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PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012

ORGANISMONACIONALDENORMALIZACINDELCOFOCALEC

PROYECTO DE NORMA MEXICANA


SISTEMA PRODUCTO LECHE ALIMENTO LCTEO LECHE CRUDA DE VACA ESPECIFICACIONES FISICOQUMICAS, SANITARIAS Y MTODOS DE

PRUEBA.


PROYECTO DE NORMA MEXICANA PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012 SISTEMA PRODUCTO LECHE - ALIMENTO LCTEO LECHE CRUDA DE VACA ESPECIFICACIONES FISICOQUMICAS, SANITARIAS Y MTODOS DE PRUEBA.

PREFACIO

En la elaboracin del presente Proyecto de Norma Mexicana, participaron las siguientes empresas e instituciones:

- ASOCIACIN DE PROFESIONALES EN TECNOLOGA DE ALIMENTOS, A.C. (APTA, A.C.)

- CMARA NACIONAL DE INDUSTRIALES DE LA LECHE (CANILEC)

- CONFEDERACIN NACIONAL DE ORGANIZACIONES GANADERAS

(CNOG)

- CONSEJO PARA EL FOMENTO DE LA CALIDAD DE LA LECHE Y SUS DERIVADOS, A.C. (COFOCALEC, A.C.)

- GANADEROS PRODUCTORES DE LECHE PURA, S.A. DE C.V.

- INSTITUTO TECNOLGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE

OCCIDENTE (ITESO)

- LECHERA GUADALAJARA, S.A. DE C.V.

- LICONSA, S.A. DE C.V.

- SECRETARA DE AGRICULTURA, GANADERA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACIN (SAGARPA) Coordinacin General de Ganadera

- UNIN DE PASTEURIZADORES DE JUREZ, S.A. DE C.V.

- UNIN GANADERA REGIONAL DE JALISCO (UGRJ)

- UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO (UNAM)

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

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INDICE DEL CONTENIDO

NMERO DE CAPTULO 0. Introduccin

1. Objetivo

2. Campo de aplicacin

3. Referencias

4. Definiciones 5. Smbolos y abreviaturas 6. Especificaciones fisicoqumicas y sanitarias 7. Muestreo

8. Mtodos de Prueba 9. Bibliografa 10. Concordancia con Normas Internacionales Apndice Normativo A Mtodos de Prueba Apndice Informativo A Ensayo de colaboracin del conteo de clulas

somticas (Mtodo de referencia) Apndice Informativo B Tincin de leche de cabra para el conteo de clulas

somticas Apndice Informativo C Distribucin de Poisson Apndice Informativo D - Evaluacin de la calidad microbiolgica de la leche por

pruebas de reduccin de colorantes Apndice Informativo E Listado de Normas Mexicanas que describen mtodos

de prueba rpidos aplicables a leche cruda de vaca

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0. INTRODUCCIN La importancia alimenticia de la leche en la nutricin humana, reside bsicamente en la calidad de sus protenas, su alta digestibilidad y alto valor biolgico, as como en su contenido de calcio y de vitaminas A, B1 y B2. Es un alimento energtico y complementario para toda la familia, en particular para los nios, mujeres embarazadas y ancianos, que forma parte de la dieta de los mexicanos y es materia prima para la elaboracin de numerosos productos. Por sus caractersticas fisicoqumicas y de composicin, la leche es altamente susceptible a la contaminacin y el deterioro, afectndose su calidad por las condiciones higinicas y sanitarias de produccin, almacenamiento y transporte, adems de que puede constituirse en un excelente vehculo de organismos patgenos. Por lo anterior, es necesario contar con una Norma Mexicana que establezca las especificaciones de la leche cruda en el pas, con la finalidad de uniformizar los requisitos que la industria solicita a los productores de leche. 1. OBJETIVO El presente Proyecto de Norma Mexicana tiene por objeto establecer las especificaciones de calidad de la leche cruda de vaca y los mtodos de prueba usados para su evaluacin. 2.- CAMPO DE APLICACIN El presente Proyecto de Norma Mexicana es aplicable a la leche cruda de vaca, de origen nacional o extranjera, destinada a la fabricacin e industrializacin de productos para consumo humano en territorio nacional. 3. REFERENCIAS Para la correcta aplicacin de ste Proyecto de Norma Mexicana se deben consultar las siguientes Normas Oficiales Mexicanas y Normas Mexicanas vigentes: NOM-008-SCFI-2002 Sistema General de Unidades de Medida. Publicada

en el Diario Oficial de la Federacin el 27 de noviembre de 2002.

NOM-155-SCFI-2003 Leche, frmula lctea y producto lcteo combinado Denominaciones, especificaciones fisicoqumicas y

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mtodos de prueba. Publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 12 septiembre de 2003.

NOM-243-SSA1-2010 Productos y servicios. Leche, frmula lctea, producto lcteo combinado y derivados lcteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Mtodos de prueba, publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 27 de septiembre de 2010.

NMX-F-718-COFOCALEC-2006 Sistema Producto Leche Alimentos

Lcteos Gua para el muestreo de leche y productos lcteos, declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 9 de noviembre de 2006.

NMX-F-730-COFOCALEC-2008 Sistema Producto Leche Alimentos

Lcteos Prcticas de higiene recomendadas para la obtencin de leche , declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 7 de agosto de 2008.

NMX-F-737-COFOCALEC-2010 Sistema Producto Leche - Alimentos -

Lcteos - Determinacin de la densidad en leche fluida y frmula lctea - Mtodo de prueba, declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 21 de julio de 2010.

4. DEFINICIONES Para fines del presente Proyecto de Norma Mexicana se entiende por:

4.1 Alimento, cualquier sustancia o producto, slido, semislido o lquido natural o transformado, destinado al consumo humano, que proporciona al organismo elementos para su nutricin por va oral. 4.2 Almacenamiento, accin de guardar en un silo o sitio especfico la leche para su conservacin, custodia, suministro, futuro procesamiento o venta. 4.3 Calostro, secrecin de la glndula mamaria obtenida en el periodo comprendido de 5 das antes a 5 das despus del parto, que difiere de la leche principalmente por su alto contenido de inmunoglobulinas (anticuerpos), clulas somticas, cloruros y la presencia de eritrocitos, y cuyo color va del amarillo al rosado.

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4.4 Caractersticas de calidad, conjunto de propiedades de la leche de vaca, que le confieren la aptitud para satisfacer las necesidades implcitas o explcitas para su uso y consumo.

4.5 Clase, rango establecido por los parmetros que determinan el grado de calidad. 4.6 Clarificacin, proceso por el cual se eliminan de la leche las impurezas macroscpicas, los grumos y de manera parcial los microorganismos, leucocitos y otras clulas, principalmente mediante una centrifugacin continua. 4.7 Conservacin, accin de mantener la leche en buen estado, almacenndola cuidadosamente, para que no pierda sus caractersticas a travs del tiempo.

4.8 Contaminacin, cuando la leche contenga microorganismos, hormonas, bacteriostticos, plaguicidas, radioistopos, as como cualquier materia o sustancia no autorizada o en cantidades que rebasen los lmites mximos permitidos por la autoridad competente. 4.9 Filtracin, proceso por el cual se separan de la leche las partculas ajenas al producto. 4.10 Higiene, todas las medidas necesarias para garantizar la sanidad e inocuidad de la leche en todas las fases del proceso desde su obtencin hasta su uso o consumo final. 4.11 Leche cruda de vaca, es la secrecin natural de las glndulas mamarias de las vacas, sin calostro y sin substraccin alguna de sus componentes, que no ha sido sometida a tratamientos trmicos. 4.12 Materia extraa, toda aquella sustancia, resto o desecho orgnico o no, que se presenta en la leche sea por contaminacin o por manejo poco higinico de la misma durante su obtencin, almacenamiento o transporte, considerndose entre otros: excretas y pelos de cualquier especie, fragmentos de insectos y otros. 4.13 Mtodos de prueba, procedimientos analticos utilizados en el laboratorio para comprobar que un producto satisface las especificaciones que establece la norma. 4.14 Muestra, al total de unidades de producto provenientes de un lote y que representan las caractersticas y condiciones del mismo. 4.15 Refrigeracin, mtodo de conservacin fsico que se emplea en los alimentos para retardar el crecimiento de la mayora de los organismos, reducir las reacciones bioqumicas y el deterioro propio de los alimentos.

