PROTEOMIKOS ĮVADAS

Prof. Vida MildažienėVytauto Didžiojo Universitetas, Gamtos mokslų

fakultetoAplinkos tyrimų

centrasKauno Medicinos universiteto

Kardiologijos Institutas

1994

m.

Markas Vilkinsas

(Marc Wilkins) pasiūlė

terminą:

Proteoma – tam tikro organizmo (ląstelės) sintetinamų baltymųvisuma tam tikru laiko momentu.

Proteomika – visų genomo koduojamų baltymų struktūros ir funkcijos nustatymas

Tai viso organizmo baltymų rinkinio analizė. Jos metu nustatoma baltymų ekspresija – jos kitimas organizmui vystantis ir sąveikaujant su aplinka. Proteomika tiria savitus ląstelės arba organizmo genųraiškos kitimus baltymų lygmenyje.

Atliekama ne tik baltymų kokybinė ir kiekybinė analizė. Nustatoma ir jų vieta ląstelėje, modifikacijos, sąveikos bei funkcijos

PROTEUSProteus – senovės graikų dievas, žinojęs apie praeitį, dabartį ir ateitį, tačiau vengdavęs apie tai kalbėti.Pagautas jis lengvai ištrūkdavo, nes galėjo įgauti bet kokį pavidalą. Tokštamą atsakymą gaudavo tik sugebantys jį išlaikyti.

Dėl gebėjimo virsti kuo tik norėjo, Proteus tapo pirmapradės medžiagos, iš kurios mes visi sudaryti, simboliu

Laimėjimai nustatant žemesniųjų

organizmų

ir žmogaus genomą: 1970- bakteriofago, 1981 –

mtDNR, 1995 - nustatyta visas bakterijos Haemophilus influenzae (1.8 mln bp) genomas;1998 - 100Mb Caenorhabditis elegansgenomo seka; 1999 – visa žmogaus 22 chromosomos nukleotidųseka;2000 – beveik visas žmogaus genomas;Tobulėja technologijos –D. melanogaster genomas sekvenuotas per 6 savaites

Proteomika

yra genomikos

dalis

Time:

“Dicovering

the holy grail of biology”

Richard Dawkins:

“The biological equivalent to the 1969 Apollo Space Mission”

Michael Dexter, Director of the WellcomeTrust:“Medical landmark that will eclipse other great scientific discoveries of the past”Sanger Centre, Cambridge:

“Discovering the code of codes, the book of life and of humankind”.

2001 m. vasario mėn

paskelbta Pogenominė

Era –Bang! Ir

mokslas pereina į

naują

etapą, kurio tikslas yra išaiškinti

visas genomo funkcijas

DNR sekos nustatymas nereiškia ,kad išaiškintas jos veikimas

FAKTAI:

Mažiau kaip 1,2 % genomo koduoja baltymus;

Tik pusės nustatytų genų funkcija yra žinoma; apie 40% nustatytų genomo sekų koduoja nežinomos funkcijos ar ne visai nustatytos funkcijos baltymus

<30% žmogaus genomo transkribuojama, t.y., nuskaitomos tarpgeninės sritys (miRNR);

97-98% žmogaus genomo transkriptų sudaro baltymų nekoduojanti RNR (ncRNA)

Individualių žmonių DNR skiriasi tik 0.2%, arba 1 iš500 bazių;

98% žmogaus DNR sutampa su šimpanzės DNR.

‘Gyvenimo knyga' parašyta mums dar neįskaitoma kalba, tarsi senoviniais hieroglifais

Dogma apie genų

skaičiaus atitikimą organizmo sudėtingumo laipsniui -

paneigta

Viroidai – 0-1 genaiRNR virusai – 1-25 genai;T4 virusas – 200 genų;Mycoplasma genitalium – 350 genų;E. Coli bakterija – 4000 genų;Mielės – 6000 genų;Vaisinė muselė – 13000 genų;Nematoda – 18000 genų;Bitės – 15000 genųArabidopsis – 26000 genų;Žmogus – 26000 genų;Pelė – 25000 genų;Ryžiai – 45000 genų

Aukštesniųjų

eukariotų

baltymus koduojančių

genų

skaičius

(20,000 -30,000) panašus į C.elegans and D.melanogaster (apie 20,000).

Tam tikrų

augalų

ir tam tikrų

vienaląsčių

protistų

genomas didesnis už

žmogaus.

