Präparation und Kristallisation von ribosomalen Proteinen ... · Wasser gefüllten Kanal. Auf cyto- und karyoplasmatischer Seite wird die zentrale Domäne Auf cyto- und karyoplasmatischer

Präparation und Kristallisation von

ribosomalen Proteinen mit dem

Kernimportfaktor Importin 7

Diplomarbeit

vorgelegt von

Christian Schiller

aus

Kassel

angefertigt

im Institut für Mikrobiologie und Genetik an der Biologischen Fakultät

der Georg-August-Universität zu Göttingen

2006

Referent: Prof. Dr. Ralf Ficner

Korreferent: Prof. Dr. Oliver Einsle

Tag der Abgabe der Diplomarbeit: 29. Juni 2006

Letzter Tag der mündlichen Diplomprüfung: 6. Juli 2005

Hiermit erkläre ich, dass die vorliegende Diplomarbeit „Präparation und Kristallisation

von ribosomalen Proteinen mit dem Kernimportfaktor Importin 7“ selbstständig verfasst

und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt wurden.

Göttingen, den 29. Juni 2006

Inhaltsverzeichnis

III

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG ....................................................................................................................................1

1.1 DER ZELLKERN..........................................................................................................................1

1.2 GRUNDLAGEN DES KERNTRANSPORTS......................................................................................1

1.2.1 DER KERNPORENKOMPLEX.....................................................................................................1

1.2.2 REZEPTOREN DER IMPORTIN ß/ß-KARYOPHERIN-SUPERFAMILIE ...........................................3

1.2.3 KARYOPHERIN-VERMITTELTER KERNIMPORT........................................................................5

1.2.4 DAS RANGTP-SYSTEM...........................................................................................................6

1.3 KERNIMPORT DER RIBOSOMALEN PROTEINE L5 UND L23A.....................................................7

1.3.1 BIOCHEMISCHE DATEN ZU RPL5 ............................................................................................7

1.3.2 BIOCHEMISCHE DATEN ZU RPL23A AUS HOMO SAPIENS........................................................9

1.3.3 KARYOPHERIN-VERMITTELTER KERNIMPORT VON RPL5 UND RPL23A .................................9

1.3.4 RIBOSOMALE BIOGENESE.....................................................................................................11

1.3.5 FUNKTIONELLE ROLLE VON RPL5 BEI TRANSPORTPROZESSEN DER 5S RNA......................12

1.4 AUFGABENSTELLUNG UND ZIELSETZUNG ..............................................................................14

2 MATERIAL UND METHODEN............................................................................................15

2.1 MATERIAL................................................................................................................................15

2.1.1 FEINCHEMIKALIEN ................................................................................................................15

2.1.2 GERÄTE.................................................................................................................................15

2.1.3 KIT-SYSTEME........................................................................................................................17

2.1.4 ORGANISMEN........................................................................................................................17

2.1.5 PLASMIDE..............................................................................................................................17

2.1.6 ENZYME UND INHIBITOREN ..................................................................................................18

2.1.7 GRÖßENSTANDARDS.............................................................................................................18

2.1.8 DNA-OLIGONUKLEOTIDE.....................................................................................................19

2.1.9 KRISTALLISATIONSSCREENS.................................................................................................20

2.1.10 COMPUTERPROGRAMME.....................................................................................................20

2.2 METHODEN..............................................................................................................................21

2.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN................................................................................21

2.2.1.1 Nukleinsäurebiochemische Methoden...............................................................................21

2.2.1.1.1 Polymerase-Kettenreaktion.............................................................................................21

2.2.1.1.2 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen ...................................................23

2.2.1.1.3 DNA-Dephosphorylierung am 5´-Ende..........................................................................23

Inhaltsverzeichnis

IV

2.2.1.1.4 DNA-Ligation.................................................................................................................24

2.2.1.1.5 DNA-Sequenzierung.......................................................................................................24

2.2.1.1.6 Agarosegelelektrophorese...............................................................................................26

2.2.1.1.7 Visualisierung von Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid ................................................26

2.2.1.1.8 DNA-Isolierung aus Agarosegelen.................................................................................27

2.2.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN............................................................................................27

2.2.2.1 Transformation chemisch kompetenter Zellen ..................................................................27

2.2.2.2 Präparation von Plasmid-DNA..........................................................................................28

2.2.2.3 Expression rekombinanter Proteine...................................................................................28

2.2.2.3.1 Expression rekombinanter Proteine in Escherichia coli im kleinen Maßstab ................28

2.2.2.3.2 Überexpression von rekombinanten Proteinen in Escherichia coli................................29

2.2.2.3.3 Ernte und Aufschluss einer Expressionskultur ...............................................................29

2.2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN....................................................................................31

2.2.3.1 Einengen von Proteinlösungen durch Zentrifugation ........................................................31

2.2.3.2 Aufbereitung von Zellproben für eine SDS-PAGE ...........................................................31

2.2.3.3 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen..................................31

2.2.3.4 Visualisierung von Proteinen durch Coomassie Brilliant Blue.........................................33

2.2.3.5 Proteolytische Spaltung von GST-Fusionsproteinen.........................................................33

2.2.4 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN...................................................................................34

2.2.4.1 Affinitätschromatographische Reinigung von GST-Fusionsproteinen..............................34

2.2.4.2 Affinitätschromatographische Reinigung über Ni+-NTA-Sepharose ................................35

2.2.4.3 Kationenaustauschchromatographie über SP-Sepharose...................................................36

2.2.4.4 Ausschlusschromatograpisches Umäquilibrieren von Proteinen.......................................37

2.2.4.5 Präparative Ausschlusschromatographie von Proteinen....................................................38

2.2.4.6 Analytische Ausschlusschromatographie von Proteinen...................................................39

2.2.4.7 Kalibrierung einer Auschlusschromatographiesäule .........................................................40

2.2.5 ISOTHERME TITRATIONSKALORIMETRIE ..............................................................................40

2.2.6 SPEKTROSKOPISCHE METHODEN..........................................................................................42

2.2.6.1 Absorption .........................................................................................................................42

2.2.6.1.1 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäure-Lösungen..............................................43

2.2.6.1.2 Konzentrationsbestimmung von Protein-Lösungen........................................................43

2.2.7 KRISTALLOGRAPHISCHE METHODEN...................................................................................45

2.2.7.1 Kristallisation von Proteinen .............................................................................................45

2.2.7.2 Micro-Seeding zur Verbesserung der Kristallordnung ......................................................47

Inhaltsverzeichnis

V

3 ERGEBNISSE...........................................................................................................................48

