La surexpression passe souvent par la construction d'un vecteur d'expression qui contiendra la

séquence codant pour notre protéine: la construction d'un tel vecteur est une occasion en or

pour introduire dans la séquence une étiquette favorisant la purification ou l'identification de

la protéine.

Le tableau qui suit présente les caractéristiques de différentes sources de protéines exprimées

à partir d'un vecteur d'expression.

Bactérie Levure Insecte Mammifère in vitro

Facilité du procédé +/- complexe, lent +/- complexe,

lent complexe, lent

complexe,

lent simple, rapide

Expression rapide rapide assez lente assez lente très rapide

Production élevée élevée moyenne moyenne faible

milieu pas cher pas cher coûteux couteux couteux

protéine sécrétée? souvent, avec aussi corps

d'inclusion souvent parfois rarement

ne s'applique

pas

purification simple simple assez simple assez simple simple

co-expression difficile difficile assez facile difficile facile

141

Interférence avec

l'hôte rarement rarement rarement rarement non

Repliement correct pas toujours pas toujours oui oui pas toujours

N-glycosylation non oui, riche en

mannose simple, pas d'acide

sialique complexe non

O-glycosylation non oui oui oui non

phosphorylation sur Tyr; très rare sur Ser

et Thr oui oui oui non

acétylation non oui oui oui non

acylation du N-

terminus non oui oui oui non

gamma-

carboxylation non non non oui non

5.4.2 Tissu

Travailler avec du tissu comme source de matériel peut être indispensable, mais ce n'est

certes pas commode. Le tissu devra souvent être brisé (à la moulinette ou au blender!) et/ou

traité à la collagénase pour en briser les fibres insolubles et très solides. Un avantage est que

la protéine vient de son milieu naturel; un autre est que le tissu en question est peut être

vendu à prix très avantageux (un boucher vous vendra du thymus, sous le nom de ris de veau,

à coups de kilogrammes).

5.4.3 Cellules en culture

Probablement la source la plus courante de protéines non-exprimées dans un système

recombinant procaryote. Les cellules en culture sont très proches, physiologiquement parlant,

de ce qui se passe dans un être vivant. Elles sont aussi généralement très faciles à traiter pour

faire un extrait cellulaire. Malheureusement, la plupart demandent des conditions de culture

exigeant l'utilisation de réactifs et de nutrients très onéreux; en outre, plusieurs types de

cellules poussent lentement et ne donnent pas beaucoup de matériel.

5.4.4 Les levures

Si nous étudions une protéine qui se retrouve aussi bien chez ces eucaryotes plus primitifs

que dans notre modèle habituel, alors les levures constituent une excellente source de

matériel. Les conditions de culture pour les levures sont élémentaires, elles peuvent donner

énormément de matériel, et elles ont l'avantage (par rapport aux procaryotes) d'être plus près,

142

évolutivement parlant, des eucaryotes supérieurs. On y retrouvera donc des enzymes, comme

les sérine-thréonine kinases, que ne possèdent pas les vecteurs d'expression procaryotes.

Certaines levures, comme Picchia pastoris, peuvent permettre l'expression d'énormes

quantités de matériel.

La levure Saccharomyces cerevisiae, compactée et vivante, peut être achetée chez un

boulanger grossiste en paquets de un kilo ou plus... quand on songe à ce que ça coûte pour

obtenir 100g de cellules en culture, il y a de quoi pleurer.

5.4.5 Les bactéries

Elles restent ce qui se fait de moins cher et de plus puissant en fait de manufactures

moléculaires. Les bactéries peuvent être utilisées pour exprimer des quantités astronomiques

de matériel. Elles ont aussi été le sujet de plusieurs manipulations visant à en faire des

vecteurs d'expression de plus en plus performants (consultez un catalogue Stratagene, par

exemple, pour vous familiariser avec de nombreuses souches bactériennes qu'on a rendues

déficientes en protéases, ou permettant l'expression de protéines toxiques, ou que sais-je

encore).

L'utilisation d'un plasmide bactérien à partir duquel exprimer une protéine a de nombreux

avantages, dont le principal est certes la facilité. Il suffit de cloner la séquence codant pour

notre protéine dans un tel plasmide, en aval d'un promoteur qui fonctionnera dans la bactérie-

hôte choisie, et de transformer la bactérie avec le plasmide ainsi fabriqué. Si le plasmide

porte un gène de sélection (un gène de résistance à un antibiotique, par exemple) en plus

d'une origine de réplication, on n'a pas à se soucier d'intégration ou de quoi que ce soit de ce

genre.

De très nombreux vecteurs de clonage, prévu pour l'expression dans Escherishia coli, sont

disponibles commercialement. Nombre d'entre eux contiennent des sites de clonage sous le

contrôle de polymérases virales et non bactérienne (comme la T7 RNA polymerase), et sont

destinés à être utilisés en conjonction avec des souches modifiées pour exprimer une telle

polymérase -souvent sous le contrôle d'un système activable, comme celui de l'opéron gal.

L'avantage d'une telle approche est que, par exemple, tant que le répresseur gal n'est pas

inactivé par du galactose ou de l'IPTG, la polymérase T7 n'est pas synthétisée... et la protéine

recombinante que nous voulons faire exprimée ne l'est pas non plus. En outre, on peut traiter

nos cultures avec un inhibiteur d'ARN polymérase qui n'agit pas sur la polymérase virale:

ainsi, on sait que suite à l'activation, seule notre protéine est exprimée. Cela réduit le bruit de

fond causé par la présence des protéines endogènes de la bactérie.

143

Voici deux inhibiteurs d'ARN polymérase:

5.4.6 Les virus

Une approche intéressante pour la production de protéines par des cellules eucaryotes est d'en

introduire la séquence codante dans le génome d'un virus, puis d'utiliser celui-ci pour infecter

des cellules.

On utilise beaucoup le baculovirus pour infecter des cellules d'insectes. Ce système est très

efficace. On doit cependant se souvenir de ce que la glycosylation protéique chez les insectes

n'est pas exactement la même que chez les mammifères. Si cet aspect est important pour

nous, il convient de ne pas l'oublier.

Le virus de la vaccine offre un autre système d'expression. Il peut fonctionner dans des

cellules humaines. En plus, l'infection par la vaccine cause l'arrêt de la transcription et de la

traduction des protéines de l'hôte (seules les protéines venant du virus sont exprimées), ce qui

enrichit notre protéine recombinante par rapport au bruit de fond. Le problème ici est que la

vaccine est un virus vivant qui peut se transmettre à l'utilisateur (et la vaccination contre la

petite vérole a été interrompue il y a déjà quelques lustres).

5.4.7 Le homard

À ce que je sache, personne n'utilise encore le homard de façon régulière pour l'expression

des protéines.

5.5.1 Généralités

Quelque soit le type de cellule que nous ayons choisi pour produire la protéine qui nous intéresse, nous devrons persuader cette dernière d’en sortir. À moins que notre candidate ne soit une protéine sécrétée et donc disponible dans le milieu, nous devrons sélectionner une méthode pour briser les cellules et en extraire le contenu.

Plusieurs choix s’offrent à nous, choix qui seront faits en fonction du type de cellule utilisé, des conditions de purification de notre protéine, de l’équipement disponible, et même de nos goûts personnels. Soyons conscients de ce que certaines

144

méthodes d’extraction seront clairement préférables à d’autres même si elles sont plus compliquées; il nous faut donc être souples quant à notre décision finale.

Les principales approches de lyse des cellules sont les suivantes. Un choc osmotique peut suffire à briser la membrane cellulaire de cellules fragiles. Ce choc peut être assisté par un léger traitement avec un détergent (ce qui permet aussi d’aider à maintenir les protéines en solution). Une certaine action mécanique peut aussi être ajoutée au processus: un homogénéisateur à piston permet de briser la plupart des cellules de mammifères.

Pour les cellules de plantes, de levures ou les bactéries, toute approche "douce" devra tenir compte de la présence d’une paroi cellulaire très résistante; les protoplastes de telles cellules seront préparés en traitant ces dernières avec des enzymes (telle la lyticase) qui détruiront la paroi sans briser la membrane plasmique.

Finalement, dans tous les cas, une méthode brutale peut aussi être utilisée. Le traitement aux ultrasons, une lyse mécanique utilisant des billes de verre ou une presse Aminco-French, comme les cycles de congélation/décongélation, sont tous des moyens envisageables.

5.5.2 Tampon

L’extraction s’effectuera dans une solution tampon, dans laquelle les cellules seront resuspendues après une centrifugation visant à les concentrer. À cette étape, notre protéine est fort probablement en concentration infime par rapport à toutes les autres protéines cellulaires; nous mettrons les chances de notre côté en limitant toute dilution supplémentaire. On cherchera autant que possible à maintenir une concentration élevée dès les premières étapes.

Le tampon de lyse répondra à certaines exigences expérimentales. Il devrait avoir un fort pouvoir tampon, car le contenu des cellules peut être à un pH inapproprié. On ne veut pas, par exemple, que les enzymes lysosomiques puissent se retrouver tout d’un coup libérés de leur enveloppe et dans un milieu à pH acide, conditions dans lesquelles ils auraient tout loisir de détruire les autres protéines cellulaires.

Rappelons-nous que le pouvoir tampon d’une substance est plus élevée dans une région de pH proche de son pKa; voici les pKa de certains tampons populaires.

Bis-TRIS 6,46

PIPES 6,76

MOPS 7,20

TES 7,40

HEPES 7,48

Tris 8,06

Glycine 9,78

145

Le HEPES (pour la chromatographie d’échange de cations) et le Tris (pour l’échange d’anions) sont ceux que vous rencontrerez le plus souvent en purification de protéines. Méfiez-vous des solutions "tampon" qui ont un pH très éloigné du pKa; à plus de deux ordres de grandeur en plus ou en moins que le pKa, ce ne sont sûrement pas de très bons tampons.

Alors que l’intérieur des cellules est un environnement réducteur (à cause entre autres de toute cette glutathione), l’atmosphère dans laquelle nous vivons est au contraire oxydante (elle est riche en oxygène). Il y a gros à parier que notre protéine devra être protégée d’une oxydation excessive : c’est pourquoi un agent réducteur comme la glutathione, l’acide ascorbique, le beta-mercaptoethanol ou le dithiothreitol (DTT) pourra être ajouté au tampon. Ne vous en faites pas trop pour les ponts disulfures retrouvés à l'intérieur des protéines globulaires: ils devraient être bien à l'abri des conditions externes.

On retrouve souvent du glycérol dans la composition des tampons. Il stabilise les interactions protéine-protéine.

Faisons face à cette dure réalité : notre protéine a beaucoup d’ennemis. La cellule même d’où elle provient est remplie de protéases qui ne demandent pas mieux que d’en faire une bouchée. En brisant les lysosomes (particulèrement si nos cellules de départ ont une forte activité catabolique, comme les cellules du foie; ou si ce sont des cellules de plantes avec des vacuoles riches en protéases) nous avons libéré une horde de protéases féroces dans le même tampon de lyse que notre protéine. La solution? Tenir le pH élevé (entre 7 et 8), garder la soupe au frais (4°C) et ajouter des inhibiteurs de protéases à la solution.

Voici quelques-uns de ces inhibiteurs :

Inhibiteurs Cible

PMSF Toutes les sérine protéases (trypsine, thrombine,

chymotrypsine, papaine, etc).

AEBSF Toutes les sérine protéases (trypsine, thrombine,

chymotrypsine, papaine, etc). Plus soluble et moins

toxique que son prédécesseur, le PMSF.

EDTA et EGTA métalloprotéases (métal comme cofacteur)

Benzamidine sérine protéases

Pepstatin A protéases aspartiques comme la cathepsine D, la

rénine, la pepsine et les protéases d'HIV.

Leupeptin sérine- (trypsine, plasmine, kallikréine porcine) et

cystéine- protéases (papaine, cathepsine B). N'inhibe

pas la thrombine ni la chymotrypsine.

Aprotinin sérine protéases, mais pas la thrombine ou le facteur

X.

146

Chymostatin sérine protéases avec une spécificité de type

chymotrypsine (chymotrypsine, chymases, cathepsine

G et des cystéine protéases comme les cathepsines B,

H et L.

Antipain Inhibe la papaine, la trypsine et la plasmine jusqu'à un

certain point. Plus spécifique pour la trypsine et la

papaine que ne l'est la leupeptine.

Notez que l’acétylcholine estérase est une sérine protéase; la bungarotoxine du cobra pourrait donc être utilisée comme agent protecteur de votre protéine. Si vous cherchez un animal familier dans le labo, optez donc pour un cobra. Il s’occupera aussi des souris qui s’échappent de leur cage.

Plusieurs compagnies offrent un catalogue très complet d’inhibiteurs de protéases, de même que des cocktails déjà mélangés.

5.5.4 Techniques d’extraction

Si du tissu entier est choisi comme matériel, surtout s’il est riche en tissu conjonctif, il faudra d’abord libérer un maximum de cellules. Un blender de cuisine sera un outil fort utile pour ce faire, malgré son origine infâme pour les compagnies d’outillage de laboratoire. On utilisera aussi un enzyme comme la collagénase pour briser les fibres de collagène empêtrant les cellules.

5.5.4.1 Choc osmotique

Le choc osmotique permet de briser certaines cellules fragiles avec un minimum de dommages. Les cellules sont incubées dans une solution hypo-osmotique. Cherchant à rétablir l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par causer une rupture de la membrane plasmique. On peut donner un coup de pouce à la technique avec un peu de détergent (NP-40, LDAO, triton X-100) et avec un soutien mécanique (quelques coups de piston dans un homogénéisateur de type Dounce). Une telle approche permet de récupérer des noyaux presque intacts une fois séparés des débris de la membrane plasmique.

Il est possible de lyser les membranes plasmiques sans briser les noyaux. La lyse cellulaire doit être suivie par de fréquentes visites aux microscope. La lyse des noyaux, si elle arrive accidentellement, se traduira par une soudaine augmentation de la viscosité de la solution: c'est la chromatine qui est libérée qui en la responsable.

Soyons francs : ce genre de technique relève de l’art autant que de la science et il n’y a rien de tel que la pratique répétée pour que l’expérimentateur en découvre toutes les nuances.

147

5.5.4.2 Homogénéisateur de type Dounce

Cet appareil ressemble à une éprouvette (aux parois épaisses) dans laquelle s’enfonce un piston

serré. Le passage des cellules dans l’espace extrêmement exigu entre le piston et la paroi interne du

tube cause leur bris, un peu comme ce qui nous arriverait si nous étions accroché à une porte de

métro quand il s’engouffre dans un tunnel. Sproutch.

5.5.4.3 Homogénéisateur de type Potter-Elvehjem

Le "potter" ressemble à un Dounce motorisé; son piston a souvent une tête de teflon et tourne dans le cylindre contenant les cellules resuspendues.

5.5.4.4 La presse Aminco- French

Ne vous laissez pas abuser par son sobriquet anglais de French press : cet appareil n’est pas français, il a été mis au point par un certain Dr. French (un nom d’inventeur plus facile à porter, avouons-le, que Poubelle ou Crapper). L’appareil vise lui aussi à forcer les cellules à passer dans un espace plus petit qu’elles, ce qui déchire leur membrane (et réduit la plupart de leurs structures en marmelade). Il consiste en un cyclindre creux en métal, cylindre dans lequel s’enfonce un piston de métal nanti de plusieurs o-rings d’un caoutchouc très solide. À la base du cyclindre, une petite valve est installée; celle-ci peut être obstruée par une petite bille en teflon.

La suspension de cellules est versée dans le cyclindre. Le piston est installé, obstruant le trou,

et une puissante vis sans fin commence à l’enfoncer dans le cylindre (avec un bruit assez

inquiétant il faut bien l’admettre). Comme il n’y a que peu d’air dans le cyclindre et qu’un

liquide est à toute fin pratique incompressible, l’enfoncement du piston fait très rapidement

grimper la pression sur les parois du cylindre. Quand on ouvre légèrement la valve, la

148

suspension de cellules est éjectée comme de l’eau qu’on fait passer entre ses dents et les

cellules sont déchiquetées. Plus la pression est haute dans le cylindre, plus totale est la lyse.

5.5.4.5 La bombe à disruption

Elle consiste en une chambre pressurisée dans laquelle les cellules sont traitées avec de l'azote à haute pression. La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides. On libère alors la pression tout d'un coup; l'azote en solution reprend son état gazeux, forme des bulles à l'intérieur des cellules et les fait éclater.

C'est un problème similaire qui attend les plongeurs sous-marins qui remontent sans avoir respecté leurs paliers de décompression.

5.5.4.6 Les billes de verre

L’appareil utilisé pour cette technique ressemble à un blender (et un coup parti dans les anglicismes, pourquoi ne pas aller jusqu'au bout... on appelle ça un bead beater), à ceci près qu’il est beaucoup plus petit et ne contient pas de lames. Son contenant amovible est rempli de petites billes de verre sur lesquelles on verse la suspension de cellules. La suspension se répartit entre les billes. Il est important de remplir complètement le contenant et de ne pas y laisser d’air pour éviter de faire de la mousse et d’oxyder les protéines. Le tout est alors scellé et on lance la machine, qui fait furieusement tourbilloner les billes de verre dont l’action abrasive a tôt fait de réduire les cellules en charpie.

Séparer les billes du lysat est très facile parce que les billes coulent au fond dès que l'agitation cesse.

On doit prendre soin de garder le tout au frais; en fait le contenant est souvent nanti d’une chambre où on installe de la glace. Le mouvement des billes génère en effet beaucoup de chaleur.

