ProteinLab ProteinLab מעבדה ממוחשבת לניקוי חלבוניםמעבדה ממוחשבת לניקוי חלבונים

ProteinLabProteinLab - - הקדמההקדמה

תוכנה זו נכתבה באוניברסיטת תוכנה זו נכתבה באוניברסיטת, וניתן , וניתן ניתנת להורדה כאן ניתנת להורדה כאןלידסלידס

בעזרתה לתרגל ניקוי חלבוניםבעזרתה לתרגל ניקוי חלבונים התוכנה מכילה קובץ נתונים התוכנה מכילה קובץ נתונים

חלבונים חלבונים 2020המדמה תערובת של המדמה תערובת של )מזוהים במספרים סידוריים()מזוהים במספרים סידוריים(

עבור כל חלבון ידועים מס' נתונים עבור כל חלבון ידועים מס' נתוניםבסיסיים. עליכם לבחור את שיטות בסיסיים. עליכם לבחור את שיטות הניקוי היעילות ביותר כך שהחלבון הניקוי היעילות ביותר כך שהחלבון

ינוקה בצורה אופטימליתינוקה בצורה אופטימלית אזהרה: אי יעילות עלולה לשמש אזהרה: אי יעילות עלולה לשמש

עילה לפיטוריכם! עילה לפיטוריכם!

ProteinLabProteinLab – – ...ההתחלה...ההתחלה

יופיע מסך הפתיחה. יופיע מסך הפתיחה. , , לאחר הקלקה כפולה על אייקון התוכנהלאחר הקלקה כפולה על אייקון התוכנה Begin Start from BeginningBegin Start from Beginning:לאחר מכן יופיע החלון הבא:לאחר מכן יופיע החלון הבא

לאלא בוחרים: בוחרים:

החלבונים שבמאגר( הוא סכום שתי החלבונים שבמאגר( הוא סכום שתי 2020החלבון שעליכם לנקות )מתוך החלבון שעליכם לנקות )מתוך

ספרות הביקורת בתעודות הזהות של שני בני הזוג. הקישו את מספרו.ספרות הביקורת בתעודות הזהות של שני בני הזוג. הקישו את מספרו. לאחר שבחרתם, תופיע תיבת טקסט ובה מס' נתונים בסיסיים על לאחר שבחרתם, תופיע תיבת טקסט ובה מס' נתונים בסיסיים על

יש להעתיק נתונים אלו למחברתכם מאחר יש להעתיק נתונים אלו למחברתכם מאחר החלבון. החלבון. שהם לא יופיעו יותר!שהם לא יופיעו יותר!

עליכם להיעזר בנתונים התחלתיים אלו לצורך ניקוי החלבוןעליכם להיעזר בנתונים התחלתיים אלו לצורך ניקוי החלבון

)הקליקו על השורות המוארות כדי לקבל מסך

לדוגמה(

ProteinLabProteinLab – – פירוט שיטות ההפרדהפירוט שיטות ההפרדהAmmonium SulphateAmmonium Sulphate

שיטה המבוססת על עיקרון שיטה המבוססת על עיקרוןsalting outsalting out: : ריכוז מלח עולה מסיסות חלבון יורדת ריכוז מלח עולה מסיסות חלבון יורדת

יש לבחור את אחוז ההשקעה ולאשר. התוכנה יש לבחור את אחוז ההשקעה ולאשר. התוכנהתחשב את פעילות האנזים וכמות החלבון במשקע תחשב את פעילות האנזים וכמות החלבון במשקע

ובנוזל העליון שהתקבלובנוזל העליון שהתקבל על פי התוצאות, יש לבחור האם רוצים להמשיך על פי התוצאות, יש לבחור האם רוצים להמשיך

את הניקוי עם הנוזל העליון או עם המשקעאת הניקוי עם הנוזל העליון או עם המשקע כדאי לנסות הפרדות באחוזי כדאי לנסות הפרדות באחוזיAmm. SulphateAmm. Sulphate

שונים עד למציאת התנאים הטובים ביותר להפרדה שונים עד למציאת התנאים הטובים ביותר להפרדה

Heat denaturationHeat denaturation

יש לבחור את הטמפרטורה ואת משך הזמן שבו יש לבחור את הטמפרטורה ואת משך הזמן שבוהחלבונים יעברו דנטורציההחלבונים יעברו דנטורציה

יש לשמור על תנאים בהם תשמר פעילות האנזים יש לשמור על תנאים בהם תשמר פעילות האנזיםלפי האינפורמציה ההתחלתית שקבלת על האנזיםלפי האינפורמציה ההתחלתית שקבלת על האנזים

Gel filtartionGel filtartion

הפרדה המבוססת על הפרדה המבוססת עלהבדלים בגודל תת הבדלים בגודל תת

היחידות של החלבוןהיחידות של החלבון ,ככל החלבון קטן יותר, ככל החלבון קטן יותר

הוא יתעכב יותר בקולונה הוא יתעכב יותר בקולונה ויצא בפרקציות ויצא בפרקציות

המאוחרות יותר.המאוחרות יותר. לקולונות שונות יש לקולונות שונות יש

יכולות רזולוציה שונות יכולות רזולוציה שונות תיתן תיתן ” ” infoinfo““)לחיצה על )לחיצה על

