Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a

Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en

individuos colombianos

Camila Andrea González Quiroga

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química Bogotá D.C, Colombia

2019

Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en

individuos colombianos

Camila Andrea González Quiroga

Tesis o trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias-Bioquímica

Directora Dr rer nat. CLAUDIA CONSUELO RUBIANO CASTELLANOS

Codirector Ph D. EDGAR EMIGDIO CRISTANCHO MEJIA

Grupo de Investigaciones Básicas en Bioquímica- LIBBIQ y Grupo de investigación en adaptaciones

a la hipoxia y al ejercicio.

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá D.C, Colombia 2019

Proteínas séricas circulantes asociadas con exposición a hipoxia hipobárica en individuos colombianos

3

<Calma en el alma> …Y aunque no ha sido fácil, amo esta vocación que me ha

enseñado a caer y levantarse, y a hacer de la ciencia un aprendizaje para la vida…

V.K


4

Agradecimientos

Agradezco a la Universidad Nacional de Colombia por la convocatoria nacional de proyectos para el fortalecimiento de la investigación, creación e innovación 2016-2018 que permitió la financiación del proyecto 37282. A la vicedecanatura de investigación de la facultad de ciencias y al departamento de Química. Al grupo de investigación en hormonas y principalmente a la Dra. Adriana Umaña y el Dr. Mauricio Urquiza. A mi directora, la profesora Claudia Rubiano que ha sido un apoyo constante a lo largo de mi proceso de formación en investigación. A mi familia LIBBIQ y a Andrés por ser una bonita coincidencia en este camino de la vida. A Dios, a mi madre y a todos mis amigos que fueron un apoyo constante en este proceso de aprendizaje que más que un título ha sido una de las lecciones más grandes que la vida me ha dado.


5

Resumen

La condición de hipoxia hipobárica desencadena respuestas celulares y fisiológicas en organismos

aerobios. Esta condición provoca cambios en proteínas presentes en fluidos biológicos, como

producto de mecanismos moleculares que regulan procesos sistémicos, entre los que se destacan

angiogénesis, eritropoyesis y remodelación tisular (1) (2) (3) (4) (5) (6)(7). Hasta la fecha, se ha

establecido que existe una variación en el conjunto de proteínas circulantes en suero de individuos

nativos de tierras de baja altitud que se establecen en grandes altitudes (>5000 msnm), sin

embargo, no se conoce aún si estos cambios se dan también en la población andina que se desplaza

a altitudes moderadas (2000-3000 msnm) (8). Lo anterior es relevante teniendo en cuenta que

existen diferentes patrones de adaptación que varían de acuerdo con la ubicación geográfica y el

tiempo de residencia en altitud (9).

En este trabajo se realizó la evaluación de algunas variables hematológicas y un análisis

exploratorio de las proteínas que se expresan diferencialmente en suero sanguíneo de individuos

nativos y residentes en zonas de baja altitud expuestos a hipoxia hipobárica. Con este propósito,

se desarrolló una metodología para la obtención de perfiles de proteínas de buena resolución y

reproducibilidad, para lo cual se realizó la inmunodepleción de albúmina e inmunoglobulinas,

seguida de la precipitación de proteínas con ácido tricloroacético (TCA)-Acetona y electroforesis

bidimensional. El análisis comparativo de los geles obtenidos se realizó mediante el software Delta

2D 4.8.0, con el cual se obtuvieron perfiles de expresión diferencial de spots durante el tiempo de

seguimiento. Algunos spots se seleccionaron de acuerdo al fold change (FC) y al valor p para su

identificación mediante espectrometría de masas MALDI TOF TOF.

Entre las proteínas identificadas están la cadena gamma de fibrinógeno, el inhibidor 1 alfa de

antitripsina, hemopexina, la proteína de unión a retinol, transferrina y la apolipoproteína AI. Estas

son proteínas que se han relacionado con diferentes patologías y en este trabajo se estableció su

posible función en los mecanismos de ajuste fisiológico respecto a los procesos de transporte y


6

degranulación plaquetaria principalmente. Estos son resultados preliminares que constituyen una

base para la búsqueda de potenciales biomarcadores de la condición de hipoxia hipobárica.

Palabras Clave: proteínas, aclimatación, hipoxia hipobárica, electroforesis bidimensional.


7

Abstract

The hypobaric hypoxia condition triggers cellular and physiological responses in aerobic organisms.

This condition causes changes in proteins present in biological fluids, as a product of molecular

mechanisms that regulate systemic processes, among which are angiogenesis, erythropoiesis and

tissue remodeling (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). To date, it has been established that there is a variation

in the set of circulating proteins in serum of native individuals of low altitude lands that are

established at high altitudes (>5000 m), however, it is not yet known if these changes also occur in

the Andean population that travels at moderate altitudes (2000-3000 m) (8). This is relevant

considering that there are different adaptation patterns that vary according to geographical

location and residence time at altitude (9).

In this work, the evaluation of some hematological variables and an exploratory analysis of proteins

that are differentially expressed in blood serum of native and resident individuals in low altitude

areas exposed to hypobaric hypoxia are presented. For this purpose, a methodology was developed

to obtain protein profiles of good resolution and reproducibility, for which the immunodepletion

of albumin and immunoglobulins was performed, followed by protein precipitation with TCA-

Acetone and two-dimensional electrophoresis. The comparative analysis of the obtained gels was

carried out using the software Delta 2D 4.8.0, with which profiles of differential expression of spots

were obtained during the follow-up time. Some spots were selected according to the foldchange

(FC) and the p-value for identification by MALDI TOF TOF mass spectrometry.

Among the identified proteins are the fibrinogen gamma chain, the antitrypsin 1 alpha inhibitor,

the hemopexin, the retinol binding protein, the transferrin and the apolipoprotein AI. These are

proteins that have been related to different pathologies and in this work their possible function

was established in the mechanisms of physiological adjustment with respect to the transport

processes and platelet degranulation mainly. These are preliminary results that constitute a basis

for the search for potential biomarkers of the hypobaric hypoxia condition.

Keywords: proteins, acclimation, hypobaric hypoxia, two-dimensional electrophoresis.


8

Contenido Pag.

Resumen ...................................................................................................................................... 5

Lista de figuras……………………………………………………………………………………………………………………………10

Lista de tablas…………………………………………………………………………………………………………………………….11

Lista de Símbolos y abreviaturas………………………………………………………………………………………………..12

1. Introducción ........................................................................................................................... 14

2. Marco teórico ......................................................................................................................... 16

2. 1 Hipoxia ............................................................................................................................. 16

2.1.1 Hipoxia hipobárica ...................................................................................................... 17

2.1.2 Factores inducibles por hipoxia (HIFs) ......................................................................... 24

2. 2 Proteómica .......................................................................................................................... 27

2.2.1 Estudios proteómicos relacionados con hipoxia hipobárica ......................................... 32

3. Justificación ............................................................................................................................ 40

4. Preguntas de investigación ..................................................................................................... 41

5. Objetivos ................................................................................................................................ 42

5.1 Objetivo General ............................................................................................................... 42

5. 2 Objetivos Específicos ........................................................................................................ 42

6. Materiales y métodos ............................................................................................................. 43

6.1 Selección de los individuos que participaron en el estudio ................................................. 43

6.2 Toma de muestras de sangre y seguimiento ...................................................................... 44

6.3 Determinación de variables hematológicas ........................................................................ 45

6.4 Tratamiento de la muestra de suero .................................................................................. 46

6.4.1 Cuantificación de proteínas ............................................................................................ 47

6.4.2 Precipitación de proteínas .............................................................................................. 48

6.4.3 Electroforesis bidimensional 2D-PAGE ............................................................................ 49

6.4.4 Análisis de los geles obtenidos por 2D-PAGE ................................................................... 53


9

6.5 Identificación de proteínas por espectrometría de masas .................................................. 56

7. Resultados y discusión ............................................................................................................ 59

7. 1 Variables hematológicas .................................................................................................... 59

7. 2 Tratamiento de las muestras de suero y obtención de perfiles proteicos por 2D-PAGE....... 69

7.3 Análisis de geles obtenidos por 2D-PAGE ............................................................................ 73

7.4 Identificación de proteínas…………………………………………………………………………………………………86

8. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................................... 101

8.1 Conclusiones ................................................................................................................... 101

8. 2 Recomendaciones .......................................................................................................... 102

9. Anexos .................................................................................................................................. 103

10. Bibliografía ......................................................................................................................... 130


10

Lista de figuras

Figura 1. Relación entre la altitud y la presión barométrica

Figura 2. Genes candidatos de la ruta de los HIFs en diferentes poblaciones

Figura 3. Respuesta de los HIFs en condiciones de normoxia e hipoxia

Figura 4. Generación de péptidos circulantes por actividad proteasa y proteinasa en el

microambiente celular

Figura 5. Abundancia de constituyentes sanguíneos

Figura 6. Vías relacionadas por KEGG con las proteínas reguladas por hipoxia

Figura 7. Flujo de trabajo para el análisis de spots en Delta 2D

Figura 8. Valores del porcentaje de hematocrito

Figura 9. Valores de la concentración de hemoglobina

Figura 10. Concentración de hemoglobina corpuscular media

Figura 11. Concentración de proteínas totales en suero completo

Figura 12. Depleción de Alb e IgGs en suero mediante el sistema ProteoPrep Blue

Figura 13. Imágenes del perfil de proteínas obtenido mediante 2D-PAGE

Figura 14. Agrupación de los geles correspondientes al seguimiento con Delta 2D

Figura 15. Gel fusión obtenido a partir del análisis de los geles de 2D-PAGE con Delta 2D

Figura 16. Agrupamiento jerárquico de los spots

Figura 17. Clusters de spots seleccionados por K-means para identificación

Figura 18. Gráfica de volcano para la muestra del día 56 del seguimiento de los individuos

Figura 19. Perfil de expresión diferencial para los spots identificados para cada individuo

Figura 20. Red de interacción de las proteínas identificadas usando STRING

Figura 21. Red de enriquecimiento para las proteínas identificadas usando Gonet


11

Lista de tablas

Tabla 1. Parámetros hematológicos en poblaciones a diferentes altitudes

Tabla 2. Principales respuestas de aclimatación a nivel sistémico bajo hipoxia hipobárica

Tabla 3. Toma de muestras de los individuos incluidos en el estudio

Tabla 4. Programa de isoelectroenfoque para tiras de 18cm

Tabla 5. Soluciones para revelado de geles con Azul de Coomassie G-250

Tabla 6. Características generales de los individuos incluidos en el estudio

Tabla 7. Asignación de spots de acuerdo al agrupamiento por K-means

Tabla 8. Identificación de spots correspondientes al proteoma sérico de individuos expuestos a

hipoxia hipobárica

Tabla 9. Enriquecimiento de términos GO de las proteínas identificadas por MS


12

Lista de Símbolos y abreviaturas

Abreviatura Término

ADH Hormona antidiurética Alb Albúmina AMS Mal agudo de montaña ANP Péptidos natriuréticos atriales APO AI Apolipoproteína AI ATP Adenosín trifosfato A1T1 Inhibidor 1alfa de antitripsina BCA Ácido bicinconínico BSA Albúmina sérica bovina CBP Proteína de unión a CREBBP cGMP Guanosín monofosfato cíclico CMS Mal crónico de montaña DTT Ditiotreitol 2D-PAGE Electroforesis bidimensional DIGE Electroforesis en gel diferencial eIF2a Factor de iniciación de la traducción 2a eNOS Óxido nítrico sintasa endotelial EPO Eritropoyetina ESI Ionización por electrospray FC Fold change FGF-2 Factor de crecimiento de fibroblasto Fgg Cadena gamma de fibrinógeno GO Gene ontology HACE Edema cerebral HAPE Edema pulmonar Hb Hemoglobina HCM Hemoglobina corpuscular media Hct Hematocrito HDL Lipoproteínas de alta densidad HIFs Factores inducibles por hipoxia HO-1 Hemo oxigenasa-1 HPLC-MS Cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a espectrometría de masas Hpx Hemopexina HUPO Organización del proteoma humano IAA Iodoacetamida IEF Isoelectroenfoque IgGs Inmunoglobulinas IL Interleuquina IL-1a Interleuquina 1 alfa


13

OIA Yodoacetamida IPGs Gradientes de pH inmovilizado iTRAQ Sondas isobáricas para cuantificación absoluta y relativa MALDI Desorción/ionización laser asistida por matriz MAPK Proteínas quinasas activadas por mitógenos MS Espectrometría de masas msnm Metros sobre el nivel del mar MW Masa molecular NO Óxido nítrico NOS Óxido nítrico sintasa OMS Organización mundial de la salud PDGF Factores de crecimiento derivados de plaquetas PDK1 Quinasa de la piruvato deshidrogenasa 1 PHDs Prolil hidroxilasas pI Punto isoeléctrico RBP4 Proteína 4 de unión a retinol ROS Especies reactivas de oxígeno SDS Dodecil sulfato de sodio TCA Ácido tricloroacético TEMED Tetrametiletilendiamina TF Transferrina TFA Ácido trifluoroacético TfR Receptor de transferrina TLR4 Receptor toll 4 TNFa Factor de necrosis tumoral alfa VDBP Proteína de unión a vitamina D VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial VHL Von Hippel-Lindau VIH Virus de inmunodeficiencia humana


14

1. Introducción

La hipoxia es una condición en la que el suministro de oxígeno a los tejidos disminuye, lo que

constituye un factor de estrés que genera respuestas para compensar esta reducción y mantener

la homeostasis en las células. La hipoxia puede ser producto de factores externos como la actividad

física, la inhalación de monóxido de carbono, la asfixia y la exposición a grandes altitudes. Esta

última se conoce como hipoxia hipobárica y se define como la disminución de la presión parcial de

oxígeno por cambios en la presión atmosférica debido al aumento de la altitud.

La condición de hipoxia hipobárica es normal en residentes de zonas de altitud media y alta (2000-

5500 msnm) como Colombia, donde el 70% de la población vive a una altitud intermedia entre

2000 y 3000 msnm, y tiene efectos en los individuos que dependen del género, la edad, el estado

físico y la población de origen (19). Los principales responsables de la respuesta celular ante el

estímulo de hipoxia son los factores inducibles por hipoxia (HIFs: HIF-1,2,3). Estos son factores de

transcripción que desencadenan una respuesta poligénica, aunque también se han evidenciado

mecanismos de respuesta independiente de los HIFs en otras condiciones donde la hipoxia es

característica como son el cáncer y las isquemias.

Los efectos a nivel fisiológico producto de la hipoxia hipobárica varían de acuerdo con el tiempo y

el grado de exposición. De acuerdo con el tiempo de exposición pueden tener lugar dos procesos;

el primero es el proceso de aclimatación durante el cual se pueden generar respuestas agudas que

ocurren en un tiempo de segundos a horas y crónicas que tienen lugar cuando el estrés se prolonga

a días y meses. El segundo, es el proceso de adaptación que requiere años e incluso varias

generaciones y es representado por variaciones evolutivas en individuos residentes a gran altitud

(10) (11) (12).

Los cambios en la expresión génica durante la condición de hipoxia son indicadores de que el

organismo ha activado vías de señalización y rutas metabólicas en respuesta a este estímulo. De

esta forma, los genes y sus productos tienen un gran potencial como indicadores de estrés hipóxico

y por esta razón su análisis en fluidos biológicos principalmente, abarca un amplio campo de


15

estudio (13) (14) (7). A la fecha, muchos estudios sugieren que los cambios en el proteoma se

correlacionan con diferentes condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, por lo cual su análisis tiene

un gran potencial clínico para la intervención terapéutica, la identificación de biomarcadores para

diagnóstico y también como posibles blancos terapéuticos (4) (8) (15).

Respecto al análisis del proteoma sérico durante la condición de hipoxia hipobárica, algunos

estudios han determinado cambios en el perfil de expresión de proteínas en individuos nativos a

nivel del mar en altitud y en nativos de grandes altitudes (>3500 msnm) (8) (16) (17).

Principalmente, se han reportado cambios en proteínas relacionadas con la respuesta inmune y

antiinflamatoria, estrés oxidativo y apoptosis. Sin embargo, a la fecha son pocos los estudios que

evalúan cambios en la expresión de proteínas durante el proceso de aclimatación a hipoxia

hipobárica por proteómica comparativa mediante electroforesis bidimensional, técnica que

constituye la base de análisis exploratorios para la identificación de proteínas con perfiles de

expresión diferencial en todo tipo de muestras biológicas (10) (16) (17) (18).

Por otra parte, en cuanto a la respuesta sistémica que tiene lugar en altitud se destacan algunos

cambios hematológicos que son determinantes para el transporte óptimo de oxígeno a los tejidos,

así como para el desarrollo de todas las funciones vitales. De esta forma, la evaluación de

parámetros hematológicos en individuos expuestos a la condición de hipoxia se ha usado como

indicador de los cambios a nivel fisiológico con el fin de aportar conocimiento sobre los mecanismos

de compensación que tienen lugar durante los procesos de aclimatación y adaptación en altitudes

variables para caracterizar diferentes poblaciones (19). En este trabajo, se propuso evaluar en

conjunto los cambios en algunas variables hematológicas y en el proteoma sérico durante el

proceso de aclimatación a hipoxia hipobárica mediante técnicas experimentales que permitieron

determinar la existencia de perfiles de expresión diferencial como una aproximación a la

comprensión de los mecanismos de respuesta celular y sistémica a hipoxia hipobárica (18).


16

2. Marco teórico

Más de 140 millones de personas viven en regiones por encima de los 2500 msnm en el mundo y

están distribuidas principalmente en África oriental, Asia central, América central y del sur (96). Por

lo anterior, cerca del 2% de la población mundial está expuesta a hipoxia hipobárica, lo que

representa un desafío para la supervivencia debido a que la vida de individuos en altitud (>2500

msnm) se asocia con cambios fisiológicos para compensar la disminución en la disponibilidad de

oxígeno (21) (10) (20).

2. 1 Hipoxia

La condición de hipoxia hace referencia a la disminución en la disponibilidad de oxígeno en las

células y tiene lugar cuando la demanda de oxígeno supera el suministro (concentración de oxígeno

de 1% o 12.5µM). Para explicar cómo los seres vivos responden a la condición de hipoxia, hay que

saber que todos los organismos pluricelulares tienen mecanismos para la detección de oxígeno, así

como para compensar su disminución. Inicialmente, la detección de oxígeno se atribuyó

exclusivamente a células especializadas ubicadas en órganos quimiorreceptores (células

carótideas, aórticas o células neuroepiteliales) que pueden responder a la disminución de la presión

de oxígeno en segundos o minutos con cambios en su excitabilidad, contractilidad o actividad

secretora. Sin embargo, ahora se conoce que todas las células nucleadas en el cuerpo humano

detectan la concentración de oxígeno y responden cuando su disponibilidad es reducida ya sea por

un estímulo agudo o crónico, con cambios a nivel molecular originados por una cascada de

transducción de señales que favorece la activación de factores de transcripción que inducen

cambios en la expresión génica (22) (23) (24).

En humanos, esta condición puede ocurrir por una variedad de factores fisiológicos y

fisiopatológicos como la actividad física, la inhalación de monóxido de carbono, la exposición a

grandes altitudes y la inflamación, entre otros. De acuerdo con los factores que condicionan la

disponibilidad de oxígeno en las células, hay diferentes tipos de hipoxia que se clasifican como


17

hipoxia hipobárica (disminución de la presión barométrica), isquémica (reducción del flujo

sanguíneo), histotóxica (incapacidad de las células de utilizar oxígeno por la acción de agentes

tóxicos) y anémica (disminución del oxígeno total unido a la hemoglobina). También existen

algunas condiciones clínicas bajo las cuales el epitelio alveolar está expuesto a hipoxia, rasgo que

es común en muchas patologías respiratorias como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva

crónica; por lo tanto, la hipoxia tiene un rol importante en la patogénesis de las principales causas

de mortalidad en el mundo, que incluyen el cáncer, la isquemia cerebral, miocárdica y las

enfermedades crónicas que afectan el corazón y los pulmones (22). Sin embargo, hay que destacar

que la hipoxia también es una condición normal y necesaria durante procesos como el desarrollo

embrionario y el mantenimiento celular (8) (7).

2.1.1 Hipoxia hipobárica

El aire es una mezcla de gases compuesta principalmente por oxígeno y nitrógeno, cuyas presiones

parciales sumadas son iguales a la presión barométrica. La concentración de oxígeno en la

atmósfera (20,93%) es constante mientras que la presión parcial de oxígeno disminuye de forma

logarítmica a medida que cae la presión barométrica y aumenta la altitud (Figura 1). Por lo anterior,

la exposición de individuos a grandes altitudes genera la disminución de la cantidad de moléculas

de oxígeno en el aire inspirado respecto al nivel del mar (25). Esta condición se conoce como hipoxia

hipobárica y constituye un factor de estrés en los sistemas biológicos debido a que los organismos

aeróbicos requieren un suministro estable e ininterrumpido de oxígeno y por lo tanto existen

diferentes mecanismos para la homeostasis de oxígeno en procesos básicos como la respiración, el

metabolismo y la proliferación celular, entre otros.


18

Figura 1. Relación entre la altitud y la presión barométrica. En la figura se indica el cambio de la

presión barométrica y la presión parcial de oxígeno respecto a la altitud en msnm, con lo cual pone

en evidencia que el aumento de la altitud da lugar a la condición de hipoxia hipobárica. En la figura

PiO2** y %V.I.* indican la presión parcial y el volumen inspirado de oxígeno respectivamente.

Tomado de: http://altitudchulec.blogspot.com/2012/12/ciudades-de-gran-altitud.html

La capacidad de los seres humanos para hacer frente a los entornos de gran altitud es mediada por

los procesos de adaptación y aclimatación representados por variaciones evolutivas y ajustes

transitorios respectivamente, que dependen del tiempo y la altitud. Sin embargo, a la fecha no se

han establecido tiempos específicos que den cuenta del proceso de aclimatación en humanos.

Históricamente andinos, etíopes y tibetanos son las poblaciones humanas que han estado

expuestas a hipoxia hipobárica por su asentamiento permanente durante periodos de tiempo

variables contemplados entre 5 y 50 mil años en regiones geográficas de gran altitud (>3500

msnm), tiempo suficiente para establecer mecanismos de adaptación que han permitido su

supervivencia (9) (26).


19

En 1878 el fisiólogo Paul Bert sugirió que la exposición a grandes altitudes implica cambios en

parámetros hematológicos como el porcentaje de glóbulos rojos y la concentración de

hemoglobina (Hb), porque su aumento mejora la capacidad de transporte de oxígeno en la sangre

para contrarrestar la disminución de la presión parcial de oxígeno en altitud (27). De esta forma, se

propuso que la respuesta hematológica universal de nativos a nivel del mar en altitud es aumentar

la concentración de Hb (28). Otro de los factores que se tiene en cuenta para evaluar el efecto de

la altitud en diferentes poblaciones es la cantidad de oxígeno que transporta la Hb o el porcentaje

de saturación de oxígeno, que disminuye de forma inmediata con la exposición aguda a altitudes

por encima de los 3000 msnm y se usa a menudo para determinar el grado de estrés fisiológico

(29). En consecuencia, como resultado de múltiples estudios se ha establecido que parámetros

hematológicos como la concentración de Hb, la saturación de oxígeno y el contenido arterial de

este en sangre constituyen diferencias fenotípicas entre nativos a nivel del mar expuestos a hipoxia

hipobárica y pobladores de grandes altitudes, por lo que se ha propuesto la existencia de patrones

de adaptación característicos de estos últimos respecto a los valores de referencia en individuos a

nivel del mar (30) (31) (32) (Tabla 1).

Tabla 1. Parámetros hematológicos en poblaciones a diferentes altitudes. (29)

Poblaciones de referencia

(Altitud:msnm)

% Saturación de oxígeno

Concentración de hemoglobina

(g/dl)

Contenido arterial de oxígeno (ml

O2/100 ml sangre)

Hipoxemia arterial

Eritrocitosis

Nivel del mar 97 15.3 21.1 Ausente Ausente

Etíopes (3530) 95 15.6 21.1 Ausente Ausente

Tibetanos (4000)

89 15.8 19.2 Presente Ausente

Andinos, Bolivia (4000)

92 19.1 24.4 Presente Presente

El patrón de adaptación andino clásico se caracteriza por una alta concentración de Hb, baja

saturación de oxígeno y un contenido de oxígeno arterial más alto que nativos a nivel del mar;

mientras que el patrón tibetano presenta una concentración de Hb con valores similares a los


20

nativos a nivel del mar hasta que se alcanzan altitudes extremas (≥5500 msnm), la saturación de

oxígeno es bastante baja y el contenido de oxígeno arterial es aproximadamente 10% más bajo que

su contraparte a nivel del mar. Por otra parte, el patrón etíope resulta comparable con pobladores

a nivel del mar respecto a las variables analizadas. Lo anterior pone en evidencia la existencia de

patrones de adaptación subsecuentes al tiempo de residencia en altitud, así como también

representa las diferencias a nivel fisiológico que tienen lugar durante los procesos de aclimatación

y adaptación. Como evidencia de esto último también se han observado diferencias entre nativos

tibetanos y chinos de la población Han que nacieron a una altitud cercana a nivel del mar y apenas

hace 50 años comenzaron a poblar el Tibet (33) (34) (35).

Respecto a la concentración de Hb, los andinos presentan un incremento en altitudes desde los

1600 msnm, mientras que los tibetanos residentes a altitudes por encima de 4000 msnm tienen

valores comparables con individuos a nivel del mar, por lo cual se ha propuesto que estos últimos

presentan una respuesta atenuada ante la condición de hipoxia hipobárica y su background

genético ha permitido mejoras en el transporte de oxígeno mediante una alta ventilación sostenida

en reposo, baja respuesta de vasoconstricción pulmonar hipóxica y mejor saturación arterial de

oxígeno en altitud (36). Como es evidente y a partir lo de los resultados de diferentes estudios, el

aumento de la concentración de Hb es variable de acuerdo con la altitud y la población de origen.

