Protozoos susceptibles de ser transmitidos

por el agua regenerada

José Luis Alonso Molina

Responsable del Grupo de Química y Microbiología del Agua, Instituto de

Ingeniería del Agua y Medio Ambiente, UPV

ESAMUR XIV Jornadas Técnicas de Saneamiento y Depuración Regeneración de aguas: Generando Confianza Lorca 21-22 Noviembre 2018

Índice

• Protozoos transmitidos por el agua

• Epidemiología

• Técnicas de estudio y métodos de referencia

• Supervivencia en aguas

• Concentraciones en aguas

• Niveles de reducción en las concentraciones de protozoos por diferentes tipos de tratamiento en EDAR

• Legislación UE sobre reutilización: protozoos e indicadores

• Protozoos transmitidos por el agua

-Phylum Amoebozoa

Acanthamoeba castellanii (FLA)

Entamoeba histolytica

Vermamoeba vermiformis

-Phylum Ciliophora

Balantidium coli

-Phylum Apicomplexa

Cryptosporidium hominis, C. Parvum,

Toxoplasma gondii, Cyclospora cayetanensis

-Phylum Metamonada

Giardia intestinalis genotypes A and B

-Phylum Heterokontophita

Blastocystis sp.

-Phylum Excavata

Naegleria fowleri (FLA)

Protozoos patógenos

Origen fecal y no fecal de protozoos

patógenos

Fletcher M, Strak D, Harkness J, Ellis J (2012) Enteric protozoa in the developed world. A public health perspective.

Clin. Microbiol. Reviews 25(3):420-449

Especies de Cryptosporidium Feng et al. 2018. Trends in Parasitology in Press

ciclo de vida de Cryptosporidium

fuente: http://phil.cdc.gov/phil/home.asp

• La transmisión del parásito se produce por vía fecal-oral, ya sea por ingestión de agua o alimentos contaminados, o por transmisión de humano a humano o de animal a humano (Xiao, 2010).

Rutas de transmisión de Cryptosporidium Fayer (2008) General Biology. En: Crypotosporidium and Cryptosporidiosis, p. 1-42. (ed.

Fayer and Xiao). CRC Press

Cryptosporidium: dosis infectiva http://waterbornepathogens.susana.org/menuprotozoa/crypto

-La dosis infectiva en voluntarios humanos sanos está entre

10 y 1.000 ooquistes de Cryptosporidium parvum. La DI50,

depende de una serie de factores como: infectividad de los

ooquistes, virulencia de la cepa y factores relacionados con el

huésped

-El tiempo entre la adquisición de la infección y la aparición de

los síntomas puede ser de 5 a 28 días.

ciclo de vida de Giardia

fuente: http://phil.cdc.gov/phil/home.asp

Giardia especies

Seis especies descritas de Giardia. Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, syn.

G. intestinalis) puede infectar a los humanos.

Giardia duodenalis genotipos

Importancia relativa de las diferentes rutas

ambientales de transmisión de Giardia

Agua de

bebida

Más

importante Menos

importante

Agua de

uso

recreativo:

piscinas

Semillas a

germinar:

brotes de

soja

Verduras de hoja

verde: lechuga. Col.

Espinacas.

Ensaladas de 4ª

gama

Frutas sin piel:

fresas

Marisco:

ostras,

mejillones

Arena

parques

infantiles

Robertson y Lim (2011) Waterborne and environmentally-borne Giardiasis. En: Giardia a

model organism (eds. Luján HD y Svärd S) p. 29-62. Springer –Verlag/Wien

Giardia dosis infectiva

Schaefer et al. (1991) Determination of Giardia lamblia cyst infective dose for the

mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). AEM 57:2408-2409.

Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica es reconocida como una

ameba patógena, asociada con infecciones

intestinales y extraintestinales. Infecta a 50

millones de personas en el mundo y produce

100.000 muertes por año (India, Bangladesh,

Brasil, México China, Sudeste de Asia, países

del África Tropical) (Saidin et al. 2018)

Recientemente, E. histolytica ha sido

reclasificada en diferentes especies, E.

histolytica, E. dispar y E. moshkovskii, siendo

las dos últimas especies no patógenas (Plutzer y

Karanis, 2016). Las otras especies son

importantes porque pueden confundirse con E.

histolytica en las pruebas de diagnóstico.

www.cdc.gov/dpdx/amebiasis/index.html

Cyst of E. histolytica/E. dispari n an unstained concentrated wet mount of

stool. www.cdc.gov/dpdx/amebiasis/index.html

Saidin et al. Eur J Clin

Microbiol Infect Dis

(2018).

https://doi.org/10.1007/s

10096-018-3379-3

Amebas de vida libre (FLA)

FLA, Acanthamoeba, Naegleria, Vermamoeba or Balamuthia, Son

protozoos ubicuos que se encuentran comúnmente en el agua.

(Sheehan et al., 2003; Magnet et al., 2012; Retana-Moreira et al.,

2014; Niyyati et al., 2015; Sente et al., 2016). Tienen dos etapas del

ciclo de vida: el trofozoíto, metabólicamente activa, y el quiste, una

forma de resistencia.

FLA actúan como reservorio de bacterias/protozoos patógenos

(FLA-ARB).

Acanthamoeba spp. Naegleria spp.

Moreno-Mesonero et al. (2017)

Vermamoeba vermiformis

Fouque et al. (2014)

Bacterias patógenas en Amebas de vida libre (FLA)

Tesis doctoral Laura Moreno (2018)

• EPIDEMIOLOGÍA

Waterborne protozoa outbreaks 1919-2004

Karanis P., Kourenti C., Smith H. (2007) Waterborne transmission of protozoan parasites: A worldwide review of

outbreaks and lessons learnt. J. Water Health 5(1):1-38

325 water-associated outbreaks of parasitic protozoan disease have been reported

Waterborne Giardia and Cryptosporidium outbreaks and cases reported in the literature, 1954-2014

Efstratiou A., Ongerth J.E., Karanis P. (2017) Waterborne transmission of protozoan parasites: Review of

worldwide outbreaks- An update 2011-2016. Water Res. https://doi.org/10.1016/j.watres.2017.01.036

1993, Cryptosporidiosis: Brote

de Milwaukee. 403.000 casos,

4.400 hospitalizados, 54

muertos (85% con SIDA)

Confirmed cryptosporidiosis cases: seasonal distribution

Confirmed giardiasis cases: seasonal distribution

Cryptosporidiosis en Valencia

Infecciones gastrointestinales (Cryptosporidiosis,

Giardiasis) en la Comunidad Valenciana en 2012

Casos notificados al Sistema de Información Microbiológica de los

microorganismos (Cryptosporidium) más relevantes causantes de infecciones

gastrointestinales. España 1989-2013

Fuente: Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica

Elaboración: Sistema de Información Microbiológica. Centro Nacional de Epidemiología.

Boletín Epidemiológico Semanal.Vol. 22, Num 13.

http://revista.isciii.es/index.php/bes/article/view/897/1083.

Confirmed cryptosporidiosis cases: rate per 100000

population EU/EEA, 2010-2014

Confirmed giardiasis cases: rate per 100000 population

EU/EEA, 2010-2014

• Técnicas de estudio y métodos de

referencia

Métodos Analíticos de

Referencia

• ISO 15553:2006 Water quality- Isolation and

identification of Cryptosporidium oocysts and Giardia

cysts from water

• ISO 18744:2016 Microbiology of food and animal feed -

detection and enumeration of Cryptosporidium and

Giardia in fresh leafy green vegetables and berry fruits

• EPA Method 1623.1:2012 Cryptosporidium and Giardia

in Water by Filtration/IMS/FA

Filtration methods for Cryptosporidium oocysts from water

(Web Report 4178 WRF, 2008, AWWA)

ISO 15553: Water quality- isolation and identification of

Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water

DetectionWaterborne Pathogenic Protozoa

-Method 1622-1623 (Gold standard method for detecting environmental

protozoa): its has been applied widely and extensive data indicates that its

performance is effective with recovery efficiency from fresh water over a

range of quality typically for:

-Cryptosporidium from 30-50%

-Giardia from 40-60%

-These methods consist of three main parts:

1-Filtration of at least 10L of water

2-(Oo)cyst concentration using antibody based immunomagnetic

separation procedure

3-Detection component using immunofluorescence and diferential

interference contrast microscopy to enumerate total (oo)cysts

from the water sample

Extracción ADN-qPCR

METAGENÓMICA DIRIGIDA

WORKFLOW FOR 18S rRNA Moreno et al. (2018) Multiple identification of most important waterborne

protozoa in surface water used for irrigation purposes by 18S rRNA

amplicon-based metagenomics. Int. J. Hyg. Environ. Health. 221:102-111

P

• Supervivencia en aguas

Supervivencia en agua

Fuente: Kumar et al. (2012) Analyst. 143:359-375, adaptado de OMS (2011) Guidelines for

Drinking-water Quality

Efecto de la temperatura en la supervivencia de

ooquistes de Cryptosporidium y quistes de

Giardia

WHO (2006) Guidelines for the safe use of wastewater and excreta in agriculture.

Microbial Risk Assessment Section)

• Concentraciones de protozoos en

aguas

Frecuencia de detección y concentración de ooquistes de

Cryptosporidium y quistes de Giardia en aguas residuales

Hamilton et al. Cryptosporidium and Giardia in Wastewater and Surface Water Environments. Journal of

environment quality. 2018. 47 (5) p 1006-1023

Concentraciones de ooquistes de Cryptosporidium y

quistes de Giardia en aguas residuales Hamilton et al. Cryptosporidium and Giardia in Wastewater and Surface Water

Environments. Journal of environment quality. 2018. 47 (5) p 1006-1023

Concentraciones de ooquistes de Cryptosporidium y

quistes de Giardia en aguas residuales

Hamilton et al. Cryptosporidium and Giardia in Wastewater and Surface Water Environments. Journal of

environment quality. 2018. 47 (5) p 1006-1023

Concentraciones de microorganismos

patógenos en aguas residuales

Cryptosporidium spp. y Giardia en EDAR de Galicia,

Castro-Hermida et al. (2008) Contribution of treated wastewater to the contamination of recreational river areas

with Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis. Water Res 42:3528-3538.

Especies de Cryptosporidium y genotipos de Giardia

duodenalis en EDAR de Galicia

Castro-Hermida et al. (2008) Contribution of treated wastewater to the contamination of recreational river areas

with Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis. Water Res 42:3528-3538.

El caso de los brotes de E. coli que afectaron a dieciséis países de Europa

y América del Norte en 2011, con más de 4 000 casos detectados y 53

muertes en Alemania, es un ejemplo de tal situación. Se culpó del brote a

los pepinos regados con aguas residuales tratadas importados de

España, y varios Estados miembros, entre ellos Austria, Bélgica, Chequia,

Dinamarca, Alemania y el Reino Unido, bloquearon o restringieron la

importación de productos españoles ante el temor de que pudieran haberse

contaminado durante el riego.

Después se demostró que la fuente del E. coli no habían sido los

pepinos, sino más bien las semillas germinadas procedentes de una

granja alemana, y las semillas de alholva implicadas que procedían de

Egipto. Se estima que este acontecimiento costó 200 millones de euros

semanales a España en concepto de pedidos cancelados y contribuyó a

reducir la renta agrícola de la región de Murcia en un 11,3 % durante la

campaña de 2010-2011. Este hecho ha disuadido la inversión en la

transformación de productos alimenticios regados con agua reutilizada.

Fuente: Propuesta de REGLAMENTO DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL

CONSEJO relativo a los requisitos mínimos para la reutilización del agua

Water JPI Call “Emerging contaminants” METAWATER project

Partners in the project: Spain: Rosina Girones (Universitat de Barcelona), Maria José Figueras (Universitat Rovira i Virgili, Reus), José Luis Alonso (Universitat Politècnica de València) Denmark: Anna Charlotte Schultz (Technical University of Denmark) Cyprus: Georgios T. Papageorgiou (State General Laboratory) Germany: Christiane Höller (Bavarian Health and Food Safety Authority) and Michael Seidel (Technische Universität München).