את הרזולוציות עבור את הרזולוציות עבור הקולונות השונות(הקולונות השונות(

Gel filtartionGel filtartion המשךהמשך

לאחר בחירת הקולונה הרצויה, תקבל גרף של לאחר בחירת הקולונה הרצויה, תקבל גרף שלהפרקציות שהתקבלו כתוצאה מההפרדה בקולונההפרקציות שהתקבלו כתוצאה מההפרדה בקולונה

בדיקה ואיסוף הפרקציותבדיקה ואיסוף הפרקציות

::FractionFractionהאפשרויות המופיעות בתפריט האפשרויות המופיעות בתפריט

.1.1Assay enzyme activityAssay enzyme activity – – מראה מי מבין כל הפרקציות מראה מי מבין כל הפרקציותמכילה את החלבון הרצוימכילה את החלבון הרצוי

.2.2Dilute fractionsDilute fractions – – במידה ולא רואים את הקצה של אחד במידה ולא רואים את הקצה של אחדהפיקים, יש להשתמש באפשרות זו כדי למהול את הפיקים, יש להשתמש באפשרות זו כדי למהול את

המקטעים )לזכור שמהילת יתר עלולה לפגוע בפעילות המקטעים )לזכור שמהילת יתר עלולה לפגוע בפעילות האנזים המבוקש(האנזים המבוקש(

.3.3Pool fractionsPool fractions – – איסוף הפרקציות: יש לסמן בעזרת העכבר איסוף הפרקציות: יש לסמן בעזרת העכבראת גבולות הפרקציה שרוצים לאסוףאת גבולות הפרקציה שרוצים לאסוף

: אחרי שמסמנים לא ניתן לבטל את הפעולה, אלא : אחרי שמסמנים לא ניתן לבטל את הפעולה, אלא חשובחשוב חייבים להתחיל הכל מההתחלה !חייבים להתחיל הכל מההתחלה !

Ion exchange chromatographyIon exchange chromatography

קולונות קולונות44ניתן להשתמש ב ניתן להשתמש ב :: קולונות הספרוז טעונות בטווח רחב קולונות הספרוז טעונות בטווח רחב

מקולונות הצלולוזמקולונות הצלולוז PHPHיותר של יותר של לאחר שבחרתם קולונה, יש לבחור לאחר שבחרתם קולונה, יש לבחור

של בופר שיווי המשקל.של בופר שיווי המשקל. PHPHאת ה את ה לאחר מכן מתכננים את הריכוז לאחר מכן מתכננים את הריכוז

העולה של גרדיאנט המלח. העולה של גרדיאנט המלח. )שטיפה- ריכוז נמוך, אילוציה- ריכוז )שטיפה- ריכוז נמוך, אילוציה- ריכוז

גבוה( גבוה( מתקבל גרף המתאר את הפרקציות מתקבל גרף המתאר את הפרקציות

בדוק פעילות אנזים בדוק פעילות אנזים ..שהתקבלושהתקבלובפרקציות ואסוף את הפרקציה בפרקציות ואסוף את הפרקציה

הפעילה ביותר.הפעילה ביותר.

סוג הקולונהסוג הקולונהסוג המטעןסוג המטען

++DEAE Cell.DEAE Cell.

--..CM CellCM Cell..

++Q SepharoseQ Sepharose

--S SepharoseS Sepharose

שיטת הפרדה המבוססת על מטען החשמלי של המולקולותשיטת הפרדה המבוססת על מטען החשמלי של המולקולות

Hydrophobic interaction Hydrophobic interaction chromatographychromatography

קולונות: קולונות:22ניתן לבחור בין ניתן לבחור בין

.1.1 Phenyl SephPhenyl Seph - - משמשת להפרדת חלבונים מאוד משמשת להפרדת חלבונים מאודהידרופובייםהידרופוביים

.2.2 Octyl SephOctyl Seph- - משמשת להפרדת חלבונים פחות הידרופוביים משמשת להפרדת חלבונים פחות הידרופוביים לאחר שבחרתם קולונה, עליכם לבחור את טווח גרדיאנט המלח לאחר שבחרתם קולונה, עליכם לבחור את טווח גרדיאנט המלח

להפרדהלהפרדה

ריכוז התחלתי גבוה אשר מגביר את קשירת החלבון לקולונהריכוז התחלתי גבוה אשר מגביר את קשירת החלבון לקולונה1.1.