3.1 BIOCHEMISCHE ARBEITEN MIT DEM PROTEIN RPL5 AUS XENOPUS LAEVIS .........................49

3.1.1 KLONIERUNG UND EXPRESSION VON RPL5 ..........................................................................49

3.1.1.1 Subklonierung von rpL5 aus Xenopus laevis in den Vektor pGEX-6P-1..........................49

3.1.1.2 Expression von rpL5 mit GST-Affinitätssequenz..............................................................49

3.1.1.3 Zellernte und Aufschluss von GST-rpL5...........................................................................50

3.1.2 REINIGUNG VON RPL5 AUS XENOPUS LAEVIS........................................................................51

3.1.2.1 Affinitätschromatographische Reinigung über Glutathion-Sepharose ..............................51

3.1.2.2 Spaltung des Fusionsproteins GST-rpL5 durch PreScission Protease...............................52

3.1.2.3 Kationenaustauschchromatographische Reinigung von rpL5 ...........................................53

3.1.2.4 Finales Umpuffern von rpL5 .............................................................................................54

3.1.2.5 Ausschlusschromatographische Analyse des gereinigten rpL5.........................................56

3.1.3 KRISTALLISATIONSVERSUCHE MIT DEM KOMPLEX IMP7/RPL5............................................58

3.1.3.1 Präparation eines Komplexes aus rpL5 und Importin 7.....................................................58

3.1.3.2 Versuch einer Kristallisation des Imp7/rpL5-Komplexes .................................................59

3.1.4 KLONIERUNG VERKÜRZTER FRAGMENTE VON RPL5............................................................60

3.2 BIOCHEMISCHE ARBEITEN MIT DEM PROTEIN RPL23A AUS HOMO SAPIENS ........................62

3.2.1 EXPRESSION, ZELLERNTE UND AUFSCHLUSS VON RPL23A ..................................................62

3.2.1.1 Subklonierungen von rpL23a in die Vektoren pGEX-6P-1 und pQE80 ...........................62

3.2.1.2 Expression von rpL23a......................................................................................................63

3.2.1.3 Zellernte und Aufschluss der Expressionskulturen............................................................64

3.2.2 REINIGUNG VON RPL23A AUS HOMO SAPIENS......................................................................64

3.2.2.1 Versuch einer Reinigung von rpL23a mit Deca-Histidin-Sequenz ...................................64


3.2.2.3 Kationenaustauschchromatographische Reinigung von rpL23a........................................67

3.2.2.4 Finales Umpuffern von rpL23a..........................................................................................69

3.2.2.5 Ausschlusschromatographische Analyse des gereinigten rpL23a .....................................70

3.2.3 KRISTALLISATIONSVERSUCHE MIT DEM KOMPLEX IMP7/RPL23A .......................................71

3.2.3.1 Präparation eines Komplexes aus rpL23a und Importin 7.................................................71

3.2.3.2 Kristallisationsversuche mit Imp7/rpL23a.........................................................................73

3.2.4 FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN DER BINDUNG VON RPL23A DURCH

KERNIMPORTREZEPTOREN................................................................................................................74

3.2.4.1 Kartierung der Importin ß-Bindedomäne von rpL23a.......................................................74

3.2.4.1.1 Kartierung durch analytische Ausschlusschromatographie ............................................74

3.2.4.1.2 Kartierung durch isotherme Titrationskalorimetrie ........................................................76

Inhaltsverzeichnis

VI

3.2.4.2 Funktionelle Untersuchung der Bindung von rpL23a und Importin 7 ..............................79

3.2.5 PRÄPARATION DER BIB-DOMÄNE VON RPL23A...................................................................80

3.2.5.1 Klonierung der BIB-Domäne in den Vektor pGEX-6P-1..................................................81

3.2.5.2 Expression, Zellernte und Aufschluss ...............................................................................81


3.2.5.4 Ausschlusschromatographische Reinigung der BIB-Domäne...........................................82

3.2.5.5 Komplexpräparationen von rpL23aBIB und den Kernimportrezeptoren Imp7 und Impß 83

3.2.5.6 Versuch einer Ko-Kristallisation der BIB-Domäne mit Imp7 und Impß...........................85

4 DISKUSSION............................................................................................................................87

4.1 BIOCHEMISCHE ARBEITEN MIT RPL23A.................................................................................88

4.1.1 PRÄPARATION VON RPL23A UND RPL23ABIB .....................................................................88

4.1.2 KRISTALLISATIONSVERSUCHE FÜR KOMPLEXE MIT RPL23A UND RPL23ABIB ...................89

4.1.3 CHARAKTERISIERUNG DER BINDUNG VON IMPß AN RPL23A ...............................................91

4.1.4 FUNKTIONELLE ARBEITEN MIT IMP7 UND RPL23A...............................................................97

4.2 BIOCHEMISCHE ARBEITEN MIT RPL5.....................................................................................99

4.2.1 PRÄPARATION VON RPL5......................................................................................................99

4.2.2 KRISTALLISATIONSVERSUCHE MIT IMP7/RPL5 UND RPL5..................................................100

4.2.3 DIE ROLLE VON IMPORTREZEPTOREN BEI IMPORTPROZESSEN MIT RPL5...........................101

5 ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................................105

6 SUMMARY ..............................................................................................................................106

7 LITERATURVERZEICHNIS...............................................................................................107

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..........................................................................................116

9 DANKSAGUNG .....................................................................................................................119

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1 Der Zellkern

Der Zellkern enthält fast die gesamte genetische Information einer eukaroytischen Zelle

und ist der Ort ihrer Replikation und Transkription. Gegen das Cytoplasma ist der Zellkern

durch eine zweischichtige Kernmembran abgegrenzt. Diese Kompartimentierung

ermöglicht eukaroytischen Zellen differenziertere Stoffwechselvorgänge, als dies in

prokaryotischen Zellen möglich wäre, erfordert aber auch die Existenz komplexer

Transportmechanismen für den geregelten Stoffaustausch zwischen den Kompartimenten.

So sind in eukaryotischen Zellen Transkription und Translation räumlich und zeitlich

voneinander getrennt. Die mRNA muss aus dem Zellkern in das Cytoplasma zum Ort der

Proteinbiosynthese, den Ribosomen, exportiert werden. Diese bestehen aus verschiedenen

rRNAs und Proteinen. Die Biogenese der ribosomalen Untereinheiten findet zu großen

Teilen in den Nukleoli des Zellkerns statt und erfordert daher wiederum einen spezifischen

Import der im Cytoplasma synthetisierten ribosomalen Proteine. Ebenso ist für die

ribosomale Biogenese eine genaue Modulation der Transkription nötig, was den Import

von Transkriptionsfaktoren beinhaltet.