El estudio de las adaptaciones a hipoxia ha tenido lugar desde principios del siglo pasado, y solo

recientemente los estudios genómicos han permitido hacer comparaciones con el objetivo de

determinar las bases genéticas subsecuentes al proceso adaptativo. La evidencia actual sugiere que

hay variantes de los genes epas1 y egln1 que están relacionadas con la adaptación a hipoxia

hipobárica porque se han asociado con respuestas características en nativos de altitud, como por

ejemplo, la atenuación del aumento de la concentración de Hb como un factor protector frente al

aumento de la viscosidad de la sangre por eritropoyesis que puede afectar el flujo sanguíneo en los

tejidos y la entrega de oxígeno (36) (30). En este mismo sentido, con el desarrollo de estos estudios

se ha evidenciado que el proceso de adaptación implica cambios a nivel molecular que pueden

tener efectos pleiotrópicos. Por ejemplo, en un estudio realizado por Azad y colaboradores se

encontró un conjunto de 64 genes comunes entre dos de las tres poblaciones de referencia y de


21

estos se identificaron cuatro en común (pik3cb, hla-dqb1, cntnap2 y dlg2) para andinos, etíopes y

tibetanos relacionados con funciones del sistema inmune y circulatorio (31). Así mismo, se ha

evidenciado la existencia de patrones de adaptación entre las tres poblaciones con un conjunto de

genes candidatos de la ruta de los factores inducibles por hipoxia (HIFs) que son característicos de

cada población y otros que convergen en vías similares para mitigar o contrarrestar los efectos

negativos que puede generar la exposición a hipoxia hipobárica (9) (35) (Figura 2).

Figura 2. Genes candidatos de la ruta de los HIFs en diferentes poblaciones. Tomado de (9). En la

figura se destacan las tres regiones geográficas de poblaciones de humanos residentes en altitud y

en cada recuadro se nombran los genes candidatos de la ruta de los HIFs para cada población. Los

genes en color negro son característicos de cada población, en azul están los genes en común para

las tres poblaciones, en verde los genes compartidos entre tibetanos y andinos, en rojo los genes

compartidos por andinos y etíopes, y por último en púrpura los compartidos entre tibetanos y

etíopes.

De otro lado, y de acuerdo con la literatura, el proceso de aclimatación de habitantes a nivel del

mar en altitud requiere mecanismos a nivel muscular, metabólico, respiratorio, cardiovascular y


22

hormonal, que pueden o no estar plenamente comprometidos para garantizar la supervivencia y

la capacidad de realizar diferentes actividades. Durante el proceso de aclimatación se pueden

originar respuestas agudas y crónicas que tienen lugar cuando la exposición ocurre en un tiempo

de horas a días respectivamente y se generan cambios fisiológicos con el fin de maximizar la

entrega de oxígeno a los tejidos (20).

Aunque hay cambios fisiológicos que pueden conferir ventajas medibles en individuos en altitud,

se ha evidenciado que durante el retorno a nivel del mar estos cambios no se mantienen (38). Lo

anterior sugiere que algunos cambios que tienen lugar producto de la exposición prolongada a

hipoxia hipobárica pueden ser un efecto secundario de adaptaciones principales que se dan para

mejorar la entrega de oxígeno y compensar la regulación de diferentes vías durante y después al

estímulo, razón por la cual algunas son innecesarias posterior al proceso de aclimatación (26).

Como es evidente la respuesta a hipoxia hipobárica involucra diferentes mecanismos a nivel

molecular y fisiológico que son representados por los cambios que tienen lugar a nivel sistémico y

ponen en evidencia su complejidad (Tabla 2).

Tabla 2. Principales respuestas de aclimatación a nivel sistémico bajo hipoxia hipobárica.

Respuesta

Función

Hiperventilación Aumentar la presión parcial de oxígeno en la sangre (PaO2).

Hemoconcentración/Eritropoyesis

Incremento del número de glóbulos rojos por volumen de sangre o hematocrito.

Afinidad de la hemoglobina por el oxígeno

Disminución transitoria de la afinidad de la Hb por el oxígeno para facilitar la descarga de oxígeno.

Consumo de oxígeno

Disminución del consumo de oxígeno por regulación metabólica.

Diuresis

Excreción de iones de sodio y bicarbonato en la orina y retención de iones de hidrógeno para compensar la alcalosis respiratoria y contribuir a la regulación del pH corporal.


23

Vasoconstricción pulmonar

Aumento del suministro de sangre a los alvéolos con mayor contenido de oxígeno para enriquecer aún más la relación ventilación/perfusión.

Gasto cardíaco Aumento para restaurar la entrega de oxígeno a los tejidos.

Angiogénesis

Formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de una red preexistente. Favorece la vascularización.

Metabolismo energético

Regulación del metabolismo energético anaeróbico favorecido por el aumento de transportadores como GLUT-1, GLUT-3 y enzimas glucolíticas.

La alteración de los mecanismos de respuesta ante la condición de hipoxia hipobárica puede

generar una serie de síntomas debido al ascenso a altitudes por encima de los 2500 msnm. Entre

los síntomas principales se destacan dolor de cabeza, falta de apetito, cansancio, debilidad,

irritabilidad, insomnio, náuseas y diarrea, que en su conjunto caracterizan el mal agudo y crónico

de montaña (AMS y CMS) (5) (39). El diagnóstico de estos efectos fisiopatológicos en la altitud es

evaluado por medio de un sistema de puntuación de consenso denominado Lake Louise para

determinar la gravedad de los síntomas. El AMS generalmente ocurre dentro de las primeras horas

y días posteriores al ascenso rápido (>2500 msnm) y generalmente se resuelve del día 1 al 3. La

prevalencia de AMS y CMS depende de la edad, el género, la población de origen, la velocidad de

ascenso y la altitud alcanzada, factores que determinan la susceptibilidad de los individuos. Su

incidencia es mucho más alta que la de las otras dos patologías que pueden presentar los individuos

en altitud como son el edema cerebral y pulmonar (HACE, HAPE) (40) (41) (32) (31).

Aunque el AMS y el CMS han sido ampliamente estudiados, los mecanismos bajo los cuales se

presentan no han sido completamente elucidados y se ha determinado que comparten

características con algunas patologías como el cáncer, las apneas del sueño y las isquemias. Debido

a estas similitudes, la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la aclimatación y

los efectos negativos producto de la exposición a hipoxia hipobárica pueden contribuir al diseño de


24

nuevas herramientas clínicas y terapéuticas que contrarresten los efectos de la hipoxia en

diferentes condiciones (41).

2.1.2 Factores inducibles por hipoxia (HIFs)

Los HIFs son una familia de factores de transcripción que han sido descritos como mediadores de

la respuesta a hipoxia y están conservados en todas las especies de animales independientemente

de la presencia de sistemas especializados de transferencia de oxígeno como pulmones y corazón

(23) (42) (14). Inicialmente se identificaron como reguladores de la expresión del gen epo

(eritropoyetina), y posteriormente se determinó que son reguladores a nivel transcripcional de

múltiples genes en respuesta a la condición de hipoxia.

Específicamente, los HIFs son heterodímeros con dominios hélice-loop-hélice constituidos por dos

subunidades que se expresan constitutivamente en todas las células, una alfa que presenta tres

isoformas (HIF-1a, HIF-2a, HIF-3a) y una beta (42). La actividad de los HIFs es mediada por la

estabilidad de la subunidad alfa y depende de la concentración de oxígeno. En condiciones de

normoxia (concentración de oxígeno ~ 20-50µM) la subunidad alfa es rápidamente degradada (T

½: 5 min) debido a que las enzimas prolil hidroxilasas (PHD1, PHD2, PHD3) hidroxilan dos residuos

de prolina altamente conservados (402 y 564) que posteriormente son reconocidos por el complejo

de la proteína VHL (E3 ubiquitin ligasa) que poliubiquitina la subunidad alfa para que esta sea

reconocida por el proteosoma para su degradación (Figura 3) (42) (12). Por otra parte, en

condiciones de hipoxia la subunidad alfa (T ½: 30 min) se trasloca al núcleo y forma un

heterodímero con la subunidad beta y tiene lugar la unión de proteínas coactivadoras como p300

y CBP (acetiltransferasas de histonas) que forman el complejo de inicio para la transcripción de

genes que tienen elementos de respuesta a hipoxia (HREs: 5´-(A/G)CGTG-3´) en su región

promotora (4) (7)(42) (23) (24). Los HREs han sido identificados en la región reguladora de genes

que codifican para transportadores de glucosa (GLUT-1, GLUT-3), isoformas de enzimas glucolíticas

y genes implicados en diferentes procesos biológicos (43).


25

Figura 3. Respuesta de los HIFs en condiciones de normoxia e hipoxia. Tomado de (44). En la figura

se muestra la actividad de los HIFs en condición de normoxia e hipoxia, se puede observar la

degradación de HIF alfa por el proteosoma en condiciones de normoxia debido a la actividad de las

PHDs y en contraparte la traslocación de HIF alfa al núcleo para inducir la transcripción de genes

con HREs en condiciones de hipoxia.

Aunque existen diferentes vías de señalización que pueden modular la respuesta a hipoxia, la

regulación de los HIFs ocurre principalmente por la hidroxilación de HIF-1a por las PHDs, que son

sensores de oxígeno y tienen como cofactores hierro y α-cetoglutarato; en consecuencia, la

dependencia de oxígeno celular, intermediarios del ciclo de Krebs y la disponibilidad de hierro

explica el mecanismo de regulación de las PHDs para la degradación de los HIFs (23) (42) (45) (46).

Por otra parte, si HIF-1a no es degradado por las PHDs, su actividad transcripcional puede ser

bloqueada por asparaginil hidroxilasas que hidroxilan un residuo conservado de asparagina (Asn803)

y de esta forma inhiben la unión del complejo de proteínas coactivadoras para el inicio de la

transcripción (14) (24). Como otro mecanismo de regulación de los HIFs, también se ha reportado

que pueden ser degradados por el lisosoma de forma independiente de oxígeno (12).

La influencia de los HIFs en la expresión génica puede variar entre diferentes tipos de células y

depende de las tres isoformas de la subunidad alfa (42). Se ha determinado que HIF-1a tiene una


26

función general como parte de la maquinaria transcripcional en el núcleo de todas las células,

mientras que HIF-2a y HIF-3a tienen funciones concretas en la homeostasis de oxígeno y son tejido

específicas (7) (45) (12). Los HIF-1a y 2a han sido ampliamente estudiados debido a que regulan un

amplio espectro de funciones celulares y procesos biológicos, facilitando el suministro de oxígeno

a gran variedad de células y tejidos en respuesta a hipoxia (28) (7) (47). De forma interesante, la

expresión de HIF-2a es restringida a células renales, endoteliales, hepáticas y pulmonares, y tiene

un 48% de similitud en la secuencia de aminoácidos con HIF-1a (42). Específicamente, HIF-1a regula

la expresión de enzimas glucolíticas y su función está relacionada con el uso de oxígeno durante el

desarrollo fetal y postnatal, así como también ejerce control sobre vías apoptóticas que no están

bajo el control de HIF-2a; mientras que HIF-2a estimula el crecimiento tumoral y la angiogénesis

(47) (42). Cabe señalar además que HIF-1a desempeña un papel crítico en la respuesta inicial a

hipoxia severa (<0,1% de O2) entre las primeras 24 horas, mientras que HIF-2a actúa bajo la

condición de hipoxia crónica entre las primeras 48 y 72 horas.

Aunque como se ha mencionado hasta ahora los cambios inducidos por hipoxia en la expresión

génica dependen principalmente de los HIFs, estos se extienden mucho más allá de la regulación a

nivel transcripcional por los HIFs. A la fecha hay evidencia de mecanismos a nivel post-

transcripcional, post-traduccional y epigenético bajo esta condición. Respecto a este último, en

mamíferos se ha determinado que la hipoxia puede causar modificaciones por acetilación de

histonas y metilación en las islas CpG, así como también en las secuencias que corresponden a los

HREs, lo que sugiere que la modulación de la metilación en el ADN de genes regulados por los HIFs

tiene un rol importante en la respuesta molecular a hipoxia (4) (3). Como evidencia de esto se ha

demostrado que la condición de hipoxia altera los patrones de metilación en el promotor de epo,

por ejemplo, en líneas celulares donde el promotor no está metilado su expresión se ve

incrementada significativamente en respuesta a hipoxia, mientras que en líneas celulares con el

promotor metilado no se expresa el gen. Además de la regulación epigenética de epo, hay otros

genes que participan en la ruta eritropoyética que pueden estar bajo control epigenético, sin

embargo, este constituye un campo de investigación aun poco explorado (3).


27

Por último y como se ha reportado, los HIFs son regulados por varios circuitos de retroalimentación

negativa que sugieren la actividad de PHDs, microARNs y mTOR, entre otros, para modular la

expresión de numerosos genes y coordinar la respuesta sistémica (24). En resumen, su actividad es

una red bastante compleja que comprende varios mecanismos y cascadas de señalización, que

tienen potencial para la investigación en respuesta a condiciones fisiológicas y fisiopatológicas en

las que la hipoxia es característica (24) (22) (12).

2. 2 Proteómica

El término proteoma fue introducido por primera vez en el año 1995 para describir todo el conjunto

de proteínas que se expresan en un organismo, tejido o célula en condiciones específicas y su

estudio dio origen a la proteómica (48), una disciplina que aborda el estudio a gran escala de

productos génicos mediante métodos bioquímicos y de biología molecular para tener una

comprensión integral de diversos procesos celulares asociados a un estado biológico. Por otra

parte, el peptidoma constituye un subconjunto del proteoma representado por péptidos con peso

molecular de hasta 10 kDa y en consecuencia la principal diferencia en términos de propiedades

físicas con las proteínas es su peso molecular y por lo tanto su estructura.

Los péptidos pueden ser hormonas, factores de crecimiento y citoquinas que a menudo son

mediadores de procesos biológicos como productos derivados de la escisión proteolítica (49). A la

fecha, el cáncer y los trastornos basados en la inflamación se han asociado con patrones alterados

de proteólisis por metaloproteasas y otras enzimas (1). La alteración en la actividad de proteasas

genera péptidos a partir diferentes proteínas o de una misma proteína en varios residuos, y tiene

lugar en números procesos biológicos que incluyen la replicación del ADN, progresión del ciclo

celular, morfogénesis, remodelamiento de tejidos, crecimiento neuronal, hemostasia, cicatrización

de heridas, angiogénesis y apoptosis, entre otros. A su vez se ha reportado que la actividad de

proteasas es variada de acuerdo con el tipo de célula, lo cual representa diferencias en la

composición del proteoma de acuerdo con su fuente de origen (50).


28

Los péptidos respecto a las proteínas de las que se derivan o sus precursoras tienen mejor

permeabilidad en los tejidos debido a su tamaño, lo cual favorece su identificación en fluidos

biológicos, y a su vez ha permitido enfocar su estudio en la posible relación con patologías y/o

condiciones específicas como indicadores de cambios en la expresión de proteínas precursoras y

las proteasas correspondientes (50) (Figura 4).

Figura 4. Generación de péptidos circulantes por actividad proteasa y proteinasa en el

microambiente celular. Tomado de (51). Derivados de la actividad proteasa y proteinasa se

generan proteínas de bajo peso molecular y péptidos que se pueden mantener en circulación

sanguínea y son indicadores de diferentes contextos biológicos que tienen lugar en diferentes tipos

de células.

Respecto a la identificación de péptidos y proteínas en fluidos biológicos, es importante mencionar

que usualmente el suero es preferido para muchas pruebas bioquímicas debido a que los

anticoagulantes usados para aislar el plasma sanguíneo pueden interferir con pruebas específicas,

por lo cual actualmente la mayoría de los bancos de muestras clínicas consisten en muestras de

suero (52). Además, porque se han encontrado péptidos de abundancia relativa que están

presentes en suero y no son detectables en el plasma (15). Lo anterior es de suma importancia


29

teniendo en cuenta que el proceso de recolección de la muestra de sangre debe ser controlado

debido a que ex vivo se pueden generar múltiples péptidos como derivados de plaquetas y

componentes celulares por acción de enzimas en la cascada de coagulación (15).

Aunque el suero tiene una composición similar al plasma, este se caracteriza porque carece de los

factores de coagulación que involucran una cadena de proteínas y cofactores entre los cuales se

destacan trombina, fibrinógeno, calcio y transglutaminasa, entre otros. En suero más del 90% del

total de proteínas está representado por menos de 10 proteínas, siendo la albúmina (Alb) (65%:

45mg/ml) y las inmunoglobulinas (IgGs) (15%: 10mg/ml) las más abundantes, además de otros

constituyentes como citoquinas, factores de crecimiento y receptores (53). Por otra parte, la

diversidad de constituyentes séricos aumenta como producto de spliccing alternativo y

modificaciones post-traduccionales (54). Teniendo en cuenta lo anterior, la evaluación de péptidos

y proteínas derivados de fluidos biológicos es compleja considerando su diversidad y el rango de

concentración de otros constituyentes como sales, lípidos y carbohidratos (55) (15) (56) (53).

La concentración de proteínas en suero varía en un rango muy estrecho de acuerdo con su función

en áreas que incluyen inmunidad, coagulación, transporte de moléculas pequeñas, inflamación y

metabolismo lipídico (Figura 5); y por esta razón los fluidos sanguíneos han sido considerados como

una fuente potencial de biomarcadores. Los biomarcadores son moléculas que se puede medir y

evaluar objetivamente como indicadores de procesos biológicos normales, patogénicos o

respuestas farmacológicas frente a una intervención terapéutica, y se destacan por dos

propiedades fundamentales, especificidad y sensibilidad (48) (57).

Actualmente, se han postulado péptidos y proteínas de interés clínico con potencial para el estudio

de diferentes patologías como son apolipoproteínas (enfermedad cardiovascular), factores del

sistema complemento y protrombina (trastornos de la coagulación sanguínea), timosina (sistema

inmunitario), proteína de unión al factor de crecimiento insulínico y proteína de unión a vitamina

D (cáncer), que pueden estar presentes en concentraciones extremadamente bajas (ng/ml-pg/ml)

(58) (48) (59).


30

Figura 5. Abundancia de constituyentes sanguíneos. Tomado de (56). La concentración de

proteínas en fluidos como el suero y el plasma sanguíneo varia en un amplio rango de acuerdo con

su abundancia.

Debido a la dificultad de encontrar una única proteína o péptido asociado a una condición

específica, se ha llegado a un consenso mediante el cual las investigaciones se dirigen a la búsqueda

de un panel de biomarcadores que sean una huella característica de dicha condición debido a la

presencia de interferencias en fluidos biológicos, así como por la existencia de péptidos y proteínas

minoritarias que pueden ser enmascaradas por otras más abundantes que dificultan su detección

(60) (48). Es por esto que al considerar la complejidad de la muestra y la variabilidad analítica entre

los diferentes enfoques que permiten su análisis, es fundamental establecer la metodología más

simple y rápida que garantice la suficiente reproducibilidad y sensibilidad. Actualmente, el suero y

el plasma sanguíneo son la fuente principal para el estudio del proteoma y su caracterización es

una de las iniciativas de la HUPO (Human Proteome Organization, https://www.hupo.org/). La

identificación de las fuentes de variación entre individuos debido a factores fisiológicos (edad, sexo,


31

ciclo menstrual, ejercicio, estrés) y fisiopatológicos que permitan postular posibles biomarcadores

(48) (61).

La identificación de biomarcadores ha sido posible por los avances en el estudio del proteoma, que

a su vez ha tenido lugar debido a la integración de técnicas a gran escala para la identificación de

proteínas mediante métodos de ionización suave (MALDI y ESI) aplicados a la espectrometría de

masas (MS), que han mejorado la precisión y facilitado el análisis de datos con un alto rendimiento,

así como por la creación de bases de datos para compilar la información obtenida a partir de la

implementación de estas técnicas (61)(62). Desde su introducción, la proteómica se ha desarrollado

rápidamente como una herramienta de investigación aplicada a diversos campos de la ciencia

debido a las variaciones que tienen lugar en el proteoma por diferentes condiciones fisiológicas y

fisiopatológicas (63) (57).

La implementación de técnicas en proteómica incluye estrategias para la preparación de la muestra

que contemplan los procedimientos preliminares para el muestreo, la manipulación y el

almacenamiento, así como diferentes metodologías para la eliminación de proteínas de gran

abundancia (52) (53). Por lo anterior, la estandarización de los procedimientos de preparación de

la muestra de suero y/o plasma es crítica para la identificación de biomarcadores confiables, ya que

ligeros cambios en el procedimiento de preparación de la muestra pueden conducir a variaciones

en el perfil de péptidos y proteínas. Por otra parte, se debe tener en cuenta que factores como la

edad, el sexo y el estado nutricional determinan la composición del proteoma, y por lo tanto se

requiere de una consideración cuidadosa que a su vez depende de la calidad de la muestra, la

sensibilidad y la reproducibilidad de las técnicas empleadas para el análisis.

Aunque a la fecha existen diferentes técnicas para el estudio del proteoma como DIGE (Difference

gel electrophoresis), HPLC-MS (high performance liquid chromatography- mass spectrometry) y

iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation), la electroforesis bidimensional (2D-

PAGE) constituye la base de los estudios exploratorios del proteoma bajo diferentes condiciones

principalmente debido a su costo y a su enfoque exploratorio (61). La 2D-PAGE es aún una técnica

ampliamente usada porque permite separar mezclas complejas de proteínas y/o péptidos en un


32

solo experimento de dos dimensiones, en la primera dimensión las proteínas se separan en un

gradiente de pH hasta que su carga neta es igual a cero y corresponde con su punto isoeléctrico,

posteriormente en la segunda dimensión la separación ocurre en función del peso molecular (62).

Como resultado se obtiene un perfil en el que cada señal o “spot” corresponde a una o incluso

varias proteínas que se pueden comparar con otras muestras para identificar diferencias en los

perfiles de expresión (57). La resolución de esta técnica se debe a que la separación en las dos

dimensiones tiene parámetros independientes, por lo cual es útil para mezclas complejas de

proteínas. Sin embargo, la principal limitación de esta estrategia es la baja posibilidad de

automatización, lo cual la hace útil para el análisis de un número limitado de muestras (62) (49). La

implementación de esta técnica comprende varias etapas que son esenciales para obtener

resultados reproducibles que permitan identificar patrones de expresión diferencial. Actualmente,

el desarrollo de gradientes de pH inmovilizados (IPGs) acoplado a geles de poliacrilamida y la

introducción de métodos de tinción más sensibles ha simplificado y mejorado en gran medida la

capacidad, sensibilidad y reproducibilidad de los geles bidimensionales (49). Así mismo, el

desarrollo de diferentes programas o software de análisis de imágenes ha permitido realizar la

comparación y cuantificación objetiva de un gran número de spots de acuerdo con su intensidad,

para su posterior identificación por MS (57).

2.2.1 Estudios proteómicos relacionados con hipoxia

hipobárica

La regulación de la expresión de genes asociados con hipoxia de forma independiente y

dependiente de los HIFs está relacionada con la regulación positiva y negativa de péptidos y

proteínas que participan en diferentes procesos biológicos. Por lo anterior, el análisis del proteoma

constituye una herramienta importante que aborda el estudio a gran escala de productos génicos

para tener una comprensión integral de procesos celulares asociados a diferentes condiciones

fisiológicas y fisiopatológicas relacionadas con la hipoxia (63). Así mismo, el análisis del proteoma

desde diferentes enfoques ha permitido identificar cambios en la expresión, isoformas, localización

subcelular, modificaciones post-traduccionales e interacciones de un gran número de proteínas.


33

A la fecha existe una base de datos no redundante y curada manualmente llamada HypO2DB

(http://www.hypoxiadb.com/) que integra la información de algunas de las proteínas que se ha

reportado son reguladas por hipoxia en humanos. Esta base de datos permite encontrar una lista

de proteínas que presentan cambios en su expresión en hipoxia bajo diferentes condiciones (% de

oxígeno) y de acuerdo con el tipo de tejido (endotelio, epitelio, entre otros) a partir de

publicaciones revisadas por pares que corresponden a evidencia experimental, y de modo general

agrupa las proteínas de acuerdo con los términos GO (Gene Ontology). También posee vínculos a

otros recursos como Uniprot (https://www.uniprot.org/), OMIM (Online mendelian inheritance in

man, https://www.omim.org/), PDB (Protein data bank, https://www.rcsb.org/), PubMed

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) y KEGG (https://www.genome.jp/kegg/), con este

último se han determinado las principales vías en las que participan estas proteínas (Figura 6) (11).

Figura 6. Vías relacionadas por KEGG con las proteínas reguladas por hipoxia. Tomado de:

http://www.hypoxiadb.com/facts.html. De acuerdo con la vinculación de KEGG a HypO2DB se ha

determinado que las proteínas que presentan cambios de expresión en hipoxia participan en

diferentes vías entre las que se pueden destacar mayoritariamente las relacionadas con procesos

metabólicos, vías asociadas con cáncer y la interacción receptor-citoquina.


34

De acuerdo con la información en esta base de datos es evidente que hay un gran número de

proteínas reguladas por hipoxia que tienen funciones en diferentes procesos como la homeostasis,

la respuesta antiinflamatoria y antioxidante (5) (8) (16). Según se muestra en la figura 6, el 24% de

las proteínas que son reguladas por hipoxia participan en vías metabólicas que incluyen el

metabolismo energético, de los ácidos biliares y del grupo hemo. Como parte del metabolismo

energético, se ha determinado que hay un aumento en los transportadores de glucosa GLUT-1 y

GLUT-3 y en algunas enzimas glucolíticas como la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa y

enolasa. Esto implica un cambio del metabolismo oxidativo al glucolítico anaeróbico de forma

rápida y reversible, favoreciendo el uso de glucosa y el aumento de la concentración de lactato

mediado por enzimas como la fosfofructoquinasa-1 y la piruvato quinasa. El aumento en la

producción de lactato tiene lugar durante la etapa aguda de aclimatación, sin embargo, con el

transcurso del tiempo de exposición, los niveles de lactato disminuyen a valores similares a los de

residentes a nivel del mar, efecto conocido como la paradoja del lactato. Lo anterior indica que

deben existir mecanismos para mantener la producción energética independiente de la vía

glucolítica, corroborado también por los cambios en los niveles de expresión de proteínas

implicadas en el metabolismo energético como la citocromo c oxidasa (64).