האילוציה מתבצעת בריכוז מלח נמוך אשר מגביר את מסיסות האילוציה מתבצעת בריכוז מלח נמוך אשר מגביר את מסיסות 2.2.החלבון והתנתקותו מהקולונההחלבון והתנתקותו מהקולונה

יש לאסוף יש לאסוף ;;גם כאן מתקבל גרף המתאר את הפרקציות שהתקבלוגם כאן מתקבל גרף המתאר את הפרקציות שהתקבלו את הפרקציה הפעילה ביותראת הפרקציה הפעילה ביותר

Isoelectric focusingIsoelectric focusing ה ה יש לבחור את טווח יש לבחור את טווחPHPH הפרדה )אין נתונים מראש( הפרדה )אין נתונים מראש( לל

לאחר שמתקבל גרף ההפרדה, יש לאסוף את הפרקציה הטובה ביותרלאחר שמתקבל גרף ההפרדה, יש לאסוף את הפרקציה הטובה ביותר

Affinity ChromatographyAffinity Chromatography מפריד את האנזים המבוקש על בסיס אינטראקציה ספציפית של מפריד את האנזים המבוקש על בסיס אינטראקציה ספציפית של

אנזים סובסטרט או רצפטור-ליגנד. אנזים סובסטרט או רצפטור-ליגנד.

אפשרות זו זמינה רק בחלק קטן מהחלבוניםאפשרות זו זמינה רק בחלק קטן מהחלבונים

ולא לשכוח...ולא לשכוח...

לכל פעולה יש מחיר, והתוכנה נותנת הערכה •שלו.

מבטא שני מרכיבים עיקריים- עלות costה- •הריאגנטים והציוד, ומשך הזמן שהפעולה

לוקחת.

מובן שעדיף קודם לנצל את הפעולות שעלותן •נמוכה )דנטורציה בחום, השקעה באמוניום

סולפט( מאשר להתחיל באלו שעלותן גבוהה.

פעולות זולות יעלות לרוב מפעולה 2-3ככלל, •אחת יקרה.

ProteinLabProteinLab – – ...הסוף...הסוף

:)תרגיל להגשה )עבודה בזוגות(:תרגיל להגשה )עבודה בזוגותסכמו בקצרה את שיטות ההפרדה הנזכרות בתוכנהסכמו בקצרה את שיטות ההפרדה הנזכרות בתוכנה1.1.כל זוג יקבל חלבון להפרדה. עליכם להעשיר את החלבון כל זוג יקבל חלבון להפרדה. עליכם להעשיר את החלבון 2.2.

או יותר שיטות הפרדה או יותר שיטות הפרדה44 לפחות תוך שימוש ב- לפחות תוך שימוש ב-1515פי פי יש להגיש את דו"ח ההתקדמות שהתוכנה יצרה מלווה יש להגיש את דו"ח ההתקדמות שהתוכנה יצרה מלווה 3.3.

בדיון תמציתי )אילו פעולות היו יעילות, ואילו היו בדיון תמציתי )אילו פעולות היו יעילות, ואילו היו מיותרות(.מיותרות(.

בצעו את ההוראות הנ"ל ביחס לחלבון הנוסף בצעו את ההוראות הנ"ל ביחס לחלבון הנוסף 4.4.שקיבלתם. שקיבלתם.

השוו בין שני החלבונים שלכם, והסיקו מסקנות ביחס השוו בין שני החלבונים שלכם, והסיקו מסקנות ביחס 5.5., , pHpH, משקל מולקולרי, טמפרטורה, יציבות ל-, משקל מולקולרי, טמפרטורה, יציבות ל-PIPIאליהם )אליהם )

הידרופוביות(.הידרופוביות(..המצגת זמינה באתר הקורס.המצגת זמינה באתר הקורס

ועוד כמה מילים טכניותועוד כמה מילים טכניות

בכל שלב ניתן לראות את דו"ח הפעילות שלכם על בכל שלב ניתן לראות את דו"ח הפעילות שלכם עלHelp progress reportHelp progress reportידי הקשה על : ידי הקשה על :

כל עוד לא סיימתם את פעולת הניקוי הנוכחית כל עוד לא סיימתם את פעולת הניקוי הנוכחיתתוכלו לבטלה על ידי:תוכלו לבטלה על ידי:

Quit Abandon this step and continueQuit Abandon this step and continue:כדי לצאת מהתוכנה ולהתחיל מהתחלה:כדי לצאת מהתוכנה ולהתחיל מהתחלה

Quit Abandon scheme and start againQuit Abandon scheme and start again

!!!! חשוב ביותר !!!!חשוב ביותר בכל שלב כתבו במחברתכם את נתוני הפעולה בכל שלב כתבו במחברתכם את נתוני הפעולה שביצעתם. התוכנה אינה שומרת את הנתונים שביצעתם. התוכנה אינה שומרת את הנתונים הללו, אלא רק את התוצאות שהתקבלו מהם.הללו, אלא רק את התוצאות שהתקבלו מהם.

את הדו"ח שהתוכנה נותנת "צלמו" בעזרת מקש את הדו"ח שהתוכנה נותנת "צלמו" בעזרת מקש

““print screenprint screen שבמקלדת, והדבקתו בתוכנת ” שבמקלדת, והדבקתו בתוכנת ”paintpaint

, משם תוכלו לגזור את החלקים , משם תוכלו לגזור את החלקים PCPCשב- שב-

הרלוונטיים.הרלוונטיים.

Progress Report

2-Dimensional PAGE

על מנת לזהות את האנזים המבוקש :

Stain Immunoblot