Der Zellkern benötigt darüber hinaus eine Vielzahl weiterer Moleküle wie z.B. die

Proteine des Replikations- und Transkriptionsapparates oder die verschiedenen

Untereinheiten der Nukleosome. Diese und weitere Transportprozesse werden in

eukaryotischen Zellen durch eine äußerst komplexe, spezifische und hoch regulierte

Transportmaschinerie vermittelt.

1.2 Grundlagen des Kerntransports

1.2.1 Der Kernporenkomplex

Der Stoffaustausch zwischen Zellkern und Cytoplasma wird durch einen Porenkomplex

(nuclear pore complex – NPC) vermittelt, der in die Doppelmembran des Zellkerns

eingebettet ist. Eine proliferierende somatische Zelle besitzt etwa 3000 bis 4000

Einleitung

2

Kernporen (Görlich und Kutay, 1999) und an jeder Kernpore können Hunderte von

Transportprozessen pro Minute stattfinden (Görlich und Mattaj, 1996). Der NPC von

Vertebraten hat eine ungefähre molekulare Masse von 125 MDa (Reichelt et al., 1990) und

besteht aus cirka 30 verschiedenen Proteinen, die Nukleoporine (Nups) genannt werden.

Einige dieser Nukleoporine liegen als Kopien in einer Anzahl vor, die dem Vielfachen der

Zahl 8 entspricht (Cronshaw et al., 2002).

Die Struktur des NPC ist zwischen Vertebraten und Hefen konserviert und weist eine

achtzählige Rotationssymmetrie auf (Stoffler et al., 1999). Abbildung 1 zeigt eine

schematische Darstellung der Architektur. Die zentrale Domäne des NPC bildet einen mit

Wasser gefüllten Kanal. Auf cyto- und karyoplasmatischer Seite wird die zentrale Domäne

von zwei Ringstrukturen flankiert. Sowohl in das Cyto- als auch das Karyoplasma

erstrecken sich jeweils acht symmetrisch angeordnete Filamente, die an den

Ringstrukturen verankert sind. Die cytoplasmatischen Filamente sind parallel zueinander

positioniert. Die karyoplasmatischen Filamente laufen dagegen speichenförmig zusammen

und bilden eine korbähnliche Struktur, den nuclear basket (Kisseleva et al., 2000).

Abbildung 1 (A) Dreidimensionales Modell des NPC. Der Kernporenkomplex bildet eine 8-fache Rotationssymmetrie. Die Beschriftung zeigt die Lokalisation wichtiger Nukleoporine. (B) Schematische Darstellung des Kernporenkomplexes. Dieser vertikale Querschnitt zeigt den prinzipiellen Aufbau des NPC aus den einzelnen Komponenten (Abb. aus Allen et al., 2000)

Die Translokation von Substraten durch den NPC erfolgt auf unterschiedliche Weisen.

Niedermolekulare Substanzen und einige kleinere Proteine können die Kernpore passiv

durch Diffusion passieren. Der Transport der meisten Proteine und RNAs wird jedoch

Einleitung

3

signalabhängig über spezifische Transportrezeptoren vermittelt. Mittlerweile sind

allerdings auch Transportsubstrate wie der Transkriptionsfaktor PU.1 bekannt, die durch

direkte Interaktion mit dem NPC transloziert werden (Zhong et al., 2005).

Ein Drittel der identifizierten Nukleoporine bei Vertebraten und Hefen besitzt eine Reihe

seriell angeordneter Domänen mit den Aminosäuremotiven FXFG oder GLFG (engl. FG-

repeats) (Doye und Hurt, 1997; Chook und Blobel, 2001). Diese FG-repeats-tragenden

Nukleoporine interagieren im Verlaufe der Translokation spezifisch mit Transport-

rezeptoren (Bednenko et al., 2003). Es existieren verschiedene Modelle, die den

rezeptorvermittelten Kerntransport durch den NPC beschreiben. Ein Modell geht z.B. von

einer Translokation durch nacheinander folgende Bindungen des Rezeptors an FG-repeats

entlang eines ansteigenden Affinitätsgradienten aus (Ben-Efraim und Gerace, 2001).

1.2.2 Rezeptoren der Importin ß/ß-Karyopherin-Superfamilie

Die in dieser Diplomarbeit untersuchten Importrezeptoren Importin 7 (Imp7) und

Importin ß (Impß) gehören zur Importin-ß/ß-Karyopherin-Superfamilie (kurz

Karyopherine). Der Kerntransport der meisten bekannten Transportsubstrate wird durch

Mitglieder dieser Rezeptor-Superfamilie vermittelt (Weis, 2003).

Bis heute wurden 20 verschiedene Karyopherine von Homo sapiens und 14 von

Saccharomyces cerevisae identifiziert. Die Zahl der Import-spezifischen Rezeptoren

überwiegt dabei. So sind bei S. cerevisae 10 Karyopherine auf Import und drei auf

Exportprozesse beschränkt. Nur von dem Rezeptor Msn5 sind sowohl Import- als auch

Exportfunktionen bekannt. (Mosammaparast et al., 2004).

Karyopherine sind relativ große Proteine (95-145 kDa) mit einem isoelektrischen Punkt im

sauren Bereich und ähnlicher Domänenstruktur (Mosammaparast et al., 2004; Fried und

Kutay, 2003; Weis, 2003) Sie besitzen eine N-terminale Ran-Bindestelle, eine oder

mehrere Nukleoporin-Bindestellen sowie eine oder mehrere Substratbindestellen

(Cingolani et al., 2002; Conti, 2002; Chook und Blobel, 2001; Görlich und Kutay, 1999).

Ihre prinzipielle Architektur besteht aus einer Reihe von tandemartig angeordneten

Sekundärstrukturmotiven, den so genannten HEAT-repeats (von „Huntingtin-elongation-

A-subunit-TOR“). Jeder HEAT-repeat ist aus zwei, durch eine Schleife miteinander

Einleitung

4

verbundene, antiparallele α-Helices (A und B) aufgebaut. Benachbarte HEAT-repeats sind

gegeneinander relativ beweglich, und so angeordnet, dass Importin-ß-Superfamilien-

proteine eine flexible superhelicale Tertiärstruktur besitzen (Cingolani et al., 1999;

Fukuhara et al., 2004).

Verschiedene Komplexstrukturen von Impß zeigen, dass die B-Helices hier mehr auf der

konkaven, inneren Seite des Rezeptors liegen und in die Bindung verschiedener Substrate

wie z.B. PTHrP (parathyroid hormone-related protein) und RanGTP involviert sind. Die

A-Helices sind mehrheitlich auf der konvexen äußeren Seite lokalisiert und interagieren

mit den Nukleoporinen des NPC (siehe Abbildung 2) (Cingolani et al., 2002; Conti et al.,

2006).