Pogenominės eros iššūkiai

Žinių apie visus organizmo genus nekanka suprasti kas lemia fenotipą...

Nustatyti raidžių

tvarką: tik pradžios pabaiga.Genomika

yra >>> nei genomo sekos išaiškinimas;

genomo realizavimui suprasti būtina proteomika

iRNR

“profilis”

tiesiogiai nesutampa su baltymų

“profiliu”

Esamos tyrimų

technologijos ir DNR savybės (pvz., stabilumas)

lėmė

tai, kad DNR buvo

“žemiau kabantis vaisius”

Molekulinės biologijos tyrimai visada buvo daugiau orientuoti į genus, tik vėliau buvo domimasi jų koduojamais baltymais.

DNR yra stabili molekulė, sudaryta iš 4 nukleotidų. Erdvinė molekulės konformacija (dviguba spiralė) ir funkcijos pobūdis nepriklauso nuo nukleotidų sekos. Istoriškai baltymų tyrimai apsiribojo vienos rūšies baltymo analize (baltymų chemija) ir savybių tyrimu. Padėtis pasikeitė, pradėjus taikyti daug efektyvesnius DNR ir baltymųvisuminio tyrimo metodus. 2002 m. chemijos mokslų Nobelio premija skirta J.B. Fenn (JAV) ir K. Tanaka (Japonija) už biologinių molekulių MS analizės metodo patobulinimus, įgalinančius atlikti baltymų tyrimus Didžiajai daugumai ląstelės vyksmų tiesiogiai svarbūs ne genai, o jų koduojami baltymai. Siekiant suprasti ląstelės vyksmus, būtina gauti informaciją apie joje esančių baltymų visumą: baltymųstruktūrą, funkcijas ir jų sąveiką.

Genomas

realizuojamas

per proteomą:

centrinė

molekulinės biologijos

dogma

DNR

– genetinė

informacija Replikacija

RNR

–

instrukcijos

baltymams

Transkripcija

Transliacija

Baltymai

–

gyvos ląstelės struktūra ir funkcija

Organizmas turi vieną

genomą, tačiau daug proteomų

Organizmo baltymų skaičius gali būti keliomis eilėmis didesnis negu genų. Tai paaiškinama alternatyviu sukirpimu ir posttransliacinėmismodifikacijomis, kurių žinoma virš 200 atmainų.Baltymai sudaryti iš >20 monomerų. Kiekvieno baltymo erdvinė struktūra (biologinės funkcijos pobūdis) yra unikali. Jie nestabilūs.Proteoma labai dinamiška. Ji sąveikauja genomu ir kinta priklausomai nuo organizmo vystymosi, aplinkos poveikio ir ligų. Kiekvienas kūno organas turi kitą proteomą.Vienas baltymas - daug funkcijų (“moonlightning”): skirtingos funkcijosdalijasi vienu genu. Būdingi struktūros motyvai ir domenai sudaro baltymų grupavimo įšeimas pagrindą.

Organizmo

sudėtingumą

lemia ne genomo DNR kiekis ir ne jo koduojamų

baltymų

kiekis –

jį

lemia nepaprastas baltymų

pasaulio sudėtingumas.

Alternatyvus sukirpimasmikro-RNR

Daugybinės sąveikosDaugiafunkciai

baltymai

RNRi

konformacinė

baltymų įvairovė

Daugybinis savitumas

Veikia multimeriniaikompleksai

Proteomikos

tikslas

yra išaiškinti baltymų

visumos veikimo principus: baltymų

raišką

(kiek kokių

baltymų

yra tam tikroje ląstelėje), jų

funkcijos valdymo principus, sąveiką, nutaikymą, veikimo vietas, įtaką

medžiagų

apykaitai ir struktūrai, fenotipui; proteomos

pokyčių

prasmę

Dvi proteomikos

strategijos: I. Visuminis baltymų

raiškos apibūdinimas -

-

2DE/MS

II. Visuminis baltymų

funkcijų

apibūdinimas Proteomics

represents

an

exploration

of

the

great

unknown

ProteomikosProteomikos

tyrimtyrimųų

tipaitipaiStruktūrinė Proteomika - 2D ir 3D baltymų struktūra

rentgeno spindulių kristalografijaNMR spektroskopija

Raiškos proteomika - visuminės baltymų raiškos nustatymas, įvertintant jos pakitimus vystymosi, aplinkos poveikio ir susirgimų metu – svarbu diagnostikai, prognostikai ir vaistams kurti.