149

5.5.4.7 La sonication

Elle consiste en la destruction des cellules par les ultrasons, exactement comme le faisait l’invention du professeur dans "L’affaire Tournesol" de Hergé. Ici, une tige de métal (le "sonicateur") à l’extrémité très fine est introduite dans la suspension de cellules et induite à vibrer violemment, émettant un bruit fort déplaisant même pour l’utilisateur portant ses cache-oreilles obligatoires. Les vibrations sont des ondes de pression ultrasoniques qui causent la croissance de bulles par un phénomène appelé "cavitation". Ces bulles sont soumises à un grand stress par les ondes ultrasoniques et peuvent subitement grandir, se contracter ou même imploser. Une telle implosion est accompagnée d'une très haute augmentation locale de la pression et de la température. Quel genre d'augmentation? Et bien une microbulle qui implose ainsi peut voir sa température grimper à 5000°C et sa pression atteindre plusieurs centaines d'atmosphère. Comment les microbulles se forment-elles? Une analogie possible est celle d'un attache-trombone qu'on tortille. Il est fait de métal, mais en le pliant et le dépliant rapidement vous pouvez faire augmenter sa chaleur, "fatiguer" les liens moléculaires qui assurent sa cohésion locale et le briser. C'est la même chose qui arrive aux molécules d'eau quand un sonicateur les fait vibrer. Les vibrations ultrasoniques réussissent à briser les ponts hydrogènes qui assurent l'état liquide de l'eau, ce qui les convertit en gaz. Il s'agit en quelques sorte d'une ébullition à froid, effectuée en agitant les molécules d'eau. Mais comment maintenir de l'eau à l'état gazeux dans un liquide froid? Assurément cela ne peut pas durer bien longtemps et le gaz se condense. Or voilà: le gas qui se condense perd du volume et laisse derrière lui un espace vide (une cavité, d'où le nom de "cavitation"). L'eau liquide se précipite dans l'espace vide pour le remplir, et les molécules d'eau liquides entrent en collision au coeur de la cavité. L'onde de choc de cette collision s'étend alors dans le voisinage comme les cercles concentriques générés par un caillou lancé dans une mare. Et l'addition de toutes ces ondes de choc peut pulvériser les cellules, comme le ferait un très puissant ouragan qui tomberait sur notre maison à l'improviste. Le hic avec le sonicateur est qu'il génère beaucoup de chaleur dans le matériel biologique. L'utilisateur a tout intérêt à garder le tube dans lequel a lieu la sonication dans un bac à glace.

150

5.5.4.8 Enzymes lytiques

Avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir compte de la paroi cellulaire qui protège la membrane plasmique. Si on n’opte pas pour une méthode mécanique et violente d’extraction, il faudra d’abord détruire cette paroi avant de s’en prendre au reste de la cellule.

Différents enzymes comme le lysozyme (du blanc d'oeuf de poule, par exemple) ou la lyticase de S.aureus sont disponibles pour s’occuper de cette tâche; il suffit de choisir le plus approprié.

5.5.4.9 Élimination précoce de ce qui n'est pas utile

La cellule contient une très grande quantité de protéines, parmi lesquelles celle qui nous intéresse est fort probablement très minoritaire. Si possible, il sera donc tout à notre avantage de nous débarasser le plus vite possible de la majorité des protéines qui ne nous intéressent pas.

De nombreuses protéines sont concentrées dans une région limitée de la cellule : facteurs de transcription et histones dans le noyau, par exemple; protéines mitochondriales dans les mitochondries, etc. Plusieurs protocoles existent pour isoler ces organelles les unes des autres par centrifugation. Une extraction douce des organelles suivie de leur isolation nous donnera une très grande longueur d’avance pour la suite de la purification.

Un exemple de séparation des

composantes cellulaires par

centrifugation différentielle.

Certaines organelles de la cellule

sont plus denses que d'autres et plus

à même de sédimenter à basse

vitesse de centrifugation.

Si notre protéine est contenue dans

une organelle particulière, nous

pouvons gagner beaucoup de temps

et d'effort en séparant d,abord celle-

ci du reste des composantes

cellulaires; c'est particulièrement le

cas des noyaux.

Les protéines nucléaires sont presque toujours préparées à partir de noyaux et pas de cellules entières. Une bonne façon de séparer les noyaux du reste est de

151

déposer le lysat cellulaire (avec les noyaux intacts) sur un coussin de sucrose. La densité du sucrose ne laisse passer que les particules denses comme les noyaux, les débarassant de la majeure partie du reste du matériel cellulaire.

La compagnie Caprion, de Montréal, s’est fait une spécialité de purifier les organelles. Une visite sur son site web www.caprion.com est fort instructive.

5.5.4.10 La chromatine

Selon la technique utilisée, nous nous retrouverons avec un extrait protéique brut contenant de l’ADN plus ou moins intact et associé à un grand nombre d’histones. Plus cette chromatine est intacte, et plus notre soupe est visqueuse. Une extraction à la presse Aminco-French ou au sonicateur va pulvériser la chromatine et n'en laisser que des débris; une extraction de protéines ne lysant pas les noyaux laissera la majeure partie de la chromatine derrière nous.

On peut séparer la plupart des protéines de la chromatine en changeant la force ionique de la solution (ce qui se passe lors d'une précipitation au sulfate d’ammonium, par exemple). L'histone H1 va décrocher à partir de 100 mM d'ammonium, ce qui aide la solubilisation de l'ADN; les histones de l'octamère décrochent entre 400mM et 700mM d'ammonium). On peut même utiliser une simple ultracentrifugation après la lyse nucléaire pour se débarasser de la chromatine (la chromatine intacte est un énorme réseau très visqueux qui s'écrasera dans le culot, alors que la plus grande partie des protéines solubles resteront dans le surnageant).

Mieux vaut se débarasser de l’ADN dès que possible.

On peut opter pour un traitement aux nucléases (si on ne craint pas de traîner des nucléases derrière nous) ou encore choisir comme première étape de purification chromatographique un passage sur une résine de DEAE, chargée positivement, qui retiendra fortement l’ADN chargé négativement. Ce serait en tout cas mon choix.

5.5.4.11 Protéines membranaires

Ces protéines ne se promènent pas librement en milieu aqueux puisqu’elles comptent au moins un domaine transmembranaire hydrophobe. Elles sont donc assez insolubles et difficiles à préparer. Leur purification requiert l’utilisation de détergents.

5.5.4.12 Corps d’inclusion

La même chose est vraie de protéines exprimés chez E.coli, surexprimées ou non, et qui se retrouvent dans des agrégats insolubles appelés corps d’inclusion. Notons au passage que la solubilité d’une protéine surexprimée chez E. coli peut varier selon les étiquettes qu’on y ajoute par ingénierie génétique; ainsi, il est possible qu’une même protéine soit insoluble avec une étiquette 6-histidines et soluble avec une étiquette GST.

Les corps d’inclusion peuvent être récupérés par centrifugatrion. Si nous ne craignons pas de travailler avec du matériel qui a précipité et a été resuspendu,

152

nous pouvons alors entreprendre de resolubiliser les protéines qu’ils contiennent. Des agents vigoureux comme la guanidine-HCl, le SDS ou l’urée 8M sont utilisés pour resuspendre les agrégats; ils doivent ensuite être éliminés pour permettre la renaturation.

Le problème au point de vue expérimental est de jongler entre des conditions assez dénaturantes pour prévenir l'aggrégation et la précipitation, mais aussi assez douces pour ne pas systématiquement dénaturer toutes nos protéines. Chaque protéine demandera un protocole optimisé.

Voici le protocole du Protein Purification and Expression Facility de l'EMBL, à Heidelberg en Allemagne:

Tampon de lavage

50 mM Tris-HCl pH 7.5

50 à 200 mM NaCl

Tampon d'extraction

50 mM Tris-HCl pH 7.5

8 M urea

1 mM DTT

1 mM PMSF* * Le PMSF est instable en solution aqueuse et est ajouté au

tampon au moment décrit dans le protocole.

Procédure

1. Centrifuger le lysat cellulaire à 4°C pour 20 min. à 30 000 g (16 000 rpm dans un rotor SS34 de Sorvall ou JA-20 de Beckman).

2. Resuspendre le culot dans 10 mL de tampon de lavage contenant 1% triton X-100 et 1M urée par gramme de culot de cellules. Incuber à T/P pour 5 minutes.

3. Centrifuger le lysat cellulaire comme à l'étape (1).

4. Répéter 3 fois.

5. Resuspendre le culot dans 10 mL de tampon de lavage et centrifuger la suspension à 4°C pour 30 min. à 45 000 rpm dans un rotor 45Ti de Beckman.

6. Resuspendre les corps d'inclusion dans le tampon d'extraction. Utiliser assez de tampon pour obtenir une concentration finale en protéine de 1 mg/mL. Ajouter 10 uL PMSF (100 mM) par mL de solution. Incuber une heure à T/P.

7. Diluer la solution dix fois avec le tampon d'extraction et dialyser toute la nuit contre 100 volumess de solution de lavage.

8. Centrifuger le dialysat à 4°C pour 30 min. à 45 000 rpm dans un 45Ti.

153

En voici un autre, de Laurent Vuillard et Alasdair Freeman de l'université de St

Andrews (Royaume Uni).

Solubilisation des protéines des corps d'inclusions

- Resuspendre le culot d'un litre de culture batérienne dans 20 mL de

50mM HEPES-NaOH pH7.5

0.5M NaCl

1mM PMSF

5mM DTT

avec 0,35mg/mL de lysozyme

Incuber 30 min. à 20°C.

- Ajouter du triton X-100 à une concentration de 1% (vol./vol.)

- Soniquer par coups de 30 secondes jusqu,à ce que la solution s'éclaircisse.

- Traiter l'extrait à la DNAse I (20 mg/L) pour 60 min. à 37°C

- Sédimenter les corps d'inclusion par centrifugation à 30 000g, 30 min., 4°C.

- Laver le culot (les corps d'inclusion) deux fois au TBS ou au PBS contenant 1% Triton X-100, et centrifuger à 30 000g, 30 min., 4°C

- Solubiliser le culot dans 2 mL de

50mM HEPES-NaOH pH7.5,

6M guanidine HCl,

25mM DTT

et laisser 1h at 4C.

- Le matériel insoluble est retiré par centrifugation à 100 000g pour 10 minutes. Cette étape est

particulièrement importante pour enlever les aggrégats qui pourraient servir de noyaux de précipitation

pendant le relpiement des protéines resolubilisées.

- Évaluer la concentration en protéines et ajuster à 1mg/mL en utilisant

50mM HEPES-NaOH pH7.5,

6M guanidine HCl,

25mM DTT

Repliement

Les protéines resolubilisées sont diluées aussi vite que possible 1 : 10 dans le tampon de repliement à 4°C:

50mM HEPES pH7.5,

0.2M NaCl,

1mM DTT,

1M NDSB256 (Phorbol 12,13 diacetate).

La concentration finale en protéines ne devrait pas excéder 0,05 à 0,1 mg/ml. Le mélange doit être fait

rapidement. Pour de très petits volumes, on peut directement déposer la suspension protéique dans la

solution de repliement en vortexant. Pour des volumes plus grands, plutôt qu'un vortex, utiliser un

agitateur magnétique vigoureux. Agiter 2 minutes après l'addition. Incuber 1 heure à 4°C. Le reste du

NDSB et de la guanidine peuvent être retirés par dialyse.

Notes

154

- Les paramètres-clés de ce protocole sont la concentration protéique, celle du guanidium résiduel et la

température. Optimiser au besoin.

- Les NDSB (Non-detergent sulfobetaines) sont des agents aidant le repliement des protéines. Ce sont des

zwitterions qui contiennent un groupement sulfobetaine hydrophilique et une courte chaîne

hydrophobique; ils ne peuvent cependant pas former de micelles. Ils aident à réduire l'aggrégation et

facilitent le repliement des protéines dénaturées (on présume que c'est en interagissant avec les

groupements hydrophobes des protéines et en masquant ceux-ci à des groupes similaires sur d'autres

protéines).

Le NDSB 256 est d'habitude un peu plus efficace que le NDSB 201 mais ce dernier est beaucoup moins

cher.

5.6 Séparation et enrichissement

Après avoir choisi une source de matériel et sélectionné une technique d'extraction, vous

voici arrivé à l'étape de la séparation des protéines et de l'enrichissement de celle que vous

voulez purifier.

De façon générale, les premières étapes d'une séparation protéique sont des techniques peu

coûteuses et à capacité élevée. Les techniques demandant des réactifs plus onéreux (des

anticorps, par exemple) sont d'habitude gardées pour plus tard, quand il y a moins de matériel

total et une plus grande proportion relative du matériel qui nous intéresse.

5.6.1 Précipitation différentielle au sulfate d'ammonium

Cette technique utilise la solubilité différentielle des protéines. Comme chaque protéine est

plus ou moins soluble en solution selon sa composition, on peut en séparer plusieurs en

fonction de leur tendance à précipiter plus ou moins vite quand on change la force ionique de

la solution qui les contient.

Une force ionique élevée peut avoir deux effets sur la solubilité: neutraliser certaines charges

ioniques requises en surface pour le maintien de la solubilité, et compétitionner avec les

protéines pour les molécules d'eau disponibles en solution. Quand la concentration en sel est

assez élevée pour priver une protéine des molécules d'eau qui l'hydratent, celle-ci sort de

solution et précipite. C'est ce qu'on appelle le phénomène de salting-out.

Les protéines seront éventuellement toutes précipitées par une teneur en sel assez élevée,

mais certaines d'entre elles seront remarquablement résistantes alors que d'autres

précipiteront très facilement. C'est cette différence de solubilité qui permet de les séparer.

La série de Hofmeister ci-dessous décrit les effets relatifs de différents ions sur la

précipitation des protéines ou la promotion de leurs interactions hydrophobiques. (L'anion

phosphate et le cation ammonium sont est les plus efficaces pour précipiter les protéines;

l'anion chlorate et le cation Ca2+

sont au contraire les plus efficaces pour les remettre en

solution. Notez que ce ne sont pas toutes les combinaisons de ces ions qui donnent un sel

soluble).

155

précipitation

(salting out)

PO43-

> SO42-

> COO- > Cl

- > Br

- > NO3

- > ClO4

- chaotropique

(salting in) NH4+ > Rb

+ > K

+ > Na

+ > Cs

+ > Li

+ > Mg

2+ > Ca

2+

Le sel le plus utilisé en laboratoire pour précipiter les protéines est le sulfate d'ammonium

(NH4)2SO4. Sa solubilisation n'affecte pas la température de la solution (au contraire du NaCl,

dont la solubilisation exothermique aide à faire fondre la glace dans les rues l'hiver), il ne

dénature pas les protéines et ne coûte pas cher.

Le tableau ci-dessous donne les quantités de (NH4)2SO4 requises pour atteindre le niveau de

saturation à 0°C. (Le tableau indique aussi combien de sel ajouter à une solution qui en

contient déjà).

La procédure suivie d'habitude quand on travaille en aveugle est de préparer quelques

précipitats avec des concentrations croissantes de sulfate (qu'on peut ajouter directement à la

solution protéique):

(1) Ajustement à 20% sulfate Centrifugation et récupération du culot

(fraction C20)

156

(2) Ajustement du surnageant

à 40% sulfate

Centrifugation et récupération du culot

(fraction C40)

(3) Ajustement du surnageant

à 60% sulfate

Centrifugation et récupération du culot

(fraction C60)

(4) Ajustement du surnageant

à 80% sulfate

Centrifugation et récupération du culot

(fraction C80)

(5) Ajustement du surnageant

à 100% sulfate

Centrifugation et récupération du culot

(fraction C100)

Notre protéine se trouvera dans une des fractions C20, C40, C60, C80 ou C100.

Bien sûr, si on sait à l'avance comment notre protéine réagit au salting-out, on peut viser avec

plus de précision. Si elle précipite à environ 35% sulfate, on fera une première coupure avec

30% sulfate, une deuxième à 40% sulfate, et une dernière (juste au cas) à une teneur en sel

plus élevée. Mais nous saurons déjà que notre protéine se trouve dans la fraction C40, et

qu'elle est débarassée de tout ce qui précipite en-deçà de 30% sulfate et au-delà de 40%.

Les culots de protéines peuvent alors être resuspendus. Ils contiendront cependant encore une

grande quantité de sulfate dont il faut se débarasser.

5.6.2 Dialyse

La méthode la plus utilisée pour changer la concentration en sels d'une solution protéique est

la dialyse. Dans une dialyse, les protéines dans une concentration de sels donnée sont

séparées d'une solution à la concentration en sels différente par une membrane poreuse. Les

pores de cette membrane peuvent avoir différentes tailles; certaines membranes ne laisseront

passer que des ions alors que d'autres laisseront même passer de petites protéines (jusqu'à des

poids moléculaires de 50 000 Da).

Les sels auront tendance à équilibrer leur concentration de part et d'autre de la membrane. En

utilisant un volume de tampon de dialyse beaucoup plus grand que celui de la solution

protéique, on changera rapidement la teneur en sels de celle-ci en la même que celle du

tampon de dialyse.

Afin d'accélérer le processus, il vaut mieux changer souvent le tampon de dialyse pour du

tampon neuf plutôt que d'utiliser une seule quantité (même grande) de tampon. Voyez plutôt:

puisque C1V1=C2V2, la dialyse de 10mL de solution protéique à 500mM dans 1000mL de

tampon de dialyse à 100mM donnera une concentration de 104 mM à l'équilibre.

(500mM x 10 mL) + (100mM x 1000mL) = 1010 mL x 104mM

157

On aurait pu atteindre la même concentration en dialysant dans un plus petit volume et en

changeant le tampon une fois:

dialysat protéique tampon dialyse équilibre

1) (500mM x 10mL) + (100mM x 100mL) = 110mL x 136 mM

2) (136mM x 10mL) + (100mM x 100mL) = 110mL x 103 mM

La vitesse de dialyse dépend beaucoup de la quantité de matériel à dialyser et de la viscosité

des solutions.