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Domänenorganisation von Impß. Jeder HEAT-repeat wird in Form von zwei Kreisen symbolisiert, die jeweils für A- und B-Helix stehen. Eingezeichnet sind die an den A-Helices lokalisierten Bindeseiten von RanGTP, PTHrP und der IBB-Domäne von Imp� sowie die auf der Seite der B-Helices gelegene Nukleoporin-Bindeseite (Abb. aus Cingolani et al., 2002).

Ihre Flexibilität verleiht den Karyopherinen die Fähigkeit zu großen Änderungen der

Konformation und ermöglicht ihnen damit, eine Vielzahl unterschiedlicher Importsubstrate

jeweils spezifisch über einen induced-fit-Mechanismus zu binden (Conti et al., 2006; Lee

et al., 2005; Matsuura und Stewart, 2004; Fukuhara et al., 2004; Cingolani et al., 1999). In

Abbildung 3 sind verschiedene Strukturen von Impß allein bzw. im Komplex mit

Bindungspartnern dargestellt. Während ungebundenes Impß in einer relativ gestreckten

Form mit niedriger superhelicaler Windungszahl vorliegt, nimmt es je nach Bindungs-

partner verschiedene kompaktere Konformationen an.

.

Einleitung

5

Abbildung 3: Strukturelle Flexibilität von Karyopherinen am Beispiel von Impß. v.l.n.r.: Struktur von freiem Impß auf Basis von small-angle X-ray scattering (SAXS) (Fukuhara et al., 2004). Desweiteren sind die Kristallstrukturen der Komplexe Impß-Ran (Lee et al. 2005), Impß-SREBP-2 (Lee et al., 2003), Impß-Nup1p (Liu und Stewart, 2005) und Impß-IBB� (Cingolani et al., 1999) abgebildet (Abbildung aus Conti et al., 2006).

1.2.3 Karyopherin-vermittelter Kernimport

Die Fähigkeit der Kerntransportmaschinerie, eine Vielzahl von chemisch unterschiedlichen

Substraten spezifisch zu translozieren, wurde durch die Entwicklung verschiedener

Mechanismen erreicht. Zum einen sind Transportrezeptoren aufgrund ihrer strukturellen

Flexibilität in der Lage, eine Vielzahl verschiedener Substrate zu binden. Zum anderen

wurden im Laufe der Evolution unterschiedliche Mechanismen des Kerntransports

entwickelt. Bis zum heutigen Zeitpunkt sind drei verschiedene prinzipielle Import-

mechanismen von Karyopherinen bekannt:

1. Der Ein-Rezeptor-Weg: Hierbei bindet ein einzelner Import- oder Exportrezeptor das

Substrat und vermittelt die Translokation durch den NPC. Ein Beispiel hierfür ist der

Import der ribosomalen Proteine L5 und L23a (Rout et al., 1997; Jäkel und Görlich, 1998).

2. Der Ein-Rezeptor-Ein-Adapter-Weg: Ein Transportrezeptor bindet das Substrat und

fungiert anschließend als Adapter für einen zweiten Transportrezeptor, der den

eigentlichen Transport durch den NPC vermittelt. Ein bekanntes Beispiel ist der Import

von Substraten mit klassischer Kernlokalisationssequenz (engl. nuclear localisation signal

– kurz NLS) durch das Impα/Impß-Heterodimer (Adam et al., 1994; Moroianu et al., 1995)

3. Der Zwei-Rezeptoren-Ein-Substrat-Weg: Der Transport des Substrates wird durch ein

zuvor gebildetes Heterodimer aus zwei verschiedenen Rezeptoren vermittelt. Ein Beispiel

ist der Import des Linker-Histons H1 durch das Impα/Imp7-Heterodimer (Jäkel et al.,

1999; Bäuerle et al., 2002).

Einleitung

6

Bei allen beschriebenen Importmechanismen erfolgt die Bindung des Substrats durch den

oder die Rezeptoren im Cytoplasma, gefolgt von einer rezeptorvermittelten Translokation

durch den Zentralkanal des NPC. Die Freilassung des Substrats am nuclear basket des

NPC oder im Karyoplasma beinhaltet die Bindung von RanGTP und / oder die Beteiligung

weiterer karyoplasmatischer Faktoren.

1.2.4 Das RanGTP-System

Eine Schlüsselrolle bei Karyopherin-vermittelten Import- oder Exportprozessen spielt der

Zyklus der kleinen ras-verwandten GTPase Ran. Dieses System bestimmt die

Direktionalität von Transportprozessen und stellt durch Hydrolyse von GTP die benötigte

Energie zur Verfügung. (Nigg et al., 1999; Melchior et al., 1993; Moore und Blobel, 1993;

Drivas et al., 1990).

Ran kann durch seine GTPase-Domäne gebundenes GTP zu GDP hydrolysieren. Die

Verteilung von GDP- bzw. GTP-gebundenem Ran innerhalb der verschiedenen

Kompartimente von eukaryotischen Zellen ist nicht homogen. Vielmehr besteht ein

RanGTP/GDP-Gradient zwischen Zellkern und Cytoplasma. So ist die Ran-GTP-

Konzentration im Kern hoch und im Cytoplasma niedrig. Genau entgegengesetzt hierzu

verhält sich der Gradient der RanGDP-Konzentration zwischen beiden Kompartimenten.

(Melchior et al., 1993; Moore und Blobel, 1993; Görlich et al., 1996 b). Erzeugt wird

dieser Gradient durch eine Reihe von regulatorischen Proteinen mit ebenfalls

kompartimentierter Verteilung. RanGTP wir durch verschiedene Karyopherine aus dem

Kern exportiert. Im Cytoplasma erfolgt die Hydrolyse von RanGTP zu RanGDP. Dabei

wird die intrinsische GTPase-Aktivität von Ran durch ein Zusammenspiel der Proteine

RanGAP1 (Ran-GTPase-activating-protein) sowie RanBP1 (Ran-binding-protein) und

RanBP2 erheblich gesteigert (Bischoff et al., 1994, 1995; Yokoyama et al., 1995; Seewald

et al., 2002). Der Transport von freiem RanGTP in den Kern wird durch den Rezeptor

NTF2 vermittelt (Moore und Blobel, 1994; Paschal und Gerace, 1995; Smith et al., 1998;

Ribbeck et al., 1998). Im Kern erfolgt dann der Nukleotidaustausch von Ran-gebundenem

GDP gegen GTP durch den Austauschfaktor RanGEF (früherRCC1) (Bischoff und

Postingl, 1991, 1995).