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5. SMBOLOS Y ABREVIATURAS Cuando en ste Proyecto de Norma Mexicana se haga referencia a los siguientes smbolos y abreviaturas, se entiende por:

g/L gramos por litro mL mililitros g gramos g/kg microgramos por kilogramo +/- ms o menos que m/m masa por masa v/v volumen por volumen % porcentaje C grados Celsius H grados Horvert mn. mnimo mx. mximo UFC/mL unidades formadoras de colonias por mililitro CS/mL clulas somticas por mililitro < menor o igual que > mayor o igual que cm2 centmetros cuadrados mm2 milmetros cuadrados mm milmetros 6. ESPECIFICACIONES FISICOQUMICAS Y SANITARIAS 6.1 La leche cruda de vaca debe cumplir con las especificaciones descritas en las tablas 1 y 2 (vanse tablas), en el lugar donde se acuerde la transferencia de propiedad. 6.2 Una vez obtenida la leche cruda de vaca debe ser filtrada y refrigerada lo ms pronto posible, preferentemente a una temperatura de 4 C o menor sin llegar a la congelacin. 6.2.1 No se podrn usar conservadores, ni realizar ninguna manipulacin de la leche cruda que modifique sus caractersticas sanitarias, salvo las que expresamente autorice la Secretara de Salud. 6.3 La leche cruda puede clarificarse en la explotacin lechera si se cuenta con la infraestructura. Debe clarificarse en el centro de acopio o en la planta procesadora de leche.

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TABLA 1. Especificaciones fisicoqumicas para leche cruda de vaca.

Parmetro Especificacin Mtodo de Prueba

Densidad a 15C g/ml 1,0295 mn. NMX-F-737-COFOCALEC-2010 Grasa butrica g/L Clase A Clase B Clase C

> 32

31 mn. 30 mn.

NOM-155-SCFI-2003

Protenas totales g/L Clase A Clase B Clase C

> 31

30 a 30,9 28 a 29,9

NOM-155-SCFI-2003

Casena g/L 23 mn. NOM-155-SCFI-2003 Lactosa g/L 43 a 50 NOM-155-SCFI-2003 Slidos no grasos g/L 83 mn. NOM-155-SCFI-2003 Punto Crioscpico C Entre -0,515 y -0,536 NOM-155-SCFI-2003

NOTA Punto Crioscpico expresado en H: Entre -0,535 y -0.560

TABLA 2. Especificaciones sanitarias para leche cruda de vaca.

Parmetro Especificacin Mtodo de PruebaAcidez (como cido lctico) g/L 1,3 a 1,6 NOM-155-SCFI-2003 Prueba de alcohol al 72 % v/v Negativa Vase inciso 1 del Apndice Normativo A Materia extraa Libre Vase inciso 2 del Apndice Normativo A Inhibidores Negativo NOM-243-SSA1-2010 Aflatoxina M1 g/kg 0,5 mx. NOM-243-SSA1-2010 Cuenta total de Bacterias Mesoflicas Aerobias UFC/mL Clase 1 Clase 2 Clase 3 Clase 4

< 100 000 101 000 a 300 000 301 000 a 599 000

600 000 a 1 200 000

NOM-243-SSA1-2010

Conteo de Clulas Somticas CS/mL Clase 1 Clase 2 Clase 3 Clase 4

< 400 000 401 000 a 500 000 501 000 a 749 000

750 000 a 1 000 000

Vase inciso 3 del Apndice Normativo A

7. MUESTREO Para fines de muestreo del producto objeto de este Proyecto de Norma Mexicana se propone el uso de la Norma Mexicana NMX-F-718-COFOCALEC-2006 (Ver el punto 2 Referencias). 8. MTODOS DE PRUEBA Para la verificacin de las especificaciones que se establecen en el presente Proyecto de Norma Mexicana se deben aplicar los mtodos de prueba sealados en las tablas 1 y 2 (vanse tablas).

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9. BIBLIOGRAFIA CODEX STAN 206-1999. Norma General para el uso de Trminos Lecheros. International Standard ISO 13366-1:2008|IDF148-1:2008 Milk Enumeration of somatic cells Part 1: Microscopic method (Reference method). 10. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES Este Proyecto de Norma Mexicana coincide bsicamente con la Norma Internacional ISO 13366-1:2008 Milk Enumeration of somatic cells Part 1: Microscopic method (Reference method), en el punto 3 del Apndice Normativo A y los Apndices Informativos A, B y C. Difiere en el resto de su contenido por no existir Norma Internacional sobre el tema tratado.

APENDICE NORMATIVO A

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- Mtodos de prueba A.1. Prueba del alcohol al 72 % v/v A.1.1 FUNDAMENTO Cuando se mezcla un volumen dado de alcohol con leche, provoca una deshidratacin parcial de ciertos coloides hidroflicos presentes en la muestra, desnaturalizndolos y alcanzando un estado de desequilibrio entre sus dos fases discontinuas (emulsin grasa y suspensin coloidal) por lo que floculan. Este cambio slo se produce cuando la mezcla final alcanza un cierto contenido de alcohol, abajo del cual la leche trmicamente estable no flocular y por lo tanto la leche resistir un tratamiento trmico. A.1.2 REACTIVOS Y MATERIALES A.1.2.1 Alcohol etlico al 72 % v/v A.1.2.2 Tubos de ensayo de 10 ml. A.1.2.3 Pipetas de 20 ml. A.1.2.4 Alcoholmetro o aermetro graduado. A.1.2.5 Probeta. A.1.3 PROCEDIMIENTO Medir 2 ml de muestra y colocarla en un tubo de ensayo, agregar 2 ml de alcohol etlico al 72 % v/v, mezclar y observar si hay formacin de grumos. A.1.4 CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS La formacin de grumos (reaccin positiva), es clara evidencia de que la estabilidad de la suspensin coloidal de la leche se encuentra afectada, por lo que no resistir el proceso trmico de la pasteurizacin. Expresar el resultado como positivo o negativo. A. 2. Determinacin de materia extraa en leche A.2.1 FUNDAMENTO Se filtra una cantidad predeterminada de leche (a temperatura de 32 a 38 C), a travs de un disco de algodn, para retener la materia extraa y comparar la cantidad obtenida contra estndares preparados de acuerdo con este procedimiento.

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A.2.2 EQUIPOS Y MATERIALES A.2.2.1 Analizador. De construccin simple, de fcil limpieza y ajustable entre muestreos para permitir la limpieza sanitaria del disco utilizado y su reemplazo con uno limpio. Antes de utilizar, evaluar la reproducibilidad del analizador de acuerdo con lo descrito en el punto 2.3.4. La leche o la materia extraa no debe sobrepasar el disco. Seleccione el tipo de acuerdo con el mtodo de muestreo: A.2.2.1.1 Mtodo para muestras compuestas. Tipo de vaco, gravedad o presin: A.2.2.1.1.1 Para muestras de 3,785 L utilice un aditamento apropiado que filtre la muestra a travs del disco con un rea de exposicin de 28,6 mm de dimetro. A.2.2.1.1.2 Para muestras de 473 mL, prepare la unidad con un filtro que tenga un rea de filtrado de 10 mm de dimetro, o utilice algn aditamento que tenga un rea de filtrado de 10 mm de dimetro. A.2.2.1.2 Mtodo del fondo. Puede ser para dos tipos de unidades. En el caso de unidad simple para la toma de 473 mL sobre el movimiento ascendente del mbolo y descarga a travs del disco en el movimiento descendente del mbolo. En el caso del tipo de dos unidades, la primera para la remocin de 473 mL de leche del fondo de la cntara de leche y otra para el filtrado de la muestra. Utilice el aditamento de muestreo con la longitud suficiente para alcanzar el fondo del cntara de leche y que tenga un rea de filtrado de un dimetro de 28,6 mm.

A.2.2.2 Discos de algodn para materia extraa. Discos de algodn estndar o almohadillas de 28,6 mm de dimetro, para utilizarse sobre pantallas planas de alambre en el analizador y que tienen un rea de exposicin de 28,6 mm de dimetro. El disco no debe contener residuos de resinas fenlicas u otros qumicos que puedan contaminar la leche. Pruebe los discos de materia extraa de la siguiente manera: Filtre a travs de la almohadilla 12 mg de una mezcla estndar de materia extraa (alcuota de 60 mL, ver el punto 2.3.1 utilizando matraces limpios para recibir el filtrado. Transfiera el filtrado a un vaso de precipitado, enjuague 3 veces el matraz con agua destilada y vierta los enjuagues al vaso de precipitado. Filtre a travs de papel filtro de 7 9 cm que haya sido lavado previamente con 200 mL de agua destilada, secado a peso constante a 100 C y enfriado en un plato cubierto en el desecador antes de pesar. Enjuague completamente el vaso de precipitado y el papel filtro y seque a peso constante como se describe anteriormente. Pruebe 3 discos; el peso promedio del sedimento que pase a travs de cada disco debe ser 2,8 mg. Adems, el disco estndar preparado con la mezcla fina no debe aparecer como si tuviera materia extraa oculta bajo la superficie.