Lo anterior constituye evidencia de que el tiempo de exposición a la condición de hipoxia genera

efectos variables que alteran la composición del proteoma (63) (46). Durante la aclimatación las

principales vías de transducción de señales implican la actividad de proteínas quinasas (MAPK,

SAPK y PKC) y fosfatasas dependientes de calmodulina, así como de diversas isoformas de proteínas

quinasas C, que modulan la expresión génica y la función celular. Por ejemplo, se ha reportado que

la hipoxia activa la vía de señalización p38 (p38α, p38β, p38δ, p38γ), parte de la superfamilia de

proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK).

A la fecha hay algunos estudios proteómicos comparativos entre individuos que habitan en altitud

y a nivel del mar. Tanto Ahmad como Padhy y colaboradores identificaron un total de 12 y 36

proteínas que se expresan de forma diferencial en nativos de gran altitud respecto a controles a

nivel del mar (16) (65). Entre las proteínas reguladas positivamente se destacan la proteína de

unión a vitamina D (VDBP), hemopexina (Hpx), inhibidor 1 alfa de antitripsina (A1T1), cadena β de


35

haptoglobina, apolipoproteína AI y A-IV, transtiretina, la cadena beta de Hb, y la óxido nítrico

sintasa (NOS). Por otra parte, se encontró que entre las proteínas reguladas negativamente están

la transferrina (Tf), el componente 3 y 4 del sistema complemento, la proteína sérica amiloide, la

proteína de unión a retinol (RBP4), el angiotensinógeno y la angiotensina. En conjunto estos

estudios encontraron cambios en la expresión de proteínas que actúan como factores de respuesta

antiinflamatoria (16) (65). Otros estudios en humanos y modelos murinos también han encontrado

que la mayoría de las proteínas reguladas positivamente son proteínas de fase aguda que facilitan

el control rápido y eficaz del daño inflamatorio tras la exposición a la hipoxia, sugiriendo que la

inflamación es una característica de la respuesta de aclimatación a la hipoxia hipobárica (17) (16)

(61) (65).

Los estudios proteómicos también han evidenciado que las poblaciones nativas de grandes

altitudes tienen niveles plasmáticos más altos de óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) y

metabolitos derivados de óxido nítrico (NO) frente a controles a nivel del mar; lo que a su vez se ha

relacionado con la activación de una vía independiente para generar NO a través de la reducción

de nitratos y nitritos, que favorece la disponibilidad de NO y en conjunto sugiere la importancia de

su producción durante el proceso de aclimatación, debido a su función como vasodilatador (66).

Al respecto, un estudio realizado por Padhy y colaboradores evaluó el proteoma plasmático en

nativos Ladakhi (3520 msnm) y nativos a nivel del mar los días 1, 4 y 7 de exposición a hipoxia

hipobárica. En este estudio se identificó un total de 208 proteínas que presentaron variación en los

nativos Ladakhi respecto a los controles a nivel del mar y se demostró que la vía cininógeno

calicreína bradiquinina es la principal reguladora de la actividad de eNOS, una de las isoformas de

la NOS, que al igual que iNOS (inducible) depende de la actividad de los HIFs (10).

Por otra parte, también se han evidenciado cambios en péptidos natriuréticos atriales (ANPs) que

tienen una función importante en la respuesta a hipoxia y se han asociado con la actividad del

sistema adrenérgico, debido a que son secretados en la circulación rápidamente y maximizan el

transporte de oxígeno, así como el uso de energía a corto plazo. En este sentido, los ANPs se han

catalogado como hormonas que se caracterizan por sus propiedades diuréticas, natriuréticas y

vasodilatadoras, y se ha propuesto que la presión sanguínea es el principal estímulo para su


36

liberación (67). Los ANPs tienen receptores específicos, y su función biológica esta mediada por el

guanosín monofosfato cíclico (cGMP) como un segundo mensajero. Sin embargo, se ha demostrado

que los individuos que se aclimatan a grandes altitudes no presentan o presentan cambios mínimos

en los ANPs, por lo cual dichos cambios se han asociado exclusivamente con condiciones

patológicas en las que la natriuresis es alterada (68) (69) (68).

Como es conocido los niveles de múltiples hormonas en plasma pueden variar por factores como

la edad y el origen étnico, y de esta forma pueden influenciar la respuesta ante diferentes factores

de estrés como la hipoxia. Lo anterior teniendo en cuenta que la aclimatación es un proceso crítico

regulado en múltiples niveles que incluyen al sistema endocrino en relación con el balance de

fluidos por natriuresis y diuresis, así como también por variaciones en el requerimiento y la

disponibilidad de metabolitos fundamentales como el hierro, la glucosa y el NO (69). De esta forma,

se ha propuesto que la variación entre individuos respecto a la respuesta endocrina es significativa

y tiene lugar por un amplio grupo de hormonas como epinefrina, vasopresina, leptina, insulina,

cortisol, hepcidina, y grelina, entre otras. Estas diferencias se pueden atribuir a variaciones en el

tiempo de exposición y al ciclo circadiano de cada hormona, por lo cual no ha sido posible

establecer un consenso respecto a los procesos regulados por estas bajo la condición de hipoxia

hipobárica (69).

Los estudios integrativos a partir de las ciencias ómicas en hipoxia han permitido determinar los

cambios a nivel celular que tienen un efecto directo en la fisiología de los individuos expuestos a

hipoxia hipobárica. Como un ejemplo de esto, un estudio realizado por Chicco y colaboradores, que

tenía como objetivo evaluar el metabolismo energético en músculo esquelético después de

someter a 21 individuos nativos de bajas altitudes durante 16 días a 5260 msnm permitió evidenciar

diferencias considerables a nivel metabólico y proteómico en los individuos a nivel del mar y

después de 16 días de exposición a hipoxia hipobárica (70). Mediante biopsias de músculo se

determinó que hubo un aumento en 119 de 250 metabolitos que incluían intermediarios

glucolíticos, aminoácidos y ácidos grasos, lo que es indicador de una mayor disponibilidad de

sustratos metabólicos en músculo esquelético bajo hipoxia. También se realizó la evaluación del

proteoma y se evidenciaron cambios significativos en 38 proteínas, de las cuales 31 disminuyeron


37

y estaban representadas principalmente por las que tenían una función mitocondrial y glucolítica

(citocromo c oxidasa, succinato deshidrogenasa, gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa y piruvato

quinasa, entre otras). Por otra parte, 7 de las proteínas que presentaron variación, incrementaron

significativamente después de los 16 días y entre estas se destacaron enzimas de glucólisis

(fosfoglicerato quinasa), oxidación de ácidos grasos (carnitina O-palmitoiltransferasa) y la

subunidad catalítica del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial. Con los hallazgos de este

estudio parece que la condición de hipoxia retiene componentes específicos del metabolismo

muscular citosólico y mitocondrial en condiciones fisiológicas de reposo, en lugar de inducir un

cambio global de la vía aeróbica a la anaeróbica (70). También sugiere que la reducción de enzimas

en músculo esquelético es el reflejo de la reducción del gasto energético para mejorar la eficiencia

metabólica, lo cual es consistente con otros estudios y por lo cual se ha propuesto que la dinámica

mitocondrial mejora la eficiencia en la producción energética evitando la generación excesiva de

especies reactivas de oxígeno (ROS) en hipoxia (70).

Tomando como ejemplo el estudio anterior, los trabajos en proteómica para evaluar la condición

de hipoxia se han realizado mayoritariamente en plasma y en tejido muscular. Primordialmente,

los estudios realizados en fluidos como el plasma y el suero sanguíneo destacan su importancia

como una fuente útil de información que se puede obtener de forma mínimamente invasiva. Por

otra parte, la importancia de los estudios en músculo radica en que este tejido proporciona un

buen modelo de adaptación de hipoxia in vivo, ya que su tasa metabólica puede aumentar hasta

100 veces más que los niveles basales, y está sujeta a niveles fluctuantes de oxígeno durante el

ejercicio (71). Por ejemplo, se ha reportado que la exposición a hipoxia hipobárica prolongada

genera alteraciones en la estructura y el volumen de la densidad mitocondrial en el tejido muscular,

así como también hay evidencia de la acumulación de lipofuscina, un producto de peroxidación

lipídica. En este sentido, en músculo esquelético de modelos murinos se ha identificado la

expresión diferencial de proteínas mitocondriales (cadena A de ATPasa y subunidad alfa de la

hidroxiacil CoA deshidrogenasa, entre otras) bajo la condición de hipoxia frente a un grupo control,

con lo cual se ha concluido que la exposición a hipoxia hipobárica durante 30 días afecta la

expresión de las proteínas mitocondriales que participan en la producción de ATP (adenosín


38

trifosfato) y el metabolismo de lípidos, lo que disminuye la estabilidad de la membrana

mitocondrial y afecta la cadena de transporte de electrones (72).

Otro de los cambios en el músculo durante la condición de hipoxia hipobárica se ve reflejado en la

síntesis de proteínas, lo cual se relaciona con la pérdida de peso característica de habitantes de

tierras bajas en la altitud. De acuerdo con los resultados de estudios que evalúan la síntesis de

proteínas en músculo bajo la condición de hipoxia, se ha establecido que probablemente el

músculo es resistente a estímulos anabólicos y es más sensible a condiciones que regulan

negativamente la síntesis de proteínas musculares y favorecen la proteólisis muscular. Al parecer,

la regulación negativa de la síntesis de proteínas en el músculo ocurre por mecanismos

dependientes e independientes de los HIFs que implican la señalización del complejo 1 del objetivo

mecanicista de la rapamicina quinasa (mTORC1), que a su vez depende del grado de hipoxia, el

estado energético y la actividad física (73).

En un estudio realizado por Vigano y colaboradores (74), se evaluó el efecto de la exposición a

hipoxia hipobárica (4559 msnm) durante 7 y 9 días en proteínas en músculo esquelético mediante

DIGE acoplada a MS para determinar los mecanismos funcionales involucrados en la aclimatación,

y como resultado se evidenció que proteínas implicadas en el transporte de hierro, el ciclo de Krebs,

la fosforilación oxidativa y la respuesta a estrés oxidativo disminuyeron significativamente (74).

Entre estas se destacan la alfa-enolasa, un marcador de lesión por hipoxia tisular, la 2-oxoglutarato

deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, aconitato hidratasa, superóxido dismutasa, glutatión

transferasa y las peroxiredoxinas 2 y 6, consideradas como marcadores del estado redox (74).

También se vio reducida la expresión de marcadores de la función mitocondrial como la beta

ATPasa, el complejo de la proteína ubiquinol-citocromo c reductasa y la mitofilina entre otras, y de

algunas proteínas involucradas en la beta oxidación (74). Por otra parte, se encontró que la

expresión de la guanidinoacetato N-metil transferasa implicada en la biosíntesis de creatina y el

metabolismo de aminoácidos está aumentada, así como el número de proteínas ubiquitinadas, lo

que indica que la oxidación de ácidos grasos y la ruta ubiquitina-proteasoma tienen mayor actividad

(74). En el mismo estudio se encontró que los marcadores de hipoxia como HIF-1a, la quinasa de la

piruvato deshidrogenasa 1 (PDK1), mTOR y el factor de iniciación de la traducción 2a (eIF2a), no


39

presentaron cambios en hipoxia aguda excepto mTOR que se redujo, lo que puede sugerir una

cascada de señalización independiente de mTOR. Los resultados respecto a mTOR son

contradictorios en comparación con otros estudios realizado en modelos murinos, que sugieren

que mTOR no está sujeto a cambios en la presión parcial de oxígeno (74) (71). Sin embargo, la

evidencia sugiere que mTOR potencia la actividad transcripcional de HIF-1a sin afectar sus niveles

de ARNm o la tasa de degradación y en consecuencia puede regular positivamente su actividad por

otros mecanismos, posiblemente de acuerdo con el tipo de célula y el estado fisiológico (12). Por

otra parte, mTOR es principalmente conocido por ser un regulador negativo de la traducción

mediante la fosforilación de eIF2a, y de esta puede tener control en la expresión de una amplia

variedad de proteínas durante la condición de hipoxia (12).

De acuerdo con los estudios realizados en músculo, se puede sugerir que la disminución en la

síntesis de ATP está mediada por la respuesta transcripcional posterior a la exposición a hipoxia

que parece afectar procesos anabólicos que requieren una alta demanda de ATP celular. Lo anterior

sugiere que la inhibición de la síntesis de proteínas puede ser necesaria para mantener la

homeostasis celular y proporciona una adaptación rápida a la disponibilidad reducida de oxígeno,

donde la única evidencia indirecta de la inhibición de la síntesis de proteínas es la disminución de

mTOR (73). En general, los cambios en el proteoma a partir de fluidos biológicos y tejido muscular

son compatibles con la disminución de enzimas del ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa, por

lo cual es evidente que en respuesta a la condición de hipoxia, el control del gasto de energía es

crucial y por lo tanto, disminuye la síntesis de proteínas en tejidos como el músculo para mantener

el suministro de energía al sistema nervioso central y al corazón (71).

Considerando la complejidad de la respuesta a hipoxia durante el proceso de aclimatación, el

análisis de los perfiles de expresión diferencial de proteínas a partir de fluidos biológicos y tejidos

de individuos y modelos murinos sometidos a hipoxia hipobárica respecto a los controles a nivel

del mar han permitido postular algunos mecanismos subyacentes al proceso de aclimatación y a la

susceptibilidad de los individuos frente al AMS y el CMS. Sin embargo, a la fecha aún es difícil

establecer un consenso entre los estudios reportados a causa de las diferencias en el tiempo y la

altitud (61).


40

3. Justificación

La hipoxia hipobárica es una condición que genera diferentes mecanismos de respuesta derivados

de cambios a nivel molecular para compensar la disminución en la disponibilidad de oxígeno. Estos

mecanismos dependen principalmente del tiempo y el grado de exposición a la altitud. En los

estudios realizados hasta la fecha se han demostrado cambios en variables hematológicas y en el

proteoma sérico y plasmático que están relacionados con el ajuste fisiológico durante los procesos

de aclimatación y adaptación a la altitud en nativos a nivel del mar en altitud y nativos de grandes

altitudes.

Actualmente no hay un consenso que permita determinar el tiempo requerido para el proceso de

aclimatación en humanos, y tampoco se ha llegado a un consenso respecto a los cambios en el

proteoma que tienen lugar durante este proceso en nativos de la región andina a altitudes

moderadas. El estudio de las proteínas implicadas en los mecanismos de respuesta a hipoxia

hipobárica puede también ser relevante en otras situaciones en las que la hipoxia es característica.

De acuerdo con un reporte en 2004 de la organización mundial de la salud (OMS), el 22,46% de las

muertes en todo el mundo ocurre debido a la condición de hipoxia, ya sea de forma directa o

indirecta por patologías como isquemias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y diferentes

tipos de cáncer, entre otras.

El estudio de los mecanismos implicados en la respuesta a hipoxia hipobárica así como la

comprensión de los cambios en el proteoma durante el proceso de aclimatación tiene un gran

impacto a nivel clínico debido a la importancia de las proteínas como moléculas funcionales

responsables del ajuste fisiológico en respuesta a hipoxia. Por lo anterior, en este trabajo se

propuso la evaluación del proteoma sérico durante el proceso de aclimatación para determinar la

posible relación con parámetros hematológicos como una aproximación de carácter exploratorio

para la búsqueda de potenciales biomarcadores asociados a hipoxia hipobárica.


41

4. Preguntas de investigación

A partir de lo expuesto anteriormente, se plantearon los siguientes interrogantes que dieron

lugar al desarrollo de este trabajo:

● ¿Es posible identificar cambios en el perfil de proteínas en suero durante el proceso de

aclimatación de individuos expuestos a la condición de hipoxia hipobárica mediante la

técnica de 2D-PAGE?

● ¿Qué proteínas presentan perfiles de expresión diferencial y en qué procesos biológicos

participan?

● ¿Es posible identificar un patrón en el comportamiento de variables hematológicas durante

el proceso de aclimatación?

● ¿Hay relación entre los cambios en parámetros hematológicos y el proteoma sérico

durante el seguimiento de individuos expuestos a hipoxia hipobárica?


42

5. Objetivos

5.1 Objetivo General

Establecer diferencias en el perfil de expresión de proteínas circulantes en suero durante el

proceso de aclimatación de individuos colombianos expuestos a hipoxia hipobárica.

5. 2 Objetivos Específicos

● Evaluar algunas variables hematológicas durante el seguimiento de individuos originarios

de baja altitud expuestos a la condición de hipoxia hipobárica.

● Reducir la complejidad proteica del suero sanguíneo para su posterior caracterización

electroforética.

● Determinar las condiciones experimentales que permitan la cuantificación y el análisis del

perfil de proteínas circulantes en suero mediante 2D-PAGE.

● Identificar algunas de las proteínas que se expresan diferencialmente en suero sanguíneo

inmunodepletado durante el seguimiento de individuos expuestos a hipoxia hipobárica.

● Establecer la posible función de las proteínas identificadas durante el proceso de

aclimatación.


43

6. Materiales y métodos

En este capítulo se presenta la metodología propuesta para el desarrollo de este trabajo que

comprende la selección de los individuos que participaron en el estudio, la toma de muestras de

sangre de los participantes, el tratamiento de las muestras para la determinación de algunas

variables hematológicas y la evaluación del proteoma sérico mediante 2D-PAGE, con la

subsecuente identificación de algunas de las proteínas diferencialmente expresadas.

6.1 Selección de los individuos que participaron en el

estudio

Para el inició de este trabajo se contactó a los estudiantes admitidos a la sede Bogotá de la

Universidad Nacional de Colombia provenientes de zonas con un umbral de altitud <1400 msnm

con los cuales se socializó el propósito y la idea general del proyecto vía correo electrónico antes

de su llegada a Bogotá. Posteriormente, el día 1 después de su llegada a Bogotá (2600 msnm) se

socializó el proyecto en su totalidad. Para la selección se solicitó a los participantes responder una

encuesta básica relacionada con su estado de salud y actividad física para determinar si cumplían

con los criterios de inclusión y exclusión propuestos. Una vez el proyecto fue socializado y los

individuos manifestaron libre y voluntariamente su deseo de participar firmaron el consentimiento

informado ellos o sus acudientes, en caso de ser menores de edad.

Criterios de inclusión

✓ Haber nacido a una altitud por debajo de los 1400 msnm y haber vivido a ese umbral de

altitud durante mínimo 2 años

✓ Tener al menos 16 años al momento de participar

✓ Aceptar y firmar el consentimiento informado (acudiente en caso de menores de edad)

✓ Estar en disposición de realizar el seguimiento durante 3 meses


44

Criterios de exclusión

✓ Estar en estado de embarazo o lactancia

✓ Haber viajado a zonas de alta altitud en los últimos 6 meses o haber permanecido más de

un día en altitud

✓ Usar algún medicamento bajo prescripción medica

✓ Tener alguna enfermedad hematológica, respiratoria o renal diagnosticada por un médico

✓ Ser fumador

✓ Realizar actividad física de alta intensidad de manera recurrente

✓ Tener algún plan de alimentación especial (Ej: vegetariano, vegano, etc.)

Este estudio, antes de ser puesto en marcha, fue evaluado y aprobado por el comité de ética de la

facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia en Acta 09-2017 para su realización e

incluye el formato del consentimiento y asentimiento informado que fueron debidamente

socializados y firmados por los participantes (Anexo A). Una vez se verificó que los participantes

cumplían con los criterios propuestos se realizó el seguimiento por tres meses desde su llegada a

Bogotá. Durante la ejecución de este proyecto se aplicaron los protocolos de bioseguridad

requeridos, y se garantizó la protección de la identidad de los participantes, la confidencialidad de

la información y el uso exclusivo de los datos por los investigadores.

6.2 Toma de muestras de sangre y seguimiento

Con cada individuo se realizó la determinación del peso y la estatura, y la toma de una muestra de

sangre de la vena antecubital (4ml) recolectada en tubos al vacío con EDTA y gel separador (BD

Vacutainer® SST™) para la determinación de variables hematológicas y la evaluación del proteoma

sérico respectivamente los días 1,3,5,12,19,26,56 y 86 desde su llegada a Bogotá (2600 msnm)

(Tabla 3). Lo anterior corresponde a un experimento de riesgo mínimo (Resolución 008430 de 1993,

MinSalud).


45

Tabla 3. Toma de muestras de los individuos incluidos en el estudio.

Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8

Día 1 3 5 12 19 26 56 86

Una vez se realizó la toma de cada una de las muestras de sangre se siguió el protocolo para la

determinación de algunas variables hematológicas y la separación del suero sanguíneo. Para esto,

el tubo con gel separador se invirtió suavemente entre 5 y 10 veces, y se dejó reposar a

temperatura ambiente durante 30 minutos para centrifugar a 3000rpm por 10 minutos a

temperatura ambiente. Posteriormente se aisló el suero obtenido y se adicionó el volumen

necesario de coctel inhibidor de proteasas P8340 (Sigma) en una relación de 1μl por cada 400μl de

suero, se mezcló y se realizaron alícuotas de 500μl para almacenar a -80°C hasta su análisis. El uso

de inhibidor de proteasas garantiza cambios mínimos en los espectros de proteínas obtenidos por

MS en los análisis posteriores (75).

6.3 Determinación de variables hematológicas

El día correspondiente a la toma de muestras de sangre durante el seguimiento de los participantes

se realizó la determinación de la concentración de Hb y el hematocrito (Hct) por duplicado a partir

de la muestra recolectada en tubos con EDTA.

Para la determinación de la concentración de Hb se usó el equipo OSM3 (Radiometer, Dinamarca),

que permite la cuantificación fotométrica de Hb usando un pequeño volumen de muestra (75µl).

Paralelo a esto, se realizó la determinación del Hct por el método de microhematocrito. Para esto

se llenó un capilar con el volumen de muestra requerido dejando medio centímetro en uno de los

extremos y se selló manualmente. La muestra se centrifugó a 5000rpm durante 5 minutos. Una vez

transcurridos los 5 minutos, el capilar se colocó en el respectivo lector para determinar el valor del

hematocrito como porcentaje.


46

6.4 Tratamiento de la muestra de suero

Debido a la complejidad de proteínas que componen el suero sanguíneo y la abundancia de

proteínas como Alb e IgGs que dificultan su caracterización mediante electroforesis, fue necesario

realizar el tratamiento de las muestras para reducir su complejidad. Con este objetivo se empleó el

sistema ProteoPrep® (Blue Albumin and IgG depletion kit, Sigma-Aldrich) diseñado para remover

Alb e IgGs de suero humano para análisis en proteómica. Para esto, previamente se realizó una

dilución en relación 1:100 de suero: cloruro de sodio 0.15M para la cuantificación de proteínas

usando ácido bicinconínico (BCA), posteriormente se tomó el volumen (25-100μl) correspondiente

a una cantidad de proteínas totales entre 2 y 2,5mg para la depleción. El procedimiento realizado

se siguió de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y como se describe a continuación.

El medio suministrado en el kit para el acondicionamiento de la columna se agitó suavemente hasta

verificar una suspensión uniforme antes de usar, posterior a esto se transfirió un volumen de 400μl

a la columna que se colocó en un tubo nuevo de colección de 2ml y se centrifugó a 10000rpm por

1 minuto para remover el buffer de almacenamiento. Luego se verificó que el buffer de

almacenamiento se hubiera recolectado en el tubo de colección y se descartó conservando el

mismo tubo de colección. Posterior a esto se adicionaron 400μl del buffer de equilibrio a la columna

y se centrifugó a 10000rpm por 1 minuto, se descartó el buffer de equilibrio y se continuó usando

el mismo tubo de colección. Se agregaron nuevamente 400μl del buffer de equilibrio y se centrifugó

como se indicó anteriormente, se descartó el tubo de colección y se colocó la columna en un tubo

de colección nuevo. Con este procedimiento se preparó la columna para colocar el volumen de

suero correspondiente y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después se

centrifugó a 12000rpm por 1 minuto en un tubo de colección nuevo. El eluido recolectado en el

tubo de colección se pasó nuevamente por la columna y se incubó a temperatura ambiente durante

10 minutos para garantizar que la depleción fuera óptima. Después, la columna se centrifugó a

12000rpm por 1 minuto en el mismo tubo de colección que en el paso anterior. Para retirar el

remanente de proteínas no unidas se agregaron 100μl de buffer de equilibrio en el centro de la

columna en el mismo tubo de colección. Luego se centrifugó a 12000 rpm por 1 minuto y se

recolectó el eluido que corresponde a las proteínas no unidas.


47

Posterior a la recolección del eluido de proteínas no unidas, se realizó la elución de proteínas unidas

a la columna y para esto se transfirió la columna a un tubo de colección nuevo y se agregaron 150

μl del reactivo de extracción tipo 4 suministrado por el kit (Urea 7M, Tiourea 2M, 1% C7BzO, 40

Mm Trizma, pH 10.4) en el centro de la columna. Luego se centrifugó la columna a 12000rpm por

1 minuto y se agregaron nuevamente 150μl del reactivo de extracción tipo 4 conservando el mismo

tubo de colección. A continuación, se centrifugó a 12000rpm y se verificó la recolección de un

volumen de 300μl.

El procedimiento descrito se realizó dos veces para obtener un volumen de 200μl del eluido de

proteínas no unidas y 600μl del eluido de proteínas unidas a la columna. Finalmente, con el

volumen correspondiente al eluido de proteínas no unidas se preparó una dilución de 1:40 en

cloruro de sodio 0.15M para la cuantificación con BCA y el volumen restante se almacenó a una

temperatura de -20°C.