Einleitung

7

Abbildung 4: Schematische Darstellung des Ran-Zyklus. Ran wechselt zwischen einer GDP- und einer GTP-gebundenen Form und zirkuliert zwischen dem Nukleus und dem Cytoplasma. RCC1 katalysiert den Nukleotidaustausch im Karyoplasma (aus Görlich et al., 2003). Der Export erfolgt nach der Bindung an Importrezeptoren oder Exportkomplexe. Die Hydrolyse von RanGTP zu RanGDP erfolgt entweder durch direkte Interaktion von RanGAP oder durch vorheriges Binden von RanBP1. Der Zyklus wird durch den Import von RanGDP durch NTF2 vollendet (Abb. aus Görlich et al., 2003).

1.3 Kernimport der ribosomalen Proteine L5 und L23a

Die beiden ribosomalen Proteine rpL5 und rpL23a sind Transortsubstrate der Import-

rezeptoren Imp7 und Impß. Beide ribosomalen Proteine besitzen gemeinsame

Eigenschaften, wie eine z.B. eine hohe Basizität und die Fähigkeit RNA zu komplexieren.

Sie unterscheiden sich jedoch in strukturellen und funktionellen Eigenschaften.

1.3.1 Biochemische Daten zu rpL5

Das ribosomale Protein rpL5 aus X. laevis besitzt drei verschiedene, räumlich

unterschiedliche und unabhängig voneinander funktionelle Kernlokalisationssequenzen

(NLS) (Claußen et al., 1999; Rudt und Pieler, 2002). In Abbildung 5 ist eine Kartierung

der bekannten Transportsignale von rpL5 dargestellt:

Einleitung

8

NLS-1 (AS 1-25): Diese N-terminale NLS umfasst die ersten 25 Aminosäuren von L5.

Die Sequenz ähnelt dem klassischen, von Nucleoplasmin bekannten bpNLS (bipartite

NLS) (Robbins et al., 1991). Hierbei sind zwei kurze basische Sequenzen durch eine

sogenannte „Spacer-Region“ getrennt. Innerhalb desselben Sequenzabschnitts liegt auch

Kernexportsignal (NES), das eine physiologische Rolle beim Export von rpL5 im

Komplex mit 5S rRNA als 5S Ribonucleoprotein (RNP) spielt (Murdoch et al., 2002).

NLS-2 (AS 32-253): Dieses Signal umfasst Sequenzelemente, die über die Aminosäure-

sequenz verstreut sind. Es gehört daher zu keiner bekannten Klasse von NLS-Konsensus-

sequenzen.

NLS-3 (AS 261-285): Die C-terminale NLS ähnelt ebenfalls dem von Nucleoplasmin

bekannten bpNLS.

Abbildung 5: Kartierung der verschiedenen Import und Exportsignale von L5: NLS-1 /NES (AS 1-25, blau), NLS-2 (AS 32-253, gelb), NLS-3(AS 261-285, rot) (Kartierung nach Claußen et al., 1999; Rout und Pieler, 2001; Murdoch et al., 2002).

Nur NLS-1 und NLS-3 sind in der Lage den Import eines 5S RNPs zu vermitteln. Die

Bindung von 5S rRNA erfordert sowohl N- als auch C-terminale Reste (AS 17-296).

Möglicherweise wird NLS-2 durch die gebundene RNA maskiert. NLS-1 ist in vitro in der

Lage, die Karyopherine Importin α, Importin ß, Importin 7 oder Transportin zu binden.

Die funktionellen Importrezeptoren von NLS-2 und NLS-3 sind unbekannt (Claußen et al.,

1999). Der Import von rpL5 über NLS-1 und NLS-2 ist Ran-abhängig (Rudt und Pieler,

2001). Daher ist eine Beteiligung von Karyopherinen an NLS-2 involvierenden

Importprozessen wahrscheinlich. Der Import von rpL5 über NLS-3 ist unabhängig von

RanGTP und bekannten Importrezeptoren, kann jedoch bei in vitro Import-Assays durch

Energiedepletion inhibiert werden (Rudt und Pieler, 2001).

Einleitung

9

1.3.2 Biochemische Daten zu rpL23a aus Homo sapiens

rpL23a gehört zur Gruppe I der ribosomalen Proteine (Wool et al., 1995). Es hat eine

Länge von 156 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 17,7 kDa. Das Protein ist

äußerst basisch und enthält 30 Lysin- und 11 Arginin-Reste. Der mit dem Programm

ProtParam berechnete theoretische isoelektrische Punkt liegt bei pH 10,44.

Das humane L23a ist ein Ortholog der ribosomalen Proteine L25 aus S. cerevisae, L23 bei

dem Archaeon Methanococcus vannielii und L23 bei dem Eubakterium E. coli. (Suzuki

und Wool, 1993; McIntosh und Bonham-Smith, 2001) In der Kristallstruktur der großen

ribosomalen Untereinheit von Haloarcula marismortui (Auflösungsgrenze 2.4 Å)

interagiert L23 mit den Domänen I und III der 23S rRNA (Ban et al., 2002).

rpL23a besitzt eine Kernlokalisationssequenz, welche die Aminosäurereste 32-74 umfasst

und BIB-Domäne (für beta-like import receptor binding domain) genannt wird. Alle bisher

als funktionell charakterisierten Importrezeptoren binden diese NLS (Jäkel und Görlich,

1998). Die BIB-Domäne ist äußerst basisch mit einem berechneten pI von 12,2 und einer

Nettoladung von +18. Im Vergleich zu den klassischen SV40-Typ-NLS (Kalderon et al.,

1984) oder bpNLS (Robbins et al., 1991) zeigt die BIB-Domäne einen komplexeren

Aufbau.

1.3.3 Karyopherin-vermittelter Kernimport von rpL5 und rp L23a

Sowohl rpL23a als auch rpL5 können durch verschiedene Mitglieder der Importin ß-

Superfamilie in den importiert werden. So konnte durch in vitro Import-Assays der Import

beider Proteine durch die Transportrezeptoren Impß, Imp7, Imp5 und Transportin

nachgewiesen werden (Jäkel und Görlich, 1998). Der Mechanismus entspricht dem Ein-

Rezeptor-Weg (vgl. 1.2.3). Abbildung 6 zeigt eine schematische Darstellung eines solchen

Importweges für den Transportrezeptor Imp7:

Einleitung

10

Abbildung 6: Modell eines Ein-Rezeptor-Imports mit Imp7. rpL5 oder rpL23a (hier cargo genannt) werden im Cytoplasma durch Imp7 gebunden. Nach der Translokation durch den NPC erfolgt die Dissoziation des Importkomplexes durch Bindung von RanGTP an Imp7 (Abbildung mit freundlicher Genehmigung entliehen von D. Wohlwend, Model nach Jäkel und Görlich, 1998).