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A.2.2.3 Equipo para la filtracin de la materia extraa. A.2.2.3.1 Para dimetros estndar de 28,6 mm. El equipo debe soportar discos para materia extraa de 31,8 mm y tener un rea efectiva de filtracin de 28,6 mm de dimetro. Esta rea no debe ser obstruida excepto por la pantalla de alambre o por sta y el soporte para el disco de filtrado. El equipo debe contar con matraces de filtracin de tal manera que pueda ser utilizado vaco para lograr una filtracin rpida o un matraz con salida de aire de tal forma que al cerrarlo se detenga la filtracin. El equipo debe tener un embudo de 80 con una capacidad de entre 80 a 450 mL. Pruebe el equipo filtrando la suspensin de agua que se describe en el punto 2.3.4 a travs del disco estndar. El disco debe tener una orilla claramente definida. Cuando la suspensin de la materia extraa es filtrada, debe ser homogneamente distribuida sobre el disco procurando no establecer un patrn de distribucin. A.2.2.3.2 Para dimetros estndar de 10 mm. Equipo con vaco que soporta discos para materia extraa de 31,8 mm y utiliza slo un rea de filtracin de 10 mm de dimetro. Pruebe el equipo de acuerdo con el procedimiento descrito en el punto anterior. A.2.3 PROCEDIMIENTO A.2.3.1 Preparacin de estndares de discos con materia extraa gruesa. Prepare una mezcla uniforme de materiales secados al horno (100 C), durante 3 o 4 horas, que renan las siguientes especificaciones para malla o tamizado. Muela todos los materiales a mano con un mortero y pistilo. Estircol de vaca, a travs de una malla o tamiz No.40.......................................... 53 % Estircol de vaca, a travs de una malla o tamiz No. 20, retenido en el No. 40. 2 % Tierra de jardn, a travs de una malla o tamiz No. 40............................................ 7 % Carbn, a travs de una malla o tamiz No. 40........................................................ 14 % Carbn, a travs de una malla o tamiz No. 20, retenido en el No. 40.................... 4 % Coloque 2 g de la mezcla antes descrita en un frasco volumtrico de 100 mL, humedezca completamente con 4 a 6 mL de la solucin Aerosol OT (preparar solucin 1 al 2% en acetona y diluir con agua) o cualquier otro agente humidificante apropiado, agregue 46 mL de la solucin goma de algarrobo al 0,75%, y lleve el nivel del lquido hasta el cuello del frasco aadiendo solucin de sacarosa (sucrosa) al 50% (por peso). Deje reposar 30 minutos, aada pocas gotas de alcohol y diluya a volumen con la solucin de sacarosa (sucrosa). Mezcle muy bien y vierta en un vaso de precipitado de 250 mL o cualquier otro recipiente adecuado y agite con un agitador mecnico o magntico a una velocidad tal (200 a 300 rpm) que la mezcla sea completamente agitada pero cuidando que no se formen burbujas en la suspensin. Observe contra la luz brillante que la suspensin se encuentre uniformemente mezclada.

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Transfiera, mientras agita, una porcin de 10 mL (200 mg de sedimento estndar) con una pipeta graduada de punta amplia a un matraz volumtrico de 1 L y diluya al volumen con la solucin de sacarosa (sucrosa) al 50%. Cuando se encuentre completamente mezclada, cada mL contiene 0,2 mg de sedimento. Mezcle y vierta en un vaso de precipitado y agite de la misma manera que anteriormente. Si las partculas se acumulan en los lados del vaso, resuspndalas con la misma suspensin de materia extraa o con la punta de la pipeta. Mientras agita, saque con la pipeta volmenes definidos de la suspensin con materia extraa y agrguelas a 0,35 L de leche descremada dulce filtrada. Mezcle bien y pase la mezcla a travs del disco de materia extraa estndar del equipo de filtracin (vase A.2.2.3 y A.2.2.3.1). Con cuidado vierta la leche hacia el equipo de filtrado y filtre con muy poca o nada de succin. Lave el recipiente rpidamente con un 0,11 L de leche descremada filtrada. Deje que la ltima parte de la leche fluya a travs de la almohadilla sin aplicar succin. Si la materia extraa no parece estar uniformemente distribuida en la almohadilla, agregue 15 o 20 mL de leche descremada y fltrela sin succin. Repita este procedimiento hasta que la materia extraa aparezca homogneamente distribuida. Aspire aire a travs del disco por aproximadamente 1 minuto para remover el exceso de leche descremada. Para registros permanentes, monte y roce los discos con solucin de formaldehdo al 40% o con una solucin alcohlica que contenga 2,5 g tanto de mentol como de timol en 100 mL. No obstante, si toda la leche es eliminada a travs de la aspiracin no es necesario aplicar conservadores. Las almohadillas secas pueden ser recubiertas con cemento plstico transparente diluido con 1:3 volmenes de acetona de tal manera que la mezcla sea lo suficientemente delgada que permita su fcil aplicacin. Si la acetona disuelve el pigmento del papel o mancha las almohadillas, coloque stas ltimas en un cristal plano para la aplicacin del cemento diluido. Mueva las almohadillas mientras se secan para evitar que se peguen al cristal. Cuando las almohadillas estn casi secas, coloque un objeto ligero (por ejemplo caja de Petri) encima de las mismas para evitar que se enrosquen. Las almohadillas pueden ser montadas con cemento plstico. (Los discos estndar hechos con estircol de vaca contienen grandes cantidades de clorofila y no pueden ser recubiertos con cemento plstico debido a que el solvente extrae la clorofila y mancha de verde las almohadillas. Utilice este mtodo de conservacin de las almohadillas solo si no hay deslave de pigmentos del sedimento al aplicarse cemento plstico diluido). Despus de llevar a cabo el mtodo antes descrito, prepare diferentes discos con la mezcla de materia extraa utilizando las siguientes cantidades: 0,0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 12,0, y 14,0 mg. Marque el disco con la cantidad de materia extraa utilizada para preparar cada almohadilla. Evite utilizar como estndar aquellas almohadillas en las que la materia extraa no se encuentre uniformemente distribuida. Para realizar comparaciones entre muestras se pueden utilizar series completas de discos pero por lo general es ms conveniente seleccionar pocos discos que demuestren diferencias en el contenido de materia extraa que sean aplicables a la investigacin que se est llevando a cabo. En aquellos caso en que se elaboren

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informes y tablas comparativas, es importante sealar el tipo de muestra utilizada (mezclada o muestra del fondo de la cantara). Si los estndares se van a utilizar por un periodo prolongado, protjalos con cristal o con hojas de plstico o cualquier otro material adecuado. Al utilizar estndares, use cualquier de los siguientes mtodos: Califique el disco de materia extraa con el disco estndar ms cercano sin importar si la cantidad de sedimento es inferior o superior al estndar; o Califique el disco de materia extraa de la muestra como ms de ____ mg o menos de ___ mg. Elija los estndares que se ajusten al mtodo de calificacin. Cuando califique los discos, elimine las piezas burdas (moscas completas, pelos, pedazos grandes de estircol o lodo, etc.), pero si dichos materiales se encuentran presentes selelos de manera separada en el informe. A.2.3.2 Preparacin de estndares de discos con materia extraa fina. A.2.3.2.1 Estndar de 28,6 mm de dimetro. Muela estircol de vaca secado en el horno (100 C), tierra de jardn y carbn de madera (entero) en un molino Wiley (o equivalente) con malla o tamiz fino. Pase el estircol de vaca por el molino 2 3 veces. Separe los materiales en cantidades mximas de 50 g, como sigue: Seque 25 a 50 g a 100C por 3 a 4 horas. Mientras est todava caliente, coloque en una malla o tamiz de 203 mm No. 140 que se encuentre unido a una malla o tamiz No. 230. Ponga la cubierta y el recibidor. Sacuda los tamices con la mano durante 5 minutos a 120 movimientos por minuto. Separe los tamices y elimine el material que se haya pegado en la parte de abajo del tamiz 230 y elimine antes de vaciar el tamiz. Seque el material retenido en el tamiz No. 230 por aproximadamente 2 horas (cantidad mxima de 20 g) y vuelva a sacudir durante 5 minutos, como se describi anteriormente. Separe los tamices y elimine el material que se haya pegado a la parte de abajo del tamiz No. 230 antes de vaciarlo. Utilice las fracciones del tamiz No. 230 de la segunda sacudida y mzclelas uniformemente en las siguientes proporciones: estircol de vaca 66%, tierra de jardn 28% y carbn 6%. Combine las dos fracciones de arriba 140 de cada uno de los materiales y sacuda nuevamente como se hizo anteriormente, con la excepcin de utilizar un tamiz No. 120 conectado sobre el No. 140. Reagite la fraccin nueva 140, retenga la fraccin 140 de la segunda agitada. (Seque antes de cada agitada y elimine el material acumulado en la parte baja del tamiz No. 140 antes de vaciarlo). Mezcle el estircol, la tierra y el carbn en las proporciones mencionadas anteriormente. Coloque 1,8 g de la mezcla de la fraccin 230 y 0,2 g de la mezcla de la fraccin 140 en un matraz volumtrico de 100 mL. Repetir los mismos pasos que se describen en A.2.3.1, empezando en humedezca completamente con 4 a 6 mL