6.4.1 Cuantificación de proteínas

La cuantificación de proteínas totales se realizó mediante el método de BCA a partir de la muestra

de suero sanguíneo y posterior a la depleción de Alb e IgGs. Este método se fundamenta en que las

proteínas reducen los iones cúpricos a cuprosos (Cu2+ ----> Cu1+) bajo condiciones alcalinas, y estos a

su vez reaccionan con el BCA para formar un complejo púrpura estable que permite la detección

colorimétrica a 570nm. Este método de cuantificación tiene varias ventajas entre las que se puede

destacar que tiene un límite de detección menor que otros métodos (Bradford y Lowry), presenta

linealidad en un amplio rango de concentraciones (200-1000μg/ml), menor susceptibilidad frente

a otros métodos respecto a la presencia de detergentes en la muestra y el complejo formado

producto de la reacción es estable.

Para la cuantificación se realizó una curva de calibración por duplicado de concentraciones

estándar entre 0-1000μg/ml de BSA (Bovine Serum Albumin) y se preparó la solución de trabajo

para la cuantificación de los patrones de BSA y las muestras en placas de 96 pozos. Para la

cuantificación de las muestras de suero y los eluidos de proteínas no unidas posterior a la depleción

se prepararon diluciones en relación 1:100 y 1:40 en cloruro de sodio 0.15M respectivamente. Para


48

la cuantificación se mezclaron 200μl de la solución de trabajo con BCA y 25μl de cada dilución y los

patrones. Las muestras se incubaron a 37°C por 30 minutos y se leyó la absorbancia en el lector de

placas de Elisa a una longitud de onda de 570nm verificando la formación de un complejo púrpura

hidrosoluble. La concentración de proteína en las muestras se determinó por comparación con la

curva estándar de BSA y se realizó por duplicado para cada una de las muestras.

6.4.2 Precipitación de proteínas

El suero sanguíneo contiene además de proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos y sales

que dificultan el proceso de migración de las proteínas durante la electroforesis, así como

interferencias con los diferentes métodos de tinción de los geles. Por lo anterior, se han establecido

diferentes metodologías para eliminar este tipo de interferentes del suero, entre las más comunes

se destacan la diálisis, la ultrafiltración y la precipitación (76).

La precipitación de proteínas constituye un paso fundamental para eliminar agentes

contaminantes, garantiza que las proteínas presentes en la muestra se concentren y a su vez

permite desintegrar complejos proteicos e inactivar proteasas en un solo paso. Aunque con este

objetivo hay diferentes métodos, la selección del método más adecuado depende de varios

factores como son las características de la muestra, el análisis posterior de la misma, el número de

muestras y su manipulación. De acuerdo con todos los factores anteriormente mencionados y por

revisión en la literatura el método más adecuado para la precipitación de proteínas es el

tratamiento de las muestras con ácido tricloroacético-acetona (TCA-acetona) que favorece el

análisis posterior por 2D-PAGE. Con este método las proteínas son desnaturalizadas y solubilizadas

mediante agentes caotrópicos, detergentes y agentes reductores que son compatibles con la

electroforesis (76) (62).

Para la precipitación de proteínas con TCA-acetona se siguió un protocolo reportado previamente

(77). A partir de los resultados de la cuantificación de proteínas se tomó el volumen de suero

sanguíneo depletado correspondiente a una cantidad de proteínas totales de 500μg (77). A este

volumen se agregaron 10µl de TCA frío para una concentración final de 10% y el volumen se

completó con agua a 100µl. La muestra se incubó a -10°C durante 1 hora, y posterior a esto se


49

centrifugó a 10000rpm por 15 minutos (4°C). Se retiró el sobrenadante con pipeta y al pellet se

agregó un volumen de 50µl de acetona fría (-20°C). Posterior a esto, se centrifugó nuevamente a

10000rpm por 5 minutos (4°C). El paso anterior se repitió nuevamente y se descartó el

sobrenadante con pipeta. Se verificó que el pellet estuviera completamente seco y se resuspendió

en 325μl del buffer de rehidratación (7M urea, 2M tiourea, 2% CHAPS, 0.2% anfolitos-Biolyte) para

proceder a realizar la primera dimensión de la electroforesis.

6.4.3 Electroforesis bidimensional 2D-PAGE

Para la 2D-PAGE se siguieron protocolos previamente descritos (77). Se tomó el volumen de la

muestra solubilizada en buffer de rehidratación que corresponde a 500μg de proteínas totales en

un tubo eppendorf de 1,5ml y se adicionaron 12µl de DTT (1M) y 3µl de azul de bromofenol (1%)

para una concentración final de 40mM y 0.002% respectivamente en un volumen final de 340µl.

Posterior a esto se colocó todo el volumen de la muestra en la cubeta para el isoelectroenfoque

entre los dos electrodos evitando la formación de burbujas y con ayuda de pinzas se retiró el

plástico protector de la tira y se colocó el gel de la tira hacia abajo verificando que quedara

sumergido en el volumen de la muestra. La cubeta se cubrió con la tapa y se colocó en el dispositivo

Protean® IEF cell (Biorad) para dejar en rehidratación pasiva por 1 hora a temperatura ambiente.

Se usaron tiras de un gradiente de pH de 5-8 y 18cm de largo teniendo en cuenta que la separación

de las proteínas es favorecida usando este formato de acuerdo con la complejidad de la muestra

(Biorad, ref 1632036).

Una vez terminó el tiempo de rehidratación pasiva, se colocaron 2ml de aceite mineral (Biorad)

sobre la tira comenzando por un extremo hacia el centro para que esta quede completamente

sumergida y así evitar la deshidratación y el sobrecalentamiento durante el proceso. En el equipo

se especificó el número de tiras que se colocaron para iniciar la fase de rehidratación activa, así

como también se verificó el programa de isoelectroenfoque a 20°C (Tabla 4).


50

Tabla 4. Programa de Isoelectroenfoque para tiras de 18cm (76).

Voltaje Tiempo (Horas) Etapa

0 1 Rehidratación Pasiva-Sin

corriente

50 11 Rehidratación Activa

250 0,5 Rampa Rápida


1000 1 Constante


4000 1 Constante

8000 1 Rampa Rápida

10000 Hasta 60000 Rampa Rápida

500 5 Paso de seguridad- Rampa lineal

Al terminar el programa se retiró la cubeta del equipo y con ayuda de pinzas se sujetó la tira en

posición vertical en la cubeta para eliminar el exceso de aceite mineral. Posterior a esto, se ubicó

la tira con la parte del gel hacia arriba en una placa de equilibrio, cuando fue necesario las tiras se

guardaron en la placa a -20°C o -80°C dependiendo del tiempo de almacenamiento requerido hasta

correr la segunda dimensión.

Para realizar la segunda dimensión, se descongeló el volumen necesario de buffer de equilibrio y

se dispuso en un tubo falcón de 15ml, teniendo en cuenta que por tira se requieren 3ml de buffer,

en este mismo tubo se pesó la cantidad de ditiotreitol (DTT) requerida para la reducción de las

proteínas en la tira, teniendo en cuenta que por tira se requieren 60mg de DTT. El DTT se solubilizó

por inversión del tubo y a cada una de tiras en la placa de equilibrio se agregaron 3ml de buffer de

equilibrio con DTT. La placa se colocó en agitación horizontal moderada durante 15 minutos a

temperatura ambiente. Luego se descartó esta solución y se colocó el volumen necesario de buffer

de equilibrio en un falcón de 15ml y se pesó la cantidad de yodoacetamida (IOA) requerida de


51

acuerdo con el número de tiras (125mg por tira). La IOA se solubilizó en la cantidad del buffer

requerido y se colocaron 3ml a cada tira para realizar el segundo lavado por 15 minutos a

temperatura ambiente con agitación horizontal.

Paralelo al tiempo del isoelectroenfoque se preparó un gel SDS-PAGE al 12% (p/v) en condiciones

denaturantes que consistió en realizar el montaje requerido y la mezcla de acuerdo con el número

de geles necesarios (agua, tris-HCl 1.5M pH8.8, acrilamida 30%, bisacrilamida 0.8%, SDS 10%,

persulfalto de amonio 10% y tetrametiletilendiamina (TEMED)). Inmediatamente después de servir

la acrilamida, se colocó isopropanol al 10% y se esperó el tiempo necesario hasta verificar la

completa polimerización de los geles. Se retiró el isopropanol y se colocó el mismo volumen buffer

de corrida 1X sobre el gel. Luego con ayuda de pinzas se colocó la tira de gradiente de pH con el gel

hacia el frente verificando que estaba en contacto con la acrilamida. Posterior esto se sembraron

10μl del marcador de peso molecular con ayuda de unas pinzas y papel filtro en el extremo

izquierdo del gel. Luego se colocaron sobre la parte superior de la tira aproximadamente 2 ml de la

solución selladora de agarosa al 1% (p/v) con azul de bromofenol (0.01%) para fijar la tira y

visualizar el frente de corrida.

Una vez listo el montaje, se llenó la cámara de electroforesis con buffer de corrida 1X, y los geles

se corrieron a 60V hasta que el frente de corrida llegó al final del gel. Al terminar la electroforesis

se desmontaron los geles y se visualizaron por tinción con azul de Coomassie coloidal. Para esto se

siguió un protocolo de tinción que requiere de 4 soluciones con agitación horizontal continua en

cubetas usando un volumen de 200ml de cada solución por gel (Tabla 5).


52

Tabla 5. Soluciones para revelado de geles con Azul de Coomassie G-250

Solución Composición Tiempo

1 Etanol 50%, Ácido fosfórico 2%, Agua 3 horas

2 Agua destilada Lavados cada 20 minutos

por 3 veces

3 Etanol 18%, Ácido fosfórico 2%, Sulfato

de amonio 15%, Agua

1 hora

4 Azul de Coomassie G-250 2% Adición a la solución 3 de 2

ml de Coomassie coloidal.

Posterior a los 3 días de tinción de los geles con la solución 4 se realizaron sucesivos lavados con

agua milli-Q para eliminar el background y se documentaron en un analizador de imágenes

(Biorad). Los geles se conservaron en una solución de ácido acético al 5% hasta cortar los spots que

fueron seleccionados posteriormente para la identificación por MS.

Como parte del método seleccionado para la tinción de los geles es necesario destacar que el

agotamiento de proteínas abundantes como Alb e IgGs no es suficiente por sí solo para detectar

variaciones en proteínas de baja abundancia, y en consecuencia actualmente se emplean

diferentes métodos de tinción altamente sensibles para la visualización como son los métodos

basados en agentes fluorescentes como Oriole y Sypro Ruby (Biorad) entre otros, que permiten

detectar cantidades de proteínas hasta de 1ng. Sin embargo, el alto costo de estos métodos de

tinción ha limitado su uso, por lo cual uno de los métodos más usados para la tinción se realiza con

azul de Coomassie coloidal G-250. Este tiene la capacidad de formar complejos con ciertos

aminoácidos básicos como arginina, tirosina, lisina e histidina proporcionando una sensibilidad

para la detección de proteínas de 10ng, no produce un background muy intenso en el gel, es de

fácil aplicación y es compatible con técnicas como MS.


53

6.4.4 Análisis de los geles obtenidos por 2D-PAGE

La visualización de los geles después de la tinción se realizó para su respectiva documentación y

para exportar las imágenes en formato .TIFF. El análisis posterior para determinar las posibles

diferencias entre los geles pertenecientes a un mismo individuo a lo largo del seguimiento se realizó

con el software Delta 2D (Decodon). La elección del programa de análisis fue un criterio

fundamental debido a que con el tiempo se han desarrollado diferentes software que presentan

diferencias en el esquema de flujo de trabajo y tienen como fundamento dos categorías diferentes,

algunos tienen como criterio inicial la detección de spots y otros el solapamiento de las imágenes,

con este último enfoque se ha determinado que es posible evaluar de forma más rápida la

expresión diferencial de proteínas. Independientemente de la categoría a la que pertenece cada

software, su implementación garantiza que los resultados puedan ser evaluados objetivamente y

que sea posible extraer información respecto a los cambios de expresión a nivel de proteínas,

teniendo en cuenta que los algoritmos implementados en la detección de spots tienen como

objetivo superar la distorsión de las imágenes y las dificultades propias de la migración

electroforética que afectan la detección de spots, la cuantificación y la creación de perfiles de

expresión.

Delta 2D es un software que tiene como principio el solapamiento de imágenes. Esto permite

realizar la comparación entre las imágenes tomadas en diferentes tiempos y sus respectivas

réplicas, en este caso permitió realizar la comparación entre las imágenes obtenidas a lo largo del

seguimiento de cada individuo. Este software tiene un algoritmo de filtrado de imágenes para

eliminar el ruido de fondo. Esto permite optimizar la cuantificación y solapar las imágenes para la

asignación de spots mediante vectores en un gel fusión que incluye los spots de todos los geles

para su posterior modelamiento gaussiano. De esta manera es posible generar un mapa del

proteoma que es representativo de todo el experimento. Aunque la detección de los spots es

automática, la asignación de los vectores se realizó de forma manual para corroborar los resultados

del solapamiento entre los geles. La comparación entre los spots se realizó eligiendo como

parámetro la normalización del volumen que se usó para asignar el valor de fold change (FC). Para


54

seleccionar los spots que presentaron los mayores cambios en el tiempo se tuvo en cuenta el gel

fusión generado por Delta 2D para todos los puntos de tiempo de cada individuo (Figura 7).

Figura 7. Flujo de trabajo para el análisis de spots en Delta 2D. En el diagrama se especifican cada

uno de los pasos desde la adquisición de las imágenes para el análisis con Delta 2D hasta la selección

de algunos de los spots para su identificación por MS.

Luego de la asignación y filtrado de los spots, se realizó un análisis de agrupamiento con base en el

volumen normalizado. La normalización de volumen generalmente es la mejor opción para análisis

en proteómica porque en este tipo de estudios los valores de los volúmenes de cada spot no

presentan en un 100% una distribución normal debido a que entre los spots de mayor abundancia

hay mayor varianza. Existen diferentes tipos de algoritmos de agrupación (clustering) basados en

modelos de conectividad, centroides, distribución y densidad. Entre los más comúnmente usados

se destacan los algoritmos de agrupación jerárquica que se encuentran clasificados dentro de


55

modelos de conectividad y consisten en métodos no supervisados de aprendizaje de máquinas o

“machine learning”. Estos algoritmos de agrupamiento jerárquico están basados en diferentes

medidas de distancia (Euclidiana, Manhattan, etc) y utilizan como criterio una distancia mínima

para encontrar grupos que no deben superponerse. Además, tienen numerosas aplicaciones

porque permiten la visualización intuitiva de complejos pero pequeños conjuntos de datos para el

reconocimiento de patrones, análisis de imágenes y bioinformática. En este trabajo se realizó el

agrupamiento jerárquico de los spots mediante distancia euclidiana y se obtuvieron clusters que se

pueden visualizar como un dendograma.

Otro tipo de algoritmo ampliamente usado para el agrupamiento es K-means, este es un modelo

basado en centroides y determina la variación entre los datos para la asignación de grupos basado

en el cálculo de la mediana y no la media como comúnmente se hace, lo cual minimiza el error en

todos los grupos para que sean “compactos”. Las similitudes en los datos se miden comúnmente

con la distancia; partiendo de la hipótesis de que dos o más objetos estarán en un grupo particular

si están estrechamente relacionados en función de una distancia dada. Aunque existen varios

enfoques de agrupamiento, aún surgen dificultades para encontrar una técnica de agrupamiento

adecuada para determinados conjuntos de datos experimentales. Sin embargo, el análisis basado

en K-means es un método de agrupamiento por partición que está integrado en Delta 2D y se

empleó para la obtención de clusters de spots para cada individuo. Lo anterior con el objetivo de

evidenciar si algunos de los spots pertenecientes al mismo cluster tenían funciones biológicas

relacionadas, y debido a que se tiene como antecedente que este algoritmo es ampliamente usado

para el análisis de conjuntos de datos biológicos (78).

A partir del agrupamiento realizado con los valores del FC y el valor de p obtenido de la prueba t

de student para cada spot en Delta 2D, se identificó el punto de tiempo en el que se presentaba

mayor cambio usando diagramas de volcano. Este tipo de gráficas es ampliamente usado en el

análisis de grandes conjuntos de datos en ciencias ómicas. Finalmente, la combinación de estos dos

parámetros (FC≥2 y p≤0.05) fue el criterio para seleccionar los spots que fueron identificados

mediante MS (Figura 7).


56

6.5 Identificación de proteínas por espectrometría

de masas

A partir del análisis comparativo de las imágenes con Delta 2D se seleccionaron algunos spots entre

los dos individuos que cumplían con los criterios antes mencionados para su identificación. Aunque

un buen número de spots cumplieron con el criterio de selección, debido a limitaciones

presupuestales solo fue posible usar 12 de estos para su identificación. Los spots seleccionados

fueron cortados manualmente y se transfirieron a un tubo eppendorf de 0.6ml con agua Milli-Q

para su identificación por huella peptídica MS/MS mediante MALDI-TOF/TOF en la Unidad de

proteómica de la Universidad de Córdoba (España).

Según el protocolo seguido por la unidad de proteómica para la identificación de los spots, los

fragmentos de gel se digirieron con tripsina usando dos pasos de destinción de 30 minutos a 37ºC

con 100mM bicarbonato amónico/50% acetonitrilo; dos rondas de lavado con 25mM bicarbonato

amónico y dos más con 25mM bicarbonato amónico/50% acetonitrilo, durante 15 minutos cada

una; deshidratación con 100% acetonitrilo durante 5 minutos y secado de la muestra a temperatura

ambiente. A continuación, las muestras se hidrataron con 20ml de tripsina porcina (Promega)

preparada en 25mM bicarbonato amónico a 12.5ng/ml, durante 45 minutos a 4ºC; se retiró la

tripsina sobrante y se añadieron 20ml de 25mM bicarbonato amónico, incubando las muestras a

37ºC durante 12 horas o bien en microondas a 200W en dos pasos de 5 minutos.

La digestión se detuvo añadiendo a cada muestra 1ml de una solución de ácido trifluoracético (TFA)

al 10% en agua. Los péptidos resultantes de la digestión con tripsina, se purificaron mediante una

microcolumna de resina C18 (ZipTip, Millipore), eluyéndose directamente con una solución de

matriz (1,4mg/ml de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico preparada en 85% acetonitrilo, 15% agua,

0.1% TFA y 1mM NH4H2PO4) sobre la placa MALDI en un volumen de 2ml.

Tras la cristalización sobre la placa, las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas

MALDI-TOF/TOF Ultraflextreme de Bruker, controlado por el software flexControl 3.4, en el rango

m/z de 700 a 3500Da en reflector y modo positivo.


57

Los espectros MS fueron analizados con el software flexAnalysis 3.4. Se realizó calibración interna

de los espectros utilizando las relaciones masa/carga (m/z) de los péptidos resultantes de la

autolisis de la tripsina porcina (M+H+=842.509, M+H+=2211.104), obteniéndose de esta manera

una precisión en la medida de las m/z de ± 20ppm. De cada muestra se obtuvieron espectros de

fragmentación (MS/MS) de las ocho m/z más intensas.

La identificación de proteínas se realizó teniendo en cuenta los espectros MS y sus

correspondientes MS/MS sobre la base de datos de UniProt (UniProt: the universal protein

knowledgebase) utilizando MASCOT v2.6 (Matrix Science Ltd., London;

http://www.matrixscience.com) como motor de búsqueda, integrado en el programa Protein

Scape 4.0 (Bruker), con carbamidometilación completa de los residuos de cisteína y oxidación

parcial de los residuos de metionina. El error máximo permitido en la búsqueda fue de 50 ppm para

el precursor, 0.5Da para los fragmentos MSMS y el número máximo de errores en el corte de la

proteasa fue uno. Se consideraron positivas las proteínas identificadas con score superior a 60.

Es importante destacar que la identificación exitosa de proteínas depende de la calidad de los datos

generados por el espectrómetro de masas, el método empleado en la búsqueda de datos y los

motores de búsqueda. En este trabajo los resultados se corroboraron por huella peptídica

(búsqueda con los datos de masas) y MS/MS o LIFT (búsqueda con los datos de la fragmentación

de péptidos) que confirma en todos los casos el resultado de la búsqueda utilizando MASCOT.

Actualmente, MASCOT es el motor de búsqueda más usado y su sistema de puntuación estadístico

Mowse calcula la probabilidad de un emparejamiento aleatorio entre un pico del espectro y la

relación m/z calculada a partir de la secuencia de un péptido o fragmento para cada una de las

entradas de la base de datos. De acuerdo con el número de picos realmente emparejados y los

calculados por azar, se ordenan los candidatos en un ranking de puntuación o lista priorizada que

incluye las proteínas que presentan mayor probabilidad de corresponder con la proteína analizada

en función de su huella peptídica y el emparejamiento de péptidos.

Posteriormente, los códigos de acceso de Uniprot de las proteínas identificadas se cargaron en

STRING (http://string-db.org/) para obtener una red de interacción entre las proteínas


58

identificadas y luego se evaluó el enriquecimiento de los términos GO correspondientes de acuerdo

con la categorías de proceso biológico en STRING y Gonet (http://tools.dice-database.org/GOnet/)

para establecer su posible relación con el ajuste fisiológico que tiene lugar durante la aclimatación.

http://tools.dice-database.org/GOnet/


59

7. Resultados y discusión

En este capítulo se presentan los resultados obtenidos junto con los respectivos análisis a partir de

la metodología propuesta para el desarrollo de este trabajo. Este comprende la evaluación de las

variables hematológicas, el análisis de los perfiles proteicos obtenidos, la identificación de spots y

su posible asociación con el proceso de aclimatación.

7. 1 Variables hematológicas

Para el desarrollo de este trabajo se contó con la participación de seis individuos que cumplieron

con los criterios de inclusión y exclusión propuestos, y a su vez manifestaron presentar hábitos de

alimentación saludable y tanto ellos como sus padres son procedentes de altitudes cercanas a nivel

del mar. Las características antropométricas de los individuos incluidos se muestran en la tabla 6,

uno de ellos (P5) fue excluido porque no continuó con el seguimiento.

Tabla 6. Características generales de los individuos incluidos en el estudio. *Índice de masa

corporal. Género: F: Femenino. M: Masculino.

INDIVIDUO GENERO EDAD

(Años)

ESTATURA

(cm)

PESO

(kg)

IMC*

(kg/m2)

LUGAR DE

ORIGEN-ALTITUD

(msnm)

P1 M 19 172,0 68,8 23,3 Saravena-223

P2 F 18 153,0 52,7 22,5 Arauca-125

P3 F 17 156,5 59,6 24,5 Yopal-390

P4 M 18 172,0 117 39,6 Arauca-125

P6 M 22 166,0 66,8 24,2 Saravena-223

P7 M 25 163,0 57,7 21,7 Arauquita-165


60

La evaluación de variables hematológicas ha sido la primera aproximación para la compresión de

los mecanismos fisiológicos que tienen lugar en la altitud durante la aclimatación, por lo cual fue

uno de los componentes de este trabajo. Entre las variables más estudiadas se encuentran masa

de Hb, el Hct y la concentración de Hb. En este trabajo se realizó la evaluación de estas dos últimas.

Específicamente, el Hct representa el porcentaje de glóbulos rojos en un volumen de sangre y

depende de su número y tamaño, y de otro lado, la concentración de Hb hace referencia a la

concentración de esta en un volumen determinado. Los valores de referencia a nivel clínico para el

Hct de individuos a nivel del mar están en un intervalo de 38-47% para hombres y mujeres, y el

promedio de la concentración de Hb para mujeres mayores de 21 años se ha reportado como 13.8

g/dl (12.0-15.6) y para hombres 15.5g/dl (13.5-17.5).

Los valores obtenidos de estas variables para los individuos incluidos en el trabajo se encuentran

dentro de los valores de referencia reportados (Figuras 8,9). Como se puede observar, hay

diferencias claras entre el promedio de la concentración de Hb y el porcentaje de Hct para mujeres

(P2, P3, Hb: 13,14g/dl-Hct: 40,8%) y hombres (P1, P4, P6, P7, Hb: 16,17 g/dl-Hct: 48,9%), que se

atribuyen al género principalmente, debido a que es evidente que el valor promedio es más alto

para los hombres respecto a las mujeres (Figuras 8,9).

Figura 8. Valores del porcentaje de hematocrito. A. Porcentajes de Hct para mujeres. B. Porcentaje

de Hct para hombres. En la figura se observa el promedio de los datos obtenidos para cada uno de

los individuos durante el seguimiento (M1-M8) correspondiente a los días 1,3,5,12,19,26,56 y 86.

Mujeres n=2 y hombres n=4. La línea punteada roja representa el intervalo de referencia del

porcentaje de Hct para mujeres y hombres. Las líneas verticales sobre cada barra representan el

valor máximo y mínimo.


61

A.

B.


62

Figura 9. Valores de la concentración de hemoglobina A. Concentración de Hb para mujeres. B.

Concentración de Hb para hombres. En la figura se observa el promedio de los datos obtenidos

para cada uno de los individuos durante el seguimiento para todas las muestras 1-8 del seguimiento

correspondiente a los días 1,3,5,12,19,26,56 y 86. Mujeres n=2 y hombres n=4.

A.

B.


63

En cuanto a los valores iniciales y finales durante el seguimiento para la concentración de Hb y el

porcentaje de Hct se observó un incremento respecto al valor inicial excepto para el individuo 1 y

6 respectivamente (Figuras 8,9 Anexos B,C). En general, los resultados respecto a las dos variables

analizadas son heterogéneos entre los individuos, y por lo tanto es evidente que a lo largo del

seguimiento no hay ninguna tendencia de normalización, y aunque así fuera, sería discutible

establecer un punto de ajuste constante después de los tres meses de seguimiento que represente

una forma de aclimatación exitosa debido al tamaño de la muestra.