Neben ihrer Importfunktion erfüllen die Importrezeptoren von ribosomalen Proteinen auch

noch eine chaperonartige Schutzfunktion. Viele ribosomale Proteine besitzen große

basische Oberflächen, die z.B. eine funktionelle Rolle bei der Bindung von rRNA oder

Transportrezeptoren spielen. Sie sind daher aber auch in der Lage, unspezifische

Komplexe mit Nukleinsäuren zu bilden (siehe hierzu Abbildung 7) (Jäkel und Görlich,

2002).

Abbildung 7: Schematische Illustration des basischen Chaperonproblems. Basische ribosomale Proteine (rot dargestellt) können durch multivalente ionische Interaktionen große Aggregate mit Polyanionen wie z.B. Nukleinsäuren formen (aus Jäkel und Görlich, 2002).

Einleitung

11

Importrezeptoren können durch spezifische Bindung große Teile dieser basischen

Oberflächen von der Umgebung abschirmen. Diese chaperonartige Schutzfunktion

verhindert die unspezifische Aggregation von ribosomalen Proteinen mit Polyanionen wie

z.B. Nukleinsäuren (Jäkel und Görlich, 2002).

1.3.4 Ribosomale Biogenese

Der Import von ribosomalen Proteinen wie L5 oder L23a ist ein Bestandteil der Biogenese

von Ribosomen. Dieser Prozess findet bei Eukaryoten zu einem großen Teil in einer

definierten Substruktur des Zellkerns, dem Nukleolus, statt.

Der Nukleolus ist aus verschiedenen Substrukturen aufgebaut: der dichten fibrillären

Komponente (DFC), der granulären Komponente (GC) und dem fibrillären Zentrum (FC).

Frühe Prozessierungsschritte der ribosomalen Biogenese finden im DFC statt (Milkereit et

al., 2001), bevor die prä-ribosomalen Partikel zunächst zur granulären Komponente und

schließlich ins Karyoplasma transportiert werden. Von hier werden die ribsomalen

Untereinheiten schließlich durch die Kernpore ins Cytoplasma exportiert (Lei und Silver,

2002).

Die ribosomalen Untereinheiten setzen sich sowohl aus rRNA als auch einer Vielzahl von

ribosomalen Proteinen zusammen: In Eukaryoten besteht die kleine 40S-Untereinheit des

Ribosoms aus einer einzelnen 18S rRNA und je nach Organismus aus 30 bis 50

verschiedenen ribosomalen Proteinen (RPs). Die große 60S-Untereinheit des eukaryo-

tischen Ribosoms ist aus drei verschiedenen rRNA-Komponenten (5S, 5,8S und 23S

rRNAs) und 40 bis 50 verschiedenen ribosomalen Proteinen aufgebaut (Woolford und

Warner, 1991; Planter und Mager, 1998). Alle rRNAs bis auf die 5S rRNA werden

zunächst in Form einer einzelnenen Vorläufer- RNA durch die RNA-Polymerase I

transkribiert. Die hierfür codierende rDNA ist in Form von tandemartigen

Transkriptionseinheiten aufgebaut (Cheutin et al., 2002). Bei allen Eukaryoten wird die 5S

rRNA unabhängig durch die RNA-Polymerase III im Nukleus transkribiert (Lee und

Nazar, 2003).

In allen eukaryotischen prä-RNAs sind interne (ITS1, ITS2) und externe (5`ETS und

3`ETS) nichtcodierende „Spacer“-Sequenzen inseriert, die codierende Sequenzabschnitte

Einleitung

12

voneinander trennen (Nazar, 2004). Nach dem Ende bzw. in der späten Phase der

Transkription beginnt die Prozessierung des rRNA-Primärtranskripts durch eine geordnete

Reihe von endo- und exonucleolytischen Spaltungen, wobei diese „Spacer“-Regionen

entfernt werden. In Abbildung 8 sind die rRNA-Primärtranskripte, sowie die zugehörigen

Nuklease-Schnittstellen dargestellt.

Abbildung 8: Schematische Darstellung der bei den meisten Eukaryoten vorkommenden rRNA-Primärtranskripte. Kleine Pfeile markieren Schnittstellen von bekannten, prozessierenden Nukleasen, große Pfeile markieren Schnittstellen von bisher noch nicht identifizierten Nukleasen (Abbildung aus Nazar 2004).

Im Laufe des Reifeprozesses wird die prä-rRNA auch an zahlreichen Stellen kovalent

modifiziert, z.B. durch Methylierung von 2’-OH-Gruppen. Ein Großteil dieser

Modifikationen findet schon während der Transkription der Vorläufer rRNA statt (Maden,

1990). An der Biogenese der ribosomalen Untereinheiten sind neben Nukleasen,

Methyltransferasen und anderen chemisch modifizierenden Proteinen des weiteren auch

eine Vielzahl von Helikasen, RNA-Chaperonen und snoRNAs (engl. small nucleolar

RNAs) beteiligt. Nach der Wanderung in das Karyoplasma erfolgt der rezeptorvermittelte

Export der maturierten Untereinheiten. Die 60S Untereinheiten werden unter Beteiligung

des Karyopherins CRM1 und des Adaptermoleküls NMD3 exportiert. NMD3 bindet dabei

an leucinreiche NES in ribosomalen Proteinen (Johnson et al., 2002).

1.3.5 Funktionelle Rolle von rpL5 bei Transportprozessen der 5S RNA

Das ribosomale Protein L5 ist ein wichtiger Bindungspartner der 5S rRNA innerhalb der

60S Untereinheit des Ribosoms. Es spielt darüber hinaus eine bedeutende Rolle bei

zyklischen Transportprozessen der 5S rRNA im Laufe der Zellentwicklung.

Studien mit Oocyten von Xenopus laevis haben gezeigt, dass die 5S rRNA zeitlich vor

anderen ribosomalen Komponenten transkribiert wird (Murdoch et al., 2002). Nach der

Einleitung

13

Transkription kann die 5S rRNA z.B. durch den Transkriptionsfaktor TFIIIA gebunden

werden, wobei ein 7S RNP-Komplex ensteht (Allison et al., 1991; Guddat et al., 1990;

Wischnewski et al., 2004). Dieser

7S RNP-Komplexe werden zu einem beträchtlichen Teil in das Cytoplasma exportiert

(Guddat et al., 1990). Ein Reimport der 7S RNPs ist nicht möglich, wahrscheinlich, weil

das Importsignal von TFIIIA durch die 5S rRNA maskiert wird (Rudt und Pieler, 1996).

