Protocollo di

Real-Time RT-PCR

per la diagnosi del fitoplasma della

Moria del Pero

Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini

Moria del pero

(Candidatus Phytoplasma pyri)

Genoma a DNA:

cromosoma relativamente piccolo

(530-1200 kbp)

Genoma virale: 1,8-350 kbp

E. coli: 4.000 kbp

Fitoplasmi:

Microrganismi procarioti

unicellulari che, a differenza dei

batteri, non possiedono pareti

cellulari e che si possono

sviluppare esclusivamente su

tessuto vivo d’un ospite.

primers DNA polimerasi

DNA da amplificare

1955 A. Kronembreg e coll.

(Stanford University)

Scoperta della DNA-polimerasi cellulare

Basata sulla sintesi della catena complementare di DNA ad

opera di un’enzima (la polimerasi) in una reazione a catena (PCR

= polymerase chain reaction).

- Diagnosi molecolare

DNA polimerasi

primer

Nucleotide

(dNTP)

APERTURA

DOPPIA

ELICA DEL

DNA

LEGAME

DEI

PRIMERS DI

INNESCO

DUPLICAZIONE

DEL DNA

STAMPO

1983 Kary.B. Mullis utilizzò la DNA polimerasi in una

reazione di polimerizzazione ciclica: la PCR

Premio Nobel per la Chimica nel 1993.

IL MECCANISMO DELLA PCR:

1) Denaturazione a

94°C

2) Appaiamento dei

primers a 50-60°C

3) Estensione a

72°C

GLI STEP DELLA PCR:

Per una PCR di 35 cicli: 34 miliardi di copie

Amplificazione esponenziale

PrimersDNA polimerasi

ELEMENTI NECESSARI PER LA REAZIONE DI

AMPLIFICAZIONE

DNA STAMPO

DESOSSIRIBOSIO

Base Azotata

(Adenina, Timina,

Citosina, Guanina, Uracile)

Desossi Nucleotidi trifosfati

(dNTP)

GLI «INGREDIENTI» FONDAMENTALI DELLA PCR:

Primers:corte sequenze di DNA complementari alle 2

estremità del framento da amplificare

dNTPs (dATP,dGTP,dCTP,dTTP):

nucleotidi trifosfati,

‘mattoni’ per costruire i nuovi filamenti

Taq polimerasi

(buffer, MgCl2):

enzima (DNA polimerasi) che compie la reazione

DNA stampo:Squenza bersaglio

LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

(POLIMERASE CHAIN REACTION)

PCR (reazione a catena della polimerasi)

Per i virus il cui genoma è costituito da RNA, si utilizza la

trascrittasi inversa, che consente la sintesi di un primo filamento di

DNA (cDNA) sul quale si innesca la reazione a catena della

polimerasi

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)

--

Bassa concentrazione del Fitoplasma nella pianta:

NESTED – PCR (nPCR)

DNA TARGET

5’ 3’

Primo step:

Primers Esterni

aumento della sensibilità, riduzione degli inibitori

Secondo Step:

Primers Interni

I AMPLIFICATO

II AMPLIFICATO

RIVELAZIONE ED ANALISI DEL PRODOTTO DI AMPLIFICAZIONE

Nested-PCR

Tecnica molto sensibile ma può presentare diverse

limitazioni, in particolare nell’esecuzione di saggi su

larga scala:

molto laboriosa con alto dispendio di tempo;

rischio di contaminazioni molto elevato.

Multiplex Real-Time PCR

È possibile monitorare in ogni istante la cinetica della reazione di

PCR mediante il rilevamento di una fluorescenza

Si riesce a misurare l’amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale

della PCR, quando cioè l’efficienza di amplificazione è influenzata

minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati

quantitativi molto più accurati rispetto alla PCR tradizione “end point”.

Real-Time PCR: Caratteristiche

Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di

agarosio

Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

Rilevamento della fluorescenza associata

all’amplificazione

Real-Time PCR: Caratteristiche

LightCyclerRoche

7700Applied Biosystems

Mx3000P® QPCR SystemSTRATAGENE

Mx4000® Multiplex Quantitative PCR System

STRATAGENE

Real-time nucleic acid detection system

LightCycler® 480 SystemRoche

iQ5 Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad

7900HT Fast Real-Time PCR SystemApplied Biosystems

Bioneer

ABI PRISM 7000 SDS Applied Biosystem

Real-Time PCR: Caratteristiche

Baseline → il segnale di fluorescenza è accumulato ma è al di sotto del limite di

rilevazione dello strumento

Linea soglia → linea che interseca tutte le curve di amplificazione dei campioni

all’inizio delle fase esponenziale

Ciclo soglia (CT) → è la frazione di ciclo in cui la fluorescenza emessa attraversa

la linea soglia

Il valore che assume è INVERSAMENTE PROPORZIONALE alla

quantità iniziale di DNA

Rn indica la fluorescenza relativa calcolata dal software: Rnf - Rnb

Sistemi basati su primer o sonde marcate:

• Molecular Beacon

• Scorpion Primer

• LUX Primer

• Simple probe

• FRET hybridization probes

• Plexor Technology

Sistemi basati sull’idrolisi di sonde

• TaqMAN

Quasi tutti gli attuali sistemi Real Time PCR sono basati sull’emissione di un segnale

di fluorescenza direttamente proporzionale alla quantità di amplicone formato.