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de solucin Aerosol OT al 1%... excepto que se utiliza agua en lugar de la solucin al 50% de sacarosa (sucrosa) para diluir una alcuota de 10 mL a 1 L. En donde se describe en A.2.3.1 que Mientras agita, saque con la pipeta volmenes definidos..., proceda de la siguiente manera: Determine la capacidad del embudo del equipo de filtrado (vase A.2.2.3.1), al vaciar agua destilada en el equipo ensamblado con la salida de aire del frasco de filtrado cerrado. Incluya el agua destilada que se filtra como parte de la capacidad del embudo. Mientras agita, transfiera alcuotas de la suspensin de materia extraa hacia los vasos de precipitado. Agregue agua destilada para hacer un volumen total de 20 a 50 mL menor que la capacidad del embudo, utilizando el volumen total de entre 60 a 400 mL. Con la salida del aire del matraz de filtracin cerrada para evitar la filtracin, mezcle la alcuota diluida y vacela al equipo (vase A.2.2.3.1), provisto con un disco estndar hmedo (vase A.2.2.2.) (Use alcohol o agente humidificador cuando sea necesario para mojar el disco). Aada 20 a 50 mL de agua al vaso de precipitado y enjuague girando el vaso. Vace en el embudo, manteniendo el labio del vaso tocando la superficie de agua en lo posible. (El agua de enjuague debe casi llenar el embudo si la capacidad es de 450 mL). Abra la salida de aire del matraz. Despus de que el agua ha sido filtrada a travs de la almohadilla, aplique vaco y aspire el disco por espacio de 1 minuto. Remueva la almohadilla y djela secar en una caja cubierta. Si la materia extraa no se encuentra uniformemente distribuida, elimine la almohadilla. Despus de algo de prctica, aproximadamente el 75% de las almohadillas preparadas deben ser aceptables. No se requiere conservador. Las almohadillas pueden ser cubiertas con cemento plstico diluido y utilizadas como se describe en A.2.3.1. A.2.3.2.2 Estndar de 10,2 mm de dimetro. Mientras agita, transferir con la pipeta 100 mL de la suspensin fina diluida descrita anteriormente en un contenedor apropiado y diluir a 800 mL con agua destilada. Cada mL contiene 0,025 mg de sedimento y cuando se filtra a travs de un rea de 0,40 de dimetro es equivalente a un filtrado de 0,2 mg a travs de un rea de 28,6 de dimetro. Prepare varios estndares filtrando alcuotas adecuadas a travs de los discos en el equipo (vase A.2.2.3.2). Diluya cada alcuota a 50 a 60 mL y filtre con una succin mnima. Enjuague el vaso con un volumen pequeo de agua destilada y vierta al embudo. Con mucho cuidado enjuague los lados del embudo con un volumen pequeo de agua destilada. Utilice la succin mnima necesaria para remover el exceso de agua del disco. Designar el dimetro de 10,2 mm como __mg equivalente y utilice en la calificacin 473 mL de la muestra mezclada para discos de prueba de la misma manera en que son utilizados los estndares de 28,6 mm de dimetro. A.2.3.3 Estndares en fotografa.- Pueden ser utilizados como una gua en la calificacin de las almohadillas de materia extraa, sin embargo es preferible usar discos reales como los preparados segn se describi en A.2.3.1 y A.2.3.2. (vanse puntos) En cada caso se deben utilizar los estndares que ms se

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acerquen al disco que est siendo calificado. No utilice fotografas que se han deteriorado, manchado o daado. A.2.3.4 Verificacin de los analizadores de materia extraa. Para verificar los aditamentos para evaluacin de materia extraa es necesario llevar a cabo las siguientes actividades: Mida el volumen real de leche entregado para asegurarse que los 473 mL son retirados y pasados a travs del disco. Transfiera 10 mL de la solucin al 2% de la suspensin de sedimento en sacarosa (vase A.2.2.4), utilizando una pipeta graduada de punta amplia a un bote de leche con 37,8 L de agua destilada limpia filtrada. Despus de agitar la mezcla bien, remueva 473 mL con un medida que asegure dicho volumen y fltrelos a travs de un disco de sedimentos con un rea dimetro de 28,6 mm (vase A.2.2.2), ensamblado en un embudo apropiado de tamao correcto (por ejemplo vase A.2.2.3.1). Despus de una agitacin adecuada del contenido de la cantara de leche, de nuevo remueva una muestra de 473 mL con el aditamento de prueba de sedimentos y pselo a travs del disco exactamente de la misma forma en que se evala la leche. Repita esta operacin con el analizador varias veces para determinar si los discos obtenidos de esta manera proporcionan la misma materia extraa que el disco obtenido a travs de la filtracin por el embudo (vase A.2.2.3.1). A.2.3.5 Obtencin de la muestra A.2.3.5.1 Mtodo de muestra de prueba mezclada. Para cantaras de leche, de 20 a 40 L, y tanques de almacenamiento, utilizar muestras de 473 mL 3,78 L. Antes de mezclar la leche, transfiera con un colador pequeo cualquier materia extraa flotante, tal como moscas, pelo, pedazos grandes de restos, etc., al disco instalado (vase A.2.3.6.1), o instale un disco separado adecuadamente identificado. Mezcle adecuadamente la leche en la cantara antes de tomar la muestra para prueba. Evite contaminar la muestra con materia extraa que vaya en los agitadores o por cualquier otro medio. Para contenedores de comercializadores tome 473 mL del contenedor mezclado o el nmero suficiente de muestras para lograr un volumen de 3,78 L. Lleve a cabo las actividades de acuerdo con lo descrito en A.2.3.6.1. A.2.3.5.2 Mtodo del fondo. Para cntaras de leche de 20 a 40 L tome muestras de 473 mL mediante cualquiera de los probadores de fondo de cantaras de leche sin agitar. Antes de sacar la muestra, remueva con un colador pequeo cualquier materia extraa flotante como en el punto anterior. Tome una muestra a < 6,4 mm del fondo de una cntara de leche sin agitar introduciendo el aditamento para muestrear y, durante el movimiento hacia arriba del embolo, mover la cabeza del instrumento cruzando una vez el dimetro del fondo de la cntara o alrededor de la circunferencia si el bote tiene un centro elevado. Expulse la leche con la pistola en la cntara y despus con un golpe corto remueva el exceso de fluido de la almohadilla. Proceder como se describe en A.2.3.6.2. A.2.3.6 Determinacin

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A.2.3.6.1 Muestras mezcladas. Pase las muestras de prueba a travs del disco apropiadamente ajustado (vase A.2.2.2) sostenido en la posicin correcta el analizador. Caliente 473 mL de leche a una temperatura de 32 a 38 C y filtre a travs del rea restringida del dimetro de 10,2 mm (vase A.2.2.1.1). Si se utiliza una unidad sencilla del analizador del fondo con cabeza especial, caliente una muestra mayor de 473 mL a una temperatura de 32 a 38 C y retire 473 mL con el analizador mientras agita o retire 473 mL hacia el analizador y caliente la leche sosteniendo el analizador bajo el chorro de agua caliente antes de descargar la leche en el disco. Caliente 3,78 L de la muestra a una temperatura de 26 a 32 C o filtre en fro a travs del rea del disco con dimetro de 28,6 mm (vase A.2.2.2). Si la leche es filtrada a temperatura de 32 C, enjuague el disco con 236 mL de agua destilada caliente libre de sedimentos antes de removerlo del probador. Si la leche va a ser recuperada no diluir con agua. (La leche vara en su velocidad de flujo a travs de los discos; la leche pasteurizada puede ser ms difcil de filtrar que la leche cruda. Otros factores que pueden influir en la velocidad de flujo son la temperatura, contenido de grasa, grado de agrupamiento de los glbulos de grasa, la etapa de lactacin, presencia de leche de vacas con mastitis y cantidad de sedimentos en la muestra). Quitar el disco del analizador y colocarlo en papel de tamao especial o almacenar en sobres individuales transparentes y encerados. (Si el disco es colocado en papel o en sobre cuando todava se encuentra hmedo, el secado de la leche puede actuar como adhesivo). Califique por comparacin con discos estndar (vase A.2.3.1 y A.2.3.2), e indicar en el reporte si la almohadilla fue calificada hmeda o seca. (El carcter de la materia extraa puede ser determinada a travs del examen microscpico). Para prevenir la descomposicin durante el almacenamiento, el disco puede ser rociado con una solucin de formaldehdo o una solucin alcohlica de mentol timol como se describe en A.2.3.1 No utilice pegamento para fijar el disco al papel; si el disco se desprende, humedezca con pocas gotas de agua y vulvalo a fijar. Protjalos de la contaminacin. A.2.3.6.2 Muestras del fondo. Remueva disco del analizador (vase A.2.3.5.2) y proceda como lo indica el punto anterior, prrafo tercero, empezando ...colocarlo en papel de tamao especial

A.2.4 CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Califique el disco de la muestra, eliminando la materia burda (moscas completas, pelos, trozos grandes de estircol o lodo, etc.), contra el disco estndar ms cercano y reporte la cantidad de materia extraa de la muestra como ms de ____ mg o menos de ___ mg, incluyendo en el informe, si es el caso, de la presencia de materia burda.