Notez que l'eau sera la première à diffuser: il n'est pas rare de voir un tube de dialyse gonfler

progressivement alors que l'eau y pénètre pour en réduire la concentration en solutés.

Attention aux éclatements.

À l'inverse, on peut utiliser des agents hygroscopiques pour concentrer les protéines dans un

sac à dialyse sans en changer la concentration en sels: il faut alors utiliser un tampon de

dialyse de même composition que le tampon se trouvant dans le tube, mais contenant un

agent comme le polyethylèneglycol (ou PEG, un gros polymère hygroscopique) de taille

supérieure à la porosité de la membrane. Le PEG ne pourra pas entrer dans le tube mais il

attirera l'eau qui s'y trouve hors du tube, concentrant du même coup les protéines.

5.6.3 Filtration sur membrane

Je la mentionne ici parce qu'elle peut être utilisée pour changer la salinité d'une solution de

protéines, mais en fait la filtration sur membrane se prête beaucoup mieux à une étape tardive

de la purification qu'au début des opérations.

On y utilise des membranes avec une porosité permettant à certaines substances de passer

(sels, petites molécules, petites protéines). Ces membranes sont le plus souvent vendues sous

forme d'unités de filtration (vous en avez peut-être déjà rencontrées sous le nom de colonne

Centricon),

qui consistent en un tube dont la partie inférieure est séparée de la partie supérieure par la

membrane. Les protéines sont déposées dans la partie supérieure du tube, et reposent sur la

membrane; le tube est alors centrifugé à basse vitesse pour forcer le liquide et les petites

molécules à traverser cette dernière sous le coup de la gravité. Les protéines, trop grosses, ne

peuvent pas passer et restent dans la partie supérieure; on peut ensuite soit les diluer avec un

nouveau tampon et recentrifuger (c'est une bonne technique de lavage) ou récupérer les

protéines concentrées.

Il faut bien sûr ne pas centrifuger si longtemps que tout le liquide ait traversé la membrane.

158

5.6.4 Sédimentation

Vous trouverez beaucoup d'informations sur les principes de la sédimentation à cette adresse:

http://ntri.tamuk.edu/centrifuge/centrifugation.html

Les protéines ont un coefficient de sédimentation défini par leur taille, leur forme et leur

densité. On peut donc les séparer par ultracentrifugation sur des coussins ou des gradients de

sucrose ou d'autres substances.

Dans une centrifugation zonale, l'échantillon est déposé en une mince bande au sommet d'un

tube contenant un tampon présentant un gradient de densité. Les protéines s'enfonceront et se

sépareront dans le gradient en fonction de leur coefficient de sédimentation (les plus lourdes

et denses coulent plus vite). Comme toutes les protéines finiront par arriver au fond du tube,

il faut arrêter la centrifugation avant, puis séparer chaque "étage" du tube (en fait, on

fractionne le contenu du tube en en retirant des volumes égaux à partir du sommet).

Dans ce type de centrifugation, la densité du matériel à séparer excède celle du matériel du

gradient. C'est ce qui permet aux particules de s'y enfoncer sans s'arrêter en cours de route.

Ce genre de séparation est particulièrement approprié pour la préparation de gros complexes

protéiques qui sédimenteront beaucoup plus vite que leurs composantes individuelles. C'est

une des excellenetes façons d'exploiter à notre profit la taille de telles complexes sans

nécessairement avoir recours à une technique de filtration. Les ARN polymérases eucaryotes

ou les facteurs de transcription complexes comme TFIIH se prêtent particulièrement bien à la

purification par fractionnement sur gradient.

Dans une centrifugation isopycnique, maintenant, le gradient de densité couvre un spectre qui

inclue la densité de toutes les particules à séparer. Le matériel "flottera" alors dans le gradient

à un niveau où sa densité est égale à celle du milieu ambiant.

L'ADN a longtemps été préparé sur des gradients isopycniques de chlorure de césium. On

peut aussi séparer les protéines sur CsCl. (Le CsCl forme spontanément un gradient dans un

tube quand il est centrifugé à haute vitesse pendant 24-48hrs parce que les atomes lourds Cs+

ont tendance à decendre au fond). Comme ce gradient se forme spontanément, les particules à

159

séparer peuvent être mélangées directment au CsCl avant la mise en tube: l'établissement du

gradient de CsCl et la séparation isopycnique des particules se feront en même temps pendant

la centrifugation.

Le Percoll, une substance développée par Amersham Biocsciences, est une suspension de

billes de silice couvertes de polyvynipyrrolidone. Comme les billes ont une taille hétérogène,

le Percoll peut lui aussi spontanément former un gradient quand il est centrifugé assez

longtemps, On s'en sert pour la séparation isopycnique d'organelles cellulaires ou de virus.

Il est possible de préparer une centrifugation isopycnique avec un gradient préparé à l'avance:

il faut alors s'assurer de ce que la partie la plus dense du gradient excède la densité du

matériel que l'on veut voir se stabiliser dans sa migration en fonction de sa densité propre.

On a souvent recours à un type de gradient isopycnique utilisant un gradient discontinu de

sucrose: un coussin à haute teneur en sucrose (mettons 80%) se trouvera dans le fond du tube,

avec un coussin de 50% par dessus, puis un coussin de 25%, puis un coussin de 10%. Les

particules qui traversent un coussin pourraient être arrêtées à la surface du suivant.

Différents types de gradients permettant la séparation de particules en fonction de leur

densité. Une centrifugation isopycnique utilise un tampon avec gradient de densité incluant

les densités de toutes les particules à séparer. Les particules vont donc se stabiliser à un

point du gradient égal èà leur propre densité. En (A), on utilise dans le tampon un agent

comme le CsCl qui forme spontanément un gradient pendant la centrifugation; le matériel à

séparer peut lui être directement mélangé. En (B), on utilise dans le tampon un gradient

préformé (par exemple de sucrose) et le matériel est déposé au sommet. Les particules à

séparer s'enfoncent jusqu'à leur point isopycnique (ou de même densité). En (C), on voit que

le résultat est le même en bout de course. En (D), on prépare un gradient discontinu en

supreposant des coussins de densité différente. Le matériel est déposé en haut et centrifugé.

En (E), on voit que les particules s'enfoncent jusqu'à la frontière d'un coussin dont la densité

excède la leur. La centrifugation zonale utilise un coussin ou un gradient dans lequel les

particules s'enfoncent plus ou moins vite en fonction de leur coefficient de sédimentation.

160

Comme la densité maximale du gradient ne dépasse pas celles des particules, celles-ci

s,enfonceraient toutes jusqu'au fond si on ne les arrêtait pas avant.

5.6.5 Filtration sur gel

Il s'agit ici d'une séparation des protéines selon leur taille utilisant un tamis moléculaire. Une

colonne de chromatographie pour filtration sur gel est remplie d'une résine consistant en

billes creuses et poreuses. La taille des pores de ces billes est telle que certaines protéines

(petites) peuvent entrer et sortir à leur guise; que certaines (plus ou moins grosses) peuvent

essayer d'entrer mais avec plus ou moins de succès, alors que d'autres (trop grosses) ne

peuvent pas entrer du tout et passent tout droit.

Les plus grosses protéines, celles qui passent carrément entre les billes, sortent en premier de

la colonne. Les autres sont retardées par leurs interactions avec les billes; les plus petites

protéines, qui peuvent entrer et sortir à leur guise, sont les dernières à quitter la colonne.

Nom de la résine Capacité de fractionnement (en

Da)

type dextran

Sephadex G-10 700

Sephadex G-25 1 000- 5 000

Sephadex G-75 3 000- 70 000

Sephadex G-200 5 000- 800 000

161

type polyacrylamide

Bio-gel P2 200- 2 000

Bio-gel P6 1 000- 6 000

Bio-gel P-150 15 000- 150 000

Bio-gel P-300 60 000- 400 000

type agarose

Sepharose 2B 2 000 000- 25 000 000

Sepharose 4B 300 000- 3 000 000

Bio-gel A-0,5M 30 000- 500 000

Bio-gel A-15M 30 000- 15 000 000

Bio-gel A-150M 5 000 000- 150 000 000

Cette technique est très efficace mais nécessite une haute concentration et un faible volume

de matériel de départ parce que les protéines ont tendance à s'étaler le long de la colonne, ce

qui réduit la qualité de leur séparation si elle n'y entrent pas relativement toutes en même

temps.

Cette colonne peut aussi être utilisée pour dessaler un échantillon.

La forme d'une colonne de filtration devrait être étroite et longue pour une meilleure

séparation.

La filtration sur gel se fait avec un tampon dont la nature ne change pas pendant la séparation,

à l'inverse de ce qui se passe dans une chromatographie d'échange d'ions. Les protéines

assemblées en complexes macromoléculaires (comme par exemple les ARN polymérases, qui

comptent un grand nombre de sous-unités) ont donc plus de chances de rester assemblées,

puisqu'on n'interfère pas avec les interactions entre les différentes sous-unités.

162

5.6.6 Échange d'ions

Dans une colonne à échange d'ions, les protéines collent par affinité électrostatique à des

groupements chargés de la résine. Une résine portant des groupements positifs est dite

"échangeuse d'anions", parce que des ions négatifs ou les groupements acides d'une protéine

peuvent interagir avec. Une résine portant des groupements négatifs est dite "échangeuse de

cations" parce que ce sont des cations ou les groupements basiques d'une protéine qui

interagissent avec elle.

On fera décoller les protéines d'une telle résine en augmentant progressivement la force

ionique du tampon d'élution, ou en changeant le pH de telle façon que la protéine soit moins

chargée. Un gradient salin permet de séparer les protéines selon leur degré de charge positive

ou négative à un certain pH et est une étape de choix dans une purification.

On peut même effectuer les deux types de chromatographie d'échange d'ions, car une même

protéine aura souvent des charges positives et des charges négatives distribuées de façon

inégale. À l'inverse de ce qui se passe en électrophorèse, ici, ce n'est pas la charge nette de la

protéine qui compte mais la capacité de ses résidus chargés d'interagir avec la résine.

Comme on veut favoriser l'interaction de la protéine avec la résine choisie, on aura avantage

à jouer avec le pH de la solution tampon qui circule dans la colonne. Pour une résine

échangeuse de cations (monoS ou phosphocellulose, par exemple), on voudra optimiser la

charge positive de la protéine et donc travailler à un pH plus bas, histoire de bien former des

groupements -NH3+ et -COOH plutôt que -NH2 et -COO

-. Un tampon HEPES à pH 7,5 serait

approprié. À l'inverse, pour une résine échangeuse d'anions (monoQ ou DEAE), on utilisera

plutôt un tampon basique comme le Tris à pH 8,2, histoire de favoriser la formation de

groupements -COO- et de réduire la présence de groupements NH3

+.

La résine n'a pas à être utilisée en colonne. On peut la mettre au fond d'un bécher et y ajouter

la solution de protéine (ce qui est pratique dans les premières étapes d'une purification si on a

de très grands volumes de matériel). On peut aussi ménager la chèvre et le chou et mettre les

protéines en contact avec la résine dans un bécher ou un tube, effectuer des lavages à faible

force ionique dans le même récipient, puis déposer la résine dans une colonne vide pour

procéder à une élution plus contôlée.

163

Il existe une très grande variété de résines échangeuses d'ions, variant les groupes chargés

comme la nature des supports solides. Des colonnes pré-empaquetées sont aussi disponibles

et sauvent un temps précieux. Le catalogue Amersham Biosciences www.amersham.com

présente un grand inventaire de telles résines et colonnes.

5.6.7 Interactions hydrophobes

En solution, les protéines à caractère hydrophobe cherchent davantage à s'associer entre elles

qu'à s'hydrater avec les molécules d'eau.

Des résines portant des groupements hydrophobiques (cycliques ou aliphatiques) permettent

de retenir de telles protéines sur une colonne. À l'inverse de ce qui se passe sur une colonne

de chromatographie par échange d'ions, une colonne de chromatographie d'interaction

hydrophobe est chargée à haute force ionique (qui favorise les interactions hydrophobes) et

est éluée avec un gradient de sel à la baisse. Grâce à cela, on peut faire passer un échantillon

164

frais élué (avec une haute concentration en sel) d'une colonne d'échange d'ions directement

sur une colonne d'interaction hydrophobe, sans avoir à dialyser ou diluer.

Les résines les plus utilisées pour ce type de chromatographie sont l'octyl- et le phényl-

sépharose.

5.6.8 Hydroxyapatite

L'hydroxyapatite est du phosphate de calcium cristallisé comme nos dents en contiennent.

Cette substance retient les protéines de deux façons: son calcium interagit avec les

groupements acides des protéines alors que son phosphate interagit avec leurs groupements

aminés. L'élution n'est pas ici faite avec un gradient de sel mais plutôt avec un gradient de

phosphate ou de potassium pour compétitionner ces interactions.

5.6.9 Chromatographie d'affinité

Dans une telle technique, on a recours à l'affinité de certaines molécules pour d'autres. On

pourra ainsi fixer des anticorps sur une matrice solide dans une colonne (Protéine A-

sépharose, par exemple) et faire passer notre échantillon sur la colonne pour y attraper les

protéines reconnues par l'anticorps.

On a souvent recours à des colonnes dont la matrice porte des fragments spécifiques d'ADN

pour aller pêcher les protéines liant l'ADN. Le bromure de cyanogène (CNBr) est l'un des

réactifs utilisés pour coupler ainsi une cible à la matrice d'une colonne.

Plusieurs protéines de fusion ont des étiquettes permettant de reconnaître et de fixer des

résines spécialement adaptées. Une telle étiquette est la glutathione-S-transférase, qui permet

165

à la protéine à laquelle elle est fusionnée de se fixer sur une résine de glutathione-sépharose.

La chitin-binding-protein (CBP) fait la même chose pour une résine couplée à de la chitine,

un polymère de N-acétylglucosamine.

Les lectines comme l'agglutinine de germe de blé (WGA, pour wheat germ agglutinin) ont la

très utile capacité de permettre l'adsorption de protéines glycosylées. Le WGA lie le N-

acétylglucosamine; la concanavalin A (Con A) lie le mannose et le glucose

Puisque la chromatographie d'affinité repose sur l'interaction entre deux ou plusieurs

molécules, on devine que seule l'imagination limite ses possibilités de combinaison. Il suffit

de disposer de deux substances qui ont de l'affinité l'une pour l'autre et d'en fixer une sur un

support solide.

Résine Affinité pour...

Calmodulin sepharose 4B ATPases

5' AMP sepharose 4B kinases dépendantes de l'ATP

DNA-agarose ADN polymérases, protéines liant l'ADN

Colonnes d'héparine Lipases, protéines liant l'ADN

Poly(U) sepharose Transcriptase réverse, ARNm

Arginine sepharose 4B Sérine protéases

Lysine sepharose 4B ARNr

166

On retrouve dans le commerce des résines d'affinité déjà faites. En voici quelques unes

vendues par la compagnie Amersham.

On en retrouve d'autres sur le site de la compagnie.

Des résines "pré-activées" et prêtes à recevoir un ligand pour former une nouvelle résine

d'affinité existent aussi.

Résine Groupe à coupler

CNBr-activated Sepharose 4B -NH2

EAH Sepharose 4B -COOH

Activated thiol sepharose 4B -SH

rProtein A sepharose Partie Fab des anticorps

5.6.10 IMAC (immobilized metal affinity chromatography)

Cibacron blue F3G-A enzymes nécéssitant des nucléotides

ConA Sepharose 4B glycoprotéines contenant du -D-mannose, du -

D-glucose et des sucres similaires

Wheat germ Lectin Sepharose glycoprotéines contenant du N-acetyl- -D-

glucosmine

167

Ce type de chromatographie d'affinité fait appel à l'immobilisation, sur une résine, d'un atome

métallique comme le nickel ou le cobalt. Cet atome immobilisé peut établir des liens de

coordination avec certains polypeptides, comme par exemple une chaîne d'histidines.

L'étiquette 6-His est justement ajoutée aux protéines pour que ces dernières soient plus

aisément purifiées par chromatographie d'affinité pour le métal.

Dans la figure ci-dessous, une résine IMAC populaire (nickel- nitriloacetic acid ou nickel-

NTA) utilise un ion de nickel comme site actif. L'ion Ni2+

possède six liens de coordination.

Quatre sont sollicités par le NTA pour l'immobiliser sur la résine; il en reste donc deux pour

interagir avec les atomes d'azote du cycle de la chaîne latérale de deux résidus histidines.

À pH <6, les résidus histidines commenceront à être réduits et ne pourront plus lier le nickel.

On peut donc utiliser une variation de pH pour faire décoller les protéines. Cependant, la

technique d'élution la plus usuelle (plus douce) se fera à l'aide d'un composé qui

compétitionnera avec l'histidine pour le nickel: l'imidazole.

Imidazole, un composé compétitionnant avec l'histidine pour

permettre l'élution de protéines d'une colonne d'affinité pour le

métal immobilisé.

Le nickel peut être chélaté par l'EDTA et l'EGTA, aussi ces composés doivent être utilisés

avec parcimonie (et selon les instructions du fournisseur en résine). Les agents réducteurs

peuvent aussi avoir un effet néfaste et doivent aussi être utilisées selon les instructions du

manufacturier (qui a généralement amplement testé sa résine)!

Comme une étiquette multi-histidines est très petite, facilement clonable à l'extrémité N' ou

C' d'une protéine, qu'elle permet la purification par affinité et peut être reconnue par des

anticorps spécifiques disponibles commercialement, elle est un excellent choix de

modification mineure facilitant la purification d'une protéine recombinante. Son aléa majeur

168

est qu'il existe des protéines contenant naturellement des séquences répétées d'histidines; il

faut donc se débarasser de celles-ci par une autre étape. (une recherche BLAST sur le

protéome de S. cereviasiae révèle 15 protéines avec au moins six histidines d'affilée). Pour de

telles protéines, une colonne IMAC peut servir de colonne d'affinité même sans l'ajout d'une

étiquette.