Con los resultados de las dos variables analizadas es posible determinar el valor de la Hb

corpuscular media con la relación ((Hb/%Hct) *100). Esta es una medida que establece la relación

entre la concentración de Hb y el Hct, y permite determinar la cantidad de Hb por glóbulo rojo. En

los primeros días de seguimiento, en los hombres se presenta un mayor incremento de la

concentración de Hb por glóbulo rojo respecto a las mujeres y posteriormente se observan cambios

menores, excepto para el caso de las mujeres que presentan un pico atípico en la muestra que

corresponde al día 56 del seguimiento (Figura 10). Esto puede ser debido a que ellas

probablemente se encontraban en la fase lútea de su ciclo menstrual y por esto se presenta un

efecto de hemoconcentración. Teniendo en cuenta que uno de los criterios de inclusión en el

estudio fue no realizar actividad física de alta intensidad, tal vez es de esperarse que a una altitud

moderada no ocurrieran cambios drásticos en las dos variables analizadas ya que la demanda de

oxígeno es menor en individuos sedentarios comparados con individuos activos.


64

Figura 10. Concentración de hemoglobina corpuscular media. Valores promedio de la

concentración de Hb corpuscular media para todos los individuos durante el seguimiento. Los

puntos corresponden al valor promedio y las barras a los valores mínimos y máximos.

Por otra parte, en este trabajo se propuso un esquema de seguimiento de los individuos durante 3

meses con el objetivo de evaluar las respuestas agudas y crónicas que tienen lugar durante el

proceso de aclimatación, sin embargo, a la fecha no hay un consenso que permita determinar el

tiempo requerido para el proceso de aclimatación en humanos. Con los resultados de estudios que

han realizado la evaluación de variables hematológicas, se ha evidenciado que durante el proceso

de aclimatación hay cambios determinantes a nivel fisiológico que están relacionados con la

producción de EPO y son dependientes de la altitud, debido a que a mayor altitud se presentan

cambios significativos. Sin embargo, estos no se mantienen después de 24 horas en la mayoría de

los individuos, lo cual constituye evidencia de que con el tiempo se reduce la magnitud del estímulo

eritropoyético (13) (38).

Como es ampliamente conocido la concentración de Hb es un componente clave para el transporte

de oxígeno, sin embargo, su utilidad como marcador de aclimatación y adaptación altitudinal

todavía no es claro debido a que se han documentado diferencias en esta variable entre individuos


65

de diferentes poblaciones a la misma altitud, lo que pone en evidencia que los cambios además de

estar relacionados con el tiempo de exposición a la altitud, también dependen del origen étnico.

Por otro lado, aunque el ajuste hematológico más relevante durante la exposición a hipoxia

hipobárica es el incremento de la capacidad sanguínea para transportar oxígeno, los factores

determinantes para este ajuste son la disminución del volumen plasmático inicial (exposición

aguda) y el posterior incremento en la síntesis de Hb y eritrocitos (exposición crónica).

Bajo la condición de hipoxia, la respuesta eritropoyética se alcanza hasta que la presión arterial de

oxígeno disminuye aproximadamente a 65-70Torr, lo que se corresponde con una altitud entre

2500 y 3000 msnm. Por lo cual parece que a altitudes mayores a 2100 msnm ocurre la liberación

continua de EPO, sin embargo, no ha sido posible determinar un umbral bajo el cual se favorece su

producción y liberación sostenida (38). Así mismo, se ha determinado que hay grandes diferencias

en la respuesta eritropoyética de acuerdo al género, lo cual está relacionado con la carga de

testosterona y estrógenos en hombres y mujeres. Específicamente, el aumento de testosterona en

individuos expuestos a hipoxia hipobárica se ha relacionado con una respuesta favorable durante

la aclimatación debido a que esta hormona regula la eritropoyesis y la ventilación en diversas

especies de mamíferos, incluyendo humanos, así como también está relacionada con la

disponibilidad de hierro en el organismo, junto con la hepcidina. Por otra parte, se ha postulado

que las hormonas sexuales femeninas pueden modular la ventilación hipóxica al afectar la

secreción dopaminérgica del cuerpo carotídeo. De hecho, en un estudio de 2006 se reportó que los

esteroides ováricos estimulan la ventilación al disminuir el impulso inhibidor dopaminérgico

periférico, y los resultados demuestran que la regulación dependiente de la ventilación hipóxica

implica la interacción entre la EPO y los esteroides sexuales (79). En su conjunto, lo anterior

constituye evidencia de que las hormonas cumplen una función importante en el proceso de

aclimatación a pesar de que los mecanismos subyacentes siguen siendo poco conocidos (80).

Aunque la mayoría de los estudios ha sugerido que el patrón característico de nativos a nivel del

mar en altitud consiste en un aumento de la concentración de Hb y el porcentaje de Hct para

mejorar la capacidad aeróbica, esto puede tener un efecto negativo debido a que el aumento

excesivo de la concentración de Hb genera eritrocitosis y dificulta la oxigenación de los tejidos al


66

aumentar la viscosidad sanguínea y la resistencia vascular (13,18). Como un ejemplo de esto, el

aumento en nativos de grandes altitudes se ha asociado con policitemia y en las mujeres se ha

determinado que hay una menor incidencia de CMS en edad premenopáusica que aumenta luego

de la menopausia. Lo anterior constituye evidencia de que los efectos negativos producto de la

condición de hipoxia hipobárica tienen lugar cuando hay alteraciones en los mecanismos de

respuesta a esta condición (30), y por lo cual se ha establecido que el tiempo y el grado de

exposición son los factores fundamentales en la respuesta a hipoxia hipobárica.

Respecto al tiempo de exposición en altitud, en diferentes estudios se ha reportado que este factor

es determinante en cuanto a los cambios que se pueden presentar en la concentración de Hb y el

porcentaje de Hct en habitantes de tierras bajas, debido a que el aumento de glóbulos rojos

depende de la altitud y la respuesta eritropoyética del volumen inicial de glóbulos rojos, porque

tanto en hombres como en mujeres una concentración inicial baja de Hb genera un aumento más

dramático a mayores altitudes que aquellos con una concentración de Hb inicial más alta (81). Así

mismo, los individuos más jóvenes, independientemente del género, también presentan un

aumento más dramático a mayores altitudes que los individuos mayores de 60 años. Paralelo a

esto se ha determinado que el tiempo de exposición a altitudes por encima de los 4000 msnm debe

ser superior a 2 semanas para que tenga lugar un efecto estadísticamente significativo en la

concentración de Hb, así como a altitudes más bajas (1300-2950 msnm) se requieren tiempos de

exposición más prolongados (13).

En el análisis de variables hematológicas es importante destacar que el patrón de adaptación de

nativos de grandes altitudes difiere de los habitantes de tierras bajas, lo cual está directamente

relacionado con los mecanismos de respuesta regulados por los HIFs como principales mediadores

de la respuesta molecular y fisiológica a hipoxia que induce procesos a nivel sistémico como la

eritropoyesis (30). Dado los efectos pleiotrópicos de la cascada de señalización de los HIFs, no es

claro si la concentración de Hb es el objetivo fenotípico directo de la selección natural o si

representa un efecto de selección sobre otro rasgo fisiológico que está regulado por la señalización

de los HIFs (30).


67

Estudios previos en población colombiana universitaria a diferentes altitudes han determinado que

con el incremento de la altitud hay un incremento de la concentración de Hb y el Hct y este a su

vez es mayor en los hombres respecto a las mujeres, lo cual está de acuerdo con nuestros

resultados como se puede evidenciar por comparación entre la muestra inicial y final del

seguimiento (19). En este mismo sentido, las diferencias por género en el porcentaje de Hct, la

masa y la concentración de Hb se atribuyen principalmente a factores como el contenido de masa

muscular y grasa corporal, y los niveles de testosterona. Además, se ha establecido que la

determinación de estas variables en las mujeres en edad reproductiva depende de la fase del ciclo

menstrual y la carga hormonal principalmente (82). Lo anterior teniendo en cuenta que las

diferencias en la respuesta eritropoyética son dependientes del género y como se ha reportado las

mujeres presentan un menor incremento en las respuestas asociadas a eritropoyesis que los

hombres respecto a los valores en la concentración y masa de Hb, el Hct y la concentración de EPO,

lo cual se ha sugerido puede ser debido a que presentan mayores valores de la saturación arterial

de oxígeno como una ventaja ventilatoria por las hormonas sexuales femeninas que modulan la

respuesta eritropoyética (82) (83).

En diferentes estudios también se ha reportado que el incremento rápido y masivo de la

concentración de Hb y el Hct en altitud se debe a un efecto de hemoconcentración provocado por

un desplazamiento de fluidos hacia el intersticio. En consecuencia, durante la fase aguda de

aclimatación el incremento observado en estas variables puede ser causado por una reducción del

volumen de plasma y no por un incremento de la tasa de producción de eritrocitos, teniendo en

cuenta que el volumen de plasma puede disminuir debido a un efecto de deshidratación a causa

del patrón de respiración y la inspiración de aire frío y seco, así como por otros factores como la

ingesta reducida de líquidos y la diuresis (25). Lo anterior incrementa el contenido de oxígeno en

la sangre arterial a valores superiores a los observados al arribo a la altitud. Sin embargo, aunque

el volumen plasmático disminuye en la altitud, este aumenta nuevamente al regresar a menor

altitud, y esta capacidad de oscilación se ha evidenciado aún después de 20 años de exposición a

cambios continuos de altitud (82). Por lo anterior, la oscilación entre ciclos de hipoxia-normoxia, es


68

evidente tanto en el volumen total de sangre como en la concentración de Hb, el porcentaje de Hct

y la concentración de EPO plasmática (84).

De acuerdo con lo anterior, la respuesta diurética hipóxica se ha relacionado también con cambios

en la concentración de hormonas relacionadas con la diuresis, la natriuresis y la función renal. Por

ejemplo, existen reportes que indican la disminución en la fase aguda de aclimatación de los niveles

de aldosterona, la hormona antidiurética (ADH), y un aumento en los ANPs, lo que podría explicar

el comportamiento del volumen plasmático, sin embargo, los estudios sobre las variaciones de este

durante la hipoxia hipobárica son escasos. En este mismo sentido, un estudio demostró que,

aunque hombres y mujeres aumentan la producción de orina a los 3 días de exposición a 3500

msnm, solo en los hombres disminuyen los niveles de ADH y renina, mientras que, en las mujeres

este fenómeno se presentó a mayor altitud y tiempo de exposición, por otra parte, los ANPs

aumentaron en hombres a los tres días y en las mujeres no hubo cambios, lo cual se relaciona con

la pérdida del volumen plasmático en las mujeres.

Por último, el comportamiento observado para las variables evaluadas en los individuos incluidos

en el estudio corresponde con lo que se ha reportado en la literatura. Aunque estos parámetros

son evaluados comúnmente como indicadores del proceso de aclimatación, se ha establecido que

estos son variables de acuerdo con factores como la dieta, el género y la edad, y en consecuencia

no son suficientes para dar cuenta del proceso de aclimatación en humanos. Esto también sugiere

la existencia de mecanismos de respuesta diferencial inter e intraindividuos que dependen

principalmente del género y la edad (15,16). Por lo anterior, es evidente la necesidad de realizar la

determinación de otras variables hematológicas como la masa de Hb y la saturación arterial de

oxígeno que no dependen del volumen, así como la concentración de EPO que pueden ser

indicadores más objetivos de los cambios relacionados con el transporte de oxígeno en

comparación con las otras variables ya descritas. En el caso de la determinación de la masa de Hb,

el método para su determinación es sensible y ha sido útil para establecer diferencias entre

residentes de varias altitudes, así como para comprobar el efecto del entrenamiento físico. De

hecho, la evidencia sugiere el aumento en la masa de Hb en altitudes moderadas como efecto de

la aclimatación (15,16), aunque también es importante destacar que esta puede incrementar por


69

efecto del entrenamiento regular de resistencia, el uso de EPO humana recombinante y

transfusiones sanguíneas (84).

7. 2 Tratamiento de las muestras de suero y

obtención de perfiles proteicos por 2D-PAGE

La cuantificación de proteínas totales en las muestras de suero extraídas a lo largo del seguimiento

de cada individuo se realizó con BCA. Los resultados obtenidos muestran que la concentración de

proteínas totales en las muestras no fue homogénea (Figura 11). Este hecho puede atribuirse a

factores como diferencias en la dieta, variaciones genéticas, efectos del entorno, entre otros. Sin

embargo, la mayoría de las muestras se encuentra dentro del intervalo reportado de proteínas

totales en suero (60-80mg/ml) de adultos sanos y la baja concentración en algunas muestras puede

ser debida a la disminución en la cantidad de Alb que constituye más de la mitad de la cantidad de

proteínas totales en suero, lo cual se ha relacionado principalmente con la dieta de los individuos

(Anexo D) (55).


70

Figura 11. Concentración de proteínas totales en suero completo. En la figura se observa la

concentración de proteínas totales determinada con BCA de cada una de las muestras del

seguimiento (1-8) para los individuos P1, P2, P3, P6 y P7 (P1, P6 y P7: hombres y P1,P2: mujeres).

El intervalo señalado con líneas punteadas hace referencia a la concentración de proteínas totales

en suero de individuos sanos.

En cuanto a la depleción de Alb e IgGs se determinó el volumen de suero requerido para realizar la

depleción de una cantidad de proteínas totales entre 2 y 2,5mg teniendo en cuenta que esta es una

cantidad óptima para realizar dos lavados de la columna y recolectar un mayor volumen de la

fracción de proteínas unidas y no unidas a la columna. Para las muestras de suero con baja

concentración de proteínas totales se tomó el volumen que corresponde a una cantidad de 2,5mg,

y se garantizó que no se saturara la matriz de la columna. Es así como para la depleción se tuvo en

cuenta la cantidad de proteína y el volumen de suero a depletar (25-100μl) como recomienda el

fabricante. Como indicador de la eficiencia de la depleción se determinó que el porcentaje

promedio de recuperación de proteínas totales fue de 60% (Figura 12), para lo cual también hay

que destacar que la cantidad de Alb e IgGs en cada muestra es variable.

Mediante SDS-PAGE se puede observar la separación electroforética de una muestra de suero

sanguíneo depletada en condiciones reductoras, con lo cual se verificó la presencia de las proteínas

en los eluidos de proteínas no unidas y unidas a la columna (Figura 12).

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

90,00

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

P1 P2 P3 P6 P7

Co

nce

ntr

aci

ón

(m

g/m

l)

Individuos


71

Figura 12. Depleción de Alb e IgGs en suero mediante el sistema ProteoPrep Blue. A. Gel SDS-

PAGE 12%. M: Marcador de peso molecular. S: Suero sin depletar. EU: Eluidos de proteínas unidas

a la columna. ENU: Eluidos de proteínas no unidas o suero depletado. En todos los carriles se

cargaron 16 µg de proteínas totales. En el gel se destacan las bandas de peso molecular que

corresponden a la Alb (67kDa) y las IgGs, cadenas ligeras (25kDa) y pesadas (50kDa). B.

Representación del rendimiento promedio de la depleción de todas las muestras de suero, el suero

depletado tiene un 40% menos de Alb e IgGs.

A. B.

En la electroforesis se pueden observar bandas bien definidas de peso molecular variable, así como

también se observa la diferencia entre la cantidad de Alb en el eluido de proteínas no unidas y el

eluido de proteínas unidas a la columna, con lo cual se puede verificar que el proceso de depleción

fue eficiente aunque no completo.

Actualmente hay diferentes kits comerciales para realizar la inmunodepleción de las proteínas más

abundantes en el suero y el plasma sanguíneo, y se ha evidenciado que aunque sólo se realice la

inmunodepleción parcial de IgGs y Alb, el número de spots en un gel de 2D-PAGE aumenta

dramáticamente (53). En este sentido los resultados obtenidos de la depleción fueron un buen

punto de partida para las posteriores 2D-PAGE.


72

7.3 Análisis de los geles obtenidos por 2D-PAGE

Debido al número de muestras sanguíneas recolectadas para cada uno de los participantes en el

estudio y a limitaciones presupuestales, para la evaluación del proteoma mediante 2D-PAGE se

seleccionaron únicamente dos individuos (P1 y P6) a los cuales se hará referencia en adelante como

individuos 1 y 2 respectivamente.

Con las muestras de suero depletadas se realizó la 2D-PAGE y se obtuvieron los geles para cada una

de las muestras del seguimiento de los dos individuos, con lo cual también se verificó la eficiencia

de la depleción, ya que no se observaron señales muy intensas que generen distorsión del perfil

electroforético (Figura 13, Anexo F). A continuación, se realizó el análisis comparativo de los geles

2D-PAGE para cada una de las muestras del seguimiento tomando como referencia o control la

muestra del día uno de cada individuo.

Figura 13. Imágenes del perfil de proteínas obtenido mediante 2D-PAGE. Geles obtenidos para el individuo 1

durante el seguimiento. Rango de gradiente de pH de 5 a 8 y valores de peso molecular en kDa del marcador de peso molecular.

Días 1 3 5 KDa 𝑝𝐻 5 8 5 8 5 8

45 35 25

Días 12 19 26 KDa 𝑝𝐻 5 8 5 8 5 8

45 35 25

Días 56 86 KDa 𝑝𝐻 5 8 5 8

45 35 25

En general, los geles de 2D-PAGE obtenidos a partir de las muestras de suero de los dos individuos

muestran una buena resolución en cuanto a la separación de los spots con un patrón de distribución

regular a lo largo de los geles y entre geles para el mismo individuo. En los geles se observan spots

bien definidos y patrones de separación de spots comparables, indicando que la metodología

empleada fue adecuada. Además, en los extremos de los geles, es decir a valores de pH menor de 5.5

y mayor a 7.5 no se observa un gran número de spots, lo cual evidencia una buena separación entre

los spots, teniendo en cuenta que las proteínas evaluadas se encuentran dentro del rango de pH

fisiológico.

Mediante la técnica de 2D-PAGE fue posible obtener perfiles electroforéticos para comparar la

expresión de spots de forma cualitativa y cuantitativa. Se minimizaron los coeficientes de variación

producto de factores inmersos en la técnica mediante la corrida de varios geles al tiempo bajo las

mismas condiciones para reducir la posibilidad de artefactos resultantes de la manipulación. Esto se

logró usando el sistema PROTEAN Plus Dodeca Cell (Biorad) y a través del uso de un software que

permitió el procesamiento y la comparación de imágenes. Aunque este tipo de análisis aún no es

completamente automatizado, es crucial para la cuantificación y la creación de perfiles de expresión

para el análisis estadístico, lo cual ha mantenido la técnica de 2D-PAGE vigente para el estudio de

proteomas (62) (85).

Con el uso del software Delta 2D inicialmente se llevó a cabo un control de calidad de las imágenes

obtenidas de los geles de 2D-PAGE. Para esto se cargaron las 16 imágenes que corresponden a cada

una de las muestras del seguimiento con su respectiva réplica y se seleccionó una imagen de

referencia que para este caso constituye la muestra del primer día del seguimiento para cada

individuo. Posteriormente, se realizó el agrupamiento de los geles de cada individuo y las imágenes

se alinearon o emparejaron de forma semiautomática (Figura 14).

Figura 14. Agrupación de los geles correspondientes al seguimiento con Delta 2D. Agrupación de las

imágenes correspondientes a los geles de uno de los individuos para la detección de spots con el

software Delta 2D. En la figura se observa la agrupación de las muestras (M1-M8) y su respectiva

réplica para el análisis, y en el centro se representa el gel que corresponde a la muestra control.


75

Los spots detectados por el software se revisaron y editaron manualmente para crear un gel fusión

en el cual se realizó nuevamente la curación manual de los spots, cualquier spot que mostrara

anomalías debido a streaking (distorsión/rayas) o se considerara como artefacto se descartó. Los

spots de áreas muy saturadas o que mostraban algún tipo de tendencia a distorsionarse también se

descartaron independientemente de que mostraran o no un perfil de expresión diferencial entre las

muestras, esto con el fin de eliminar falsos spots y corregir falsos emparejamientos. El criterio para

la normalización de los spots fue el volumen ya que este permite corregir la variación técnica entre

muestras y a la vez otorga robustez al análisis para obtener un valor de intensidad normalizado de

cada spot en los diferentes geles.

Posteriormente se realizó el análisis de los perfiles de expresión para cada spot y se obtuvieron los

valores de la media, la desviación estándar, la tasa de cambio (ratio o FC) y el valor de p para cada

uno a partir de una prueba t de student usando el valor del volumen normalizado. Para el individuo

1 y 2 se detectaron un total de 1423 y 1771 spots respectivamente en el conjunto de geles que

corresponden al seguimiento. Estos fueron curados manualmente a partir de cada uno de los geles y


76

el gel fusión que es una imagen representativa de los perfiles proteicos obtenidos para cada una de

las muestras del seguimiento, con lo cual se llegó a un consenso en el gel fusión de 66 y 40 spots

respectivamente (Figura 15) (Anexo E).

Figura 15. Gel fusión obtenido a partir del análisis de los geles de 2D-PAGE con Delta 2D. En círculos

azules se encuentran los spots detectados y curados manualmente, y el número corresponde al ID de

los spots seleccionados (como se describe posteriormente) para su identificación por MS. A la

izquierda se muestran dos bandas del marcador de peso molecular como guía. A. Individuo 1. B.

Individuo 2.

A.


77

B.

Con los resultados del análisis comparativo de las imágenes de los geles con Delta 2D se evidenció que hay

spots que presentan cambios en la intensidad a lo largo del seguimiento, lo cual se corroboró por el FC y

el valor de p a partir de una prueba t de student. La relación de estos dos valores se muestra en las gráficas

de volcano. El valor de FC es útil ya que es poco probable que el cambio en la intensidad de un spot sea el

resultado de un fenómeno aleatorio, además, la combinación con el valor de p constituye un criterio fuerte

para la selección de los spots que serían identificados mediante MS (Figura 7).

Para la comparación de los patrones de expresión de los spots obtenidos para cada individuo se usaron

las herramientas integradas en Delta 2D. Se realizó un análisis de agrupación jerárquica usando la función

HCl (hierarchical clustering) por distancia euclidiana y ligamiento completo (complete linkage). Los

resultados se visualizaron en un dendograma y un mapa de calor donde el color representa la intensidad

escalada de cada spot (filas) para cada una de las muestras del seguimiento (columnas), lo cual es un

primer paso para evaluar la calidad de los datos cuantitativos y a la vez identificar spots con un perfil de

expresión similar.


78

Los valores del volumen normalizado para cada spot se usaron para realizar el agrupamiento jerárquico y

obtener grupos de spots representados en un dendograma. En el dendograma obtenido para el individuo

1 (Figura 16 A), se tienen dos grupos bien diferenciados (1 y 2) y de acuerdo con el mapa de calor, se

observa que en uno de los dos grupos (marcado como 1 en la figura) hay un aumento de la expresión a lo

largo del seguimiento con un pico en la muestra 7 correspondiente al día 56. En el segundo grupo, que

corresponde a un mayor número de spots respecto al grupo 1, se observa un aumento en la expresión

desde el inicio del seguimiento hasta la muestra 4 (día 12) y posteriormente disminuye, este grupo se

subdivide a su vez en 2 subgrupos (Figura 16.2A y 2B), de los cuales el 2A muestra un aumento en la

expresión en la muestra correspondiente al día 26.

Por otra parte, para el individuo número 2 se identificó un menor número de spots que se distribuyen en

dos grupos con menor similitud entre ellos comparados con el individuo 1 (Figura 16 B). En el segundo

grupo (marcado como 2 en la figura) disminuye la expresión entre las muestras 1 y 4 y posteriormente

entre la muestra 5 y 8 aumenta, entre los cuales se destacan algunos spots que presentan un pico en la

muestra 6 y 7. En el primer grupo se observa la tendencia contraria, y en la muestra 6 disminuye la

expresión para todos los spots pertenecientes a ese grupo. Algunos spots se seleccionaron de forma

preliminar mediante el análisis de clustering y posteriormente se ratificaron en la gráfica de volcano al

combinar el FC con el valor de p en el respectivo punto de tiempo donde el cambio fue mayor.

Figura 16. Agrupamiento jerárquico de los spots. Dendograma y mapa de calor obtenido para cada

individuo. Cada columna corresponde a una muestra con su respectivo replicado y cada fila a un spot

donde la escala de color indica si el nivel de expresión es bajo (azul) o alto (amarillo). A. Individuo 1. B.

Individuo 2. P1M1-M8: Muestras del seguimiento que corresponden a los días 1,3,5, 12,19,26, 56 y 86. En

el recuadro rojo se encuentran los spots seleccionados para identificación por MS.


79

A.


80

B.

Además del agrupamiento jerárquico, también se realizó un agrupamiento de los spots usando el

algoritmo K-means, con un valor K de 10 (Tabla 7).


81

Tabla 7. Asignación de spots de acuerdo al agrupamiento por K-means

Individuo 1 2

Cluster

N° de spots

% de spots

en el grupo

Cluster

N° de spots

% de spots en

el grupo

Cluster

1 11 16 8 20

2 7 10 6 15

3 5 7 6 15

4 4 6 4 10

5 4 6 3 7

6 4 6 3 7

7 2 3 3 7

8 9 13 4 10

9 11 16 2 5

10 11 16 2 5

Total 66 100 44 100

La aplicación de algoritmos de agrupamiento es una primera aproximación que permite suponer que

las proteínas que pertenecen a los mismos grupos están involucradas en procesos biológicos

relacionados, aunque no hay evidencia que permita determinar qué tipo de interacción (directa o

indirecta) hay entre las proteínas que se asignan al mismo grupo. Por ejemplo, puede ser que las

proteínas dentro del mismo grupo estén co-reguladas por una proteína reguladora común. En este

mismo sentido, el análisis de grupos o la validez de los resultados de agrupamiento clasificados entre

los métodos de aprendizaje no supervisado constituye una aproximación para establecer la posible

relación entre las proteínas que pertenezcan al mismo cluster y un proceso biológico determinado.

Figura 17. Clusters de spots seleccionados por K-means para identificación. En el recuadro rojo se

encuentran los spots seleccionados para identificación por MS. A: Individuo 1. B. Individuo 2.