Die cytoplasmatischen 7S RNPs können als eine Speicherform der 5S rRNA angesehen

werden (Pieler und Rudt, 1997). Während der späteren Entwicklungsphasen von Oocyten

aus Xenopus laevis steigt der Bedarf an Ribosomen auf ein maximales Maß, und die 5S

rRNA wird für die ribosomale Biogenese im Nukleolus benötigt. In der Folge kommt es zu

einer Ersetzung von TFIIIA durch rpL5, wobei 5S RNPs entstehen (Allison, et al., 1995).

Diese RNPs werden durch Interaktion von rpL5 mit Komponenten der Kernimport-

maschinerie in den Zellkern importiert (Claußen et al., 1999; Murdoch und Allison, 1996).

Hiefür kommen auch die in die Importrezeptoren Imp7 und Impß in Betracht (Jäkel und

Görlich, 1998; Rudt und Pieler, 2001). Ein wiederholter Export von 5S RNPs unter

Beteiligung des Adaptermoleküls Nukleophosmin und CRM1-RanGTP ist ebenfalls

möglich (Yu et al., 2006). Der letztgenannte Transportweg könnte auch eine Rolle beim

Export von ribosomalen 60S Untereinheiten spielen, was bisher jedoch noch nicht

bewiesen werden konnte.

Einleitung

14

1.4 Aufgabenstellung und Zielsetzung

Die Aufgabenstellung dieser Diplomarbeit bestand zum einen in der Etablierung der

Expression und Präparation der ribosomalen Proteine L5 aus Xenopus laevis und L23a aus

Homo sapiens. Neben den Volllängeproteinen sollten auch funktionelle Fragmente

kloniert, exprimiert und präpariert werden.

Desweiteren sollten die gereinigten ribosomalen Proteine im Anschluss als Komplexe mit

dem Kernimportrezeptor Importin 7 aus Xenopus laevis präpariert werden. Ein Hauptziel

war es, diese Kernimportkomplexe zu kristallisieren, um mittels Röntgenbeugungs-

experimenten ihre Struktur aufklären zu können.

Zusätzlich sollte in funktionellen Untersuchungen die Bindung von rpL23a durch die

Kernimportrezeptoren Importin ß und Importin 7 charakterisiert werden. Im Vordergrund

standen hierbei die räumliche Lokalisierung der Bindestellen der Rezeptoren für rpL23a,

sowie eine Untersuchung von Bindungsenergien und Bindungsaffinitäten.

Material und Methoden

15

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Feinchemikalien

Alle Feinchemikalien und organischen Substanzen werden von den Firmen AppliChem

(Darmstadt), BioRad (München), Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Mettler-Toledo

(Steinbach), MWG Biotech (München), Oxoid (Basingstoke, GB), Roth (Karlsruhe) oder

Sigma-Aldrich (Steinheim) bezogen und besitzen den Reinheitsgrad pro analysis. Dabei

wird in der Regel der günstigste Anbieter gewählt.

2.1.2 Geräte

AbiPrism 3100 DNA Sequencer Applied Biosystems, Darmstadt

Agarose-Gelelektrophoresekammer BioRad, München

Äkta Prime General Electrics Health Care, München

Äkta Purifier General Electrics Health Care, München

Binokulare Carl Zeiss, Jena

Inkubator Mytron Schütt, Göttingen

Fraktionssammler Frac900 General Electrics Health Care, München

GelDoc Geldokumentationsgerät BioRad, München

Gelschüttler Promax 1020 Heidolph, Schwabach

Heizbad IKA, Staufen

Heizblock Dri-Block CB-2A Techne, Minneapolis, USA

Innova 4230 Schüttelinkubator New Brunswick Scientific, Nürtingen

Magnetrührer IKAMAG REO IKA, Staufen

Microfluidizer 110 S Microfluidics, USA

Microtip 102 C Branson, USA

PCR-Thermocycler Biometra, Göttingen

pH-Meter Beckman Coulter, Krefeld


16

Photometer Biometra, Göttingen

Pipettierhilfe Accu-Jet Brand, Wertheim

Röntgendiffraktometer RU-H3R Rigaku, Japan

Rotationsschüttler Karl Hecht, Staufen

Rotor JA-20 / JA-30.50 Ti Beckman Coulter, Krefeld

Rotor JLA 8.1000 Beckman Coulter, Krefeld

Rotor S4180 Beckman Coulter, Krefeld

SDS-Gelelektrophoresekammer Biometra, Göttingen

Vakuumkonzentrator 5301 Eppendorf, Hamburg

Spektralphotometer General Electrics Health Care, München

Auftragsschleifen (10 ml, 50 ml, 150 ml) General Electrics Health Care, München

Taumelrollenmischer RM5 Schütt, Göttingen

Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge 5417 R Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge Micro centrifuge II Sylvania, Ohio, USA

Ultraschallbad Sonorex Super RK 510 Bandelin, Berlin

Unitron Schüttelinkubatoren Infors, Einsbach

Vortexer Schütt, Göttingen

VP-ITC Mikrokalorimetersystem Microcal Inc., Northhampton, USA

Zentrifuge Allegra 21R Beckman Coulter, Krefeld

Zentrifuge Avanti J-20 XPIJA-20 Beckman Coulter, Krefeld

Zentrifuge Avanti J-30 I Beckman Coulter, Krefeld

Zentrifuge Avanti JA-20 Beckman Coulter, Krefeld

Chromatographiesäulen

Einweg-Leersäulen BioRad, München

GSH-Sepharose Säule (30ml) General Electrics Health Care, München

HisTrap Chelating Ni-NTA-Sepharose (5ml) General Electrics Health Care, München

HiPrep 26/60 Desalting (53ml) General Electrics Health Care, München

SP-Sepharose FF (24ml) General Electrics Health Care, München

Superdex 75 (26/60, 10/300) General Electrics Health Care, München

Superdex 200 (26/60, 10/300) General Electrics Health Care, München


17

2.1.3 Kit-Systeme

Big Dye Terminator v1.1 Mix Applied Biosystems, Darmstadt

Finnzymes Phusion High-Fidelity PCR Kit Finnzymes, Finnland

NucleoSpin Plasmid Macherey-Nagel, Düren

QIAquick Gelextraktionskit QIAGEN, Hilden

QIAquick PCR Reinigungskit QIAGEN, Hilden

QIAGEN Plasmid Mini Kit QIAGEN, Hilden

2.1.4 Organismen

E. coli BL21(DE3)

E. coli BL21(DE3) RP

E. coli Rosetta 2 (DE3)

E. coli BL21(DE3) STAR Stammsammlung der AG Ficner

E. coli HMS174 (DE3)

E. coli Origami

E. coli SG13009 (pREP4)

E. coli M15

E. coli XL1-Blue

2.1.5 Plasmide

pGEX-5X-1-rpL5 T. Pieler, Universität Göttingen

pGEX-6P-1-rpL5

pGEX-6P-1-rpL5/nostop* (AS 1-48)



pGEX-6P-1-rpL5 (AS 48-296)

pGEX-6P-1-rpL5 (AS 189-296)

pGEX-6P-1-rpL5 (AS 234-296)