5.6.11 Système de chromatographie

La figure ci-dessous décrit un système de base de chromatographie (il est inspiré du système

FPLC d'Amersham Biosciences).

Le coeur de ce système est évidemment la colonne. Elle est reliée au reste du système de

façon à ce que le tampon la traverse de haut en bas. Ce tampon provient de réservoirs situés

tout au bout en amont du système. On a ici représenté deux tampons différents (A et B) reliés

chacun à une pompe (A et B), même si bien entendu il est possible de faire fonctionner ce

système avec un seul tampon et une seule pompe. L'avantage d'en avoir deux est qu'on peut

programmer le système pour pomper progressivement plus d'un tampon que de l'autre,

générant ainsi un gradient. (D'ordinaire, les deux tampons ont la même composition sauf pour

la concentration en sel; faire varier la proportion de l'un par rapport à l'autre pendant la

chromatographie génère un gradient de force ionique dans la colonne).

Chaque pompe est reliée au mélangeur, une chambre où s'effectue le mélange des deux

tampons. Le tampon de chromatographie passe ensuite dans le distributeur, qui l'enverra soit

vers la colonne, soit vers une autre destination. C'est aussi dans le distributeur qu'on déposera

l'échantillon à chromatographier; le distributeur le dirige vers la colonne.

En aval de la colonne, on installe d'habitude un conductimètre, qui enregistre la conductivité

du tampon (et donc sa concentration en sel) et une cellule spectrophotométrique qui

enregistre l'absorbance aux UV pour détecter le passage des protéines. L'éluat de la colonne

est ensuite recueilli en petites fractions par un collecteur.

169

La figure ci-dessous nous montre ce à quoi ressemble l'enregistrement de la densité optique

de l'éluat en fonction du temps pendant une chromatographie d'échange d'ions avec un

gradient de sel.

Le conductimètre a enregistré le passage d'une concentrations en ions de plus en plus élevée

avec le temps. Les protéines, elles, décrochent de la colonne en fonction de l'effet qu'a ce

gradient de sel sur leur interaction avec les groupements chargés de la colonne. Les protéines

du pic 1 décrochent avant les protéines du pic 8; c'est donc que leur interaction avec la

colonne était plus faible.

Remarquez que les pics ont des formes différentes. La plupart d'entre eux reflètent sûrement

la présence de plusieurs protéines différentes, surtout si cette chromatographie a été pratiquée

en début de purification. On remarquera aussi que certains pics sont fusionnés: ainsi, le pic 2

court presque à la même place que le pic 3 et lui donne une épaule. On trouve une autre

épaule, beaucoup plus importante, dans le pic 8; cependant, dans ce cas, l'épaule peut

simplement être due à la très grande taille du pic.

5.6.12 HPLC

High performance liquid chromatography: il s'agit d'une technique permettant de séparer les

protéines (entre autres) avec une très grande résolution.

En gros, un système HPLC ressemble au système vu ci-haut: les différences majeures seront

que la colonne est généralement en acier et que le tampon de chromatographie (le solvant) est

sous haute pression pendant la séparation.

Plusieurs types de séparation sont possibles en HPLC. La chromatographie d'échange d'ions

et la filtration sur gel s'y pratiquent selon les mêmes principes qu'avec une chromatographie

"low pressure" (même si à strictement parler, ce n'est pas un "gel" qu'on trouve ici dans la

colonne pour effectuer la filtration).

On distingue souvent en HPLC la chromatographie en phase normale de la chromatographie

en phase inverse. En phase normale, la matrice de la colonne est très polaire (de style silice,

par exemple) et la phase mobile (le solvant) est non-polaire (n-hexane, par exemple). En

phase inverse, vous l'avez deviné, c'est le contraire: la matrice de la colonne est non-polaire

170

ou hydrophobique et le solvant est polaire (eau, méthanol, acétonitrile). C'est le pendant à

haute pression de la chromatographie à interaction hydrophobe.

Le HPLC se distingue par le très petit diamètre de ses colonnes (moins de 5 mm); un flot à

haute pression de solvant; la capacité de séparer et détecter de très petites quantités; et

finalement une très haute résolution.

Sur le sujet du HPLC, je vous recommande le livre en ligne des Drs Yuri Kazakevich et

Harold McNair.

5.6.13 Techniques de précipitation

On a souvent recours à une précipitation d'un aliquot de notre préparation pour des fins

analytiques (pour mettre les protéines sur gel, par exemple). Il existe plusieurs techniques

rapides et fiables pour précipiter les protéines. Je recommanderais de se tenir loin de toutes

celles qui utilisent le triethanolamine, cependant, à cause de son odeur de latrines de métro.

Voici deux protocoles rapides et efficaces ne demandant que très peu de manipulations.

Attention à vos doigts: ils sont couverts de kératine qui va promptement contaminer vos

échantillons si vous n'y prenez garde! Le port de gants de laboratoire est de rigueur.

Précipitation des protéines à l'acide trichloroacétique

1- ajuster les protéines à 25% TCA (trichloroacetic acid)

2- Laisser précipiter 30 minutes sur glace

3- Centrifuger 10 minutes (microfuge, 14 000 rpm)

4- Laver avec 300 uL de 5mM HCl dans l'acétone (au vortex)

5- Centrifuger 5 minutes

6- Laver à l'acétone pure (vortex)

7- Centrifuger 5 minutes

8- Les protéines sont dans le petit culot.

Précipitation des protéines au méthanol

1- À 100 uL de protéines, ajouter 400uL de méthanol (vortex).

2- Ajouter 100 uL de chloroforme (vortex)

3- Ajouter 300 uL H2O (vortex)

4- Centrifuger 2 minutes (microfuge, 14 000 rpm)

171

5- Les protéines sont à l'interface. Retirer la phase supérieure et jeter.

6- Ajouter 300 uL de méthanol au reste du mélange.

7- Centrifuger 2 minutes (microfuge, 14 000 rpm)

8- Les protéines sont dans le petit culot.

5.6.14 Pontage

Les protéines s'associent souvent à d'autres molécules. Il est indispensable parfois de pouvoir

préserver ces associations pendant une purification. Bien qu'il soit parfois possible d'utiliser

certaines méthodes douces préservant les associations en questions, très souvent on doit

s'assurer qu'elles tiennent bon en les aidant un peu à l'aide d'un traitement chimique.

Un exemple de pontage entre les sous-unités d'une protéine est donné ci-dessous. Dans ce cas

on a eu recours au DMS, ou diméthylsuberimidate. (Ne pas confondre avec un autre DMS, le

diméthylsulfate ou encore avec le DMSO, le diméthylsulfoxide). Il est possible que toutes les

sous-unités ne soient pas pontées en même temps, mais à l'analyse on peut déduire la nature

de leurs interactions.

Ici, comme on découvre sur gel SDS des bandes correspondant à des complexes des sous-

unités 1-2-3, des sous-unités 1-2 et 1-3 mais pas des sous-unités 2-3, on pourrait conclure que

la sous-unité 1 contacte les deux autres dans l'holoenzyme, mais que les sous-unités 2 et 3

n'ont pas de contact direct.

172

6.0 Étude des protéines modifiées

6.1 Généralités

Que faire de nos protéines maintenant qu'elles sont purifiées? Ce que nous voulons! Mais

certaines méthodes d'analyse se retrouvant plus souvent que d'autres dans la littérature

scientifque, c'est à elles que nous prêterons maintenant attention.

Vous noterez que nous ne nous attardons pas trop aux principes physiques sur lesquels

reposent les techniques de spectrométrie. Ces sujets dépasseraient le propos de ce cours, aussi

nous nous limiterons à expliquer la base de chaque méthode et à comprendre comment les

utiliser dans le cadre d'un projet de biologie moléculaire.

6.2 Spectrométrie de masse

Voici une adresse fort utile pour être initié aux principes de la spectrométrie de masse par le Dr Alison Ashcroft de l'université de Leeds

Vous ne pouvez pas vous tromper non plus en visitant le site de l'université de l'Arizona.

En un mot, un spectromètre de masse c'est une balance. Il ne fonctionne pas du tout comme une balance, mais c'est tout de même ce qu'il est. Vous lui donnez un échantillon, et il va vous donner un poids -mais d'une manière vraiment précise... Pour une protéine de 40 000 Da, le spectromètre de masse peut vous indiquer un poids qui n'aura une marge d'erreur que de 4 Da!!! C'est amplement suffisant pour détecter le changement d'un acide aminé en un autre, ou encore la présence d'un groupement hydroxyl supplémentaire.

Mieux encore, si vous avez accès à une information génomique complète (comme c'est le cas pour de plus en plus d'organismes dont les génomes ont été séquencés) vous pouvez utiliser le spectromètre de masse pour identifier des protéines. Ainsi, si vous digérez la protéine XYZ (encore inconnue) à la trypsine et que vous en analysez les fragments par spectrométrie de masse, vous recevrez une liste de poids moléculaires. Un ordinateur peut facilement comparer les poids de cette liste avec les poids de toutes les séquences polypeptidiques codées par les cadres de lecture du génome qui nous intéresse, et identifier celles qui coïncident. Quand vous entendez un biochimiste dire qu'il a découpé une bande d'un gel SDS et l'a envoyé en mass spec, c'est tout juste ce qu'il a fait.

Il existe plusieurs types de spectromètres de masse. Ils portent des noms comprenant des sigles ésotériques comme TOF (time of flight), MALDI (matrix assisted laser desorption), ESI (electrospray ionisation), APCI (atmospheric pressure chemical ionisation), EI (electron impact), CI (chemical ionisation), FAB (fast atom bombardment), FD/FI (field desoprtion/ field ionisation), TSP (thermospray ionisation), Q (quadrupole), FT-ICR (Fourier transform-ion cyclotron resonance) etc.; ces sigles sont souvent combinés entre eux pour refléter la nature de l'appareil ou ce à quoi ils sont connectés (LC-MS = liquid chromatography -mass spectrometer, etc).

173

Le principe général de la spectrométrie de masse repose sur une ionisation du matériel et au voyage du matériel chargé vers un détecteur. On distingue plusieurs systèmes de spectrométrie de masse selon la technique d'ionisation et la technique de détection.

6.2.1 Ionisation

6.2.1.1 EI (electron ionization, jadis electron impact)

Ici, on utilise la chaleur pour faire perdre des électrons à un filament de tungstène ou de rhénium dans lequel passe un courant électrique. Ces électrons sont emportés par un champ magnétique induit par un aimant, ce qui cause la formation d'un faisceau d'électrons avec lequel les particules gazéifiées de notre échantillon vont entrer en contact. L'impact va briser les protéines en plus petits peptides et les ioniser.

À basse énergie (environ 20 eV), les électrons ne résussissent pas à provoquer une ionisation. À environ 70 eV, le transfert d'énergie entre les électrons et les molécules organiques analysées est maximisé, ce qui favorise l'ionisation des peptides.

6.2.1.2 FAB (Fast atom bombardment)

Ici, c'est un faisceau d'atomes de gaz (argon ou xénon) de haute énergie (4-10 KeV) qui bombarde la substance à analyser. Cette énergie est transmise à nos peptides qui sont ejectés sous forme ionique (positive et négative). Si la source d'accélération (les deux éclairs dans la figure ci-haut) induit un courant positif, ce sont les ions négatifs qui seront accélérés vers le détecteur; si le courant induit est négatif, ce seront les ions positifs.

6.2.1.3 ESI (electrospray)

Ici, l'échantillon est d'abord soumis à un fort champ magnétique pour en ioniser les molécules. Celles-ci sont pulvérisées dans la chambre d'ionisation sous la forme de microgouttes pleines d'ions (comme si elles sortaient d'un pouiche-pouiche pour arroser les plantes), gouttes qui sont rapidement déshydratées par un courant de gaz chauffé (il s'agit le plus souvent d'azote). Le solvant disparaissant, les ions de

174

même charge dans les gouttes finissent par ne plus pouvoir se supporter, la faisant exploser en plusieurs gouttelettes plus petites. Le processus se répète jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de solvant du tout, laissant des ions "nus" dans les airs.

Les charges sont distribuées sur les peptides de façon statistique; un même peptide peut en porter plusieurs. Un séchage plus rapide des gouttelettes favorise la multi-ionisation.

Une sectrométrie de masse utilisant l'ESI présente souvent ses résultats sous forme de m/z (ou masse / charge) pour présenter la proportion des différentes formes chargées d'un même peptide.

Le graphique ci-haut présente la distribution des ions détectés par un spectromètre de masse et distribués selon leur ration m/z. Comme la valeur de z (la charge) ne peut être qu'un nombre entier, il devient assez facile de déterminer quelle était la masse du peptide initial qui a fourni tous les ions. Dans ce cas-ci, on devine que ce peptide avait une masse de 1200 (car 1200/2=600; 1200/3=400; 1200/4=300; 1200/5=240; 1200/6=200 et 1200/7=171 et des poussières). Si l'ionisation avait été

175

particulièrement efficace et qu'on n'avait pas eu d'ions monovalents, le pic m/z de 1200 n'aurait pas été là. Malgré cela, on aurait quand même pu déterminer que le peptide initial avait une masse de 1200 en identifiant le ppcm (le plus petit commun multiple, comme on disait à la petite école!) de 171, 200, 240, 300, 400 et 600.

Le site suivant explique l'interprétation d'un spectre d'ESI.

6.2.1.4 MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation)

Ici, l'échantillon est d'abord associé à une matrice de telle façon que chaque molécule de

peptide soit séparée de ses voisines. Les peptides et la matrice doivent former une "solution

solide" (un mélange qu'on a laissé sécher jusqu'à ce qu'il forme un biscuit, en quelque

sorte!) dont tout le liquide a été retiré. L e s composés les plus populaires pour la

composition de la matrice sont l'acide sinapinique, l'acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique

et l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque. Ces molécules ont un poids moléculaire assez faible pour

permettre leur vaporisation quand on les excite avec assez d'énergie, mais aussi assez

élevé pour prévenir leur évaporation spontanée pendant ou après la préparation de

l'échantillon. Elles sont en outre acides, ce qui facilite la protonation des peptides, et

absorbent la lumière UV (ce qui joue un rôle crucial dans l'étape suivante).

L'échantillon est ensuite zappé avec un laser UV. L'énergie du laser est absorbée en quelques nanosecondes par la matrice qui chauffe très rapidement. Comme les peptides de l'échantillon sont associés à un nombre bien plus grand de molécules de la matrice, ce sont ces dernières qui absorbent le gros de l'énergie; les molécules peptidiques ne sont donc pas endommagés par le laser. Cette excitation énergétique a plusieurs effets. Elle cause d'abord la désoprtion de certains peptides qui sont expulsés. De plus, le transfert subit d'énergie de la matrice aux peptides peut les ioniser. (On peut observer des transferts de protons de la matrice vers les peptides; on peut aussi voir les peptides perdre des électrons ou en gagner. Le choix de la matrice joue un rôle important sur l'état ionique final de l'échantillon).

Comme toute cette opération se déroule entre une anode et une cathode, les ions sont ensuite propulsés en direction de l'électrode portant une charge inverse à la leur -et vers un détecteur. (Les peptides peuvent, mentionnons-le, porter de multiples charges; quoique dans le cas du MALDI, les peptides n'en portent d'habitude qu'une seule).

176

6.2.2 Détection

6.2.2.1 TOF (time of flight)

Cette technique prend en considération le temps que met un ion pour parcourir le chemin de la chambre d'ionisation au détecteur. Les ions plus gros mettent plus de temps que les plus petits.

Elle ne semble pas limitée par la taille des ions et est extrêmement précise. Elle est souvent combinée avec une méthode d'ionisation rapide comme le MALDI, qui permet de savoir exactement quand les particules ont pris leur envol à cause de la vitesse du processus MALDI (un rayon laser voyage en effet à la vitesse de...ah, vous le saviez déjà).

6.2.2.2 Analyse par double focus

Cette technique (aussi appelée sector analysis) permet de focuser les ions de même charge et de même masse mais ayant un niveau d'énergie différent, ce qui augmente la résolution de la détection des ions de même nature.

6.2.2.3 Q (quadrupole)

un spectromètre Q utilise des champs électriques pour séparer les ions selon leur masse et leur charge. Le quadrupole consiste en quatre fils parallèles formant les arètes d'un quadrilatère: deux sont positifs, deux négatifs.

Dépendant des champs électriques produits avec le courant passant dans les fils, seuls les ions avec un ratio m/z particulier se rendront jusqu'au détecteur au bout du quadripole. Les autres seront déviés sur les fils. En variant la force et la fréquence des champs, différents ions seront détectés, nous donnant ainsi leur spectre de masse. Ne vous fiez pas à la grosse flèche droite de la figure, qui ne vous indique que la direction générale. La course d'un ion dans un quadripole ressemble plus à celle d'une abeille saoûle.

177

6.2.2.4 FT-ICR (Fourier transfrom ion cyclotron resonance).

Ici, un piège à ions dans un champ magnétique statique et uniforme dans l'espace force les ions à adopter une orbite circulaire dans ledit champ; la fréquence de cette orbite dépend de la masse, de la vitesse et de la charge de l'ion. Des détecteurs suivent la course des ions et permettent d'en déterminer ces paramètres.

6.2.2.5 Piège à ions (ion trap)

Dans ce piège à ions, un autre type de quadrupole est capable de capturer les particules ionisées selon leur masse et leur charge, ainsi que selon le courant qu'on fait passer dans le quadrupole. C'est la trajectoire des ions capturés dans des conditions données de potentiel au niveau du quadrupole qui donne les informations sur m et z.

6.2.3 Autres techniques de spectrométrie de masse

6.2.3.1 MS/MS ou MSn

Cette technique commence par séparer les ions en les faisant passer à travers une série de trois quadrupoles qui sont réglés pour ne laisser passer que certains ions vers le détecteur (par exemple, un certain peptide tryptique). Un MS laisserait normalement passer tous les peptides issus d'une digestion protéique, et nous donnerait le poids de chacun. Dans le MS/MS, on commence par n'en laisser passer qu'un.