Classificazione chimiche di rilevazione

Sistemi basati su molecole leganti il doppio filamento di DNA:

•Etidio Bromuro

•SYBR Green

•BOXTO

CARATTERISTICA: presenza sonda.

– Oligonucleotide di circa 14-18 bp

– Ibridazione lungo la sequenza bersaglio

– Reporter al terminale 5’ e Quencher al terminale 3’

– Il terminale 3’ non può essere esteso dalla Taq Polimerasi

– Temperatura di dissociazione circa 10°C più elevata

rispetto alla coppia di primer usati nella reazione

TaqMAN

R Q

Taq

Reverse primer

Forward primer

Probe

Taq Polimerasi

TaqMAN

From PacMan to TaqMan - a computer game revisitedThe TaqMan process is based on the PacMan principle - a computer game introduced more than twenty years ago.

http://www.vetscite.org/issue1/tools/leute_2_0800.htm

Estrazione degli acidi nucleici

Estrarre gli acidi nucleici del fitoplasma + acidi nucleici della

pianta dai tessuti vegetali

Protocollo CTAB

Protocollo SPOT

Omogeneizzazione di 1 gr. di nervature con sabbia e

tampone Dellaporta (grinding buffer)

Centrifugazione a 4000rpm per 5 min a 4°C

Centrifugazione del sopranatante a 11000rpm per 25

min a 4°C

Risospensione pellet in tampone di estrazione Doyle &

Doyle, trasferimento in tubo Eppendorf e incubazione a

60°C per 30 min.

Aggiunta di cloroformio:alcol isoamilico (IAA) (24:1) e

centrifuga a 6000rpm per 5 min a RT

Precipitazione fase acquosa con 1 vol. di isopropanolo

freddo a -80°C per 15 min.

Centrifugazione a 13000rpm per 15 min a 4°C

Lavaggio del pellet con etanolo 70% e precipitazione

con sodio acetato (NaOAc) e etanolo assoluto a -80°C

per 10 min.

Centrifugazione a 13000rpm per 15 min a 4°C

Lavaggio del pellet con etanolo 70% e risospensione

con 100μl di acqua distillata sterile trattata con DEPC

(dietilpirocarbonato)

Protocollo di estrazione

CTAB

(5 h)

Protocollo di estrazione

SPOT

(15 - 20 min)

Macinare 1gr di floema in 5 mL di Tampone di estrazione

Caricare 5 uL di ogni campione omogeneizzato su dischetti

di nylon e asciugare

Aggiungere 100 uL di buffer di risospensione

Denaturare10 min a 95 C

Centrifugare le strip almeno 2 min.

Prelevare 2 uL e aggiungerli alla mix di Real Time.

Sonde e primers specifici per il fitoplasma della

Moria del Pero sono stati disegnati su una zona

variabile del gene 16S rDNA, utilizzando il

software Primer Express 2.0 (Applied Biosystem).

Sonde TaqMAN - PD

Controllo endogeno: primers e sonda disegnati

sul gene che codifica per la sub-unità 18S.

Marcate con due fluorocromi differenti

all’estremità 5’, per poterle usare simultaneamente

nella reazione.

Real-Time PCR: PCR singola

18 SPD

Real-Time PCR: PCR “duplex”

PD + 18S

Come ottimizzare la sensibilità della

diagnosi

• Diagnosi classica: amplificazione DNA del

Fitoplasma (nPCR, Real-Time PCR…)

• Il Fitoplasma (DNA) ha una bassa concentrazione

nella pianta.

• Il Fitoplasma produce un alto numero di copie di

RNA durante la propria moltiplicazione.

• L’RNA è indice di attività metabolica del

Fitoplasma

• Amplificare anche l’RNA del Fitoplasma per

aumentare la sensibilità della diagnosi

DNA vs. RNA in protocollo CTAB

DNA vs. RNA in protocollo SPOT

RT-PCR vs. PCR in protocollo CTAB

RT-PCR vs. PCR in protocollo SPOT

Multiplex Real-Time PCR: conclusioni

Alta specificità

Riproducibilità dei risultati

Alta sensibilità

Multiplex Real-Time RT-PCR:

Sistema “chiuso”: rischio di contaminazione molto

limitato e assenza di falsi positivi

Saggi molto rapidi: circa 1/4 del tempo richiesto

dai protocolli classici di nested-PCR

Presenza del controllo endogeno (18 S) rende il

metodo più affidabile: assenza di falsi negativi

La SPOT Real-Time RT-PCR risulta la tecnologia

ideale da applicare alla diagnosi del fitoplasma

della Moria del Pero, in particolare per analisi su

larga scala