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A.3. Conteo de clulas somticas (Mtodo de referencia) A.3.1 OBJETIVO Y ALCANCE Establecer el mtodo de prueba microscpico (mtodo de referencia) para el conteo de clulas somticas en leche cruda y leche conservada por medios qumicos. El mtodo es aplicable para el conteo de clulas somticas en la leche de vaca, siempre que los requisitos antes mencionados se cumplan. Este mtodo es adecuado para la preparacin de muestras patrn de prueba y la determinacin de los valores del mtodo de referencia requeridos para la calibracin del mtodo mecnico y automatizado de enumeracin de clulas somticas. ADVERTENCIA- El uso de ste mtodo de prueba implica el manejo de materiales peligrosos, operaciones y equipos. El alcance de este procedimiento no aborda todos los problemas asociados con su utilizacin. Es responsabilidad del usuario del mtodo establecer las medidas de seguridad adecuadas, y determinar la aplicacin de restricciones reglamentarias antes de su utilizacin. A.3.2 DEFINICIONES Para los fines de este mtodo de prueba aplica la siguiente definicin: A.3.2.1 Clulas somticas, son clulas con ncleo (leucocitos y clulas epiteliales) de acuerdo con el procedimiento descrito en este mtodo de prueba. A.3.3 FUNDAMENTO Se prepara un frotis extendiendo sobre un portaobjetos una porcin de la muestra leche por analizar. El frotis se seca y se tie. Posteriormente las clulas somticas teidas son contadas usando un microscopio. El nmero de clulas somticas contadas en un rea determinada se multiplican por el factor de trabajo, para obtener el nmero de clulas somticas por mililitro. A.3.4 REACTIVOS Y MATERIALES

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Los reactivos deben ser grado analtico a menos que se especifique algn otro requerimiento y por agua se entiende agua destilada o desionizada o agua de pureza equivalente. A.3.4.1 Disoluciones colorantes ADVERTENCIA.- El tetracloroetano es venenoso. El bromuro de etidio es mutagnico. Atienda las medidas de seguridad vigentes para su manejo, uso y disposicin. La preparacin y aplicacin de la disolucin colorante debe llevarse a cabo en una campana de extraccin de humos, utilizando equipos de proteccin. A.3.4.1.1 Disolucin colorante modificada Newman-Lampert (Modificacin Levowitz - Weber) A.3.4.1.1.1 Componentes Etanol 95% 54,0 mL Tetracloroetano 40,0 mL Azul de metileno 0,6 g Acido actico, glacial 6,0 mL Alternativamente puede usarse xileno en la misma cantidad de volumen que la descrita para el tetracloroetano.

A.3.4.1.1.2 Preparacin Mezclar el etanol y el tetracloroetano en un frasco con tapa. Calentar la mezcla en un bao Mara a 65 C, agregar el azul de metileno en una campana de extraccin de humos y mezclar cuidadosamente. Enfriar la mezcla a 4 C. Agregar el acido actico glacial y mezclar de nuevo cuidadosamente. Filtrar la disolucin, colocarla en un frasco adecuado con tapa de cierre hermtico y almacenarla en dichas condiciones. Antes de usar la disolucin de tincin Newman Lampert filtrarla de nuevo. A.3.4.1.2 Disolucin colorante de bromuro de etidio A.3.4.1.2.1 Disolucin patrn colorante. A.3.4.1.2.1.1 Composicin Bromuro de etidio 0,25 g Agua desmineralizada 100 A.3.4.1.2.2 Preparacin

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La preparacin de la disolucin debe realizarse en una campana de extraccin de humos. Disolver el bromuro de etidio en agua desmineralizada previamente calentada a 40 C. Enfriar la disolucin a temperatura ambiente. Ajustar a 100 mL con agua desmineralizada. La disolucin patrn colorante de bromuro de etidio se puede mantener durante dos meses mximo cuando se almacena en la oscuridad a 2 C +/- 2 C. A.3.4.1.3 Disolucin amortiguadora. A.3.4.1.3.1 Composicin Ftalato cido de potasio 0,51 g Hidrxido de potasio 0,162 g Agua desmineralizada 100 A.3.4.1.3.2 Preparacin

Disolver por separado el ftalato cido de potasio y el hidrxido de potasio en agua desmineralizada. La disolucin amortiguadora se conservara durante dos meses mximo cuando se almacena en la oscuridad a 2 C +/- 2 C. A.3.4.1.4 Disolucin colorante de trabajo de bromuro de etidio. A.3.4.1.4.1 Composicin Disolucin patrn colorante de bromuro de etidio

2 mL

Disolucin amortiguadora. 8 mL Triton X10 0,1 mL Agua desmineralizada 90 mL Temperaturas elevadas pueden reducir la capacidad de tincin del bromuro de etidio.

A.3.4.1.4.2 Preparacin Sucesivamente aadir en el agua desmineralizada la disolucin colorante patrn de bromuro de etidio, la disolucin amortiguadora y el Triton X-100 y mezclar cuidadosamente. Preparar la disolucin colorante de trabajo de bromuro de etidio inmediatamente antes de su uso.

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A.3.4.1.5 Disolucin amortiguadora de fosfato (PBS) A.3.4.1.5.1 Composicin NaCl 8 g

KCl 0,2 g Na2HPO47H2O 1,15 g KH2PO4 0,2 g Agua desmineralizada 1000 A.3.4.1.5.2 Preparacin

Disolver las sales en agua desmineralizada. Ajustar a 1000 mL con el agua desmineralizada restante. Ajuste el pH a 7,2 +/- 0,1 NOTA - Tambin es posible utilizar una disolucin amortiguadora de fosfato comercialmente disponible con un pH = 7,2 A.3.5 APARATOS Y EQUIPOS Material habitual de laboratorio y, en particular, los siguientes: A.3.5.1 Bao Mara, capaz de mantener una temperatura de 40 C + 2 C, 50 C + 2 C y 65 C + 2 C.

A.3.5.2 Filtro, resistente a los solventes utilizados, con un tamao de poro de 10 a 12 . A.3.5.3 Microscopio, con ampliacin de 500x a 1000x, pueden ser utilizados objetivos de inmersin en aceite. A.3.5.4 Cuando se utiliza el bromuro de etidio, se requiere de microscopio de fluorescencia. A.3.5.5 Microjeringa, para la distribucin de un volumen fijo de 0,01 mL de leche, con un mximo de tolerancia de un 2%.

A.3.5.6 Micrmetro calibrado A.3.5.7 Portaobjetos, previamente marcado con un contorno de forma rectangular o circular. Con una superficie de 1 cm2 + 5 % (95 mm2 105 mm2) o un portaobjeto estndar con una plantilla de dimensiones de 20 mm x 5 mm o con un dimetro de 11,28 mm. A.3.5.7.1 Seleccin del portaobjeto

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Trabajar preferentemente con un rea fija previamente marcada o una plantilla, a fin de evitar un nuevo clculo del factor de trabajo en cada conteo. A.3.5.7.2 Formas

Para obtener una forma rectangular, el ancho interno superior e inferior y la altura derecha e izquierda, no deben diferir en ms de 0,2 mm. Para obtener una forma circular, el dimetro interno vertical y horizontal no debe diferir en ms de 0,2 mm A.3.6 MUESTREO Debe enviarse al laboratorio una muestra representativa. La muestra no debe daarse o alterarse durante el transporte o el almacenamiento. El muestreo no es parte de este procedimiento. La NMX-F-718-COFOCALEC-2006 describe los requisitos y recomendaciones para el muestreo (Ver punto 2. Referencias de este Proyecto de Norma Mexicana). A.3.7 PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO A.3.7.1 Almacenamiento Conservar las muestras de ensayo almacenndolas a una temperatura de 4 C + 2 C. Analizar las muestras de ensayo dentro de 6 horas despus del muestreo. En caso de requerirse un almacenamiento prolongado, aadir conservadores qumicos como el acido brico, bronopol o dicromato de potasio. La concentracin del acido brico no exceder 0,6 g por cada 100 ml de muestra para ensayo. La concentracin final de bronopol no deber exceder de 0,05 g por cada 100 ml de prueba muestra. La concentracin final de dicromato de potasio no debe de exceder de 0,1 g por cada 100 ml de muestra para ensayos. Conservar la muestra a una temperatura de 4 C por un tiempo no mayor a 6 das. Por razones ambientales, se recomienda restringir el uso del dicromato de potasio solamente para muestras que requieren una larga vida til. A.3.7.2 Preparacin Calentar la muestra de ensayo en un bao Mara mantenido a 40 C y mezclarla cuidadosamente para su homogeneizacin. Enfriar la muestra a la temperatura a la que la microjeringa ha sido calibrada, por ejemplo, a 20 C. Diluir las muestras de ensayo con una cuenta estimada de clulas somticas por encima de 1 000 000 clulas/mL, con una solucin amortiguadora de fosfato, para

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obtener una cuenta aproximada de clulas somticas de 500 000 clulas/mL para cada muestra diluida.