Le peptide qui réussit à passer entre dans une chambre où il est frappé par des molécules de gaz chargées qui brisent sa chaîne peptidique en un ou plusieurs endroits. Ces bris font en sorte que ce sont des morceaux du peptide tryptique qui finissent par arriver au détecteur. En sachant le poids théorique du peptide tryptique au départ et en comparant les poids des différents petits peptides qui en sont issus, on peut établir l'ordre des résidus contenu dans le fragment initial. Cette technique de MS/MS permet donc de séquencer un petit peptide.

178

6.3 Dichroïsme circulaire

La spectroscopie par dichroïsme circulaire nous permet d'étudier la structure secondaire (hélices, feuillets, etc.) de polypeptides et de protéines en solution. Cette technique utilise peu de matériel et ne le détruit pas. Les changements dus aux conditions ambiantes de pH, d'agents dénaturants et de température peuvent y être facilement monitorés.

La technique repose sur la capacité qu'on les structures optiquement actives d'absorber de façon inégale la lumière polarisée circulairement à droite de la lumière polarisée circulairement à gauche.

Une minute... "lumière circulairement polarisée?" vous demandez-vous. Qu'est-ce que c'est encore que cette diablerie?

Vous êtes probablement

familiers avec la théorie

ondulatoire de la lumière. Une

onde lumineuse d'une certaine

amplitude voyage dans une

direction donnée avec une

forme sinusoïdale. L'angle des

pics de l'onde par rapport à

l'axe de sa propagation peut

avoir n'importe quelle valeur,

mais il est possible de

sélectionner un angle

particulier grâce à un filtre

polarisant (polaroïd).

Consistant en de longues

molécules alignées dans une

direction précise, un tel filtre

ne laisse passer que les

oscillations d'une onde

électromagnétique orientées

de même façon (dans son axe

de transmission).

Maintenant, si nous combinons deux rayons lumineux polarisés à 90° l'un de l'autre mais se propageant dans la même direction. On obtiendra les ondes suivantes:

179

La résultante des deux ondes est une autre onde sinusoïdale située entre les deux premières. Chaque pic de l'une correspond au pic de l'autre, et chaque noeud de l'une arrive au même point que pour l'autre. Mais si notre filtre (un modulateur photoélastique), en plus de laisser passer ces deux ondes, les déphase en plus d'une valeur de π/ 2, le résultat sera tout autre. La résultante sera une spirale.

Dans L'exemple ci-dessus, on a retardé l'onde verticale bleue d'un quart de longueur d'onde (λ / 4, ou encore π / 2 radiants) pour une résultante en hélice de pas droit. Si on avait plutôt avancé l'onde bleue de π / 2 par rapport à la rouge, on aurait obtenu une hélice de pas gauche. Pour une démonstration animée, veuillez vous référer à l'excellent site suivant.

Les structures secondaires n'absorbent pas de façon égale la lumière polarisée circulairement vers la droite et la lumière polarisée circulairement vers la gauche. On raisonnera que l'absorption préférentielle de l'une de ces deux polarisations résultera en une déviation de la résultante (au lieu d'un cercle, le tracé de la résultante entre la spirale tournant à droite et la spirale tournant à gauche donnera une ellipse).

180

Cette déviation est appelée dichroïsme circulaire. Elle permet d'établir un spectre (appelé CD spectra en anglais) de forme caractéristique pour trois structures secondaires retrouvées dans les protéines: l'hélice, le feuillet et la forme aléatoire (ou random coil), qui chacune présentent des asymétries structurales.

Le spectre CD est particulièrement approprié pour juger rapidement de l'état de repliement d'une protéine (ses hélices sont-elles bien hélicales comme prévu?); pour comparer la structure de protéines obtenues de sources différentes; pour analyser l'impact de mutations ponctuelles surt la structure d'une protéine; pour juger de la stabilité de la structure face à des changements environnementaux (pH, salinité); pour déterminer l'impact sur la structure de la présence d'un cofacteur comme un le zinc ou la magnésium.

On peut aussi suivre au fur et à mesure qu'il se déroule le déploiement d'une protéine au fur et à mesure qu'on la soumet à un traitement dénaturant.

La forme du spectre obtenu pour une protéine peut être décomposée en ses trois composantes:

(a) hélicale,

(b) en feuillet,

(c) aléatoire.

Chaque composante donne une courbe spectrale caractéristique.

(Voir le site suivant pour plus d'information.

181

La stabilité thermique d'une protéine peut être évaluée en suvant le comportement de sa structure à différentes températures; cette opération peut aussi se faire de façon continue avec un spectre de températures à une longueur d'onde fixe.

La dénaturation d'une protéine risque d'être irréversible. Le CD nous permet de la suivre "en direct", et de juger si elle est encore réversible. Trouver les conditions dans laquelle une protéine peut plus facilement retrouver son état premier après une dénaturation partielle peut nous être d'un grand secours pour la conserver longtemps.

6.4 Spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

On utilise la RMN pour étudier la structure de petites protéines (jusqu'à 30 KDa environ) en solution sans avoir besoin à les cristalliser. La RMN utilise le spin des particules subatomique pour nous renseigner sur la structure des protéines.

Les électrons, les protons et les neutrons peuvent être imaginés comme des sphères tournant sur leur axe. Dans plusieurs atomes comme le carbone 12, de telles révolutions (le spin) sont appariées de telle façon que le spin global du noyau est égal à zéro. Dans d'autres atomes, cependant, comme le 1H ou le 13C, le noyau possède un spin.

(a) Si le nombre de protons et le nombre de neutrons sont tous les deux pairs, le noyau n'a pas de spin.

(b) Si le nombre de protons plus le nombre de neutrons est impair, le spin a une valeur qui finit en 1/2 (comme 1/2, 3/2, 5/2...)

(c) Si le nombre de protons et de neutrons sont tous les deux impairs, le spin a une valeur entière (1,2,3...)

Le spin global du noyau est noté I (i majuscule) et un noyau a 2I + 1 orientations possibles. Ainsi, un noyau de spin 1/2 possède (2 x 1/2) + 1 orientations, ou plus simplement 2 orientations. En l'absence de champ magnétique, ces deux orientations ont le même niveau d'énergie. Dans un champ magnétique, par contre, ces deux énergies vont diverger: le spin va soit être enligné dans le sens du champ magnétique (choix de basse énergie), ou lui être opposé (choix de haute énergie).

On peut faire transiter un noyau de l'état d'énergie faible à l'état d'énergie élevé en l'irradiant avec une fréquence donnée (dont la valeur exacte a à voir avec la précession du spin, mais là nous entrons dans des considérations de physique quantique qui, pour toutes intéressantes qu'elles puissent être, nous éloignent un peu de notre propos). Le retour subséquent du noyau à son état d'énergie antérieur est enregistrée par un détecteur. Ce phénomène de transition d'un niveau d'énergie à un autre est la résonance qui donne le R de RMN.

L'environnement des noyaux influencera la façon dont ils se comportent quand on les irradie à la longueur d'onde appropriée; la RMN permet donc de déterminer la nature des liens entourant un atome.

182

Pour en savoir plus long, n'hésitez pas à vous référer à ce site.

6.5 Diffraction aux rayons X

6.5.1 Principe

Dans un cristal parfait, toutes les sous-unités ont la même conformation et la même orientation. Quand des rayons X sont focusés à travers un cristal de protéines purifiées, ils sont déviés selon un patron particulier qu'on appelle le patron de diffraction.

Le nombre d'électrons dans les atomes de la protéine détermine le degré de diffraction des rayons, et c'est pourquoi les atomes lourds seront plus efficaces pour faire dévier les rayons X.

Chaque atome peut induire la diffraction de rayons X incidents. Les rayons déviés se répartissent dans l'espace. Si plus d'un atome est présent, les rayons déviés par l'un et l'autre se feront de l'interférence; cette interérence peut être constructrice quand deux pics, ou encore deux creux, se superposent. Elle peut aussi être destructrice quand ce sont un pic et un creux qui se superposent.

La succession d'interférence constructrices et destructrices donne le graphique du milieu; vue en 2D elle donne la figure du bas, ci-contre.

En combinant le patron de diffraction d'un cristal obtenu à partir de différents angles, on obtient assez d'information pour nous aider à déterminer l'agencement des atomes de la protéine dans l'espace.

La cristallisation demande une grande quantité de protéine pure.

183

6.5.2 Cristallisation

On cristallise une substance en la laissant devenir sursaturée dans un solvant; en permettant au solvant de s'évaporer, par exemple, ou en abaissant la température d'une solution saturée. Pour une protéine, on peut aussi faire varier le pH ou la force ionique de la solution.

Si un noyau de cristallisation est présent, il peut permettre la croissance d'un gros cristal, qui consiste en la répétion ordonnée dans l'espace d'une structure particulière.

Dans la figure ci-dessous, l'agencement régulier des sous-unité de la première structure lui donne une apparence cristalline. Dans le second cas, l'empilement des sous-unités est désordonné et non-répétitif; ce n'est pas un cristal. Dans le dessin de Moritz Escher, à droite, on voit un personnage dévaler un escalier jusqu'à ce que la répétition ordonnée de son image donne au bas de l'oeuvre une allure très cristalline. Le personnage au bas des marches a en quelque sorte servi de noyau de cristallisation.

Un cristal de protéines, qui contient environ 50% de solvant réparti dans les interstices entre les molécules, tient ensemble par le biais de forces hydrophobes, de ponts hydrogènes et de ponts de sel (contrairement à un cristal minéral qui utilise surtout les liens ioniques). En fait de solidité, un cristal de protéine est donc plus proche d'un cube de jello sec que d'un diamant.

6.6 Microscopie de force atomique (AFM)

Cette technique non-destructrice permet de relever des détails topographiques à très petite échelle. Elle détecte les formes des molécules un peu comme vous le faites en tâtant une surface avec un doigt. Dans ce cas-ci, le doigt est remplacé par un levier extrêmement ténu (la sonde). La position de cette sonde est suivie par la déviation du tracé d'un rayon laser qui rebondit en permanence sur sa surface réfléchissante et se rend jusqu'à un photodétecteur. Tout mouvement de la sonde

184

quand elle grimpe par dessus un obstacle ou descend dans une cavité se traduit par une déviation du rayon, déviation qui est notée par le photodétecteur.

Une boucle de rétroaction permet de modifier la force appliquée au levier (lui permettant, par exemple, de relâcher la pression quand il monte sur une bosse), ou encore de maintenir sa hauteur constante.

L'université de Guelph a un site instructif sur le sujet.

On distingue trois types d'AFM, dépendant du mouvement de la sonde. En mode Contact ou répulsif, la sonde est en contact avec l'échantillon. La force appliquée sur le levier est fonction de la forme de l'échantillon: elle est relâchée légèrement quand on monte et renforcée légèrement qand on descend.

En mode Sans Contact, la sonde ne touche pas l'échantillon mais est maintenu au-dessus de celui-ci, à 50-150 Angstroms. Les forces de Van der Waals entre la sonde et l'échantillon créent une tension entre les deux, et la mesure de cette tension permet d'établir la forme de l'échantillon. Le mode sans contact est utile pour les échantillons fragiles que la sonde pourrait endommager en les touchant.

En mode "poule qui picore" (tapping mode), la sonde monte et descend très rapidement (50 000 - 500 000 Hz). Quand la sonde est au dessus d'une bosse, elle a moins d'espace pour osciller; quand elle est au dessus d'un creux, elle en a davantage. Ces variations permettent d'établir le profil de l'échantillon. Ce mode a l'avantage de ne pas "traîner" le long de l'échantillon, ce qui évite les problèmes causés par les interactions électrostatiques, par l'adhésion, par la friction, et la plupart des problèmes rencontrés d'habitude par les deux autres modes.

La microscopie de force atomique a permis de visualiser la structure de la chromatine, la position de polymérases sur l'ADN, et de nombreuses autres structures ne relevant pas toujours de la biologie.

185

Ce lien mène à de très belles images obtenues par AFM. On peut y suivre la condensation croissante d'un fragment de chromatine en fonction de la concentration en sel dans le milieu ambiant.

Les avantages de l'AFM sont nombreux. Elle ne requiert pas la destruction de l'échantillon, ne demande pas de coloration et donne une excellente idée de la forme de l'échantillon.

6.7 Séquençage des protéines

1953 fut l'année où les travaux de Crick, Watson et Rosalind Franklin nous permirent de visualiser la molécule d'ADN sous la forme hélicale qui nous est maintentant familière. Cette date devrait aussi être remémorée comme celle où où Frederick Sanger décrivit la séquence des résidus dans une molécule d'insuline.

Le séquençage protéique est un procédé classiquement décrit en six étapes.

1- Détermination de la composition en acides aminés.

2- Identification des bouts.

3- Fragmentation de la chaîne polypeptidique.

4- Séquençage des fragments.

5- Seconde coupure de la chaîne polypeptidique avec un nouvel agent.

6- Agencement des fragments obtenus et séquencés.

1- Détermination de la composition en acides aminés. Cette étape a pour but d'évaluer la quantité de chaque acide aminé présent dans un peptide ou une protéine. On y parvient en brisant chaque lien peptidique de la protéine et en analysant ensuite le mélange obtenu par séparation chromatographique sur HPLC. Bien sûr, une fois qu'on a une idée de la nature et de la quantité des acides aminés contenus dans la protéine, il reste à en déterminer l'ordre.

2- Identification des bouts. Il existe des réactifs comme le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene

ou le chlorure de dansyl qui réagissent avec la partie N-terminale des protéines et leur greffent un groupement supplémentaire. Alors que les liens peptidiques sont coupés par un traitement à l'acide, ces groupements supplémentaires restent greffés à au résidu situé le plus en 5' de la protéine; on peut alors identifier quel est l'acide aminé qui porte un appendice surnuméraire.

186

Pour l'extrémité C-terminale, on a recours à une protéolyse contrôlée avec la carboxypeptidase Y, C ou P (elles coupent le résidu situé le plus en 3 prime). Il fait alors faire attention à ne pas digérer plus d'un acide aminé à l'extrémité C-terminale.

3- Fragmentation de la chaîne polypeptidique. Un traitement avec des agents chimiques ou des enzymes capables de couper la chaîne polypeptidique à des sites précis (la trypsine, par exemple, coupe après une lysine ou une arginine; la chymotrypsine après un résidu aromatique) permettra de réduire une grosse protéine en plus petits peptides. Ceux-ci pourront être séquencés séparément après séparation chromatographique.

4- Séquençage des fragments. La dégradation d'Edman permet d'enlever un par un les résidus en commençant par l'extrémité N-terminale. On arrive ainsi à déterminer la séquence de fragments d'environ 20 résidus.

187

5- Seconde coupure de la chaîne polypeptidique avec un nouvel agent. Nous avons, en (3), coupé la chaîne avec un réactif ou un enzyme afin de pouvoir séquencer les fragments obtenus. Pour pouvoir enligner ces fragments, il nous faut maintenant recommencer (3) et (4) avec un nouvel échantillon de la protéine intacte et un agent différent. (Par exemple, si on a utilisé la trypsine en (3), on pourra maintenant utiliser la chymotrypsine).

6- Agencement des fragments obtenus et séquencés. Chaque fragment peptidique que nous avons séquencé se situe quelque part dans la séquence globale de la protéine. En comparant les fragments de la première digestion (en 3) à celle de la seconde digestion (en 5) et en ayant identifié le résidu de l'extrémité N-terminale, on peut enligner toutes nos séquences par leur bout se chevauchant.

Pour découvrir où se situent les ponts disulfures, on peut faire comme Sanger sur l'insuline: il a utilisé de l'acide prformique, qui non seulement coupait les ponts disulfures mais en plus convertissait les chaînes latérales résultantes en

-CH2-SO3H plltôt qu'en -CH2-SH. Lors de la séparation pendant la séquence, on peut noter que ces cystéines modifiées ont une migration anormale.

188

6.8 Synthèse de peptides

Ce n'est pas vraiment une technique d'analyse, mais puisqu'elle est pratiquement le contraire conceptuel de la dégradation d'Edman nous allons rappeler ici les bases de la synthèse chimique de peptides.

On y utilise une phase solide sur laquelle la chaîne est alongée, un résidu à la fois, par l'addition en séquence des réactifs appropriés.

La synthèse se fait à l'envers de ce qui se passe dans la nature: c'est à dire que le premier acide aminé de la chaîne est le plus C-terminal (c'est lui qui est attaché au support solide). Le groupe N-terminal de ce résidu est protégé par un groupement Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl-), qui est stable dans les acides mais pas les bases.

Le groupe Fmoc est enlevé par traitement à la piperidine 20% dans le dimethylformamide. Les réactifs sont retirés par lavage.

Pendant ce temps, le deuxième acide aminé se prépare. Sa chaîne latérale est protégée par un groupement chimique, mais son extrémité carboxy-terminale est activée par conversion en un ester avec le HOBt ou N-hydroxybenzotriazole. Ce deuxième acide aminé est mis en présence du premier toujours fixé sur le support solide, et l'extrémité C-terminale du second vient former un lien peptidique avec l'extrémité N-terminale (déprotégée) du premier.

Ce cycle est répété autant de fois que nécessaire et la chaîne s'allonge d'un résidu à chaque fois.

Quand le polypeptide est complété, il est libéré du support solide par traitement à l'acide trifluoroacétique, en présence de scavengers qui servent à neutraliser les cations formés pendant le retrait des groupes protecteurs des chaînes latérales.