Stakeholder involment:

METAWATER

New metagenomics and

molecular based tools for

european scal

identification and control of

emerging microbial

contaminants in irrigation

water

UPV Research Team:

Coordinator

José L. Alonso, PhD, Microbiology.

Participants

Inmaculada Amorós, PhD, Microbiology.

M. Antonia Ferrús, PhD, full professor, Microbiology.

Yolanda Moreno, PhD, Microbiology.

Eva Doménech, PhD, assistant professor, Food Technology.

José Morillo, PhD, contracted researcher, Microbiology.

Isabel Escriche, PhD, full professor, Food Technology.

PhD Students (MSc):Laura Moreno Mesonero

THE METAWATER PROJECT: Lessons learned for improving the safety of irrigation water in Europe

One year surveillance of different types of irrigation water

•Distribution water (UB)

•Irrigation water channels (UPV)

•River water (UB)

•Reservoir water (UB)

•Groundwater (UB and DTU)

•Urban raw sewage (UB, UPV and DTU)

•Secondary treated effluents (UB, UPV and DTU)

•Tertiary treated effluents (UB, DTU)

•Hospital raw sewage (DTU)

Characterization of viral/bacterial/protozoa communities/pathogens in

critical points of source water and distribution networks, including antibiotic-

resistant bacteria and cyanobacterial toxins (METAWATER PROJECT)

Parameters analysed:

•Viruses: HAdV, JCPyV, MCPyV, NoV GI, NoV GII, EV, HEV

•Bacteria: E. coli, E. fecalis, Legionella spp, Aeromonas spp., Arcobacter

spp. Helicobacter pylori, Salmonella spp. and Campylobacter spp.

•Protozoa: Acanthamoeba spp. Giardia spp. and

Cryptosporidium spp.

•Cyanobacterial toxines

•Antibiotic Resistant Bacteria

EDAR2

Datos de la EDAR Caudal (m3/día): 35.384 Población servida (he): 199.550

EDAR2

Sampling Date

Giardia

spp.

cysts/10L

G. intestinalis

genotype A

G. intestinalis

genotype B

Cryptosporidium

spp. cysts/10 L C. hominis C. parvum

Acanthamoeba

spp

ISO 1553 qPCR qPCR ISO 1553 qPCR qPCR qPCR

11th March 2015 after

secondary 45 - - 32 + (WGA) -

9th June 2015 after

secondary 93 + - 1 - - +

7th October 2015 after

secondary 6 - - 2 - -

9th December 2015 after

secondary 20 + - 12 - - +

23rd February 2016 after

secondary 86 + - 5 - - +

23rd February 2016 after

tertiary 80 - - 4 - -

+ 16th July 2016 after

secondary 59 + - 4 - -

17th May 2017 after

secondary 230 + - 6 - - +

17th May 2017 after

tertiary 142 + - 2 - - +

24th May 2017 after

secondary 80 + - 0 - - -

24th May 2017 after

tertiary 20 + - 0 - - +

31st May 2017 after

secondary 82 + - 8 - - +

31st May 2017 after

tertiary 45 + - 6 - - +

Waterborne protozoa identified (Relative abundance%)

Sampling date Secondary effluent (%) Tertiary effluent (%)

11 June 2015

Entamoeba histolytica 0.31

Blastocystis sp. 0.11

Cryptosporidium sp. 0.01

Vermamoeba vermiformis 0.01

---

23 February16 Blastocystis sp. 1.58 Entamoeba sp. 0.04

Blastocystis sp. 1.31

16 July 2016 Blastocystis sp. 3.96

Cryptosporidium sp. 0.02

---

17 May 2017

Entamoeba sp. 0.001

Entamoeba coli 0.006

Entamoeba dispar 0.065

Blastocystis sp. 15.575

Entamoeba coli 0.005

Entamoeba dispar 0.062

Entamoeba hartmanni 0.003

Blastocystis sp. 10.985

24 May 2017 Entamoeba dispar 0.029

Blastocystis sp. 9.294

Entamoeba dispar 0.003

Blastocystis sp. 5.983

31 May 2017 Entamoeba coli 0.003

Entamoeba dispar 0.015

Blastocystis sp. 8.819

Entamoeba coli 0.010

Entamoeba dispar 0.035

Entamoeba hartmanni 0.008

Blastocystis sp. 4.518

Multiple identification of most important

waterborne protozoa in EDAR2 samples by 18S

rRNA amplicon-based metagenomics

730 muestras afluente entrada EDAR, 25 EDAR Australia

Muestras positivas: 83/730 (11,4%).