82

A.

B.

Con la finalidad de comprobar la distribución de los spots analizados en las muestras del seguimiento

para los dos individuos, así como su relación con el nivel de significancia estadística, se realizó una

gráfica de volcano para cada muestra del seguimiento. En esta gráfica se representan dos variables

fundamentales ya mencionadas, el valor de FC y el valor de p, aunque estas parecen ser dos

magnitudes muy diferentes, se definen como una medida directa de las diferencias entre los datos y


83

la asociación con la aplicación de pruebas estadísticas respectivamente, y la transformación

logarítmica permite establecer su relación. La gráfica de volcano es una gráfica de dispersión

bidimensional que representa (−log10) del valor p de la prueba t de student en el eje Y y el (log10) del

FC en el eje X (86). Por lo anterior, para la identificación de spots que presentaron cambios

significativos durante el seguimiento para cada individuo se tuvieron en cuenta las regiones de interés

en la gráfica que corresponden a los spots que se encuentran hacia la parte superior del gráfico que

están ubicados a la izquierda o a la derecha del eje central y que están más dispersos respecto al

origen (FC≥2, p <0.05) (Figura 18, Anexos H,I).

Figura 18. Gráfica de volcano para la muestra del día 56 del seguimiento de los individuos. Izquierda:

Individuo 1. Derecha: Individuo 2. En el eje Y de la gráfica se representa (–log10) del valor de p y en el

eje X el (log10) del FC para cada uno de los spots. En color naranja esta representados los spots que

cumplen con el umbral (línea roja punteada, FC≥2 y p <0.05) y en azul todos los demás. Los números

corresponden a los ID de algunos de los spots identificados.

Como se puede observar en las gráficas de volcano (Figura 18), hay spots con diferencias significativas

(p<0.05) en su expresión y valores de FC superiores a 2 (FC≥2) para los dos individuos. Teniendo en cuenta

estos dos criterios, se escogieron algunos spots para su identificación, sin descartar que hay otros que

cumplen con los dos criterios propuestos y pueden ser interesantes para su identificación en trabajos

posteriores. En este trabajo, a partir de los resultados obtenidos en el dendograma para el individuo 1 del


84

primer grupo se seleccionó el spot 938 y del segundo los spots 423, 392, 495, 496 y 498 para un total de

seis (Figura 16). Para el individuo 2, del primer grupo se seleccionó el spot 486 y del segundo grupo los

spots 401, 493, 299, 1277 y 523, para un total de seis spots (Figura 16).

Así mismo por comparación entre las gráficas para todas las muestras del seguimiento es posible

evidenciar que en la muestra correspondiente al día 56 del seguimiento para los dos individuos hay un

mayor número de spots que presentan cambios más representativos en cuanto a las otras muestras del

seguimiento, lo que puede sugerir que en este punto de tiempo pueden ocurrir cambios determinantes

durante la aclimatación (Anexo H). Lo anterior teniendo en cuenta que el estímulo principal al cual estaban

sometidos los individuos era la hipoxia hipobárica, por lo que es razonable asumir que las diferencias

detectadas a nivel del proteoma puedan ser atribuidas en gran medida a esta condición. Sin embargo, es

importante destacar que parte de los cambios en la expresión de proteínas en los individuos puede ser

debido a efectos no relacionados con el proceso de aclimatación.

Actualmente la evaluación de perfiles de expresión diferencial tanto de ARNs como de proteínas sigue

siendo un tema de investigación activo, por lo cual la gráfica de volcano, los mapas de calor y los gráficos

de agrupación se encuentran entre las herramientas visuales más útiles para el análisis de matrices que

son ampliamente usadas en experimentos ómicos, donde por lo general se consideran grandes conjuntos

de datos (86). Aunque sería interesante evaluar el nivel de repetibilidad de las diferencias específicas en

el proteoma de los dos individuos para determinar la relación en los resultados obtenidos durante el

seguimiento; nuestro objetivo no pretendía comparar las diferencias entre individuos sino los cambios en

el proteoma de cada individuo respecto al tiempo de seguimiento planteado, teniendo en cuenta

diferencias entre los individuos como el estado nutricional, la edad, el estado de salud y también debido

a limitaciones en el número de muestras en el presente trabajo.

7.4 Identificación de proteínas

Este trabajo como la mayoría de los estudios que usan la técnica de 2D-PAGE fue de tipo exploratorio

porque tuvo como objetivo generar hipótesis respecto a la posible función de las proteínas identificadas


85

mediante MS en el contexto biológico de la hipoxia hipobárica. Conceptualmente en este trabajo se

abordó el enfoque Bottom up que actualmente es el más usado en proteómica, teniendo en cuenta la

robustez y reproducibilidad de la espectrometría de masas MS/MS. Esta técnica fue elegida para el análisis

de spots por su rapidez y elevada sensibilidad para la identificación de proteínas a gran escala.

De acuerdo con el perfil de expresión obtenido para cada uno de los spots seleccionados para su

identificación por MS, se puede destacar que estos presentaron un perfil diferencial a lo largo del

seguimiento con picos de aumento o disminución que son más evidentes entre los días 19 y 86 del

seguimiento respecto a los primeros días (Figura 19). A partir de los spots seleccionados se identificaron

7 proteínas que presentaron cambios significativos en el proteoma de los dos individuos analizados y

respecto a las cuales se postulará su posible función durante el proceso de aclimatación a hipoxia

hipobárica. Todos los spots seleccionados se identificaron de forma exitosa excepto el spot 495 (Tabla 8).

Figura 19. Perfil de expresión diferencial de los spots identificados para cada individuo. En color azul se

representa la diferencia en el perfil de expresión para cada spot respecto al seguimiento en el tiempo.

m1v1 y m1v2 corresponden a la muestra y su respectiva réplica. En las gráficas se observa en el eje X las

muestras correspondientes al seguimiento con sus respectivas réplicas y en el eje Y el logaritmo del FC, el

número arriba en cada gráfica corresponde al ID de cada spot. A. Individuo 1. B. Individuo 2.


86

A.

B.


87

Tabla 8. Identificación de spots correspondientes al proteoma sérico de individuos expuestos a

hipoxia hipobárica.

Individuo

Spot ID

Grupo/

Cluster

FC*

Peso

molecular

teórico (kDa)

Punto

Isoeléctrico

teórico

Proteína

Código

Uniprot

1

423 2 ≥2 69.3 5.9 Albúmina P02768

392 1 ≥2 51.6 6.5 Hemopexina P02790

496 1 ≥5

51.5

5.4

Cadena gamma

de Fibrinógeno

P02679

498 1 ≥2

938 8 ≥2 23 5.8 Proteína de

unión a retinol

P02753

2

299 1 ≥5 77 6.8 Serotransferrina P02787

401 8 ≥2 69.3 5.9 Albúmina P02768

486 2 ≥2

46.7

5.4

Inhibidor 1 alfa

de Antitripsina

P01009 493 9 ≥2

523 1 ≥2

1277 1 ≥2 30.8 5.6 Apolipoproteína

AI

P02647

*Valor de FC en el gel fusión.

Respecto a las proteínas que se identificaron a partir del análisis de spots para el primer individuo,

los spots 496 y 498 corresponden a isoformas de la cadena gamma de fibrinógeno (Fgg) que difieren

en su punto isoeléctrico y están considerados en el mismo cluster que se caracteriza por presentar

un aumento en su expresión en la muestra del día 3 de seguimiento (Figura 19). Específicamente, el

fibrinógeno es un componente mayoritario del plasma que también está presente en suero

sanguíneo, y está constituido por dos conjuntos de tres cadenas polipeptídicas alfa, beta y gamma.


88

Esta proteína actúa como sustrato para la formación de coágulos de fibrina y en la unión a plaquetas

para desencadenar la agregación plaquetaria, es producida en el hígado en respuesta a la

estimulación con citoquinas y tiene una vida media de 3 a 5 días, por lo cual se ha reportado puede

reflejar el estado del desarrollo tumoral e inflamatorio de un individuo. Por lo anterior, el fibrinógeno

se considera como una proteína que hace parte de la categoría de proteínas de fase aguda en la

respuesta temprana a diversos procesos como inflamación, traumatismo, entre otros (87), y su

incremento al tercer día del seguimiento puede estar relacionado con la condición de inflamación

que se ha reportado tiene lugar en hipoxia hipobárica (87).

Por otra parte, también se ha reportado que el factor de crecimiento de fibroblasto (FGF-2), la

interleuquina 1 alfa (IL-1a) y VEGF se unen al fibrinógeno y de esta forma potencian la proliferación

de células endoteliales y estimulan su actividad, lo cual pone en evidencia la participación del

fibrinógeno en procesos biológicos que se relacionan con la regulación del tono vascular y la

angiogénesis en hipoxia (88).

Otro de los componentes previamente mencionados por su alta abundancia en el suero sanguíneo es

la Alb, por lo cual constituye una de las dificultades en la obtención de perfiles electroforéticos

mediante 2D-PAGE, y es ampliamente aceptado el uso de diferentes sistemas de depleción para

obtener perfiles de buena resolución que a su vez permitan visualizar proteínas de baja abundancia.

La Alb fue de las proteínas identificadas por presentar cambios significativos respecto al FC durante

el seguimiento en los dos individuos (spot no. 423 y 401) (Anexo E), sin embargo, es controversial

establecer su posible función como biomarcador en cualquier condición fisiológica o fisiopatológica

debido a su alta abundancia.

En un estudio que realizó la evaluación del proteoma pulmonar en modelos murinos, se propone la

importancia de la Alb por su actividad antioxidante relacionada con el estrés oxidativo que tiene lugar

por exposición a grandes altitudes. La Alb se ha reportado como una proteína de fase aguda regulada

negativamente y uno de los principales antioxidantes en el líquido del revestimiento del tracto

respiratorio, que también incluye mucina, superóxido dismutasa, glutatión, ácido úrico y ácido

ascórbico. Lo anterior debido a que un grupo tiol libre en una cisteína convierte a la Alb en la proteína


89

con mayor capacidad para eliminar especies reactivas en suero, por lo cual se ha sugerido su

capacidad para amortiguar el estrés oxidativo. Aunque el perfil de expresión de la Alb no presenta

una tendencia clara a partir de los dos spots de los cuales se identificó, se puede observar su

disminución al día 19 de exposición (Figura 19), lo cual podría poner en evidencia que después de

varios días de exposición continua tiene lugar la acumulación de especies reactivas, y posteriormente

su expresión retorna a niveles basales, así mismo, la disminución en la expresión de Alb se ha

relacionado con una mayor expresión de mediadores proinflamatorios y la inactivación de anti-

proteinasas (89).

De otro lado, una de las funciones de la Alb es garantizar el transporte de hormonas tiroideas y del

grupo hemo, esta última como una función secundaria debido a que presenta menor afinidad por el

grupo hemo respecto a la Hpx, que es la principal proteína encargada del transporte de este grupo.

Esta última fue una de las proteínas identificadas en el proteoma sérico de uno de los individuos, y

es la encargada de unirse al grupo hemo para transportarlo al hígado para su degradación,

contribuyendo así al reciclaje de hierro. La Hpx reduce la reactividad del grupo hemo libre y permite

su distribución hacia los receptores CD91 en hepatocitos para su completa degradación por la hemo

oxigenasa-1 (HO-1). Lo anterior es relevante teniendo en cuenta que el grupo hemo libre proveniente

de la Hb puede activar el receptor TLR4 (toll-like receptor 4) en plaquetas y células del endotelio,

promoviendo la señalización proinflamatoria que puede generar isquemias y lesiones en diferentes

tejidos en modelos murinos.

La Hpx pertenece a la clasificación de proteínas de fase aguda y el aumento de su concentración

plasmática se ha relacionado con su función antioxidante en nativos de gran altitud y modelos

murinos expuestos a hipoxia hipobárica entre 0 y 24 horas (89). De acuerdo con su perfil de expresión,

esta proteína aumenta en la muestra del día 3 de seguimiento, lo que puede ser posible debido al

rápido incremento de la concentración de Hb ante el estímulo hipóxico y su posterior retorno a

niveles basales. Está proteína pertenece al mismo cluster que la Fgg (Figura 17), por lo cual también

puede estar implicada en procesos relacionados durante la fase aguda de la aclimatación.


90

Otra de las proteínas identificadas a partir de la evaluación de los cambios en el proteoma fue RBP4,

(spot no. 938), que aumenta después del día 26 de seguimiento (Figura 19). RBP4 es la única proteína

transportadora de retinol en el plasma humano y se ha reportado que durante trastornos

inflamatorios su síntesis hepática se ve suprimida por citoquinas, lo cual depende de la duración y la

gravedad del estímulo. A su vez, la disminución de RBP4 genera la liberación de retinol en formas

fisiológicamente activas que favorecen el aumento de su concentración en sangre y su excreción en

orina, lo cual se ha reportado puede ser un indicador de estrés agudo respecto a individuos sanos. El

retinol libre se dirige a una variedad de receptores de la superficie celular, por lo cual se distribuye

en diferentes tejidos, principalmente en células epiteliales del plexo coroideo y órganos que

pertenecen al compartimento visceral (hígado, intestino delgado, médula ósea). Después de cruzar

la membrana celular se forman derivados retinoides que modulan la diferenciación de las células T

epiteliales y la regulación y maduración de las células B a través de la estimulación por citoquinas.

En nativos a nivel del mar en altitud, RBP4 se ha reportado como una proteína regulada

negativamente como en este trabajo, y se ha propuesto que tiene una posible función durante el

inicio de la inflamación endotelial vascular en estrés oxidativo debido a la secreción de TNF-a y un

conjunto variable de citoquinas IL-6, IL-1b, IL-2, IL -12, IL-10 (16). Por otra parte, en un estudio para

la identificación de biomarcadores en individuos con HAPE, se reportó que RBP4 se encontraba

aumentada en el plasma sanguíneo (92), por lo cual su aumento se puede sugerir como un indicador

de riesgo de sufrir efectos negativos por exposición a hipoxia hipobárica.

A partir de los spots seleccionados para el segundo individuo, se identificó la serotransferrina o

transferrina (Tf), una proteína responsable del transporte de hierro desde los sitios de absorción y

degradación del grupo hemo a los de almacenamiento y utilización, lo cual se puede relacionar con

el que hecho de que los valores para este individuo se encuentran entre los más altos respecto al

promedio de la concentración de Hb a lo largo del seguimiento (Anexos B, C). Lo anterior teniendo

en cuenta que la actividad de esta proteína está relacionada con el transporte de hierro para la

síntesis de Hb y su homeostasis como un factor protector ante los efectos negativos que se pueden

generar por exposición a hipoxia hipobárica. Previamente se ha reportado que la Tf es una proteína

regulada negativamente en nativos de grandes altitudes, lo cual se puede atribuir a la eritrocitosis y


91

al efecto tóxico del hierro libre. En su conjunto, la evidencia sugiere asociaciones importantes entre

la concentración de hierro y la fisiología de las respuestas ante la condición de hipoxia hipobárica

(90).

Respecto al perfil de expresión durante el seguimiento, la Tf presenta un pico en el día 26 que sugiere

que incluso después de varios días de exposición a hipoxia hipobárica (Figura 19), el transporte de

hierro es determinante, lo cual también puede tener explicación debido a que el hierro es cofactor

de las PHDs, enzimas encargadas de regular negativamente a los HIFs, de los cuales a su vez depende

la expresión de Tf. A su vez el aumento en la expresión de Tf se ha relacionado con la disminución de

la actividad de HIF-2a, que está implicado en los mecanismos de respuesta a la hipoxia crónica (91).

En general, los HIFs tienen un papel clave en la regulación de la expresión de proteínas relacionadas

con la homeostasis sistémica e intracelular de hierro mediante proteínas como el transportador de

metal divalente 1 (DMT1), la ferroportina 1 (FPN1), el citocromo b duodenal (Dcytb), el receptor de

transferrina (TfR), la hepcidina, y las proteínas reguladoras de hierro (IRPs). Estas proteínas están

involucradas en la absorción, el almacenamiento, la utilización y la exportación de hierro, y

constituyen un mecanismo de regulación a nivel transcripcional y post-transcripcional, que a su vez

depende de la disponibilidad de este (91).

En un estudio comparativo del proteoma entre nativos Ladakhi y controles a nivel del mar, se

encontró que la Tf aumenta su expresión mientras que la Hpx y la Fgg disminuyen en nativos de altitud

moderada (93), lo cual puede ser indicador de la importancia del transporte de hierro en altitud y la

disminución en la expresión de Hpx y fibrinógeno debido a la reducción en la degradación del grupo

hemo producto de la atenuación de la eritropoyesis y la inflamación respectivamente.

Por otra parte, en la identificación por MS es común observar que diferentes spots corresponden a

la misma proteína como es el caso de los spots 523, 493 y 486 que se identificaron como el A1T1.

Esto puede ser debido a la presencia de diferentes isoformas que varían en su punto isoeléctrico y se

pueden originar por variación alélica a nivel génico, corte y empalme alternativo (splicing) de ARN,

presencia de diferentes modificaciones post-traduccionales (glucosilación, fosforilación, etc) y/o

degradaciones parciales de la proteína.


92

A1T1 es una proteína ampliamente conocida como un inhibidor de serina proteasas, elastasa de

neutrófilos, proteinasa 3 y catepsina G. También se ha caracterizado como una proteína

antiinflamatoria e inmunorreguladora independientemente de su actividad antiproteasa. En

individuos saludables, los niveles plasmáticos oscilan entre 0,9 y 2 g/L, mientras que en inflamación

aguda o infección sus niveles aumentan de cuatro a cinco veces respecto al rango normal (94). Varios

estudios han propuesto la relación entre los niveles bajos de A1AT con diabetes mellitus tipo II e

infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). En esencia, la importancia de A1T1 radica

en el mantenimiento de la homeostasis proteasa-antiproteasa, debido a su capacidad para inhibir

otras clases de proteasas como metaloproteasas y cisteína-aspárticas, por lo cual se considera un

inhibidor de amplio espectro, y es probable que sea más eficiente en la regulación de las respuestas

inflamatorias respecto a los inhibidores de proteasas específicas (94). Esta es una de las proteínas de

fase aguda más abundantes en la circulación e interactúa con otras moléculas que pueden provocar

oxidación, degradación, formación de complejos, autoensamblaje u otras modificaciones y así

generar nuevas formas moleculares con actividad biológica, lo cual puede explicar la complejidad de

sus funciones (94). A su vez, se ha demostrado que A1T1 puede presentar varias modificaciones post-

traduccionales entre las que se destacan la nitrosilación, oxidación, polimerización y/o interacción

con lípidos que pueden regular la respuesta inflamatoria (56) (94). Se ha propuesto que la síntesis y

liberación de A1AT es importante tanto en el proceso inflamatorio agudo como en la fase de

resolución, aunque los mecanismos de sus efectos siguen sin ser comprendidos completamente.

A1AT es un regulador fisiológico del gen angptl4 que codifica una proteína de fase aguda implicada

en la homeostasis de glucosa, la sensibilidad a la insulina y el metabolismo de lípidos. Este gen es

blanco de HIF-1a y se ha relacionado con angiogénesis, enfermedades cardiovasculares, crecimiento

tumoral, diabetes, inflamación y cicatrización de heridas (95). En la literatura se ha reportado que la

deficiencia de A1T1 genera daño tisular inducido por la elastasa como hiperextensibilidad de la piel,

enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfermedad hepática, por lo cual su regulación positiva

en hipoxia hipobárica se puede relacionar con un factor protector frente a HAPE. De acuerdo con las

propiedades antiinflamatorias de A1T1, se identificó otra proteína que pertenece a esta categoría

funcional y su expresión se ha encontrado aumentada en individuos con HAPE, es Apo AI. Esta


93

proteína desempeña un papel crítico en la protección de la función de la arteria pulmonar y las vías

respiratorias, así como en la prevención de la inflamación, el depósito de colágeno en el pulmón y la

regulación del metabolismo de lípidos para el mantenimiento de la composición lipídica normal (92).

Apo AI es el principal componente proteico de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), y se ha

reportado que posee propiedades vasculares protectoras que proporcionan actividad antioxidante,

antiinflamatoria y antiapoptótica en el endotelio. En un estudio comparativo entre ratas Sprague

Dawley tolerantes y susceptibles a hipoxia hipobárica, se encontró que Apo AI es regulada

positivamente en animales susceptibles (61), por lo cual se espera que esta sea una proteína de

regulación negativa en individuos que no presentan ningún efecto adverso por exposición a hipoxia

hipobárica. Por otra parte, Apo AI también se ha descrito como un potencial biomarcador en cáncer

mediante diferentes enfoques proteómicos (87).

De acuerdo con los perfiles de expresión para Apo AI y A1T1, Apo AI presenta un aumento al día 26

del seguimiento (Figura 19), lo que puede sugerir su acción como antiinflamatorio y antioxidante

mientras que A1T1 presenta picos de aumento y disminución a lo largo del seguimiento y no hay un

consenso entre los perfiles de expresión de los tres spots a partir de los cuales se identificó, sin

embargo, en el intervalo comprendido entre los días 19 y 56 es donde presenta mayor variabilidad.

Por lo anterior, se puede sugerir que tanto Apo AI como A1T1 están implicadas en la fase crónica del

proceso de aclimatación y corresponden con la evidencia que las postula como marcadores del

proceso de adaptación en nativos de grandes altitudes.

Por otra parte, tres de las proteínas identificadas a partir de los spots seleccionados en el individuo 2

(Tf, A1T1 y Apo AI) pertenecen al mismo cluster (Figuras 16,17), y también tienen en común que son

proteínas de transporte relacionadas con la actividad antioxidante, y su importancia radica en su

capacidad para enfrentar el estrés oxidativo en la altitud. Un estudio previo que comparó las

proteínas plasmáticas de nativos de gran altitud respecto a las de un grupo control a nivel del mar

encontró que la Hpx, A1T1 y Apo AI estaban reguladas positivamente, mientras que RBP4 disminuyó

bajo la condición de hipoxia hipobárica (16). En este trabajo, todas las proteínas identificadas

presentaron patrones de expresión diferencial a lo largo del seguimiento y se caracterizan por


94

pertenecer al grupo de proteínas de fase aguda relacionadas con la inflamación y la capacidad

antioxidante, por lo cual su expresión puede facilitar el control rápido y eficaz del daño inflamatorio

y el estrés oxidativo (61).

Debido a que la respuesta integrada ante la condición de hipoxia hipobárica en humanos es poco

entendida, existen varias controversias sobre el tiempo en que ocurren adaptaciones específicas, el

grado de hipoxia en que ocurren y la especificidad de los tejidos en los que ocurren (63). En este

trabajo, se identificaron proteínas de alta abundancia en suero sanguíneo que se ha reportado están

relacionadas con diferentes patologías, por lo cual no se puede asegurar su función como

biomarcadores de la condición de hipoxia hipobárica. Lo anterior pone de manifiesto la necesidad de

caracterizarlas para comprender su mecanismo de regulación en procesos relacionados con el

requerimiento de energía de las células, la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre y la

homeostasis durante la aclimatación (61).

De otro lado, para establecer la posible relación entre las proteínas identificadas se construyó una

red con STRING. Esta última es una base de datos biológicos construida a partir de numerosas fuentes

que integra información de interacciones proteína-proteína identificadas y predichas, ya sea directas

(físicas) o indirectas (funcionales) para un gran número de organismos. La red se construyó a partir

de evidencia experimental para Homo sapiens con un nivel de confianza alto (Figura 20), y en esta se

puede observar la posible interacción entre todas las proteínas identificadas excepto RBP4, por 6

nodos con 11 conexiones y un valor de p de enriquecimiento de 2.23e-10, que sugiere que estas

proteínas presentan más interacciones entre sí de lo que lo que se esperaría para un conjunto

aleatorio de proteínas de tamaño similar, y en consecuencia indica que participan en procesos

biológicos estrechamente relacionados.

Figura 20. Red de interacción de las proteínas identificadas usando STRING. Red obtenida usando

un score de alta confianza (0.700) sin nodos adicionales. Cada nodo denota una proteína, las líneas

representan interacciones entre las proteínas y el grosor indica el nivel de confianza asociado con

cada interacción. Los colores representan el proceso biológico en el que participan cada una de las

proteínas que se encuentran en la red. Rojo: degranulación de plaquetas. Azul: Modificación post-


95

traduccional de proteínas. Verde claro: Transporte mediado por vesículas. Morado: Regulación de la

producción de mediadores de la respuesta inmune. Verde oscuro: Transporte. Las siglas

corresponden a cada una de las proteínas, ALB: Albúmina, TF: Transferrina, APOA1: Apolipoproteína

AI, SERPINA: Inhibidor 1 alfa de antitripsina (A1T1), FGG: Cadena gamma de fibrinógeno. HPX:

Hemopexina.

STRING permite establecer la relación entre las proteínas de la red de acuerdo con los tres dominios

de los términos GO que corresponden a componente celular, función molecular y proceso biológico.

En la red se destacan los términos GO que corresponden a la categoría de proceso biológico debido

a que estos permiten establecer la posible relación entre las proteínas identificadas y el conjunto de

funciones moleculares en las que participan, para proponer su posible asociación con el ajuste

fisiológico que tiene lugar en la altitud. De esta forma, la anotación funcional reveló que los procesos

biológicos más representativos para estas proteínas están relacionados con degranulación de

plaquetas, modificación post-traduccional, transporte mediado por vesículas y regulación de

mediadores de la respuesta inmune, entre otros que ya se han reportado previamente (Tabla 9).