189

7.0 Interactions protéiques

Les protéines interagissent avec leur environnement, et ce sont les règles qui régissent leur incessante partie de chassé-croisé qui nous permettent de mieux comprendre comment elles contrôlent notre métabolisme. Notre tentative de dresser une carte de toutes les interactions protéiques d'un organisme a donné naissance à un nouveau terme, la protéomique. (En fait, le suffixe "-omique" est de nos jours appliqué à toutes les sauces pour désigner l'étude de systèmes à grande échelle. Ainsi, l'étude du génome entier est connu depuis un certain temps sous le nom de génomique, celles d'un grand nombre de protéines est de venu la protéomique, et on trouve déjà des références à l'interactomique (étude des interactions), ou à la transcriptomique (étude de l'ARNm). L'étude du sens de l'humour à grande échelle s'appellera peut-être un jour la comicomique.

Pour l'instant, nous allons étudier certaines techniques permettant de suivre l'interaction de protéines entre elles ou entre les protéines et d'autres molécules

.1 Interactions protéines-protéines

7.1.2 FRET (fluorescence resonance energy transfer)

Le FRET est une technique qui permet de détecter la proximité de deux molécules fluorescentes. La première, (dite le "donneur"), est excitée par une longueur d'onde λ1 (dans l'UV, par exemple). Le donneur va libérer des photons de longueur d'onde λ2 (dans le bleu, par exemple), qu'on peut détecter. Il peut aussi transférer par résonance une partie de son énergie d'excitation à la seconde molécule fluorescente (le "receveur") qui libérera aussi des photons, mais à une longueur d'onde qui lui est propre, λ3 (dans le jaune, par exemple). Puisqu'il y a transfert d'énergie entre le donneur et le receveur (et que rien ne se perd, rien ne se crée), plus le transfert d'énergie est efficace et plus le receveur émet de photons par rapport au donneur.

Le transfert d'énergie du donneur au receveur, souligné par la détection de l'émission de lumière λ3, indique que le donneur et le receveur ont été très proches l'un de l'autre car l'efficacité du FRET est proportionnelle à l'inverse de la puissance 6 de la distance entre les deux molécules.

Les deux molécules doivent être séparées par 10-100 Angstroms; le spectre d'absorption de l'accepteur doit chevaucher le spectre d'émission du donneur; et les orientations des dipôles du donneur et de l'accepteur doivent être à peu près parallèles.

190

La distance à laquelle le transfert est efficace à 50% est appelé distance de Förster et varie selon les agents fluorescents utilisés.

Donneur Accepteur Distance de Förster (R0)

(Angstroms)

Fluorescein Tetramethylrhodamine 55 Å

IAEDANS Fluorescein 46 Å

EDANS Dabcyl 33 Å

Fluorescein QSY7 et QSY9 61 Å

ECFP EYFP 50 Å

Certains accepteurs ne fluorescent pas, mais en absorbant l'énergie du donneur ils causent une baisse de sa fluorescence qui peut être quantifiée. (Un tel accepteur non-fluorescent, dit "quencher" (ou "éteignoir"), est utilisé dans le système TaqMan de PCR quantitatif). Une forme de FRET utilise des protéines fluorescentes comme donneur et accepteur; cette approche permet d'utiliser le FRET dans un contexte in vivo. On lui donne parfois le nom de BRET pour Bioluminescent Resonance Energy Transfer. On s'en sert dans les cellules vivantes en incitant celles-ci à produire des protéines de fusion avec des domaines naturellement fluorescents, comme les variantes de la GFP (green fluorescent protein) que sont la ECFP (enhanced cyan fluorescent protein) ou la EYFP (enhanced yellow fluorescent protein). Le rayon de Förster entre la ECFP et la EYFP est de 50Å.

7.1.3 Co-précipitation

Si nous avons le moyen de faire sédimenter une protéine en particulier, par immunoprécicpitation par exemple, on peut espérer que nous puissions aussi faire

191

en mnême temps sédimenter un complexe dont elle ferait partie. Une co-immunoprécipitation utilise un anticorps contre une protéine X, sur laquelle une protéine Y vient d'habitude se coller. L'anticorps qui a reconnu X est immobilisé par une bille de protéine A sepharose, permettant la sédimentation du complexe bille-anticorps-X-Y. Comme chaque anticorps a ses caprices, on a recours la plupart du temps à une variante de ce concept: on introduit à une des extrémités de la séquence codante de X une étiquette qui peut être reconnue par un anticorps commercial (ou par tout autre agent faisant notre bonheur). Ainsi, si on utilise une étiquette portant l'épitope FLAG de Sigma, on utilisera un anticorps anti-FLAG pour récupérer le complexe X-Y; si on utilise une étiquette GST (gluthatione-S-transférase) on se servira de glutathione-sepharose, sans anticorps, puisque la GST se lie spontanément à la glutathione. Si on utilise une étiquette de six histidines, on pourra utiliser des billes de sepharose Ni-NTA. On a même recours a des étiquettes complexes, comme l'étiquette TAP (pour tandem affinity purification) qui combine un site de liaison à la calmoduline à un site d'affinité pour les IgG tiré de la protéine A. Ce type d'étiquette permet une double purification.

7.1.4 Combinaisons de buvardages

Dans la technique du Southwestern blot, on combine un buvardage de type western à un transfert de type Southern. Les protéines sont d’abord transférées sur une membrane, puis incubées dans des conditions qu’on espère suffisament douces pour que les protéines se renaturent partiellement. On ajoute ensuite une sonde d’ADN radioactive. S’il y a une interaction spécifique entre certaines protéines et l’ADN, celui-ci sera localisé sur une ou plusieurs bandes particulières sur la membrane. (Vous devinez que ce genre de technique donne un bruit de fond très important). On peut aussi s’y prendre à l’envers, et transférer d’abord l’ADN sur une membrane de nylon; on l’incube ensuite avec un extrait protéique. Si une protéine se lie à l’ADN, on pourra la révéler grâce à un anticorps spécifique. Bien entendu, pour que le système fonctionne, l’interaction ADN-protéine doit être assez stable pour se maintenir tout au long du traitement par les anticorps primaire et secondaire. On a parfois aussi parlé de “far western blot”. Cette technique au nom géographiquement pittoresque immobilise d'abord une protéine X sur une membrane qui est ensuite mise en présence de protéine Y. S'il y a interaction entre les deux, un anticorps anti-Y devrait signaler sa présence dans le voisinage de X plus qu'ailleurs sur la membrane. 7.1.5 Réaction à même le gel, ou zymogramme

Cette technique est très simple, mais aussi très élégante et a permis de démontrer que la protéine GCN5 avait une activité histone acétyltransférase. On prépare d'abord un gel SDS normal, à ceci près que sa matrice contient aussi une cible quelconque (dans le cas de l'expérience mentionnée, cette cible consistait

192

d’histones). La cible est aussi retrouvée dans le tampon. Bref, tout le système est saturé en cible. On dépose un extrait protéique dans les puits et on fait migrer le gel pour bien en séparer les protéines. Aprèes la migration, on lave le gel pour le débarasser du SDS pour permettre aux protéines de se renaturer, dans un tampon au pH et à la salinité appropriée. On fournit ensuite le substrat qui permet de suivre la réaction qui nous intéresse. Dans le cas des histones acétyltransférases, il s'agissait d'acétyl-CoA radioactif. Une histone acétyltransférase devrait transférer le groupe acétyl radioactif de l’acétyl-CoA sur les histones qui sont à sa portée. La réaction, si elle a lieu, se produira dans le gel à la hauteur de l'enzyme qui possède l'activité, puisqu'il y a de la cible partout mais que l'enzyme ne se trouve qu'à un seul endroit. il est alors facile de récupérer la bande contenant l'activité et de la faire analyser par spectrométrie de masse. 7.1.6 Double hybride

Cette technique utilise à son profit la nature modulaire de certains domaines protéiques, comme le domaine d’attache à l’ADN du facteur de transcription de levure Gal4 et le domaine d’activation de la transcription viral VP-16. Pour évaluer l’interaction entre une protéine 1 et une protéine 2, on commence par en faire des hybrides par génie génétique: un premier hybride entre la protéine 1 et un domaine d’attache à l’ADN, et un second entre la protéine 2 et un domaine d’activation de la transcription. On transfère ensuite les vecteurs d’expression de ces hybrides dans une levure contenant un gène rapporteur (comme la beta-galactosidase) sous le contrôle d’un promoteur reconnu par le domaine d’attache à l’ADN de l’hybride 1. L’hybride 1 va se lier au promoteur. Si les protéines 1 et 2 ont réellement de l’affinité l’une pour l’autre, l’hybride 2 va entrer en contact avec l’hybride 1 et se trouver positionné au promoteur lui aussi, là où son domaine d’activation de la transcription stimulera l’expression du gène rapporteur. L’interaction entre les protéines 1 et 2 mènera donc à l’activation du gène rapporteur, même si les protéines 1 et 2, dans leur contexte naturel, n’ont rien à voir avec l’expression des gènes.

193

Expérience de double hybride

7.2 Interactions ADN-protéines

7.2.1 Sensibilité à la nucléase micrococcale

La nucléase micrococcale a beaucoup de difficulté à couper l'ADN complexé à un nucléosome. On peut donc utiliser cet enzyme pour couper la chromatine entre les nucléosomes, et juger ainsi de l'état de la chromatine. L'ADN d'une cellule coupé à la nucléase micrococcale et séparé sur gel d'agarose ressemble à une échelle de fragments dont la taille est un multiple d'environ 147pb. Ils correspondent à des monomères, dimères, trimères, etc. de nucléosomes. Quand on tranfère cette échelle sur une membrane et qu’on l’hybride avec une sonde d’ADN, on observera une échelle si la région où s’hybride la sonde a des nucléosomes en phase (régulièrement déposés) ou encore une traînée si les nucléosomes sont déphasés (déposés irrégulièrement).

194

Pour juger d'un site spécifique de coupure par la nucléase micrococcale, on peut effectuer un marquage indirect ("indirect end-labelling"). Pour ce faire, après traitement à la nucléase micrococcale, l'ADN est coupé avec une endonucléase qui a un site près de la région qui nous intéresse. On effectue ensuite un transfert de Southern, et comme sonde on en choisit une, pas trop longue, qui hybride juste à l'extrémité du fragment laissé par la digestion à l'endonucléase. Cette hybridation revient au même que d'avoir effectué un marquage au site de restriction, et permet de juger des distances entre ce bout et toute coupure causée par la nucléase micrococcale. (Cette technique fonctionne aussi bien sûr avec toutes les nucléases).

7.2.2 Extension de monomères

Cette technique un peu plus compliquée donne des résultats plus difficiles à analyser mais fournit énormément d'information sur la position des nucléosomes.

195

On commence par digérer de la chromatine par la nucléase micrococcale jusqu'à l'obtention de nucléosomes monomériques (les conditions de digestion sont à déterminer empiriquement et préalablement). Les monomères sont ensuite purifiés pour en récupérer l'ADN. On aura au préalable préparé un phagemide de même séquence que la région que nous voulons étudier dans la chromatine. Ce phagemide servira à faire de l'ADN simple brin (on doit préparer les deux brins indépendamment pour déterminer la position de chacune des deux extrémités des monomères). L'ADN récupéré des monomères de nucléosome est dénaturé et hybridé sur l'ADN simple brin du phagemide; il est ensuite allongé par la polymérase de Klenow. Chaque monomère donnera naissance à un fragment d'ADN dont la synthèse commence à une position qui lui est propre. L'ADN obtenu après l'extension par la Klenow est ensuite coupé avec une endonucléase coupant une fois dans le plasmide, ce qui génère une échelle de bandes: chaque bande de cette échelle a une taille correspondant à la distance entre l'extrémité distale du monomère et le site de restriction. Cela nous donne la positon d'une des extrémités de chaque nucléosome. On répète l'opération avec l'autre brin pour obtenir la position de l'autre extrémité.

7.2.3 EMSA (ou electromobility shift assay) et REMSA (RNA electromobility shift assay)

Cette technique, la plus simple qui soit pour étudier une interaction entre un acide nucléique et des protéines, repose sur le fait qu’un complexe ADN- protéine ou ARN-protéine migrera moins vite dans un gel non-dénaturant qu’un ADN ou un ARN nu. Ce retard de migration permet de juger au premier coup d’oeil si une séquence particulière d’ADN ou d’ARN a été reconnue et liée par une protéine. On l’appelle aussi gel-shift ou gel à retardement, ce qui le fait sonner comme une bombe.

On peut vérifier la spécificité de l'interaction ADN-protéine par l'incubation préalable du complexe avec un anticorps qui se fixe à la protéine. Le complexe ternaire ADN-protéine-anticorps a une migration encore plus retardée, qu'on qualifie de supershift. Notez qu'il arrive qu'un anticorps qui fonctionne très bien en western ne vale pas grand chose en supershift. Peut-être que son épitope est moins accessible, ou que

196

son affinité n'est pas assez forte pour résister aux conditions présentes pendant la migration. On peut aussi trouver des anticorps qui interfèrenet avec la liaison ADN-protéine; ceux-là, au lieu de provoquer un supershift, vont même inhiber le gel-shift ordinaire.

Certaines protéines font se courber l’ADN. Dépendant de l’endroit où elle se lie sur une sonde d’ADN, une protéine qui fait courber l’ADN affectera de façon différente la migration sur le gel d’EMSA. Plus la courbure est au centre de la sonde et plus la migration est retardée. On peut utiliser une même sonde en y déplaçant le site de reconnaissance de la protéine pour juger de l’habileté d’une protéine à courber l’ADN.

7.2.4 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)

Le SELEX est une approche de sélection progressive des séquences d'ADN interagissant avec une ou plusieurs protéines. Son algorithme de base ressemble à ceci:

197

On part d'un ensemble d'oligonucléotides dont la séquence est aléatoire; cela veut dire qu'on y trouve toutes les séquences possibles -incluant les séquences reconnues par notre protéine, ainsi qu'une énorme majorité de séquences qu'elle ne reconnaît pas. Ces oligonucléotides contiennent des séquences permettant leur amplification par PCR: par exemple, ils pourraient avoir une séquence comme ACGTCCGTGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGTCGTGCA. Une ronde d'amplification par PCR avec des amorces ACGTCCGTGC et TGCACGACGG les amplifierait tous, quelque soit la séquences de la région NNNNNNNNNNNNNNNNNN. Ce "pool" de séquence est ensuite soumis à une sélection. In vitro, le plus simple est de faire un EMSA avec le pool en entier; les rares séquences qui sont reconnues par la protéine sont retardée lors d'une migration sur gel et le reste est éliminé. Les bandes retardées sont récupérées, et comme elles ne contiennent que peu de matériel, elles sont à nouveau amplifiées par PCR. Comme il est possible que des contaminants se soient glissées à travers les mailles du filet, un nouvel EMSA est pratiqué sur ces séquences réamplifiées; les bandes retardées sont une fois de plus purifiées. On peut exécuter ce cycle plusieurs fois. Les séquences sont à la fin séquencées et on peut alors déterminer celles pour lesquelles la protéine a le plus d'affinité. Cette technique peut aussi se faire à partir de matériel cellulaire. On commence par ponter les protéines et l'ADN avec du formaldéhyde à même la cellule. Ensuite, on morcelle la chromatine (par sonication, par exemple). Les fragments récupérés sont immunoprécipités avec un anticorps contre la protéine; le pontage est renversé par traitement à la chaleur et l'ADN récupéré. Les fragments d'ADN sont alors rendus francs par traitement à la Klenow et on leur ajoute des adapteurs par ligation pour permettre une amplification par PCR. Aprèes amplification, on peut soit utiliser un EMSA comme ci-haut ou recommencer une ronde d'immunoprécipitation, au choix de l'expérimentateur.

7.2.5 Empreinte à l’exonucléase III

198

L’exonucléase III a une activité 3’-5’ exonucléase, mais ne s’attaque qu’aux extrémités 5’ proéminentes ou franches. Elle ne coupe pas l’ADN simple-brin, ni à partir d’extrémités 3’ proéminentes. Cette activité de l’exo III est utile pour déterminer les limites d’une interaction entre une protéine et un fragment d’ADN. Si on marque l’extrémité 5’ du fragment au 32P, et que l’on traite celui-ci à l’exonucléase III pendant qu’une protéine en protège une partie, l’exonucléase III ne pourra digérer l’ADN que jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec cette protéine, qui lui barre le chemin ni plus ni moins. La taille de l’ADN protégé, qu’on détermine sur gel dénaturant, permet alors de déterminer jusqu’où s’étendait l’interaction ADN-protéine. Un des avantages de l’empreinte à l’exonucléase III est que l’ADN non-protégé par une protéine est entièrement dégradé; une interaction partielle ne génère pas de bruit de fond. 7.2.6 Empreinte à la DNAse I

Cette technique, une fois de plus, utilise le fait qu’une protéine déposée sur l’ADN peut le protéger de l’activité de dégradation d’une nucléase. Dans ce cas précis, il s’agit de la DNAse I, une nucléase qui sans couper absolument partout a quand même une affinité générale pour l’ADN et coupe très fréquemment. La DNAse I ne coupe qu’un seul brin à la fois, aussi on marque un seul des brins au 32P pour suivre son comportement sur gel de séquence. La dégradation partielle du fragment d’ADN protégé par la protéine générera une échelle de fragments de tailles différentes. En comparant l’échelle donnée par un ADN nu à celle donnée par un ADN protégé, on remarque que cette dernière présente un trou, ou une empreinte, correspondant aux sites rendus inaccessibles à l’enzyme par la protéine.