Datos Bibliografía EDAR (6,4%- 100%)

Concentración qPCR: 70-18.055 ooquistes/L,media 3.426/L

Estacionalidad de Cryptosporidium y Giardia en aguas

Como se observó en varios estudios, la estacionalidad de Cryptosporidium y

Giardia en aguas residuales presenta diferentes patrones dependiendo de las

características especiales del país como el clima, las temperaturas del agua

relacionadas con la situación epidemiológica.

108 muestras de 3 EDAR de Valencia

(Domenech et al. (2018) Cryptosporidium and Giardia safety margin increase in leafy green

vegetables irrigated with treated wastewater. Int J Hyg Environ Health 221:112-119

Nasser et al. (2016) Seasonality

of Cryptosporidium prevalence

in Wastewater, J Water Health

14:1-13

Afluente (oo)quistes/L Efluente (oo)quistes/L

Prevalencia estacional de protozoos en ensaladas de

4ª gama (648 muestras de 6 fabricantes) en Italia

Caradonna et al (2017) Detection and prevalence of protozoan parasites in ready-

yo-eat packaged salads on sale in Italy. Food Microbiology 67:67-75

• FLA isolation and ARB associated to FLA-

PROTOCOLS ESTABLISHED

DNA isolation

Membrane 3 μm

Non-Nutrient Agar Page

28 ºC, 3-12d

Water sample

sodium hypochlorite

100 ppm

16S rRNA

Metagenomics

Illumina Miseq

DNA extraction (SOPs)

16S rRNA amplification

Amplicon sequencing IIlumina MiSeq

PCR purification, attach indexes and sequencing

adapters to libraries by PCR

Pool libraries

Amplicon viewer in BaseSpace (Data)

Normalize DNA concentration to 5 ng/µL

Sequencences quality control

Bioinformatics analysis

WORKFLOW

FOR 16S rRNA

METAGENOMICS

SEQUENCING Amplicon-based metagenomics was carried out with 2 × 300 bp

paired-end reads on a MiSeq platform (Illumina) at Life Sequencing

S.L. (Valencia, Spain). The amplicon sequencing protocol targets the

V3-V4 regions of the 16S rRNA gene and strictly followed the

Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation guide

(https://support.illumina.com/content/dam/illumina-

support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16

s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf). Illumina data

were analysed using Qiime 1.9.1 (Caporaso et al., 2010) applying

additional scripts available in MicrobiomeHelper virtual box (Comeau

et al., 2017). OTUs were defined at the 97% genetic similarity cut-off.

16S SILVA 128 version was used as the reference database.

Number and percentage of analysed

samples contaminated with FLA

Wastewater treatment plants of

Valencia

A total of 31 FLA were purified using a micromanipulator from wastewater

Moreno-Mesonero et al. (2017) Detection of viable Helicobacter pylori inside free-living amoebae in

wastewater and drinking water samples from Eastern Spain. Environmental Microbiology. 19:4103-4112.

Identification of isolated FLA in wastewater

of Valencia by means of multiplex PCR or

conventional PCR plus sequencing

In wastewater samples, Acanthamoeba spp., A. castellanii, A. tubiashi, A.

polyphaga, Naegleria spp., Vannellidae spp. and Cercozoa spp. were identified.

A total of 31 FLA were purified using a micromanipulator from wastewater

Bacteria associated to FLA

(Acanthamoeba- ARB)

Different pathogens such as Legionella, Mycobacterium, Aeromonas, Listeria, Arcobacter or

Campylobacter have been isolated from inside FLA in co-culture assays. Inside them, these bacteria

survive and are more resistant to harsh environmental conditions that would normally kill them,

such as chlorination or presence of biocides Therefore, FLA act as “Trojan horses” for these ARB

(Amoeba resistant bacteria)

6 wastewater samples

have been analyzed to

identify the different FLA

present and the bacteria

associated to them.