En donde: d, es el factor de dilucin para obtener un anlisis adecuado de clulas

somticas en la toma de muestra de alrededor de 500 000 clulas/mL. Vs, es el volumen de la muestra en mL. Vb, es el volumen del amortiguador utilizado para diluir la muestra en mL. Registrar el factor de dilucin necesario d, el volumen de la muestra Vs y el volumen del amortiguador Vb utilizado para obtener la dilucin requerida. A.3.8 PROCEDIMIENTO Preparar por lo menos dos frotis por cada muestra y considerar el mejor para la enumeracin (por ejemplo el frotis no daado por el proceso de tincin). Sumergir los portaobjetos en etanol (95% v/v). Flamear y dejar enfriar. A.3.8.1 Preparacin del frotis y tincin. Para la preparacin del frotis y la tincin, siga cualquiera de los procedimientos descritos en A.3.8.1.1 en A.3.8.1.2. NOTA - La tincin de la leche de cabra se describe en el Apndice Informativo B. A.3.8.1.1 Preparacin del frotis y tincin con disolucin colorante Newman - Lampert. Tomar con la microjeringa 0,01 ml de la muestra (eventualmente diluida). Enjuagar la microjeringa con la muestra de ensayo. Si es necesario, limpiar con cuidado y suavemente la parte exterior de la microjeringa que ha estado en contacto con la muestra de ensayo. Colocar la muestra en un portaobjetos limpio con una superficie de 1 cm2. Con la punta extender la muestra de manera uniforme sobre toda el rea definida, garantizando al mismo tiempo que la zona cercana al permetro est cubierta uniformemente. Dejar el frotis a temperatura ambiente hasta que est completamente seco. Empapar el portaobjetos con el frotis seco con la disolucin colorante modificada de Newman-Lampert, por lo menos durante 15 minutos. Secar el frotis a temperatura ambiente.

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Mojar suavemente el frotis con agua de la llave hasta que todo el colorante excedente se elimine con el lavado. Secar de nuevo y almacenar protegido del polvo. A.3.8.1.2 Tincin con disolucin colorante de bromuro de etidio y preparacin del frotis. Mezclar 1 mL de la muestra preparada con 1 mL de solucin colorante de trabajo de bromuro de etidio en un tubo de ensayo. Mantener la muestra protegida de la luz. Calentar el tubo en un bao de agua a 50 C por 3 min. Enfriar a temperatura ambiente. Con la microjeringa tomar 0,01 mL de la mezcla. Enjuagar la microjeringa con la mezcla. Si es necesario, limpiar cuidadosa y suavemente la parte exterior de la microjeringa que ha estado en contacto con la mezcla. Colocar la muestra en un portaobjetos con una superficie de 1 cm2. Con la punta, distribuir la mezcla uniformemente sobre toda el rea definida, asegurando al mismo tiempo que la zona cercana al permetro est cubierta uniformemente. Mantener el frotis a temperatura ambiente hasta que est completamente seco. A.3.8.2 Determinacin

A.3.8.2.1 Optimizacin de la lectura. Con el microscopio contar los ncleos de las clulas en el frotis. Elegir la ampliacin (de 500x a 1000x) que mejor permita tener un nmero promedio mximo de 20 clulas en cada campo. Las clulas poseen un ncleo teido. Las clulas generalmente son de 8 o ms grandes. No contar las clulas menores de 4 (vase figura 1). Contar fragmentos solo si ms del 50% del material nuclear es visible. Contar grupos de clulas solo si la(s) unidad(es) nuclear(es) est claramente separada. Vase tambin figuras 2 y 3.

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Macrfagos 8-30 m La relacin entre citoplasma/ncleo es grande. Fagositosis, antgeno presente, secrecin de factores quimiotcticos

PMN 10-14 m 90% de la mastitis aguda 60% crnica. La relacin entre citoplasma/ncleo es pequea. Fagocitosis. Primera lnea de defensa contra la mastitis.

Clula epitelial 10-14 m Ncleo redondo. Citoplasma dbilmente teido

Linfocitos 5-10 m La relacin entre citoplasma/ncleo es pequea. Ncleos intensamente teidos. T auxiliares y T superiores de clulas B

FIGURA 1 - Ejemplos de clulas

Longitudes de clulas: L1 = 9,79 m y L2 = 2,77 m

FIGURA 2 - Ejemplos de clulas de leche de vaca a granel (aumento 1 000x)

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(Aumento 500x) (Aumento 1000x)

Longitudes de clulas: L22 = 9,08 m; L23 = 8,27 m; L24 = 4,95 m; L25 = 7,39 m; L26 = 6,37 m and L27 = 3,58 m.

FIGURA 3 - Ejemplos de clulas de leche de vaca a granel NOTA - El entrenamiento y la habilidad del analista es el principal factor crtico de xito para la

correcta ejecucin del mtodo. La frecuente ejecucin del mtodo y la participacin en ensayos interlaboratorio son esenciales para garantizar un nivel adecuado de contar.

Generalmente, las clulas en la leche se distribuyen segn una distribucin de Poisson (vase Apndice Informativo C). El nmero mnimo (N) de clulas que deben ser contadas en relacin con el nivel de recuento de clulas, para llegar a los coeficientes de variacin enumerados, se indican en la tabla 3 (vase tabla). Para una correcta ejecucin del mtodo, es esencial que se cuente el nmero mnimo de clulas. Los campos y las lneas a contar se elegirn de forma que se obtenga un recuento representativo de todo el frotis.

TABLA 3 - Nmero mnimo de clulas

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Concentracin

(x1000 clulas/mL) CV % N clulas

< 150 10 100

150 a 250 7 200

250 a 400 6 300

> 400 5 400

A.3.8.2.2 Contar en campos sucesivos. Contar los ncleos en campos sucesivos, en lneas verticales de campos espaciados regularmente (vase figura 4 y tabla 3). a).- Comenzar en la distancia, dL, desde el lado izquierdo. En forma circular, empezar desde una distancia suficiente, dL, desde el lado izquierdo del dimetro horizontal, a fin de poder contar con un mnimo de 5 campos en la parte superior de la lnea. Una distancia, dL, de 0,5 mm es adecuada tanto para las formas rectangulares como para las circulares. b).- Colocar el borde superior o inferior de la circunferencia del campo tangencial en el interior de los lmites superior o inferior de la plantilla (este ltimo no debe aparecer en el campo). En el caso de una superficie al descubierto cerca del borde de la plantilla, ajustar el campo al borde del frotis. c).- Despus de haber contado el primer campo, mover el objetivo a una distancia de espacio fijo, dH, abajo o arriba de la siguiente graduacin en la direccin del borde inferior o superior y contar en el nuevo campo. Una distancia, dH, de 1 mm se considera adecuada. d).- A partir del ltimo campo contado, repetir el procedimiento descrito en el inciso c), hasta que el lado opuesto (parte inferior o superior) de la lnea se alcance. Elegir entre las siguientes dos opciones. - Opcin 1 El ltimo campo no debe ser contado. - Opcin 2 Si el borde inferior o superior aparece y ocupa menos de la mitad de la superficie del campo, el conteo se realiza despus de subir el objetivo hasta que el borde desaparece por completo del campo y solo cubre el frotis.

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e).- A continuacin, desplazar el objetivo hacia la derecha a una distancia, dw (por ejemplo dw = 1,5 mm o dw = 2 mm dependiendo del nmero de campos necesarios), y comenzar una nueva lnea en la direccin opuesta (parte superior o inferior). f).- Repetir el procedimiento desde el inciso b) al inciso e) hasta que se llegue al lado derecho de la plantilla. g).- En caso que se cuente un nmero insuficiente de campos (vase tabla 3), se pueden contar campos adicionales. Para ello, enfocar el objetivo del microscopio en otros lugares (por ejemplo, cambiando el punto de partida y/o adecuando paso a paso las distancias por recorrer) a fin de obtener un nmero adecuado de campos que sean representativos de todo el frotis. h).- Calcular el resultado como se describe en el A.3.9.1 para una forma rectangular, o en A.3.9.3 para una forma circular. NOTA - Para formas rectangulares, son posibles 5 campos separados a 1 mm en lneas verticales

y 10 lneas espaciadas a 2 mm, por lo que es posible contar 50 campos. Se obtiene aproximadamente el mismo nmero de campos para formas circulares, utilizando las mismas distancias. Las distancias de los desplazamientos (espacios) se miden con el vernier desde la misma ubicacin de los campos (ajuste en el borde superior o inferior) para que incluya el dimetro del campo.