Afin de déterminer précisément la position de cette empreinte, on fait souvent courir à côté des pistes de digestion à la DNAse une réaction de séquence. Quoiqu’on puisse utiliser la technique de Maxam-Gilbert sur la sonde radioactive qui sert aussi

199

pour la réaction d’empreinte, il est plus commode de préparer une échelle de séquence par la réaction de Sanger en utilisant comme amorce un oligonucléotide dont l’extrémité correspond à celle de la sonde marquée (voir figure). Le choix de la technique de Sanger produit beaucoup plus de matériel qui en plus dure plus longtemps (il est marqué au 35S plutôt qu’au 32P, de demi-vie plus courte), utilise un isotope moins dangereux, et permet d’éviter les réactifs très nocifs de la réaction de Maxam-Gilbert (comme le DMS et la piperidine). La DNAse I favorise les sites du sillon mineur de l’ADN. Quand l’ADN est en contact avec une surface continue (comme une plaque de verre ou la surface d’un nucléosome, par exemple), elle génère des coupures à toutes les 10 paires de bases, reflétant la fréquence d’hélicité de la spirale d’ADN. Les empreintes à la DNAse I ont tendance à être grandes et claires.

7.2.7 Empreinte avec d'autres agents

7.2.7.1 Empreinte aux radicaux libres

Le principe de l’empreinte se prête à différents réactifs outre les nucléases. On peut par exemple générer dans le milieu d’incubation des radicaux hydroxyl libres qui attaquent la chaîne de phosphate de l’ADN et cassent un des brins de l’ADN. La réaction pour générer ces radicaux est la suivante: Fe2+(EDTA4-) + H2O2 -> Fe3+ (EDTA4-) + HO· C’est le radical HO· qui attaque l’ADN. Il n’a pas de préférence quant à la séquence et tend à couper partout. Une telle empreinte peut donner plus de bruit de fond qu’une empreinte à la DNAse parce que cette dernière, beaucoup plus massive, peut difficilement atteindre des sites situés sous la protéine qui protège l’ADN, alors qu’une petite molécule comme HO· y arrive plus facilement. Pour cette raison, une empreinte générée par les radicaux libres est moins claire qu'une empreinte à la DNAse I. D’autres radicaux existent pour ce type de réaction, comme par exemple le cuivre-phénanthroline. La décision quant à la technique adoptée revient au chercheur. Votre kilométrage peut varier.

7.2.7.2 Empreinte au DMS

Le diméthylsufate, ou DMS, peut méthyler les guanines. Cette réaction de méthylation est plus efficace sur l'ADN nu que sur l'ADN masqué par une protéine et on peut donc l'utiliser pour générer une empreinte. Les méthylguanines sont la cible de la pipéridine chaude, qui coupe un brin de l'ADN à leur niveau (c'est d'ailleurs la réaction utilisée par la méthode de Maxam et Gilbert pour séquencer l'ADN). Bien entendu, comme le DMS n'agit que sur les guanines, l'échelle de digestion que l'on obtient ne contiendra elle aussi que des guanines; on ne pourra pas analyser une région dépourvues de G. Un avantage du DMS est qu'il peut pénétrer les cellules sans qu'on ait à solubiliser

200

celles-ci au préalable; il se prête donc facilement aux études in vivo. Il est particulièrement actif sur les G se trouvant dans le sillon majeur de l'ADN.

7.2.7.3 Empreinte aux UV ou photofootprinting

Les UVB (280-320 nm) et les UVC (200-230 nm) peuvent induire la formation de dimères de pyrimidines quand deux pyrimidines se voisinent: on obtient alors des CPD, pour cyclobtuane pyrimidine dimers, ou des photoproduits pyrimidine-pyrimidone (6-4PP) . Les 6-4PP se forment à un taux d'environ 15-30% des CPDs. Les 6-4PP peuvent être coupés par la piperidine chaude; les CPD doivent être traités à la T4 endonuclease V et re-traités aux UVA (320-400nm) et à la photolyase. Cette technique vise plus particulièrement les régions riches en pyrimidines. Elle se prête bien aux techniques in vivo, car aucune perméabilisation membranaire n'y est requise; de plus, l'irradiation peut être très brève si l'intensité de l'irradiation est élevée, permettant de prendre une "photo" de ce qui se passe dans la cellule à un moment précis, avec un minimum de perturbations. 7.2.8 LMPCR et analyses in vivo

Presque toutes les techniques utilisées pour étudier les interactions ADN-protéines in vitro peuvent être utilisées in vivo aussi. Il est juste un peu plus difficile de faire pénétrer les réactifs dans la cellule et d’en récupérer l’ADN par la suite. La technique la plus populaire depuis une dizaine d’années pour récupérer des fragments d’ADN aprèes une réaction d’empreinte in vivo est celle du LMPCR, ou ligation-mediated Polymerase chain reaction. Elle est décrite ci-dessous.

(1) Récupération de l'ADN génomique. Cet ADN contient des coupures simple-brin, là où la DNAse I ou un autre agent comme le DMS a endommagé la chaîne de groupements phosphates.

(2) Séparation des brins et annélisation de l'un d'eux avec une amorce 1 spécifique à une région qui nous intéresse. L'autre brin pourra être étudié plus tard lors d'une autre expérience. Notez que les fragments d'ADN dont nous disposons à cette étape sont de tailles différentes, parce que la coupure à la DNAse I n'est que partielle.

201

(3) Extension de l'amorce 1. Cette élongation se fait jusqu'au bout de l'ADN qui sert de gabarit, rendant cette extrémité franche ("blunt", comme dirait Coleridge s'il avait fait de la biologie au lieu de la poésie).

(4) Ligation d'un adapteur double-brin dont une des extrémités est franche et l'autre cohésive. Ces extrémités différentes empêchent l'adapteur de se liguer plusieurs fois.

(5) PCR entre une deuxième amorce spécifique (l'amorce 2, à côté du site de l'amorce 1) et une amorce (l'amorce 3) semblable à l'extrémité prohéminente de l'adapteur que nous avons ajouté à l'étape précédente. Le premier cycle de ce PCR ne fonctionne que dans un sens, c'est à dire à partir de l,amorce 2, parce que l'amorce 3 n'a pas encore de séquence complémentaire. Cette séquence sera synthétisée lors de ce premier cycle.

Imaginons qu’on vienne de réaliser une expérience d’empreinte à la DNAse in vivo sur le promoteur du gène Gogosse-1. L’ADN génomique entier de chacune de nos

202

cellules a été coupé par la DNAse I et nous voulons maintenant voir si des sites ont été protégés au niveau de ce promoteur. Dans la case 1, l’ADN génomique en entier est récupéré. L’ADN qui correspond à notre promoteur est en si petite quantité comparé à tout le reste de l’ADN de la cellule qu’il doit être amplifié par PCR pour pouvoir être visualisé de façon utile. Dans un premier temps, une amorce spécifique au promoteur qui nous intéresse est utilisée. L’ADN génomique est dénaturé, et l’amorce 1 (ci-dessus) est utilisée pour s’allonger sur tous les fragments correspondant au voisinage du gène d’intérêt. Cette élongation s’arrête quand la polymérase manque d’ADN-gabarit, c’est à dire là où la DNAse I a fait une brèche dans le brin du bas. L’ADN de promoteur ainsi allongé est donc rendu franc à une de ses extrémités. Dans un deuxième temps, un adapteur (linker) partiellement double-brin est ligué au bout de cette extrémité franche. Cet adapteur est franc à un bout et 5’ proéminent à l’autre; cela évite entre autres d’avoir un concatémère d’adapteurs au bout de notre fragment: un seul réussit à s’y liguer. Notez que l’extrémité du fragment d’ADN se trouvant en amont de l’amorce 1 n’a pas pu être allongée et a donc une extrémité proéminente; l’adapteur ne peut pas s’y liguer non plus. On commence alors la réaction de PCR en utilisant deux nouvelles amorces. La première se trouve un peu en aval de l’amorce 1. (En fait, on pourrait carrément utiliser l’amorce 1 à nouveau, mais des expériences ont démontré que changer d’amorce à cette étape améliore la spécificité des résultats). La deuxième amorce, amorce 3 ci-dessus, correspond à l’extrémité 5’ proéminente de l’adapteur. Comme la séquence sur laquelle cette amorce 3 devrait s’hybrider n’est pas présente sur l’adapteur, le premier cycle de PCR est linéaire: seule l’amorce 2 peut s’hybrider à l’ADN et être allongée. Comme elle se rend jusqu’au bout du fragment, cette première élongation complète la séquence manquante de l’adapteur; lors du deuxième tour de PCR, l’amorce 3 sera capable de s’hybrider et la réaction sera vraiment exponentielle. Parmi les traitements disponibles pour effectuer des empreintes in vivo, mentionnons bien sûr... (a) la DNAse I (il faut alors perméabiliser les cellules pour permettre l’entrée de l’enzyme, et s’assurer de ce qu’il y ait assez de Mg2+ présent dans le milieu); (b) le diméthylsulfate ou DMS, qui pénètre spontanément dans les cellules et va causer une méthylation des guanines non-protégées, une activité particulièrement efficace dans le sillon majeur de l’ADN; le guanines méthylées peuvent alors être coupées par la piperidine; (c) et le UV footprinting, ou formation de dimères de pyrimidines par irradiation aux rayons ultraviolets UVB (280-320nm) ou UVC (200-280nm). Ces dimères de pyrimidines peuvent être coupés par une photolyase et la piperidine. Cette

203

empreinte aux UV a l’avantage de ne pas toucher aux cellules du tout, et permet donc d’étudier une cellule très près de son état naturel.

7.2.9 Pontages covalents

Pour s’assurer de la stabilité d’une interaction ADN-protéine, on peut s’aider un peu en établissant un lien covalent entre les deux. Cela est possible grâce à l’utilisation du fornaldéhyde, HCHO, lequel formera un lien covalent entre protéines ou entre protéines et ADN. Le gros avantage de ce pontage covalent est qu’il est réversible par la chaleur. Les expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, qui nous ont permis d’en apprendre beaucoup sur les modifications post-traductionnelles des histones, utilisent le pontage au formaldéhyde la plupart du temps. On peut également ponter les protéines à l’ADN par d’autres techniques. Les rayons UV pourront y parvenir, de même qu’un rayon laser. Dans de tels cas, l’énergie transmise au système permet d’avoir une réaction plus ou moins rapide; un laser assez puissant donnera une image presque instantanée de ce qui colle à l’ADN alors qu’une lampe UV de basse énergie demandera plusieurs minutes, ne révélant que les complexes très stables. (Un problème avec les sources UV de faible énergie est que les rayons UV sont facilement absorbés par le milieu de culture). 7.2.10 SPR (ou surface plasmon resonance), plus communément appelée Biacore

On mesure ici l’interaction entre deux partenaires moléculaires grâce à une machine mesurant l’intensité d’un rayon de lumière. Cette machine est fabriquée par la compagnie Biacore, qui a donnée son nom à l,appareil comme frigidaire l’a fait au réfrigérateur. La SPR, ou résonance de plasmon, se produit quand un rayon lumineux est réfléchi sous certaines conditions par un film conducteur à l’interface entre deux milieux d’indices de réfraction différents. Dans le système Biacore (tm) ces milieux sont (1) la solution dans laquelle se trouvent les molécules à analyser et (2) le verre d’une lame qui sert de senseur. Le film conducteur à l’interface des deux est un très fin film d’or à la surface de la lame de verre. La résonance de plasmon cause une réduction de l’intensité de la lumière réfléchie à un angle spécifique de réflection. Cet angle varie avec l’indice de réfraction près de la surface du côté opposé à la lumière réfléchie (c’est donc dire du côté de l’échantillon). Dans le système Biacore (www.biacore.com) , la molécule appât est attachée à la feuille d'or, du côté solution. Les molécules avec lesquelles elle peut interagir sont ajoutées en flot continu. Si l’une d’entre elles interagit avec l’appât, la concentration locale en molcules augmentera dans la région immédiate de l’appât, ce qui fera changer l’indice de réfraction local.

204

Le changement d’indice de réfraction aura pour effet de changer l’angle pour lequel la lumière réfléchie perd un maximum d’énergie par résonance. Le système détecte ce un changement et enregistre une interaction. La mesure du niveau d’interaction en fonction du temps permet d’évaluer le taux d’association. Une unité de résonance (RU) correspond à un changement de 0.0001° dans l’angle donnant une intensité minimale de lumière réfléchie, ce qui pour la plupart des protéines correspond à un changement de concentration de l’ordre de 1 pg/mm2 de surface sur la lame de verre. Le Biacore est donc extrêmement sensible.

7.3 Interactions protéines-ADN in vivo à grande Échelle

7.3.1 ChIP ou Immunoprécipitation de la chromatine La technique du ChIP, en permettant l'analyse des interactions ADN-protéines à l'échelle de génomes entiers, a profondément marqué la biologie moléculaire depuis quelques années. Elle repose sur la combinaison de différentes techniques, parmi lesquelles l'immunoprécipitation, le pontage covalent, et le PCR. Dans sa forme la plus simple, le ChIP permet de vérifier la présence d'une protéine donnée à un endroit donné dans le génome. Dans un tel cas, on commence par traiter les cellules avec du formaldéhyde, qui provoque des pontages covalents entre les protéines et l'ADN. Comme nous le verrons un peu plus loin, ces pontages sont solides mais peuvent être renversés par la chaleur (67°C). L'ADN génomique, maintenant ponté avec une grande quantité de protéines, est ensuite brisé pour donner des fragments de petite taille (environ 500 paires de bases). La technique la plus utilisée pour cette fragmentation est la sonication.

205

Pour récupérer les fragments d'ADN sur lesquels se trouve pontée la protéine qui nous intéresse, on utilise un anticorps spécifique contre cette dernière. L'anticorps sera idéalement biotinylé, ce qui permettra de le retenir contre une bille magnétique couplée à la streptavidine. Le complexe bille magnétique- streptavidine- anticorps- protéine pontée- ADN est retenu au fond d'un tube par un aimant pendant que tous les autres complexes ADN-protéines sont éliminés par lavage. Dans la figure qui suit, on utilise un anticorps qui reconnait une protéine représentée en vert.

Après les lavages, la bille magnétique a permis de retenir tous les fragments d'ADN avec lesquels la protéine d'intérêt a une interaction assez importante pour permettre le pontage au formaldéhyde. Reste maintenant à identifier ces fragments.. On commence par chauffer le complexe à 67°C pour renverser le pontage au formaldéhyde. Cela permet la libération des fragments d'ADN, qui sont récupérés et purifiés. Bien sûr, ils sont en faible quantité et il faut ensuite les amplifier par PCR pour pouvoir établir leur présence.

206

La façon la plus simple de procéder est d'utiliser une paire d'amorces spécifiques à une région particulière (la région promotrice d'un gène qui nous intéresse, par exemple) et de procéder soit à un PCR normal, soit à un Q-PCR (aussi appelé "real-time PCR", qui permet d'effectuer des analyses plus quantitatives). Si la protéine étudiée était associée à la région qui nous intéresse, des fragments d'ADN contenant cette séquence auront été retenus lors des lavages et le PCR pourra en amplifier la séquence.

7.3.2 ChIP on chip ou ChIP2

Plutôt que de se limiter à une seule région lors de la réaction de PCR, on a aussi l'option (plus coûteuse!) d'analyser la présence de notre protéine partout dans le génome. Pour ce faire, on commence par une ligation d'adapteurs aux extrémités des fragments d'ADN purifiés lors du ChIP. On utilise ces adapteurs pour pratiquer une réaction de PCR amplifiant tous les fragments présents. Cette amplification se fait en présence d'un nucléotide associé à une substance fluorescente, du genre Cy3 ou Cy5. Pour identifier et démêler tous les fragments obtenus, on les hybride ensuite sur une micropuce d'ADN (aussi appelée "DNA chip", d'où le nom de "ChIP on chip"). Plus la micropuce contient de séquences, et plus celles-ci sont courtes, plus la résolution obtenue est élevée en termes de localisation des protéines dans le génome. (Bien entendu, le résultat sera plus intéressant si la micropuce contient non seulement des séquences codantes, comme c'est le cas pour les puces de cDNA, mais aussi des séquences intergéniques qui contiennent des régions de contrôle. L'idéal serait une puce portant des séquences couvrant le génome entier).

207

En utilisant une telle technique, si on dispose d'une micropuce adéquate, on peut (par exemple) suivre l'association globale d'un facteur de transcription à l'ADN pendant le cycle cellulaire, ou suite à un traitement quelconque, ou encore déterminer d'un seul coup d'oeil la position de plusieurs composantes de la chromatine dans différentes situations.

7.3.3 ChIPPET Technique d'abord publiée dans Wei et al. (2006) Cell 124, 207-219.

Des données, des données, trop de données!!! C'est le drame des biologistes moléculaires modernes. Toute technique capable de réduire la quantité de bruit par rapport aux informations cherchées ne peut être que la bienvenue.