Several pathogenic

bacteria, such as

Legionella, Helicobacter,

Rickettsia or

Pseudomonas have

been found to be

associated to FLA in the

analyzed wastewater

samples.

Average of

1,2 million

reads per

sample

virus potencialemente patógenos para

humanos detectados en agua residual

Fernandez-Cassi et al. (2018) Metagenomics for the study of viruses in urban sewage as a

tool for public health surveillance. Sci Total Environ. 618:870-880

• Niveles de reducción en las

concentraciones de protozoos por

diferentes tipos de tratamiento en

EDAR

Calidad recomendada del agua residual

antes de la desinfección Guidelines for Environmental Management. Disinfection of Treated

Wastewater. (2002) EPA Victoria´s website

Cuando se investigó la inactivación de C.

parvum y G. lamblia con ozono y dióxido de

cloro, bajo las mismas condiciones

experimentales, los ooquistes de C. parvum

fueron 30 veces más resistentes al ozono y 14

veces más resistentes al dióxido de cloro

Cryptosporidium y Giardia: Cloro y Ozono www.cdc.gov./parasites/crypto/index

Eliminación de Cryptosporidium con

dióxido de cloro

US EPA (2005) Technologies and costs document for the Final long Term 2 Enhanced

Surface Water Treatment Rule and Final stage 2 Disinfectants and Disinfection by

Products Rule. EPA-815-R-05-013

Eliminación de Cryptosporidium con ozono

US EPA (2005) Technologies and costs document for the Final long Term 2 Enhanced

Surface Water Treatment Rule and Final stage 2 Disinfectants and Disinfection by

Products Rule. EPA-815-R-05-013

Inactivación de Cryptosporidium

con UV

US EPA (2006) Ultraviolet disinfection guidance manual for the final Long term 2

enhanced surface water treatment rule toolbox guidance manual. EPA 815-R-06-

007

Dimero de timina

https://en.wikipedia.org/wiki/Pyrimidine_dimer

Quistes G. lamblia infectivos en EDAR

Li et al. 2009. Water Res 43:3037-3046

Tecnología de Membranas

Clasificación de las membranas

Tamaño de los virus

Fuente: http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&

view=article&id=573&Itemid=579

Tamaño de los

virus oscila

entre 0,02 µm a

0,3 µm

Características físico-químicas de quistes y

ooquistes (Dumètre et al. AEM, 2012, 78: 905-912)

Reducción de virus, bacterias y

protozoos por ultrafiltración

Reducción concentraciones de protozoos por

los diferentes tipos de tratamientos NRMMC/EPHC/NHMRC (2008) Australian Guidelines for Water Recycling: Managing Health

and Environmental Risks (Phase 2) –Augmentation of Drinking Water Supplies

Tratamiento Cryptosporidium Giardia

Secundario 0,7 1,5

Ozono 1,0 3,0

Ultrafiltración 4,7 7,4

UV (12 mJ/cm2) 2,0-3.5 2,0-3,5

Cloración (800-900 mg-min/L) 1,0

Cloración (12 mg-min/L) 0,5

Soller et al. (2017) Evaluation of microbiological risks associated with direct potable reuse. Microbial Risk

Analysis. 5:3-14.

• Legislación UE sobre reutilización:

protozoos e indicadores

Normativas países UE aguas

regeneradas

Anexo I

Categorías de calidad de las aguas

regeneradas

Control de validación de las aguas

regeneradas

WHO (2006) Guidelines for the safe use of wastewater and excreta in agriculture.

Microbial Risk Assessment Section)

Concentraciones de Esporas de Clostridios

Sulfito-reductores en aguas residuales

Lucena et al. (2004) Reduction of bacterial indicators and bacteriophages infecting bacteria in

primary and secondary wastewater treatments. J. Aool. Microbiol. 97:1069-1076

Gracias por su atención

ESAMUR XIV Jornadas Técnicas de Saneamiento y Depuración Regeneración de aguas: Generando Confianza