A.3.8.2.3 Contar lneas en forma rectangular Conteo de ncleos espaciados regularmente en lneas verticales (vase figura 5 y tabla 3). a).- Partir de una distancia, dL, desde el lado izquierdo. Una distancia, dL, de 0,5 mm se considera adecuada. b).- Comenzar a contar desde el borde superior o inferior del rea rectangular. Colocar el borde del rea en el centro del campo del microscopio. Despus de haber contado todas las clulas, mover el objetivo en direccin opuesta del borde y contar todas la clulas que aparecen en esta banda hasta que el borde opuesto se alcance. Registrar el nmero de clulas contadas. c).- A continuacin, desplazar el objetivo hacia la derecha con una distancia, dw, y empezar a contar una nueva banda (por ejemplo, dw = 3 mm a 4 mm, en funcin del nmero de bandas necesarias para una cuenta representativa de todo el frotis). Repetir los incisos b) y c) hasta que el lado derecho de la plantilla se alcance. En el caso de que se cuente un nmero insuficiente de bandas (vase tabla 3), se pueden contar bandas adicionales. En este caso el objetivo del microscopio se centra en otros lugares (por ejemplo cambiando el punto de partida y/o

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adecuando dw). A fin de obtener las bandas apropiadas que sean representativas de todo el frotis. Calcular el resultado como se describe en A.3.9.2.

Clave I hacia abajo hasta el borde inferior FIGURA 4 - Lneas verticales en campos espaciados regularmente de forma circular o rectangular

FIGURA 5 - Bandas verticales espaciadas regularmente

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A.3.9 Clculo y expresin de resultados A.3.9.1 Contando campos sucesivos en forma rectangular Utilizando las graduaciones y el vernier del microscopio, verificar que los valores objetivo para la longitud Ls, y el ancho, Ws, del frotis fue de 20,0 y 5,0 mm. Calcular la concentracin total, c, de clulas utilizando la siguiente ecuacin:

O

O con el factor constante de trabajo, f w

En donde: c, es la concentracin total, expresada en un nmero de clulas por mililitro. Ws, es el ancho, en milmetros, del frotis. Ls, es la longitud, en milmetros, del frotis. Nt, es el nmero total de clulas contadas. Df, es el dimetro, en milmetros, del campo del microscopio. Nf, es el nmero de campos de un recuento completo.

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Vm, es el volumen, en mililitros, de la muestra teida (vase A.3.8.1.1 A.3.8.1.2)

[Si se utiliz la disolucin colorante modificada de Newman - Lampert para la tincin (vase A.3.8.1.1), Vm = 0,01 mL. Si se utiliz la disolucin colorante de bromuro de etidio para la tincin (vase A.3.8.1.2), Vm = 0,005 mL].

d, es el factor de dilucin utilizado en A.3.7.2 (si no se requiri de dilucin, d = 1;

con dilucin 1:1, d = 0,5). A.3.9.2 Contando bandas en forma rectangular Utilizando las graduaciones y el vernier del microscopio, verificar que los valores objetivo para la longitud y el ancho del frotis fue de 20,0 y 5,0 mm. Calcular la concentracin total, c, de clulas utilizando la siguiente ecuacin:

O

Con el factor constante de trabajo, f w.

En Donde: Nb, es el nmero de bandas contadas por completo Los otros smbolos fueron definidos en A.3.9.1 A.3.9.3 Contando campos sucesivos en forma circular Utilizando las graduaciones y el vernier del microscopio verificar que el dimetro del frotis fue de 11,28 mm. Calcular la concentracin total, c, de clulas utilizando la siguiente ecuacin:

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O

Con el factor constante de trabajo, f w.

En donde: Dc, es el dimetro, en milmetros, del frotis. Los otros smbolos fueron definidos en A.3.9.1 A.3.9.4 Expresin de resultados. Expresar los resultados de la prueba en nmeros enteros de miles (por ejemplo 401 586 clulas/mL expresarlo como 402 000 clulas/mL). A.3.10 Precisin Los valores de repetibilidad y reproducibilidad se han derivado de los resultados de un estudio interlaboratorios llevado a cabo de acuerdo con las normas aplicables para determinar la exactitud (veracidad y precisin) de resultados y mtodos de medicin1. Los detalles de este estudio interlaboratorios se resumen en el Apndice Informativo A. 1 ISO 5725-1, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 1: General principles and definitions, e ISO 5725-2, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method.

32


Los valores de esta prueba interlaboratorios pueden no ser aplicables a rangos de concentracin y matrices distintas de las indicadas. A.3.10.1 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de un ensayo nico, que se obtiene utilizando el mismo mtodo, la misma muestra, en el mismo laboratorio, por el mismo analista, utilizando el mismo equipo, en un corto intervalo de tiempo, ser en no ms del 5% de los casos mayor que los valores dados en la tabla 4 (vase tabla).

TABLA 4 - Valores de repetibilidad

Concentracin (x 1000 clulas/mL)

Sr (x 1000 clulas/mL)

r (x 1000 clulas/mL)

245 38 107

455 43 121

679 69 192

791 110 308

3.10.2 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de prueba, que se obtiene utilizando el mismo mtodo, misma muestra, en diferente laboratorio, con distinto analista y utilizando equipos diferentes, ser en no ms del 5% de los casos mayor que los valores dados en la tabla 5 (vase tabla).

TABLA 5 - Valores de reproducibilidad

Concentracin (x1000 clulas/ml)

sR (x 1000 clulas/ml)

R (x 1000 clulas/ml)

245 41 114

455 62 174

679 78 218

791 110 308

A.3.11 Informe de prueba

33


El informe de ensayo deber especificar:

a) Toda la informacin necesaria para la identificacin de la muestra;

b) El mtodo de muestreo utilizado, si se conoce;

c) El mtodo de prueba, con referencia a este Proyecto de Norma Mexicana;

d) Todos los detalles de anlisis no establecidos en este Proyecto de Norma Mexicana, o considerados como opcionales, junto con detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el resultado de la prueba;

e) El resultado de la prueba obtenido o, si la repeticin se ha comprobado, el

resultado final obtenido.

34


APNDICE INFORMATIVO A Ensayo de colaboracin del conteo de clulas somticas

(Mtodo de referencia)

General Un estudio de colaboracin internacional para leche de vaca, que involucr dieciocho laboratorios y trece pases, se llev a cabo en octubre de 2005. La prueba incluy 8 muestras en cuatro niveles de clulas/mL y se dividi en 16 duplicados ciegos. Los valores medios para cada nivel fueron respectivamente:

- Nivel 1, muestras A y B: 245 000 clulas/mL;

- Nivel 2, muestras C y D: 455 000 clulas/mL;

- Nivel 3, muestras E y F: 679 000 clulas/mL;

- Nivel 4, muestras G y H: 791 000 clulas/mL.

La prueba fue organizada por A.I.A., Laboratorio Standard Latte, Maccarese-Roma (Italia), quin tambin realiz el anlisis estadstico de los datos de acuerdo con las normas aplicadas1 para dar los datos de precisin que se muestran en la tabla A.1 (vase tabla)

TABLA A.1 - Resultados del ensayo interlaboratorios

Nivel 1 2 3 4

Nmero de participantes despus de la eliminacin de valores atpicos 24 23 24 24

Valor medio (x 1000 clulas/mL) 245 455 679 791 Desviacin estndar de repetibilidad, Sr (x 1000 clulas/mL) Coeficiente de variacin de la repetibilidad (%) Lmite de repetibilidad (2,8 Sr) (x 1000 clulas/mL)

38

169

107

43

9

121

69

10

192

110

14

308 Desviacin estndar de reproducibilidad SR (x 1000 clulas/mL) Coeficiente de variacin de la reproducibilidad (%) Lmite de reproducibilidad (2,8 SR) (x 1000 clulas/mL)

41

17

114

62

14

174

78

11

218

110

14

308

APNDICE INFORMATIVO B

35


Tincin de leche de cabra para el conteo de clulas somticas B.1 Disoluciones colorantes para leche de cabra B.1.1 Fijador de Carnoy B.1.1.1 Componentes Cloroformo 60 mL cido actico glacial 20 mL Alcohol etlico 100% 120 mL B.1.1.2 Preparacin Agregar sucesivamente el cloroformo y el cido actico glacial en el alcohol etlico y mezclar cuidadosamente. B.1.2 Disolucin colorante verde de metilo - pironina Y B.1.2.1 Componentes Pironina Y 1,0 g Verde de metilo 0,56 g Agua desmineralizada 196 mL B.1.2.2 Preparacin Sucesivamente adicionar la pironina Y y el verde de metilo en una botella con agua desmineralizada y mezclar con cuidado. Filtrar a travs de un filtro adecuado (tamao de poro de 10 a 12 ) y guardar en un frasco mbar. Antes de usar filtrar nuevamente a travs de un filtro adecuado. B.2 Preparacin del frotis Preparar el frotis con el esquema de tincin siguiente:

1. Fijador Carnoy, durante 5 minutos;

2. Etanol al 50%, durante 1 minuto;

3. Etanol al 30%, durante 1 minuto;

4. Agua, durante 1 minuto;

5. Disolucin colorante verde de metilo pironina Y, durante 6 minutos;

6. Lavar brevemente con N-butil alcohol y luego con xileno;

7. Almacenar el frotis protegido del polvo. APNDICE INFORMATIVO C

36


Distribucin de Poisson Generalmente, las clulas en la leche estn distribuidas de acuerdo a la distribucin de Poisson. La distribucin de Poisson presupone que: M = V = s2 donde M es el valor promedio; V es la varianza; s es la desviacin estndar. El coeficiente de variacin, CV, es entonces: CV = s x 100 % M o CV = 100 % s o CV = 100 % M En donde: M, es el valor promedio el cual, en el caso de contar el nmero de clulas somticas, es el nmero de partculas (clulas) contadas.