Baltymų sekos nustatymas ir identifikavimasBaltymų kiekio įvertinimas

Elektroforezė, IEF, RP-HPLC, baltymų gardelėsMasių spektrometrija

Funkcinė proteomika arba Cell mappingBaltymų modifikacijos, vieta ląstelėje, sąveikos, etc.

Masių spektrometrija,elektroforezė, mielių dihibridinėsistema, baltymų (ligandų) gardelės, mutagenezė, In silico (bioinformatika)

iRNR

lygis nėra lygus ekspresuojamo

baltymo lygiuiNeatspindi funkcionalaus baltymo prigimties

Genomo seka iRNR Baltymas Funkcionalus

baltymas

Transkripcijos valdymas

Transliacijos valdymas

Potransliacinis valdymas

Funkcinė

proteomikaStruktūrinė

proteomikaRaiškos proteomika

RaiRaišškos kos proteomikaproteomika

ProteomikosProteomikos

tyrimtyrimųų

technologijostechnologijos

Lyginami du mėginiai – kontrolinis ir tiriamasis

Bioinformatikos

poreikis

Top-Downproteomika: iš

viršaus žemyn

Bottom-up Iš

apačios į

viršų

proteomika

Ląstelių

lizėTūkstančių

peptidų

mišinystripsinas

2-D LC-

MS/MS RPLC-

MS/MS LC-IMS-

MS/MS

LC

m/z

LC

m/z

drift

Duomenų

bazių

paieška

-

MS/MS rezultatų

lyginimas su peptidų

sekomis

SCX steps

Baltymų

gausa ląstelėse labai nevienoda

Negausių

baltymų

kiekybinio nustatymo problema

Baltymų

funkcijos –

apie 40% nustatytų

genomo sekų koduoja nežinomos funkcijos ar nevisai nustatytos funkcijos

baltymus

...

Cheminė funkcija (fermentams);Biocheminė funkcija (substratas-produktas; ligandas-signalas);Ląstelinė funkcija (kokiuose keliuose veikia, kuriose ląstelės erdvės skyriuose, su kuo sąveikauja baltymas kaip sąveikų tinklo dalis);Fenotipinė funkcija (kokius požymius lemia)

Daugiadarbiai

baltymai

Paneigta dogma vienas genas-vienas baltymas-viena funkcija

Current Opinion in Structural Biology 2004, 14:663-668

Fosfogliukozės izomerazė:Ląstelės viduje: katalizuoja

2a

glikolizės

reakcijąLąstelės išorėje: 1.neuroleukinas

(brandina

B ląsteles, gemalo nugaros neuronų

išlikimo veiksnys; 2. autokrininis

judėjimo

veiksnys; 3. Brandina žmogaus mielomos

leukemijos ląsteles.

Karbinolamino

dehidrogenazė:kepenų

fenilalanino apykaitos fermentasRegul

PutA:Fermentas prolino

dehidrogenazė, esant daug Pro; DNR jungiantis baltymas, esant mažai Pro

Neurofilinas:Ląstelės paviršiaus receptoriusEndotelio ląstelėse jungia kraujagyslių

augimo veiksnį

ir signalus naujoms kraujo ląstelėmsNervų

aksonuose

yra

semaforino

III ligandas, padeda nukreipti aksomus

“Moonlighting”: skirtingoms funkcijoms panaudojamos kitos molekulės dalys;“Promiscuity”: tuo pačiu AC atliekamos skirtingos funkcijos (> nefiziologinis)

Kaip aiškinti vieno geno mutacijos lemiamų

ligų

mechanizmus? Kurios iš

daugiadarbio

baltymo funkcijų svarbios kuriems požymiams?

Kam baltymai tokie dideli?

7 iš

10 glikolizės fermentų

–daugiadarbiai

Gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazė:

Rūgštinė fosfatazėEsterazėADP-ribozilinimasMikrovamzdelius jungiantis baltymasBaltymų kinazėUracil-DNR glikozilazėt-RNR-jungiantis baltymasAmiloidinį baltymą Amy c-jungiantis baltymas

Ceruloplazminas:Plazmos feroksidazė (geležies homeostazė);Askorbato oksidazė;Vario pernaša ir saugojimas;Organinių substratų skaidymas;Antioksidacinė apsauga;Prooksidacinis aktyvumas;NO oksidacija (nitrozotioluapykaita).