La technque du ChIPPET (Chromatin immunoprecipitation Paired End diTags) s'utilise pour les analyses à grande échelle, du genre "où sur les chromosomes trouve-t-on la protéine p53 quand on traite des cellules NIH3T3 avec de la caféine?" Elle utilise d'abord une immunoprécipitation comme on l'a vu ci-dessus, mais va ensuite remplacer l'étape d'hybridation sur une micropuce par une technique de séquençage. Oh, rassurez-vous, on ne va pas cloner chacun des fragments de chromatine immunoprécipités dans un vecteur pour ensuite les séquencer un par un! Ce serait bien entendu beaucoup trop long et finalement pas moins cher que d'utiliser une hybridation sur puce d'ADN. Le ChIPPET essaie de résoudre deux problèmes associés à l'immunprécipitation de chromatine. Le premier est que la fragmentation de la chromatine par sonication donne des fragments de taille inégale (on vise ~500 pb, mais il s'agit là d'une valeur d'une moyenne). En outre, on immunoprécipitera toujours une certaine part de fragments par erreur; ce seront de faux positifs. Après l'étape de ChIP, le ChIPPET demandera qu'on clone les fragments immunoprécipités dans des vecteurs entre deux sites Mme I. Cet enzyme coupe en dehors de son site de reconnaissance : TCCRAC,20,18. Le clonage de tous ces fragments donnera donc une banque de plasmides qu'on appellera une librairie de ChIP. On va ensuite couper notre librairie de ChIP avec l'enzyme Mme I avant de refermer les plasmides avec de la ligase. Cette étape enlève la majeure partie des fragments immunoprécipités et n'en laisse que deux bouts par plasmide, soit les 18 pb en 5' de l'insert et les 18 pb en 3' de l'insert. Ces deux fragments de 18 pb recollés ensembles forment une étiquette (le diTag) qui est caractéristique d'une position dans le génome. La librairie de vecteurs ainsi coupés et religués est maintenant affublée du très flatulent nom de librairie de PETs. La librairie de PETs est ensuite coupée avec un autre enzyme présent dans le site de clonage multiple, l'enzyme BseR I, qui lui aussi coupe en dehors de son site de

208

reconnaissance (GAGGAG, 10,8). En raison de sa position par rapport au site Mme I du vecteur original, BseR I causera la formation de fragment d'environ 40 pb ayant cette allure générale : CGAC - DiTAG de 36 paires de bases - GTC

AGGCTG - DiTAG de 36 paires de bases - C

On comprendra que chacun de ces inserts correspond à un fragment immunoprécipité, dont la position dans le génome peut être déterminée en cherchant par homologie de séquence un endroit où les deux TAGs de 18 pb seraient à environ 500pb l'un de l'autre. Tous ces inserts sont ligués ensemble dans des vecteurs, formant une troisième librairie, la librairie de ChIPPET dont chaque composante sera séquencée séparément. Chaque réaction de séquence identifiera un grand nombre de fragment grâce à ses diTAGs. Là où on gagnera en confiance dans les résultats, c'est en comparant les séquences obtenues. Des faux positifs seront rares alors que de vrais positifs seront plus abondant (ce qui est vrai dans la plupart des techniques). En outre, les faux positifs générés lors de l'amplification des différentes librairies se trahiront par leurs séquences identiques; ils auront tous les mêmes bouts. Ce problème peut aussi se manifester lors du ChIP utilisant le PCR; certaines séquences s'amplifient mieux que d'autres, donnant l'impression qu'elles ont été plus souvent immunoprécipitées. Ici, les vrais positifs donneront des diTags voisins mais pas identiques, puisque la sonication ne brise pas la chromatine de manière précise.

209

7.3.4 ChIPSeq Cette technique basée sur la technologie de la compagnie Illumina vise à immunoprécipiter des fragments de chromatine et à en purifier l'ADN, puis à les séquencer directement sur une puce. Comment séquence-t-on de l'ADN collé sur une puce? C'est ce que nous allons voir. Supposons qu'on veuille séquencer le génome du biturong, un mammifère asiatique. À partir de cellules de l'animal, la technique demande qu'on en purifie l'ADN et qu'on le fragmente ensuite en petits morceaux en laissant des bouts francs. L'ADN passera par les étapes qui suivent : 1- Ligation d'adapteurs double-brin (A et B) aux deux bouts des fragments 2- Dénaturation de l'ADN et attachement des fragments simple-brin sur une surface solide ressemblant à une lame de microscope (grâce aux adapteurs, qui portent une modification à cet effet) . Les fragments s'attachent au hasard sur la surface de la plaque. Une très grande quantité d'adapteurs simple-brin (qui sont donc des amorces potentielles) se trouve aussi attachée sur le support solide, tout autour des plus grands fragments d'ADN.

3- Les longs fragments se replient et leur extrémité libre (qui porte un des brins de l'un des adapteurs) s'apparie aux courtes amorces complémentaires collées aur le support solide. 4- L'ajout de nucléotides ordinaires et d'ADN polymérase permet l'élongation des amorces qui auront réussit à s'annéliser sur les longs fragments, ce qui redonne un fragment double-brin.

210

5- Dénaturation de ces fragments double-brin; chaque brin reste attaché par son amorce fixée au support solide. 6- Nouveau repliement des fragments simple-brin (maintenant deux fois plus nonbreux) et nouvel appariement aux amorces qui se trouvent en grande quantité dans le voisinage. Nouvelle élongation. On répète ce cycle plusieurs fois, jusqu'à ce que chaque fragment initialement collé au support donne naissance à un amas de fragments semblables.

7- Ajout d'un nucléotide terminateur fluorescent, d'amorces et de polymérase. Un seul nucléotide est ajouté à chaque fragment, au bout de l'amorce de séquençage. L'appareil enregistre la position de chacun des points sur le support solide (ci-dessous je n'en ai dessiné que deux, mais il peut y en avoit plusieurs millions). Il identifie aussi le nucléotide qui a été ajouté à la position 1 pour chque point, en

raison de sa couleur spécifique.

211

8- Les réactifs sont lavés, le groupement qui bloque le bout 3' du premier nucléotide est coupé chimiquement, le fluorophore du premier nucléotide est coupé chimiquement, et un deuxième nucléotide est rajouté. Comme ci-dessus, l'appareil enregistre quel nucléotide s'est ajouté à quel point. On répète ainsi les cycles base par base, en enregistrant la séquence de chacun des points.

7.3.5 ChIC & ChEC Ces deux méthodes procèdent de la même idée, et augmentent la résolution des expriences de ChIP . Le ChIC (Chromatin ImmunoCleavage) utilise une fusion entre la protéine A et la nucléase micrococcale (on l'appelle pA-MN). On procède à une fixation des protéines sur l'ADN comme dans un ChIP normal. On purifie ensuite les noyaux grossièrement, juste pour les rendre accessibles aux anticorps. Un premier anticorps est ajouté, visant la protéine dont nous voulons déterminer la position. Un deuxième anticorps (anti-lapin, anti-souris) est ensuite utilisé pour augmenter le recrutement de pA-MN au site occupé par le premier anticorps. La parite pA de pA-MN reconnaît et se fixe à la partie Fc des anticorps, ce qui amène sa partie MN dans le voisinage de l'ADN. L'ajout de Ca2+, un cofacteur essentiel de la nucléase micrococcale, permet alors à cette dernière de couper l'ADN très près du site de laison de la protéine étudiée. La résolution obtenue est de l'ordre de 100-200 pb, alors qu'un ChIP normal est plutôt du genre 500 pb. Dans le ChEC (Chromatin Endogenous Cleavage), pendant ce temps, on produit directement une protéine de fusion entre la protéine d'intérêt et la nucléase

micrococcale. En présence de calcium, cette protéine de fusion va couper l'ADN juste à côté de son site de liaison; la résolution en est augmentée encore plus. Ces deux techniques ont été publiées par le laboratoire du Dr Laemmli (le même que celui du tampon éponyme!) dans Schmid et al. (2004) Cell 16, 147-157.

212

8.0 Protéomique et découverte de drogues

La protéomique, ou étude à grande échelle des protéines, n'est pas strictement limitée au

domaine commercial. De nombreux laboratoires utilisent depuis longtemps des techniques de

gels 2D ou de spectrométrie de masse pour étudier en même temps de très nombreuses

protéines.

Cependant, comme l'industrie doit constamment chercher à accélérer le processus de

développement de nouveaux médicaments, il n'est pas étonnant qu'elle ait recours à toutes les

techniques qui lui permettent de gagner du temps et de se présenter devant les

consommateurs avec un nouveau produit avant la compétition.

Dans ce chapitre, nous parlerons du mécanisme de mise en marché de nouveaux médicaments

et nous mentionnerons, en guise d'exemple, trois compagnies de biotechnologie qui ont mis

sur pied d'ingénieux systèmes protéomiques.

8.1 Le développement d'une nouvelle drogue

8.1.1 D'hier à aujourd'hui

La grande force de notre système moderne de mise en marché des médicaments, c'est que ces

derniers sont supposés fonctionner. Ne riez pas! Pendant longtemps, les décisions médicales

ou pharmacologiques n'ont rien eu à voir avec l'observation ou avec ce duo étonnant que sont

Essai et Erreur.

À la place, nos ancêtres pleins de bonnes intentions essayaient de corriger les états de santé

défaillants en appliquant leurs connaissances limitées du monde qui les entourait. Vous avez

sûrement entendu parler de nombreuses théories qui nous paraissent fort étranges aujourd'hui,

théories souvent basées sur d'antiques systèmes philosophiques plutôt que sur l'observation

des malades.

Ainsi, au moyen-âge, le plus docte des médecins aurait pu vous expliquer sans rire que votre

état de santé dépendait de l'équilibre des quatres humeurs que vous contenez: le phlegme, la

bile jaune, la bile noire et le sang. (Son collègue le chimiste vous aurait expliqué que la

matière, elle, était composée de quatre éléments: le feu, l'air, la terre et l'eau). Sur quoi se

basait cette croyance? Pas sur l'étude des malades, en tout cas!!! Il y a gros à parier que si

vous attrapiez une phlébite, un chirurgien-barbier vous diagnostique en moins de deux un

excès de sang par rapport aux trois autres humeurs, et vous étiez bon pour un petit traitement

aux sangsues. (George Washington, le premier président des États-Unis, trouva la mort après

avoir pris froid un bel hiver... et avoir été abondamment SAIGNÉ par son médecin).

Cet état de choses plutôt dangereux pour les patients provenait en partie d'une croyance

(encore maintenue aujourd'hui par de nombreux vendeurs d'huile de castor) selon laquelle les

Sages de l'antiquité étaient vachement forts en tout, et que toute sagesse ne pouvait provenir

que de l'émulation de ces très grands esprits. Alors si Aristote déclarait que les abeilles ou les

écrevisses sont des animaux dépourvus de sang, il était inutile d'aller vérifier. Aristote l'a dit

213

il y a 2 000 ans, donc ça doit être vrai.

Heureusement, la curiosité naturelle de nos congénères leur permettait quand même de

découvrir des choses, et d'appliquer leurs découvertes à des problèmes concrets. Force est de

reconnaître que de boire une tisane de salicaire soulage les maux de têtes un peu mieux que

les amulettes du sorcier local, et que d'ingérer du jus de raisin fermenté fait oublier les soucis.

(Jusqu'à ce qu'il donne mal à la tête, auquel cas il est bon d'avoir de la tisane de salicaire pas

loin). Éventuellement, on a cherché à savoir ce qui, dans la salicaire, apportait un

soulagement... et nous savons maintenant qu'il s'agit de l'aspirine, un inhibiteur de la synthèse

des prostaglandines, et au diable les biles jaune et noire.

8.1.2 La méthode expérimentale

La méthode expérimentale est le concept le plus révolutionnaire de toute l'histoire de la

science. En termes simples, il s'agit de répondre à la question "oui, mais ça marche-tu?" et de

vérifier si notre succès est dû à autre chose qu'au hasard. (Par exemple, je suis sûr qu'un

horoscope peut prédire avec succès le résultat d'une partie quotidienne de pile ou face... avec

un taux de réussite de 50%. Le hasard fait tout aussi bien).

L'industrie moderne utilise deux approches complémentaires pour produire de nouveaux

médicaments:

(a) Partir avec un problème et lui trouver une solution;

(b) Développer un produit et essayer de trouver un problème qu'il peut résoudre.

Dans le premier cas, on étudiera des pathologies particulières, et on cherchera à les contrôler

en jouant sur différents paramètres qui lui sont propres. Par exemple, puisqu'on sait que de

nombreux cancers dépendent de la protéine de signalisation Ras qui est positionnée à la

membrane plasmique par une ancre de farnesol, on peut développer un inhibiteur de

farnesoylation et ainsi contrecarrer l'action de Ras.

Dans le second cas, on peut ramasser n'importe quel microorganisme dans un champ ou une

forêt, le cultiver en laboratoire, et tester les substances qu'il produit dans différents contextes

pour voir si cette bibitte ne serait pas en train de synthétiser un quelconque médicament

miracle. C'est ainsi qu'on a découvert la pénicilline ou la cyclosporine, après tout.

8.1.3 La recherche pré-clinique

La première étape du développement d'une nouvelle drogue est la recherche pré-clinique.

C'est l'étape de la bonne idée. Soit on a rencontré un shaman sibérien qui jure que sa liqueur

de lichen peut guérir les pieds plats, soit on a identifié un mécanisme moléculaire qui,

interrompu, pourrait empêcher le développement des verrues plantaires. Bref, c'est l'étape ou

une idée va être exposée et testée.

La première chose à l'ordre du jour lors de cette étape est d'avoir une cible, qui sera

d'ordinaire fournie par des travaux de recherche fondamentale. Par exemple, des chercheurs

peuvent déterminer que certains cancers du sein sont stimulés par les estrogènes. La stratégie

serait donc de découvrir un médicament qui inhibe l'activité du récepteur des estrogènes (le

facteur de transcription ER) pour attaquer ces cancers. ER serait considéré la cible d'une telle

stratégie.

214

Bien sûr, certaines entreprises pharmaceutiques chercheront à découvrir elles-mêmes leurs

propres cibles. Pourquoi? Parce que dans l'industrie, il n'y a rien de tel pour assurer les profits

que l'exclusivité d'un concept, d'une idée, d'un protocole ou d'une substance. Cette exclusivité

est assurée par l'obtention d'un brevet. Et au bureau des brevets, c'est premier arrivé, premier

servi. Si l'idée d'utiliser ER comme cible dans le traitement du cancer du sein avait été

pondue dans une entreprise plutôt qu'un labo académique, cette entreprise aurait pu la

breveter... et être la seule à avoir le droit de s'en servir.

8.1.4 Phase I

Les phases cliniques sont celles ou on teste chez l'être humain. Elles sont au nombre de

quatre.

La phase I dure entre deux et six mois. Elle vise principalement à déterminer si la drogue

candidate est sécuritaire chez l'être humain. Quelques dizaines de sujets sont utilisés comme

cobayes pour cette phase; certains sont malades, d'autres bien portant. Bien sûr, on a déjà

testé la drogue sur des animaux à cette étape et on sait qu'elle sera probablement sans danger;

cependant, on veut s'en assurer parce qu'on ne sait jamais. Les deux tiers des drogues

candidates passent cette étape.

8.1.5 Phase II

La phase II vient ensuite. Personne n'ayant subi de dommages spectaculaires pendant la phase

I, on peut maintenant tester la drogue sur un plus grand nombre de personnes (jusqu'à

plusieurs centaines). On va aussi commencer à tester la drogue pour voir si elle a l'effet qu'on

veut sur les patients. Cette phase peut durer deux ans et à la fin on aura éliminé les deux tiers

des drogues candidates qu'on avait au début.

8.1.6 Phase III

La phase III est encore plus poussée et onéreuse. Elle implique des milliers de patients et peut

durer quatre ou cinq ans. Il s'agit ici de tester différents aspects de la posologie et de

l'efficacité de la substance: effet placebo, dosage de la quantité optimale de drogue pour

qu'elle ait un effet supérieur à celui d'autres substances, assurance de l'absence de contre-

indication, etc. Seul le quart des candidats du début passeront cette étape et pourront recevoir

le satisfecit de la FDA (Food and Drugs Administration).

C'est cette approche en plusieurs étapes qui a permis au Dr Frances Kelsey, de la FDA,

d'empêcher que la thalidomide ne soit utilisée pour traiter la nausée du matin aux États-unis.

Nous n'avons pas eu cette chance ici...

8.1.7 Phase IV

La phase IV se déroule quand une drogue est sur le marché. Il peut arriver (malheureusement) que malgré tous les efforts faits

pendant les trois premières phases, un médicament présente des effets dangereux imprévus à long terme.

La fenfluramine (Fen-Phen), par exemple, a été brièvement vendue comme drogue miracle

pour faire maigrir et vous imaginez quel succès elle a pu avoir chez les consommateurs.

215

Malheureusement, plusieurs utilisateurs devaient mourir de problèmes cardiaques peu après

le début de leur utilisation du produit, qui fut retiré du marché.

Le développement d'une

nouvelle drogue, depuis

les phases initiales

jusqu'aux quatre phases

cliniques.

8.1.8 Où la protéomique joue-t-elle un rôle?

216

C'est principalement au niveau de la recherche pré-clinique que la protéomique peut aider

l'industrie, et surtout au niveau de l'identification de nouvelles cibles. Par contre, ce n'est pas

là son unique application et on peut tester l'effet d'une drogue sur l'expression globale des

protéines, ou utiliser des techniques ingénieuses de synthèse pour mettre au point des

protéines artificielles qui auront un effet thérapeutique.

Le schéma ci-contre résume le processus qui conduit à la mise en marché d'une nouvelle

drogue. Qu'on parte avec une maladie à guérir ou un médicament à tester, on doit identifier

un cible qui puisse servir dans un test expérimental ET être utile dans le traitement d'une

maladie. Le test sert à vérifier si la substance candidate peut jouer un rôle; quand on découvre

qu'elle a du potentiel, on en modifie la structure chimique pour maximiser son efficacité.

8.2 Quelques compagnies intéressantes

Les compagnies suivantes (qui n’ont aucun lien avec ce site, je m’empresse de le préciser!!!)

utilisent des techniques de pointe pour étudier les interactions protéiques, découvrir de

nouvelles cibles thérapeutiques, ou encore développer de nouveaux médicaments. Une visite

sur leur propre site ne peut être qu’instructive.

La compagnie Caprion, de Montréal, utilise la spectrométrie de masse pour étudier les

nombreuses interactions protéiques présentes dans les différentes régions de la cellule. Cette

approche a permis la publication de plusieurs articles scientifiques d’une grande importance.

La compagnie Cellzome a utilisé la technique du TAP-tag pour définir une très grande

majorité des interactions protéiques chez la levure. La compagnie offre même ses résultats à

la communauté scientifique.

La compagnie Sangamo, au lieu d’utiliser des facteurs de transcription naturels pour contrôler

l’expression des gènes, synthétise ses propres facteurs en modifiant la structure de doigts de

zinc. Cela permet de créer de nouveaux facteurs de transcription capables de reconnaître de

nouvelles cibles.