Aunque en la red RBP4 está representada como un nodo independiente, las siete proteínas


96

identificadas están implicadas en procesos relacionados con el transporte y la regulación de la calidad

biológica (Tabla 9). De acuerdo con la actividad de las proteínas identificadas, la función de transporte

puede estar relacionada con iones y moléculas pequeñas como hierro, el grupo hemo, lípidos y retinol

que son los respectivos ligandos de algunas de las proteínas como Tf, Hpx, Apo AI y RBP4

respectivamente, sin excluir a la Alb que tiene numerosos ligandos y a A1T1 que presenta una afinidad

moderada por la plasmina y la trombina. El término GO relacionado con la regulación de la calidad

biológica común para las proteínas identificadas pone en evidencia que estas proteínas participan en

diferentes procesos moleculares (mantenimiento de la localización celular y respuestas del sistema

inmune) estrechamente relacionados a nivel sistémico con la homeostasis de iones, moléculas,

fluidos corporales, la respuesta cardiovascular, la angiogénesis y la eritropoyesis, entre otros

procesos que tienen lugar durante la fase aguda y crónica de aclimatación a hipoxia hipobárica.

Tabla 9. Enriquecimiento de términos GO de las proteínas identificadas por MS. Resultados

obtenidos con STRING. Términos GO seleccionados por tasa de falso descubrimiento <0.01. Los

colores representan cada una de las proteínas relacionadas en la red que participan en cada proceso

biológico. Verde claro: Alb, azul: Apo A1, gris: Fgg, Amarillo: A1T1, Naranja: Tf, Rosado: Hpx y verde

oscuro: RBP4.

GO: Proceso Biológico

Término GO Descripción Tasa de falso

descubrimiento

Proteínas relacionadas en la

red

GO:0002576 Degranulación de plaquetas 2.41E-07

GO:0043687 Modificación postraduccional de proteínas 1.99E-05

GO:0016192 Transporte mediado por vesículas 0.00047

GO:0065008 Regulación de la calidad biológica 0.00079

GO:0002700 Regulación de la producción de mediadores de la respuesta inmune 0.00095

GO:0034375 Remodelamiento de lipoproteínas de alta densidad 0.0016

GO:0006810 Transporte 0.0016

GO:0034114 Regulación de la adhesión heterotípica célula-célula. 0.0018

GO:0006896 Endocitosis mediada por receptor 0.0025

http://amigo.geneontology.org/amigo/term/GO:0002576







97

GO:1900026 Regulación positiva de la extensión celular dependiente de la adhesión

0.0028

GO:0051180 Transporte de vitaminas 0.0037

GO:0002639 Regulación positiva de la producción de inmunoglobulinas 0.0043

GO:0043062 Organización de la estructura extracelular 0.0058

GO:0071702 Transporte de sustancias orgánicas 0.0067

GO:0048878 Homeostasis química 0.0067

GO:0006879 Homeostasis celular de hierro 0.0068

GO:0006826 Transporte de hierro 0.0074

GO:0050708 Regulación de la secreción de proteínas 0.0084

GO:0001523 Procesos metabólicos retinoides 0.0095

GO:0090277 Regulación positiva de la secreción de hormonas peptídicas 0.0107

Además del enriquecimiento de los términos GO en STRING, se uso la herramienta Gonet, este

recurso permite visualizar de forma general la relación entre los procesos biologicos y las proteínas

identificadas (Figura 21).

Figura 21. Red de enriquecimiento para las proteínas identificadas usando Gonet. Red obtenida

usando un score de alta confianza (2.73e-5) en Gonet. En naranja se destacan los códigos de Uniprot

de cada una de las proteínas (P02768: Alb, P02790: Hpx, P02679: Fgg, P02753: RBP4, P01009: A1T1,

P02647: Apo AI y P02787: T) y en verde de tono oscuro a claro la reelevancia de cada uno de los

procesos biológicos.


98

Como se puede evidenciar en ambos casos, el término GO más representativo dentro de la categoria

de proceso biológico es la degranulación de plaquetas (Figuras 20,21). Este proceso es importante

porque permite la liberación de una gran cantidad de mediadores y moleculas de señalización a partir

de la activación de las plaquetas para inducir procesos como la cicatrización, la coagulación y la

angiogénesis. Este último, es un proceso clave durante la reparación de tejidos, y requiere de una


99

variedad de factores de crecimiento que actúan de diferente forma para asegurar la restauración y

funcionalidad de los vasos sanguíneos. Por otra parte, la importancia de la degranulación de

plaquetas durante la aclimatación a hipoxia hipobárica se debe a que las plaquetas liberan los

principales reguladores de la angiogénesis como son VEGF, FGF-2 y los factores de crecimiento

derivados de las plaquetas (PDGF), entre otros, que a su vez se unen a proteínas como el fibrinógeno.

Asi mismo, se ha propuesto que la liberación continua de estos factores de crecimiento promueve la

angiogénesis tanto in vitro como in vivo y tiene un efecto en la coagulación.

La participación de las plaquetas como actor principal durante la cicatrización convella al desarrollo

de diferentes fases que involucran la hemostasia, la inflamación, la proliferación y la remodelación.

En el contexto de la hipoxia hipobárica, la activación de vías relacionadas con inflamación y la

detección de moleculas de señalización relacionadas con este proceso han permitido sugerir que la

inflamación sistémica es una caracteristica fisiológica clave de los procesos de aclimatación y

adaptación. A su vez, las fases de activación, proliferación y migración de celulas endoteliales

favorecen la angiogénesis y disminuyen la probabilidad de presentar efectos negativos producto de

la exposición a hipoxia hipobárica debido al potencial de citoquinas, integrinas e interleuquinas

liberadas por plaquetas. Las plaquetas son células sin núcleo que se originan a partir de

megacariocitos en la medula ósea y están compuestas por organelos reservorios que se conocen

como gránulos densos, lisosomas y gránulos alfa. Estos últimos son el mayor reservorio de proteínas

en las plaquetas y son clave para su función, así mismo la liberación de VEGF y otros factores de

crecimiento es esencial en la angiogénesis.

Lo anterior es importante debido a que como se ha reportado previamente, la hipoxia induce la

expresión de mediadores proinflamatorios como PDGH y el factor activador de plaquetas (PAF). Estos

dos últimos tienen una función importante en el remodelamiento vascular y median la activación de

células inducidas por hipoxia y la liberación de citoquinas, por lo cual se ha propuesto que su

liberación puede estar relacionada con la progresión de efectos negativos en la altitud. En un estudio

proteómico, se identificaron proteínas expresadas diferencialmente en plaquetas bajo la condición

de hipoxia, relacionadas con la coagulación, así como también se han identificado en suero y plasma


100

sanguíneo, lo cual pone en evidencia la importancia del estudio del proteoma y la complejidad en los

mecanismos de respuesta a la condición de hipoxia.

A la fecha son pocos los estudios que evalúan el impacto de la condición de hipoxia en la función

plaquetaria en humanos, sin embargo, la literatura pone en evidencia la compleja red de interacción

entre la condición de hipoxia, la inflamación, la activación de plaquetas y la coagulación, que a su vez

están relacionados con diferentes procesos como el transporte y la exocitosis. En resumen, respecto

a las proteínas identificadas es importante destacar que la mayoría se clasifica como proteínas de

fase aguda relacionadas con hemostasia, inflamación, transporte y capacidad antioxidante, procesos

que se han relacionado con exposición a hipoxia hipobárica en nativos de gran altitud y en individuos

nativos a nivel del mar en altitud moderada como en este trabajo.

Por otra parte, aunque hay múltiples trabajos relacionados con hipoxia hipobárica en humanos (16),

estos se han centrado principalmente en el estudio de individuos a nivel del mar y en altitud, y en

ninguno de ellos se aporta información acerca de cambios en el proteoma sérico por exposición a

hipoxia hipobárica en el tiempo, también por la dificultad que tiene realizar este tipo de estudios. Por

lo anterior, el abordaje presentado en este trabajo es un primer acercamiento hacia la evaluación del

proteoma sérico durante el proceso de aclimatación a hipoxia hipobárica, y los resultados

corresponden con lo que se ha reportado en la literatura, aunque como se ha evidenciado, cada

individuo presenta una respuesta diferencial ante la condición de hipoxia hipobárica y esta está

relacionada principalmente con el género, lo cual se puede evidenciar en los resultados obtenidos

del componente hematológico principalmente. Por último, es importante resaltar que el diseño

experimental seguido en este trabajo es una aproximación adecuada para detectar diferencias en el

perfil de expresión de proteínas posiblemente relacionadas con el proceso de aclimatación.


101

8. Conclusiones y recomendaciones

8.1 Conclusiones

1. La determinación de variables hematológicas en este trabajo pone en evidencia la existencia

de mecanismos de respuesta diferencial inter e intraindividuos ante la condición de hipoxia

hipobárica que dependen principalmente del género, por lo cual su utilidad como marcadores

de aclimatación a la altitud moderada es limitado.

2. Los valores en la concentración de hemoglobina y el porcentaje de hematocrito fueron más

elevados para los hombres respecto a las mujeres, y el incremento en las mujeres

participantes en este estudio fue ligero, lo que puede ser indicador de su capacidad para ser

más tolerantes al estímulo hipóxico.

3. La metodología de electroforesis bidimensional y posterior espectrometría de masas

permitió evaluar la expresión de proteínas a lo largo de un periodo de tiempo de 3 meses en

individuos expuestos a hipoxia hipobárica como una aproximación al ajuste fisiológico que

tiene lugar en la altitud.

4. La metodología usada en este trabajo permitió evidenciar que existen proteínas cuya

expresión cambia a lo largo del tiempo bajo la condición de hipoxia hipobárica. Algunas de

estas proteínas fueron identificadas y se encontró que participan en diferentes procesos

biológicos relacionados con la aclimatación entre los que se destacan degranulación de

plaquetas, transporte y procesos de respuesta de fase aguda.

5. Este trabajo es una primera aproximación para la evaluación de cambios en el proteoma

sérico en el tiempo de individuos expuestos a hipoxia hipobárica pertenecientes a la

población andina.


102

8. 2 Recomendaciones

Estos resultados además de ser exploratorios y contribuir a la comprensión de los mecanismos

implicados en la aclimatación, generan varios interrogantes que pueden ser una guía para futuros

estudios. Con la metodología establecida se propone analizar un mayor número de muestras e

identificar un mayor número de spots para abordar un enfoque exploratorio más amplio, así como

determinar otras variables hematológicas que se complementen con pruebas a nivel molecular para

evaluar diferencias entre mujeres y hombres durante el ajuste fisiológico que tiene lugar en la altitud.

Así mismo, implementar técnicas proteómicas de mayor sensibilidad que aborden un enfoque

cuantitativo como iTRAQ y DIGE.


103

9. Anexos

A. Formato de consentimiento informado y aval del comité

de ética

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS

CONSENTIMIENTO INFORMADO

PROYECTO: “MicroARNs (miRNAs) y péptidos circulantes asociados con adaptación a hipoxia

ambiental en población colombiana”

Claudia Consuelo Rubiano; Edgar Cristancho; Camila González; Andrés García

INTRODUCCIÓN

Por medio del presente documento queremos invitarlo a participar del proyecto de investigación

titulado “MicroARNs y péptidos circulantes asociados con adaptación a hipoxia ambiental en

población colombiana” en el cual se pretende estudiar los cambios en algunos biomarcadores que se

encuentran en la sangre con el proceso de adaptación a la altura, al evaluar individuos de tierras bajas

(≤1800 msnm) que llegan a la ciudad de Bogotá (2600 msnm) y de esta manera poder relacionar

dichos marcadores con las variaciones fisiológicas del proceso adaptativo.

Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la facultad de Ciencias de la Universidad Nacional.

Además, se desarrollará según la legislación Colombiana de Buenas Prácticas Clínicas (Resolución

número 002378 de 2008) y la Declaración de Helsinki, en los cuales se regula la confidencialidad de

la identidad de los sujetos, los consentimientos informados, los métodos, aval ético y el bienestar de

los individuos. De acuerdo a lo establecido en la Resolución No. 00843 de 1993 del Ministerio de Salud

este proyecto es de riesgo mínimo para los participantes.

PROCEDIMIENTOS

Para el desarrollo de la investigación es necesario que como participante del estudio se tomen 9

muestras de sangre a lo largo de 4 meses, distribuidas de la siguiente manera: 1. Al primer día de

llegada a Bogotá; 2. a los 3 días; 3. a los 5 días; 4. a las 2 semanas; 5. A las 3 semanas; 6. Al mes; 7 a

los dos meses; 8. A los tres meses; 9 a los cuatro meses.


104

Este procedimiento se llevará a cabo en las instalaciones de la Universidad Nacional de Colombia,

bajo la dirección de los profesores Claudia Rubiano y Edgar Cristancho. Las muestras serán tomadas

por personal calificado (médico, enfermero(a) o bateriólogo(a)) y autorizado vinculado al proyecto.

Para las muestras se realizará citación previa por medio telefónico, una vez se encuentre en las

instalaciones se darán 5 minutos de reposo y para la toma de datos, posterior a esto se realiza la toma

de la muestra por venopunción a nivel braquial de 10 mL de sangre distribuidos en dos tubos que

serán utilizados para posteriores análisis de microRNAs, péptidos, hematocrito y hemoglobina.

Junto con la muestra de sangre es posible que se realicen otros procedimientos los cuales serán

notificados oportunamente. Estos procedimientos serán de tipo no invasivo y puede incluir la

medición de parámetros ventilatorios y espirométricos como la ventilación por minuto, la frecuencia

respiratoria, frecuencia cardíaca, VO2 y VCO2.

RIESGOS

A pesar de ser considerado un procedimiento de bajo riesgo y que no causa problemas a la mayoría

de los individuos puede provocar problemas inherentes a cualquier procedimiento médico y/o

quirúrgico como sangrado, hematomas, cambios en los signos vitales (Tensión arterial, respiración,

pulso) y desmayos.

BENEFICIOS

Se brindará a los individuos participantes del estudio un resultado con análisis por profesionales de

la salud de los parámetros hematológicos básicos.

CONFIDENCIALIDAD

Toda la información obtenida y los resultados serán tratados confidencialmente, esta información

será almacenada en una base de datos y al finalizar el estudio se le entregará un documento con los

resultados individuales de algunos parámetros medidos para su conocimiento. A menos que usted lo

permita, los resultados no estarán disponibles para terceras personas como empleadores,

organizaciones u otras instituciones o personas naturales o jurídicas.

TRATO DE LA MUESTRA

Las muestras de sangre obtenidas en el presente estudio se utilizarán para lo descrito anteriormente,

sin embargo, puede que queden remanentes de las muestras que podrían ser utilizados para fines

investigativos con otros propósitos. Sin embargo, es necesario su consentimiento y aprobación para

el uso de las muestras sobrantes, por tal razón solicitamos a usted que señale con una X la opción

que según su voluntad considere la mejor:


105

-Las muestras sobrantes pueden ser utilizadas con fines investigativos y solicito que se me informe

de los resultados obtenidos. ____

-Las muestras sobrantes pueden ser utilizadas con fines investigativos y no quiero que se me informe

de los resultados obtenidos, ____

-Quiero que las muestras sobrantes sean destruidas y no almacenadas una vez concluido este estudio.

____

DERECHOS Y RESPONSABILIDADES

Los participantes que firmen este documento tienen la responsabilidad de asistir a las citaciones

programadas, sin embargo, también tienen derecho a renunciar y anular este documento en

cualquier momento informando al grupo de investigación la decisión de no seguir participando en el

estudio sin ningún tipo de repercusión legal.

PALABRA FINAL

La persona __________________ explicó la naturaleza de este consentimiento informado, los

procedimientos a realizar y yo _______________________ identificado con CC _____________ me

he familiarizado con el documento, he tenido la oportunidad de hacer preguntas que han sido

respondidas, entiendo y comprendo los contenidos del mismo, por tal razón estoy de acuerdo en

participar en el estudio.

FIRMA

Nombre:

Teléfono:

Documento:

Fecha:


106



CONSENTIMIENTO INFORMADO

(Versión Padres de familia en caso de menores de edad)




INTRODUCCIÓN

Por medio del presente documento queremos invitar a su hijo/a a participar del proyecto de

investigación titulado “MicroARNs y péptidos circulantes asociados con adaptación a hipoxia

ambiental en población colombiana” en el cual se pretende estudiar los cambios en la cantidad de

algunos biomarcadores que se encuentran en la sangre con el proceso de adaptación a la altura, al

evaluar individuos de tierras bajas (≤1800 msnm) que llegan a la ciudad de Bogotá (2600 msnm) y de

esta manera poder relacionar dichos marcadores con las variaciones fisiológicas del proceso

adaptativo.

Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la facultad de Ciencias de la Universidad Nacional

de Colombia. Además, se desarrollará según la legislación Colombiana de Buenas Prácticas Clínicas

(Resolución número 002378 de 2008) y la Declaración de Helsinki, en los cuales se regula la

confidencialidad de la identidad de los sujetos, los consentimientos informados, los métodos, aval

ético y el bienestar de los individuos. De acuerdo a lo establecido en la Resolución No. 00843 de 1993

del Ministerio de Salud este proyecto es de riesgo mínimo para los participantes.

PROCEDIMIENTOS

Para el desarrollo de la investigación es necesario que a su hijo/a como participante del estudio se le

tomen 9 muestras de sangre a lo largo de 4 meses, distribuidas de la siguiente manera: 1. Al primer

día de llegada a Bogotá; 2. a los 3 días; 3. a los 5 días; 4. a las 2 semanas; 5. A las 3 semanas; 6. Al mes;

7 a los dos meses; 8. A los tres meses; 9 a los cuatro meses.



por personal calificado (médico, enfermero(a) o bateriólogo(a)) y autorizado vinculado al proyecto.



107








RIESGOS



quirúrgico como sangrado, hematomas, cambios en los signos vitales (Tensión arterial, respiración,

pulso) y desmayos.

BENEFICIOS



CONFIDENCIALIDAD






TRATO DE LA MUESTRA









108


de los resultados obtenidos, ____


____



programadas, sin embargo, también tienen derecho a renunciar y anular este documento en

cualquier momento informando al grupo de investigación la decisión de no seguir participando en el

estudio sin ningún tipo de repercusión legal.

PALABRA FINAL

La persona _______________________ explicó la naturaleza de este consentimiento informado, los

procedimientos a realizar y yo ____________________ identificado con C.C. ______ como

representante legal de __________________________ me he familiarizado con el documento, he

tenido la oportunidad de hacer preguntas que han sido respondidas, entiendo y comprendo los

contenidos del mismo, por tal razón estoy de acuerdo que mi hijo/hija participe del estudio.

FIRMA

Nombre:

Teléfono:

Cédula:

Fecha:


109



ASENTIMIENTO INFORMADO




INTRODUCCIÓN

Teniendo en cuenta que tanto niños como adolescentes son sujetos activos en ejercicio de sus

derechos y cuya autonomía y razonamiento moral se encuentra en un proceso continuo de

desarrollo; que además según la convención de las Naciones Unidas los menores de edad tienen

derecho de libertad, de conciencia y pensamiento es necesario que el participante directo de la

investigación decida de manera libre y voluntaria la participación en el estudio.

Por medio del presente documento queremos invitarlo a participar del proyecto de investigación

titulado “MicroARNs y péptidos circulantes asociados con adaptación a hipoxia ambiental en

población colombiana” en el cual se pretende estudiar los cambios en la cantidad de algunos

biomarcadores que se encuentran en la sangre con el proceso de adaptación a la altura, al evaluar

individuos de tierras bajas (≤1800 msnm) que llegan a la ciudad de Bogotá (2600 msnm) y de esta

manera poder relacionar dichos marcadores con las variaciones fisiológicas del proceso adaptativo.

Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la facultad de Ciencias de la Universidad Nacional

de Colombia. Además, se desarrollará según la legislación Colombiana de Buenas Prácticas Clínicas

(Resolución número 002378 de 2008) y la Declaración de Helsinki, en los cuales se regula la

confidencialidad de la identidad de los sujetos, los consentimientos informados, los métodos, aval

ético y el bienestar de los individuos. De acuerdo a lo establecido en la Resolución No. 00843 de 1993

del Ministerio de Salud este proyecto es de riesgo mínimo para los participantes.

PROCEDIMIENTOS

Para el desarrollo de la investigación es necesario que a usted como participante del estudio se le

tomen 9 muestras de sangre a lo largo de 4 meses, distribuidas de la siguiente manera: 1. Al primer

día de llegada a Bogotá; 2. a los 3 días; 3. a los 5 días; 4. a las 2 semanas; 5. A las 3 semanas; 6. Al mes;

7 a los dos meses; 8. A los tres meses; 9 a los cuatro meses.


110



por personal calificado (médico, enfermero(a) o bacteriólogo (a) y autorizado vinculado al proyecto.









RIESGOS



quirúrgico como sangrado, cambios en los signos vitales (Tensión arterial, respiración, pulso) y

desmayos.

BENEFICIOS



CONFIDENCIALIDAD






TRATO DE LA MUESTRA







111


de los resultados obtenidos. ______




______



programadas, sin embargo también tienen derecho a renunciar y anular este documento en cualquier

momento informando al grupo de investigación la decisión de no seguir participando en el estudio

sin ningún tipo de repercusión legal.

PALABRA FINAL

La persona ________________________ explicó la naturaleza de este consentimiento informado, los

procedimientos a realizar y yo ___________________ identificado con TI _______________ me he

familiarizado con el documento, he tenido la oportunidad de hacer preguntas que han sido

respondidas, entiendo y comprendo los contenidos del mismo, por tal razón estoy de acuerdo en

participar en el estudio.

Nombre:

Fecha:

Edad:


112


113

B. Datos para la determinación de variables hematológicas

G P

M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8

Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2 Pro Hb Hb 2

Pro Hb Hb 2 Pro

F P2 12,50 12,70

12,60 10,50

10,90 10,70 12,50 12,00

12,25 12,80 13,40

13,10 11,30 11,70

11,50

13,40 13,40

13,40

12,60

11,80

12,20

13,50

13,50

13,50

F P3 13,20 13,20

13,20 12,00

12,10 12,05 16,10 15,60

15,85 13,90 13,40

13,65 14,80 14,70

14,75

14,00 14,20 14,1

15,00

15,00

15,00

15,10

14,80

14,95

M P1 17,20 17,40

17,30 16,30

16,70 16,50 18,60 18,50

18,55 15,00 15,50

15,25 16,20 16,40

16,30

16,40 16,90

16,65

16,60

16,20

16,40

15,30

15,60

15,45

M P4 16,40 16,40

16,40 15,50

15,20 15,35 15,30 15,90 15,6 17,30 17,20

17,25 16,40 16,30

16,35

17,30 16,80

17,05

16,60

16,60

16,60

17,20

17,50

17,35

M P6 14,70 14,90

14,80 16,80

17,10 16,95 17,20 17,90

17,55 16,60 16,80

16,70 18,20 18,10

18,15

16,70 16,60

16,65

16,50

16,60

16,55

16,20

16,70

16,45

M P7 15,00 15,00

15,00 15,90

16,40 16,15 15,20 15,40 15,3 16,20 16,60

16,40 15,30 15,00

15,15

14,00 14,00

14,00

15,20

15,10

15,15

15,60

15,60

15,60

Tabla 9. Concentración de Hb. F: Femenino. M: Masculino. P: Participante. Hb y Hb2: Datos de la concentración de hemoglobina por duplicado

para cada individuo. Pro: Promedio de la concentración de hemoglobina.


114

G P

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8

Hct Hct 2 Pro Hct Hct 2 Pro Hct Hct

2 Pro Hct Hct 2 Pro Hct Hct 2 Pro Hct

Hct 2

Pro Hct Hct 2 Pro Hct Hct 2 Pro

F P2 -- -- -- 35,0

0 34,0

0 34,50

43,00

43,00

43,00

39,30

39,00

39,10

40,20

41,00

40,60 40,0

0 41,0

0 40,50

38,00

38,50 38,20 41,20 41,2

0 41,2

0

F P3 -- -- -- 43,0

0 44,0

0 43,50

46,40

45,90

46,10

38,70

38,80

38,70

43,00

44,00

43,50 43,0

0 43,0

0 43,00

36,00

36,00 36,00 44,00 44,0

0 44,0

0

M P1 46,3

0 46,2

0 46,2

0 48,0

0 48,0

0 48,00

49,00

49,00

49,00

45,70

44,90

45,30

49,00

49,00

49,00 49,0

0 50,0

0 49,50

54,00

54,00 54,00 47,00 47,0

0 47,0

0

M P4 49,0

0 50,0

0 49,5

0 53,5

0 56,0

0 54,70

44,00

45,00

44,50

49,20

49,20

49,20

48,00

49,00

48,50 52,0

0 52,0

0 52,00

58,00

58,00 58,00 52,00 52,0

0 52,0

0

M P6 62,0

0 62,0

0 62,0

0 47,7

0 47,1

0 47,40

48,50

48,40

48,40

51,00

50,00

50,50

49,20

49,20

49,20 49,0

0 49,0

0 49,00

48,00

49,00 48,50 48,00 48,0

0 48,0

0

M P7 45,0

0 45,0

0 45,0

0 47,8

0 47,1

0 47,40

45,00

46,00

45,50

49,00

49,00

49,00

46,00

46,00

46,00 38,0

0 38,0

0 38,00

46,00

46,00 46,00 47,70 46,7

0 47,2

0


115

Tabla. Porcentaje de Hct. G: Género. F: Femenino. M: Masculino. P: Participante. Hct y Hct2: Datos del porcentaje de hematocrito por duplicado

para cada individuo. Pro: Promedio del porcentaje de hematocrito

P P2 P3 P1 P4 P6 P7

MUESTRA Hb Hct CHCM Hb Hct CHCM Hb Hct CHCM Hb Hct CHCM Hb Hct CHCM Hb Hct CHCM

M1 12,84 - - 13,45 - - 17,63 46,25 38,12 16,71 49,50 33,77 15,08 62,00 24,33 15,29 45,00 33,97

M2 10,91 34,50 31,61 12,28 43,50 28,23 16,82 48,00 35,04 15,64 54,75 28,57 17,28 47,40 36,45 16,46 47,45 34,69

M3 12,49 43,00 29,04 16,15 46,15 35,00 18,91 49,00 38,58 15,90 44,50 35,73 17,89 48,45 36,92 15,59 45,50 34,27

M4 13,35 39,15 34,10 13,91 38,75 35,90 15,54 45,30 34,31 17,58 49,20 35,73 17,02 50,50 33,70 16,71 49,00 34,11

M5 11,72 40,60 28,87 15,03 43,50 34,56 16,61 49,00 33,90 16,66 48,50 34,36 18,50 49,20 37,60 15,44 46,00 33,57

M6 13,66 40,50 33,72 14,37 43,00 33,42 16,97 49,50 34,28 17,38 52,00 33,42 16,97 49,00 34,63 14,27 38,00 37,55

M7 12,43 38,25 32,51 15,29 36,00 42,47 16,71 54,00 30,95 16,92 58,00 29,17 16,87 48,50 34,78 15,44 46,00 31,51

M8 13,76 41,20 33,40 15,24 44,00 34,63 15,75 47,00 33,50 17,68 52,00 34,01 16,77 48,00 34,93 15,90 47,20 33,69

Tabla. Determinación de la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM). P: Participante. Hb: Promedio de la concentración de

hemoglobina. Hct: Promedio de la concentración de hematocrito. P2, P3: Mujeres. P1, P4, P6, P7: Hombres.