APNDICE INFORMATIVO D

37


Evaluacin de la calidad microbiolgica de la leche por pruebas de reduccin de colorantes.

Se utilizan con este fin colorantes como el azul de metileno o la resazurina, que se decoloran a una velocidad proporcional a la actividad de las reductasas microbianas. D.1 Reduccin de azul de metileno D.1.1 FUNDAMENTO Cuando se aade una pequea cantidad de azul de metileno a la leche y la mezcla se incuba a 37 C, se produce una decoloracin debida al metabolismo bacteriano; la velocidad a la que se produce el cambio de color es directamente proporcional al nmero de grmenes presentes. NOTA - La mayor parte de los microorganismos cuando se multiplican son capaces de modificar

el potencial de oxido-reduccin (rH) de la leche lo suficiente como para transformar el azul de metileno en su derivado incoloro, pero lo hacen de forma sensiblemente diferente segn sus caractersticas. Algunas especies reducen el rH mucho ms rpidamente que otras. Por lo tanto, esta prueba de reduccin no se puede considerar como una prueba exacta para valorar el nmero de bacterias realmente presentes pero en la prctica resulta de gran utilidad.

D.1.2 MATERIALES Y REACTIVOS D.1.2.1 Tubos con tapn de baquelita 16 X 160 estriles D.1.2.2 Pipetas graduadas de 10 mL estriles D.1.2.3 Frascos color mbar con tapn de rosca de 200 mL estriles D.1.2.4 Solucin de azul de metileno, disolver 5 mg de azul de metileno en 100 mL de agua destilada estril. Esta solucin se conserva durante dos semanas protegida de la luz, en un frasco bien cerrado y a una de temperatura de 4 C. NOTA - Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras de leche por

analizarse deben esterilizarse mediante:

Horno, durante 2 horas a 170 - 175 C 1 hora a 180 C Autoclave, durante 15 minutos como mnimo a 121 C + 1 C

D.1.3 EQUIPO D.1.3.1Bao con circulacin mecnica a 37 C

38


D.1.4 PROCEDIMIENTO Colocar de manera asptica 10 mL de la muestra de leche por analizar en un tubo estril y aadir de igual forma 1 mL de la solucin de azul de metileno. Cerrar el tubo con el tapn e invertir el tubo una o dos veces para mezclar la leche con el colorante. Incubar a 37 C en bao de agua, cuidando que el nivel del agua del bao sobrepase el de la mezcla de leche contenida en el tubo. Registrar con precisin la hora de la inmersin. Observar el tubo cada media hora, para controlar la reaccin. Los tubos con la mezcla de leche decolorada se sacan del bao, registrando el tiempo en el que se ha producido la decoloracin. Los tubos cuyo contenido permanece azul, se invierten una vez cada media hora y se contina la incubacin hasta la desaparicin del color azul. Es frecuente que en la zona de contacto de la leche con el aire persista una franja coloreada que no se toma en cuenta para la interpretacin de la prueba. D.1.5 INTERPRETACIN DE RESULTADOS Se pueden calcular aproximadamente los resultados de la prueba del azul de metileno de la siguiente forma: Tiempo de decoloracin Nmero estimado de

bacterias por mL Calidad de la leche

5 horas

2 a 4 horas

menos de 2 horas

100 000 a 200 000

200 000 a 2 millones

2 a 10 millones

Buena

Buena a regular

Mala

D.2 Reduccin de resazurina D.2.1 FUNDAMENTO Cuando se aade una pequea cantidad de resazurina a la leche y la mezcla se incuba a 37 C, se produce una decoloracin debida al metabolismo bacteriano; la velocidad a la que se produce el cambio de color es directamente proporcional al nmero de grmenes presentes. La reduccin pasa por una serie de etapas intermedias caracterizadas por diferentes coloraciones: azul, violeta, malva, rosa-violeta, malva-rosa y rosa, hasta la transformacin de la resazurina en resofurina; en este momento la reaccin es irreversible por la accin del oxgeno. La reduccin contina con una ltima modificacin que implica una decoloracin completa; la resofurina se transforma en dihidro-.resofurina incolora, que por la accin del oxgeno atmosfrico vuelve a tomar color rosa. NOTA - Las clulas somticas presentes en la muestra de leche tambin reducen el colorante;

por ste motivo se ha recomendado esta reaccin para el diagnstico rpido de mastitis. D.2.2 MATERIALES Y REACTIVOS

39


D.2.2.1 Tubos calibrados de 10 mL con tapn estriles D.2.2.2 Pipetas graduadas de 10 mL estriles D.2.2.3 Frascos color mbar con tapn de rosca de 200 mL estriles D.2.2.4 Solucin estndar de resazurina D.2.2.4.1 Aadir 0,1 g de resazurina en polvo a 200 mL de agua destilada, mezclar y calentar en bao de agua hirviendo durante una media hora; se lleva de nuevo el volumen a 200 mL y se conserva a 4 C en frasco de vidrio hermticamente cerrado. En el momento del empleo, preparar la solucin de trabajo, diluyendo la cantidad necesaria de solucin estndar con agua destilada estril en proporcin 1/10. NOTA - Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras de leche por

analizarse deben esterilizarse mediante:

Horno, durante 2 horas a 170 - 175 C 1 hora a 180 C Autoclave, durante 15 minutos como mnimo a 121 C + 1 C

D.2.3 EQUIPO D.2.3.1 Bao con circulacin mecnica a 37 C D.2.3.2 Disco comparador Lovibond D.2.4 PROCEDIMIENTO Colocar de manera asptica 10 mL de la muestra de leche por analizar en un tubo estril y aadir de igual forma 1 mL de la solucin de resazurina (solucin de trabajo). Cerrar el tubo con el tapn e invertir el tubo una o dos veces para mezclar la leche con el colorante. Incubar a 37 C en bao de agua, cuidando que el nivel del agua del bao sobrepase el de la mezcla de leche contenida en el tubo. Registrar con precisin la hora de la inmersin e incubar por 1 hora. Sacan los tubos del bao y leer en el comparador Lovibond como se indica a continuacin: Se coloca en el compartimiento de la izquierda del comparador un tubo con la leche analizada sin el colorante (prueba en blanco); el que contiene el reactivo y acaba de salir del bao de agua, se coloca a la derecha. Desplazando el disco con los colores patrn, se define el color del tubo de la reaccin. D.2.5 INTERPRETACIN DE RESULTADOS Despus de una hora de incubacin a 37 C:

40


Coloracin de la leche Calidad de la leche Azul (disco 6)

Violeta (disco 5) Malva (disco 4)

Buena

Rosa Violeta (disco 3) Malva Rosa (disco 2)

Rosa (disco 1)

Regular

Decoloracin total Mala

APNDICE INFORMATIVO E Listado de Normas Mexicanas que describen mtodos de prueba rpidos

aplicables a leche cruda de vaca

41


42

- NMX-F-705-COFOCALEC-2004 Sistema Producto Leche - Alimentos

Lcteos Determinacin de la cuenta total bacteriana, en leche cruda, por citometra de flujo Mtodo de prueba, declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 30 de noviembre de 2004.

- NMX-F-706-COFOCALEC-2004 Sistema Producto Leche - Alimentos

Lcteos Determinacin de la cuenta de clulas somticas, en leche cruda, por citometra de flujo Mtodo de prueba, declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 30 de noviembre de 2004.

- NMX-F-708-COFOCALEC-2004 Sistema Producto Leche Alimentos

Lcteos Determinacin de grasa, protena, lactosa, slidos no grasos y slidos totales, en leche cruda, por espectroscopia de infrarrojo Mtodo de prueba, declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 01 de marzo de 2005.


Lcteos Anlisis microbiolgicos de leche y derivados Mtodos de prueba rpidos, declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 25 de mayo de 2006.


Lcteos Determinacin de inhibidores bacterianos en leche Mtodos de prueba rpidos, , declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 16 de febrero de 2009.

Apndice Informativo D - Evaluacin de la calidad microbiolgica de la leche por pruebas de reduccin de colorantesApndice Informativo E Listado de Normas Mexicanas que describen mtodos de prueba rpidos aplicables a leche cruda de vacaTABLA 1. Especificaciones fisicoqumicas para leche cruda de vaca.TABLA 2. Especificaciones sanitarias para leche cruda de vaca.

A.1. Prueba del alcohol al 72 % v/vApndice Informativo D Evaluacin de la calidad microbiolgica de la leche por pruebas de reduccin de colorantes.

Apndice Informativo E Listado de Normas Mexicanas que describen mtodos de prueba rpidos aplicables a leche cruda de vaca

Documents

PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012 110212 (1).pdf