Akies lęšiuko kristalinai:α – šaperonasδ – arginino-sukcinato liazėε – laktato dehidrogenazėβ – aldehido dehidrogenazėλ – hidroksiacil KoA dehidrogenazėμ – ornitino ciklodeaminazėρ – NADPH-chinono reduktazėτ – enolazėσ – GSH-S-transferazė

Baltymų

disulfidizomerazė:Prolil hidroksilazės subvienetasTiroksiną jungiantis baltymasPeptidus jungiantis baltymasOligosachariltransferazėssubvienetasTriglicerolius pernešančio baltymo subvienetasTioredoksino aktyvumas

Citochromas

c

–

mitochondrijų kvėpavimo grandinės

elektronų

nešiklis;

–

apoptozės

signalo tarpininkas

Konformacinė

baltymų įvairovė: nepriklausomai nuo ligando

jungimo, galima

daugiau kaip viena baltymo konformacija

Kraštutinė

konformacijų įvairovė

būdinga betvarkiams baltymams IUPs

-

Intrinsically

Unstructured

Proteins

IUP įgauna įvairias konformacijas, priklausomai nuo baltymų, su kuriais sąveikauja;IUP susilanksto jungimosi su partneriais metu (apjungtas jungimasis ir lankstymasis).

Nors IUP nėra didelis, jungimosi paviršius didelis, nes IUP jungiasi ištemptos formos.Žinoma >100 IUPsų – jie svarbūs genų raiškai, signalo perdavimui ir šaperonų veiklai. Tarp jų nėra fermentų.

~10% baltymų yra visiški IUPsai.

~40% eukariotų baltymų turi bent vieną ilgą (>50 am.r.) bestruktūręsritį.

http://iupred.enzim.hu/

Kaip tas pats IUPsas

gali turėti priešingą

poveikį

partnerio aktyvumui?geltona spalva –

nesujungtas partneris, žalia –

aktyvintas partneris, raudona –

nuslopintas partneris.(a)

–

IUPs

gali jungtis, būdamas dviejų

skirtingų

konformacijų;(b)

-

IUPs

veikia kaip šaperonas, sukelia parterio konformacijos

pusiausvyros (akt/inakt) pasikeitimą;

(c)

IUPs

jungia du partnerius tos pačios srities alternatyviomis konformacijos

formomis

Baltymų

posttransliacinės

modifikacijos

PTM nustatymo problemosMažas santykinis modifikuotų baltymų kiekis, lyginant su nemodifikuotais;Būtina išskirti visus modifikaciją turinčius peptidus, nes galimos ne vienos vietos modifikacijos;PTM yra laikinos ir grįžtamos, todėl būtina inaktyvinti jas šalinančius fermentus; PTM nėra stabilios, jų gali nelikti tyrimo metu.

Baltymų

sąveikos: egzistuoja skirtingos to paties baltymo būsenos

Organelių proteomikaMembranųproteomika

Fluorescuojančiųžymių vaizdinimas

Baltymų

vietos ląstelėje nustatymas

Skirtingų

mielių

baltymų, sulietų

su GFP, vietos

ląstelėje vaizdinimas Cooper, Haussman

“The

Cell”

2007Taip nustatyta >4000 mieliųbaltymų

(75 proc.) vieta

Baltymų

sąveika

Drosophilamelanogaster2346 baltymų

sąveikos tinklas

Proteomikos

šakosBaltymų skirstymas. Baltymų kokybinis nustatymas.Baltymų kiekybinis nustatymas.Baltymų sekos nustatymas. Susijęs su bioinformatika, funkcijos prognozavimu, evoliucinių ryšių įvertinimu.Baltymų erdvinės struktūros nustatymas (struktūrinė proteomika).Baltymų funkcijų tyrimas:Interaktomika (baltymų sąveikos nustatymas ir prognozavimas).Baltymų modifikacijos tyrimai (fosfoproteomika ir glikoproteomika). Ląstelės proteomika – baltymų vietos ląstelėje nustatymas. Eksperimentinė bioinformatika (Mathias Mann) – eksperimentinių ir bioinformatikos metodų derinys.

~omikos

ir jų

santykis

LEGOMIKA