116

C. Promedio de la concentración de hemoglobina y el hematocrito por individuo

Figura. Hematocrito por individuo. En la gráfica se observan los valores del porcentaje de hematocrito para cada uno de los individuos durante

el seguimiento.


117

Figura. Concentración de hemoglobina por individuo. En la gráfica se observan los valores de la concentración de hemoglobina para cada uno

de los individuos durante el seguimiento.


118

D. Cuantificación de proteínas totales con BCA

Individuo

Suero sanguíneo Eluido de proteínas no unidas: Suero depletado

Muestra Abs Abs Promedio Concentración

(ug/ul) Concentración final (ug/ul)

Cantidad para la

depleción (ug) 1 Eluido

2 Eluidos (ug)

Abs Abs Promedio Concentración

(ug/ul) Concentración final (ug/ul)

1

1 0,967 1,014 0,991 0,8366 83,664 2484,831 4969,662 0,352 0,365 0,359 0,251 10,051

2 0,887 0,881 0,884 0,7309 73,088 2485,005 4970,010 0,735 0,742 0,739 0,637 25,482

3 0,935 0,910 0,923 0,7691 76,912 2484,245 4968,491 0,742 0,759 0,751 0,649 25,970

4 0,749 0,746 0,748 0,5953 59,533 2482,537 4965,074 0,700 0,711 0,706 0,604 24,142

5 0,991 0,889 0,940 0,7865 78,649 2485,323 4970,645 0,578 0,649 0,614 0,510 20,406

6 0,773 0,784 0,779 0,6261 62,612 2485,685 4971,370 0,814 0,882 0,848 0,748 29,929

7 0,900 0,905 0,903 0,7493 74,926 2485,280 4970,559 0,323 0,326 0,325 0,217 8,670

8 0,958 0,855 0,907 0,7532 75,323 2485,650 4971,301 0,777 0,791 0,784 0,683 27,330

2

1 0,591 0,595 0,593 0,4419 44,191 1988,580 3977,160 1,001 1,006 1,004 0,906 36,244

2 0,684 0,684 0,684 0,5323 53,227 2485,720 4971,440 1,315 1,348 1,332 1,239 49,563

3 0,514 0,495 0,505 0,3540 35,402 1989,603 3979,206 0,377 0,382 0,380 0,273 10,904

4 0,798 0,798 0,798 0,6455 64,548 2485,104 4970,209 0,811 0,825 0,818 0,718 28,711

5 0,896 0,917 0,907 0,7532 75,323 2485,650 4971,301 0,587 0,63 0,609 0,505 20,203

6 0,929 0,927 0,928 0,7746 77,458 2478,649 4957,299 0,398 0,401 0,400 0,293 11,716

7 0,844 0,882 0,863 0,7100 71,003 2485,104 4970,209 0,476 0,486 0,481 0,376 15,025


119

8 0,917 1,015 0,966 0,8123 81,231 2485,680 4971,360 0,787 0,804 0,796 0,695 27,797

3

1 0,812 0,852 0,832 0,6792 67,925 2486,038 4972,075 0,730 0,749 0,740 0,638 25,523

2 0,758 0,823 0,791 0,6380 63,803 2488,332 4976,663 0,361 0,340 0,351 0,243 9,726

3 0,610 0,608 0,609 0,4578 45,780 1991,410 3982,820 0,376 0,367 0,372 0,264 10,579

4 0,662 0,573 0,618 0,4662 46,624 1990,829 3981,658 0,379 0,394 0,387 0,280 11,188

5 0,864 0,851 0,858 0,7046 70,457 2487,125 4974,250 0,696 0,692 0,694 0,592 23,675

6 0,785 0,820 0,803 0,6500 64,995 2489,310 4978,620 0,524 0,543 0,534 0,429 17,157

7 0,986 1,022 1,004 0,8500 85,005 2490,645 4981,291 0,359 0,374 0,367 0,259 10,376

8 0,880 0,896 0,888 0,7349 73,486 2483,813 4967,627 0,719 0,734 0,727 0,625 24,995

6

1 0,658 0,658 0,658 0,5065 50,645 2486,693 4973,386 0,432 0,457 0,445 0,339 13,543

2 0,950 0,950 0,950 0,7964 79,643 2484,846 4969,692 0,779 0,817 0,798 0,697 27,898

3 0,606 0,606 0,606 0,4548 45,482 1987,547 3975,094 0,671 0,650 0,661 0,558 22,315

4 0,852 0,852 0,852 0,6991 69,911 2488,818 4977,637 0,359 0,374 0,367 0,259 10,376

5 0,977 0,977 0,977 0,8232 82,324 2486,177 4972,354 0,719 0,734 0,727 0,625 24,995

6 0,597 0,597 0,597 0,4459 44,588 1988,620 3977,239 0,432 0,457 0,445 0,339 13,543

7 0,567 0,567 0,567 0,4161 41,609 1988,898 3977,795 0,427 0,433 0,430 0,324 12,954

8 0,684 0,684 0,684 0,5323 53,227 2485,720 4971,440 0,921 0,924 0,923 0,824 32,954

7

1 0,810 0,810 0,810 0,6574 65,740 2484,965 4969,930 0,531 0,541 0,536 0,431 17,259

2 0,587 0,587 0,587 0,4359 43,595 1989,668 3979,337 0,429 0,415 0,422 0,316 12,629

3 0,745 0,745 0,745 0,5929 59,285 2489,970 4979,940 0,512 0,529 0,521 0,416 16,629

4 0,828 0,828 0,828 0,6753 67,527 2485,005 4970,010 0,716 0,735 0,726 0,624 24,954

5 0,850 0,850 0,850 0,6971 69,712 2481,748 4963,496 0,871 0,785 0,828 0,728 29,117

6 0,726 0,726 0,726 0,5740 57,398 2485,343 4970,685 0,524 0,473 0,499 0,393 15,736

7 0,821 0,821 0,821 0,6683 66,832 2486,157 4972,314 1,051 1,09 1,071 0,974 38,964

8 0,819 0,819 0,819 0,6663 66,634 2485,432 4970,864 0,486 0,509 0,498 0,392 15,695

Tabla. Cuantificación de proteínas totales con BCA. Abs: Absorbancia


120

E. Análisis estadístico de los geles 2D con Delta 2D

Tabla. Resultados de los spots detectados en el seguimiento para el individuo 1.


121

Tabla. Resultados de los spots detectados en el seguimiento para el individuo 2.


122

F. Imágenes de geles 2D-PAGE Figura. Imágenes de los geles 2D-PAGE correspondientes al seguimiento del individuo 2. Geles obtenidos para el individuo 2 durante el

seguimiento. Rango de gradiente de pH de 5 a 8 y valores de peso molecular en kDa del marcador de peso molecular.

Días 1 3 5 KDa 𝑝𝐻 5 8 5 8 5 8 45 35 25

Días 12 19 26 KDa 𝑝𝐻 5 8 5 8 5 8 45 35 25


123

Días 56 86 KDa 𝑝𝐻5 8 5 8

45 35 25


124

G. Clusters para cada individuo obtenidos por K-means

Figura. Clusters del individuo 1. De abajo hacia arriba en el primer panel los cluster 1,2,3,4 y 5. De

abajo hacia arriba en el segundo panel los cluster 6,7, 8, 9 y 10.

Figura. Clusters del individuo 2. De abajo hacia arriba en el primer panel los cluster 1,2,3,4 y 5. De

abajo hacia arriba en el segundo panel los cluster 6,7,8, 9 y 10.


125

H. Gráficas de volcano para los individuos analizados

Figura. Gráficas de volcano correspondiente a cada una de las muestras del seguimiento del

individuo 1. Los números corresponden a los ID de algunos de los spots identificados.


126

Figura. Gráfica de volcano para correspondientes a cada una de las muestras del seguimiento del

individuo 2. Los números corresponden a los ID de algunos de los spots identificados.

I. Datos para gráficas de volcano

Tablas. Datos de FC y el valor de p calculados para realizar las gráficas de volcano

correspondiente a cada una de las muestras del seguimiento del individuo 1 y 6 respectivamente.

Los números corresponden a los ID de los spots identificados con Delta 2D y las celdas resaltadas

con color a los valores que cumplen con los criterios de (FC≥2,p<0.05).


127

Spot ID

Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8

Log FC -log p valor

Log FC -log p valor

Log FC -log p valor

Log FC -log p valor

Log FC -log p valor

Log FC -log p valor

Log FC -log p valor

496 1,370 8,777 0,113 1,551 0,083 5,305 -0,186 2,658 0,326 1,287 0,156 2,495 0,049 -0,397

498 1,291 8,770 0,265 2,108 0,238 2,854 0,299 2,328 0,264 0,828 -0,010 1,192 0,301 -0,076

495 1,014 8,728 -0,695 8,154 -0,428 7,553 -0,572 5,180 -0,429 2,658 -0,793 4,553 -0,175 -0,658

435 0,645 4,764 -0,193 4,366 0,017 2,187 -0,616 3,523 -0,170 3,398 -0,178 4,131 -0,402 -0,616

436 0,556 6,140 0,055 4,939 -0,230 4,527 -0,810 3,699 -0,399 1,199 -0,415 4,198 -0,237 -0,623

442 0,428 3,523 -0,054 2,022 -0,156 3,523 -0,592 4,000 -0,281 1,951 -0,144 4,499 -0,229 -0,653

402 0,373 4,000 -0,151 4,509 -0,035 3,097 -0,514 4,000 -0,446 2,032 0,192 3,155 -0,536 -0,499

429 0,339 8,283 -0,180 4,857 -0,003 0,896 -0,588 4,710 -0,197 2,959 -0,262 3,699 -0,485 -0,568

290 0,329 8,265 0,176 0,673 -0,174 3,000 -0,280 4,458 -0,719 4,000 -1,796 6,706 -0,100 -0,826

356 0,260 4,000 0,061 1,759 0,161 2,699 -0,053 3,046 -0,585 2,921 -0,370 4,483 -0,310 -0,652

416 0,259 8,120 -0,015 2,174 0,096 3,301 -0,147 3,699 -0,253 3,398 -0,155 4,764 -0,408 -0,678

392 0,253 8,106 -0,439 2,921 -0,400 4,553 -0,793 5,194 -0,545 3,155 -0,489 4,097 -0,209 -0,613

389 0,224 8,026 -0,177 2,959 -0,180 3,222 -0,420 4,910 -0,951 4,485 -0,380 5,851 -0,282 -0,767

284 0,138 7,688 0,139 1,298 0,027 3,523 -0,275 2,959 -0,889 5,383 -1,347 4,533 -0,296 -0,656

432 0,118 5,842 -0,072 3,699 0,050 2,658 -0,197 3,699 0,300 3,046 -0,148 3,301 -0,254 -0,519

1165 0,108 7,503 0,205 3,523 0,082 1,848 0,175 5,465 0,375 3,222 0,373 5,160 0,326 -0,713

353 0,090 2,620 -0,020 1,467 0,140 4,127 -0,007 2,194 -0,821 4,180 -0,006 1,186 -0,006 -0,074

348 0,087 3,699 0,010 1,301 -0,234 5,082 -0,415 4,234 -0,305 0,664 -0,174 5,472 -0,253 -0,738

352 0,082 3,398 -0,007 0,757 0,154 4,000 -0,038 2,678 -1,032 4,325 0,050 3,523 0,235 -0,547

544 0,080 7,269 0,041 5,951 0,041 7,133 -0,082 4,000 0,106 1,947 -0,091 3,523 -0,084 -0,547

471 0,068 7,141 -0,055 4,431 0,030 2,319 -0,193 6,119 -0,087 2,071 -0,265 4,550 -0,312 -0,658

423 0,052 5,087 -0,024 1,218 -0,066 3,097 -0,541 7,577 -0,180 1,870 -0,150 4,979 -0,165 -0,697

938 0,043 6,757 0,225 3,301 0,107 1,785 0,643 3,699 0,694 3,699 0,876 3,699 0,676 -0,568


128

347 0,041 5,757 -0,123 7,089 0,029 2,886 -0,345 4,506 -0,144 0,398 -0,109 4,719 -0,425 -0,674

343 0,037 3,398 0,103 5,275 -0,208 4,674 -0,359 4,413 -0,327 0,495 -0,169 5,488 -0,144 -0,739

354 0,037 3,222 -0,273 4,764 0,166 4,269 -0,342 3,699 0,142 0,584 -0,008 1,780 -0,458 -0,250

973 0,028 5,264 0,008 1,317 -0,061 3,523 -0,032 1,879 0,060 2,149 0,117 2,569 -0,003 -0,410

984 0,025 6,327 0,061 3,000 0,055 2,638 0,001 1,164 0,223 2,585 0,298 4,000 0,113 -0,602

812 0,019 6,067 0,016 1,648 -0,059 1,810 -0,001 0,070 0,125 4,389 0,249 3,523 0,161 -0,547

472 0,019 6,060 -0,068 2,553 -0,089 4,333 -0,267 5,020 -0,156 3,699 -0,201 3,699 -0,253 -0,568

395 0,010 5,547 -0,130 2,854 -0,249 6,780 -0,487 7,963 -0,412 3,398 -0,349 4,690 -0,223 -0,671

346 0,010 5,011 0,000 0,067 0,018 2,481 -0,138 4,171 -0,754 4,499 -0,075 2,620 -0,184 -0,418

606 -0,017 4,000 -0,298 2,921 -0,161 2,092 -0,433 2,886 -0,710 2,357 -0,374 4,000 -0,334 -0,602

692 -0,020 6,190 -0,062 3,398 -0,053 2,585 -0,069 3,155 0,106 4,000 0,084 6,007 0,061 -0,779

1085 -0,022 5,440 -0,049 2,770 0,031 1,889 -0,015 4,754 0,054 1,983 0,234 3,523 0,008 -0,547

539 -0,027 4,000 -0,093 5,243 -0,045 4,083 -0,215 5,444 -0,097 1,889 -0,119 3,046 -0,184 -0,484

285 -0,027 6,437 0,046 0,077 -0,025 1,672 -0,239 2,301 -1,046 5,407 -1,187 4,274 -0,567 -0,631

421 -0,038 4,799 -0,069 2,187 0,074 2,678 -0,286 3,523 -0,577 3,000 -0,194 4,975 -0,558 -0,697

534 -0,039 3,301 -0,089 4,287 -0,154 5,955 -0,429 5,670 -0,243 4,076 -0,231 4,332 -0,297 -0,637

476 -0,042 6,842 -0,155 4,009 -0,073 5,210 -0,327 4,262 -0,256 2,886 -0,298 4,000 -0,495 -0,602

345 -0,054 7,061 -0,214 4,146 -0,073 4,266 -0,457 4,000 -0,375 3,398 -0,426 4,483 -0,547 -0,652

1486 -0,068 7,269 -0,203 5,767 -0,074 3,301 -0,226 6,101 -0,033 1,623 -0,146 4,000 -0,205 -0,602

385 -0,080 7,428 -0,076 3,398 -0,184 6,321 -0,266 4,740 -0,799 4,733 -0,333 4,247 -0,567 -0,628

552 -0,092 7,559 -0,120 4,000 -0,102 4,000 -0,274 4,400 -0,157 2,060 -0,156 2,959 -0,338 -0,471

390 -0,096 7,604 0,103 4,000 -0,067 3,398 -0,146 4,215 -0,801 4,000 -0,400 5,963 -0,428 -0,775

469 -0,103 4,611 -0,146 3,523 0,057 3,398 -0,213 5,818 -0,259 3,523 -0,194 5,382 -0,194 -0,731

382 -0,111 7,740 -0,087 3,699 -0,060 2,553 -0,437 5,045 -1,018 4,489 -0,330 4,163 -0,426 -0,619

380 -0,111 5,830 -0,082 4,573 -0,085 2,149 -0,342 4,489 -1,013 6,149 -0,344 4,561 -0,362 -0,659


129

562 -0,114 7,767 -0,179 3,301 -0,012 1,458 -0,287 4,860 -0,035 0,924 -0,031 1,767 -0,213 -0,247

514 -0,115 7,777 -0,114 2,252 0,082 1,833 -0,074 2,051 -0,025 0,678 0,249 3,301 -0,375 -0,519

467 -0,135 4,406 -0,108 8,775 0,037 3,222 -0,162 4,277 -0,162 2,721 -0,228 5,839 -0,389 -0,766

1016 -0,136 7,947 -0,225 4,000 -0,173 2,770 0,039 2,824 0,183 2,553 0,174 2,699 0,033 -0,431

529 -0,141 2,292 -0,305 3,222 -0,133 2,229 -0,168 2,638 0,058 0,177 0,433 3,523 0,047 -0,547

380 -0,153 8,069 -0,316 4,613 -0,042 3,699 -0,445 4,000 -0,991 5,561 -0,395 6,248 -0,503 -0,796

424 -0,268 3,398 -0,102 3,699 -0,857 5,633 -0,369 4,029 -0,067 2,886 -0,168 5,466 -0,812 -0,738

312 -0,288 8,764 0,050 2,187 -0,547 3,398 -0,561 3,398 -0,721 3,699 -0,842 4,265 -0,804 -0,630

291 -0,292 8,780 -0,056 0,421 -0,237 5,588 -0,347 3,046 -0,652 3,046 -1,032 4,294 -0,726 -0,633

853 -0,307 7,062 -0,207 4,466 0,190 4,854 -0,290 4,460 -0,151 3,523 0,127 5,622 -0,227 -0,750

434 -0,324 8,907 0,022 2,328 0,010 1,450 -0,287 4,587 -0,403 4,000 -0,210 3,301 -0,889 -0,519

463 -0,368 5,049 -0,124 4,020 -0,057 4,228 -0,308 5,094 -0,558 4,917 -0,249 4,642 -0,321 -0,667

517 -0,384 5,833 -0,509 5,367 -1,013 4,788 -0,243 5,256 0,003 0,835 -0,173 3,699 -1,022 -0,568

862 -0,394 9,152 -0,183 3,222 0,344 5,682 -0,116 4,039 -0,126 2,456 0,295 4,124 -0,134 -0,615

518 -0,542 3,523 0,305 2,252 0,327 4,000 0,186 1,456 -0,383 1,971 0,612 3,398 -0,237 -0,531

314 -1,114 6,269 -1,041 4,971 -1,229 5,321 -0,975 6,636 -0,065 0,105 -0,686 4,812 -0,476 -0,682

263 -1,284 11,344 -1,268 4,719 -1,036 4,514 -0,824 6,532 -0,903 3,699 -2,097 5,227 -0,917 -0,718

297 -1,292 6,024 -0,996 4,959 -1,456 6,478 -1,328 5,289 -0,498 0,983 -0,863 4,804 -0,507 -0,682


130

Spot ID

Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8

Log FC -log p valor Log FC

-log p valor Log FC

-log p valor Log FC

-log p valor Log FC

-log p valor Log FC

-log p valor Log FC

-log p valor

299 0,267 2,770 -0,277 -0,442 0,050 1,475 0,112 1,979 0,863 4,658 -0,237 1,762 -0,186 1,951

169 0,263 2,745 -0,156 -0,438 0,020 0,398 0,034 0,741 -0,019 0,462 0,468 3,699 -0,023 0,740

1277 0,195 2,523 0,073 -0,402 0,207 3,097 0,234 2,638 0,664 4,742 -0,264 3,097 0,150 1,967

523 0,125 2,046 0,272 -0,311 -0,025 0,443 0,417 2,620 0,976 4,848 -0,019 0,325 0,497 3,699

231 0,115 2,796 0,100 -0,447 0,510 3,301 -0,457 3,699 0,386 2,770 -0,213 1,399 0,074 2,409

246 0,076 2,041 0,106 -0,310 0,261 3,155 -0,350 3,301 0,607 4,009 -0,483 3,155 -0,215 3,097

529 0,076 2,638 -0,012 -0,421 0,026 1,592 -0,025 0,798 -0,243 3,301 0,001 0,083 -0,081 2,538

332 0,066 1,955 0,001 -0,291 -0,081 1,939 0,192 2,745 0,189 2,481 0,490 4,143 0,134 2,658

559 0,055 1,189 0,132 -0,075 0,038 1,039 0,092 1,788 -0,096 2,125 -0,042 1,467 0,054 1,445

310 0,047 1,333 0,073 -0,125 0,031 1,093 0,218 2,444 0,049 1,470 0,200 2,824 -0,063 1,487

307 0,031 0,651 0,128 0,187 -0,060 1,335 0,142 2,076 -0,264 2,398 0,148 2,180 -0,095 1,644

553 0,016 1,536 -0,043 -0,186 -0,029 1,631 -0,095 2,347 -0,538 4,051 -0,045 2,319 -0,235 3,222

277 0,006 0,401 0,138 0,397 0,009 1,130 -0,017 0,453 -0,488 4,495 -0,009 1,190 -0,385 4,614

508 0,001 0,044 0,055 1,358 -0,021 2,009 0,317 3,699 0,615 4,573 -0,003 0,322 0,205 4,141

333 0,000 0,021 0,091 1,682 -0,079 2,229 0,132 2,194 0,133 2,959 0,365 4,027 -0,033 1,478

347 -0,042 4,261 -0,234 -0,630 -0,256 4,000 0,053 1,347 0,448 4,001 0,173 2,469 0,028 1,821

476 -0,048 1,240 0,027 -0,093 0,486 4,502 -0,434 4,099 -0,527 3,699 -1,398 4,780 -0,592 3,523

487 -0,061 1,762 -0,021 -0,246 0,007 0,938 -0,431 4,111 -1,155 4,444 -0,088 3,000 -0,377 4,000

916 -0,078 1,708 0,057 -0,232 -0,551 4,446 -0,141 2,409 -0,182 3,699 0,119 5,325 -0,123 2,678

431 -0,080 1,656 -0,076 -0,219 -0,074 1,979 -0,674 3,301 -0,857 3,523 -0,015 0,665 -0,465 3,222

566 -0,080 2,237 -0,256 -0,350 -0,185 3,155 -0,660 4,000 -0,327 3,301 -0,161 3,046 -0,520 3,523

262 -0,090 2,310 0,101 -0,364 -0,035 1,670 0,038 1,775 -0,184 2,745 0,047 1,996 -0,164 2,959

535 -0,091 1,807 0,002 -0,257 0,003 0,097 0,015 0,608 -0,381 4,115 -0,044 2,538 -0,015 1,305

304 -0,105 2,260 0,001 -0,354 -0,164 3,000 0,136 1,740 -0,214 3,301 0,091 1,618 0,221 2,167

486 -0,126 3,097 -0,092 -0,491 0,001 0,093 -0,597 4,365 -1,180 4,493 -0,130 3,398 -0,788 4,461

276 -0,127 1,801 0,069 -0,256 -0,344 2,569 0,037 0,898 -0,205 1,695 0,098 1,790 -0,247 2,301


131

296 -0,141 2,155 -0,090 -0,333 -0,093 1,900 0,005 0,148 -0,257 2,678 0,307 3,301 0,084 1,507

326 -0,148 2,602 -0,097 -0,415 -0,130 3,046 -0,305 3,523 -0,231 3,523 -0,201 3,398 -0,237 3,398

341 -0,182 3,097 0,088 -0,491 -0,260 3,523 0,086 2,420 0,347 4,032 0,228 3,699 -0,010 0,756

1934 -0,186 2,041 -0,005 -0,310 -0,206 2,187 0,165 1,900 -0,197 2,056 0,483 3,699 0,286 2,409

447 -0,199 3,155 0,002 -0,499 0,140 3,097 0,049 1,087 -0,312 3,398 0,143 2,456 -0,184 3,000

337 -0,201 2,481 -0,048 -0,395 -0,340 3,155 0,037 1,633 0,060 1,971 0,145 2,745 -0,261 3,046

401 -0,229 3,222 -0,251 -0,508 0,033 1,223 -0,415 3,222 -0,156 2,886 -0,609 3,523 -0,279 2,721

493 -0,230 2,824 -0,315 -0,451 -0,253 3,097 -0,767 3,699 -0,126 2,215 -0,315 3,155 -0,506 3,523

225 -0,291 3,222 0,138 -0,508 0,050 1,955 0,195 1,833 -0,425 3,523 0,294 2,638 0,117 1,827

609 -0,292 3,097 0,132 -0,491 0,595 4,701 -0,243 2,432 -0,214 2,357 -0,975 4,000 -0,260 2,921

540 -0,425 2,377 -0,762 -0,376 -0,627 3,699 -0,474 2,337 0,501 5,173 -0,524 2,051 -0,164 2,854

236 -0,474 4,156 0,114 -0,619 0,162 2,886 -0,072 1,971 -0,200 4,000 0,015 0,401 0,090 1,672

990 -0,481 3,301 -0,322 -0,519 -0,149 3,097 -0,485 3,699 -0,445 3,699 0,062 2,469 -0,582 3,699

1031 -0,511 3,301 -0,521 -0,519 -0,210 3,155 -0,509 3,523 -0,491 3,699 -0,148 3,000 -0,317 3,523


132

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