18

pQE70-rpL23a D. Doenecke, Universität Göttingen

pQE80-rpL23a

pGEX-6P-1-rpL23a

pGEX-6P-1-rpL23a /nostop* (AS 32-74)

* Translationsstop am Stopcodon der Multiple Cloning Site (= +7 Aminosäuren)

2.1.6 Enzyme und Inhibitoren

Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) New England Biolabs, Frankfurt

Phusion-DNA-Polymerase Finnzymes, Finnland

Pfu-DNA-Polymerase New England Biolabs, Frankfurt

PreScission-Protease Universität Göttingen

Protease Inhibitor Cocktail Tabletten

„EDTA-free“

Roche, Mannheim

Restriktionsenzyme

(BamHI, XhoI, HindIII)

Fermentas, St. Leon-Rot

T4-DNA-Ligase Fermentas, St. Leon-Rot

Taq-DNA-Polymerase Universität Göttingen

2.1.7 Größenstandards

BR(broad range)-Protein-Standard New England Biolabs, Frankfurt

DNA-Standard „1kb-ladder” New England Biolabs, Frankfurt

Gel Filtration Standard Bio-Rad Laboratories, München


19

2.1.8 DNA-Oligonukleotide

Die Berechnung der Schmelztemperaturen Tm für die verwendeten DNA-Oligonukleotide

erfolgte nach den unten angegebenen Formeln. Die DNA-Oligonukleotide werden von 5´

nach 3´ dargestellt.

Tm = 81,5 + 0,41 [%GC] – (675/N)

N = Anzahl der Nukleotide

Alle Oligonukleotide stammen von der Firma MWG Biotech, München:

pGEX_f GCT GGC AAG CCA CGT TTG GT

pGEX_r CGT CTC CGG GAG CTG CAT GT

PQE80_for GTG AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA G

pQE80_rev CGC CCG GCG GCA ACC GAG CGT TCT

rpL23a_BamHIfor CGG GAT CCA TGG CGC CGA AAG CGA AG

rpL23a_XhoIrev CCG CTC GAG TTA GAT GAT CCC AAT TTT GTT G

rpL23a_HindIIIrev CCC AAG CTT TTA GAT GAT CCC AAT TTT GTT G

BIB_BamHI_for CGG GAT CCG TCC ACA GCC ACA AAA AG

BIB_XhoI_rev CCG CTC GAG ATA GTG GTC AAG CTT GTT TC

rpL5_BamHIfor CGG GAT CCA TGG GGT TCG TAA AGG

rpL5_XhoIrev CCG CTC GAG TTA GCT GTC TGC CTT CTG

rpL5_N48rev CCG CTC GAG CTT GGG AGT ATT GTA CTT G

rpL5_N189rev CCG CTC GAG TTC TTT GCT TTC AGA GTC ATA G

rpL5_N234rev CCG CTC GAG ATC TGC TGC GAC ACC ATT C

rpL5_C48for CGG GAT CCA AGT ACA GGA TGA TTG TAC G

rpL5_C189for CGG GAT CCG AAT TCA ATG CTG AGG TC

rpL5_C234for CGG GAT CCG ATC AGT TGG AAG ACA TAT AC


20

2.1.9 Kristallisationsscreens

Die nachfolgend aufgelisteten Screens werden von Mitarbeitern der Abteilung für

Molekulare Strukturbiologie an der Universität Göttingen angesetzt.

Crystal Screen 1 Hampton Research, USA

Crystal Screen 2 Hampton Research, USA

Crystal Screen Lite Hampton Research, USA

Crystal Screen Cryo Hampton Research, USA

Crystal Screen PEG/Ion Hampton Research, USA

JB Screens 1-10 Jena Bioscience, Jena

Magic Screens 1-4 Biogenova, Kanada

Footprint Screens 1-3 Stura et al., 1999

Structure Screens 1-3 Molecular Dimensions, England

Folgende käuflich erwerbbare, bereits fertig angesetzte Screens wurden verwendet:

JCSG+ Nextal Biotechnologies, Kanada

Opti Salts Nextal Biotechnologies, Kanada

PACT Nextal Biotechnologies, Kanada

pHClear Nextal Biotechnologies, Kanada

The MPDs Nextal Biotechnologies, Kanada

2.1.10 Computerprogramme

DeepView 3.7 http://www.expasy.org/spdbv/

Lasergene (Protean, Seqman, Megalign) DNAStar, Madison, US

ProtScale http://www.expasy.ch/tools/protscale.html

PSIPredict http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/

SWIFT II Biochrom Ltd., England

Swiss Model http://swissmodel.expasy.org/


21

2.2 Methoden

2.2.1 Molekularbiologische Methoden

2.2.1.1 Nukleinsäurebiochemische Methoden

2.2.1.1.1 Polymerase-Kettenreaktion

Der Prozess der Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) wurde

1983 von Kary Mullis entwickelt. Mit Hilfe dieser Technik ist es möglich, ein spezifisches

DNA-Fragment zu amplifizieren, das zwischen zwei Regionen bekannter Nucleotid-

sequenzen innerhalb einer längeren DNA-Matrize liegt.

Für die Amplifikation der DNA wird eine hitzestabile DNA-Polymerase verwendet. DNA-

Polymerasen sind nicht in der Lage, Nukleinsäureketten de novo zu synthetisieren. Daher

benötigt man für eine PCR kurze DNA-Oligonukleotide (20-30 Basen), die zu den

bekannten, das 3`- und das 5`-Ende der Ziel-DNA flankierenden Sequenzen,

komplementär sind. In einem PCR-Ansatz muss außerdem eine ausreichende Menge aller

Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) vorhanden sein.

Ein PCR-Prozess besteht aus einer Anzahl von 25 bis 40 Zyklen, die in einem

Thermocycler durchgeführt werden. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten:

1. Denaturierung: Die doppelsträngige DNA wird auf 95°C erhitzt, um die beiden

komplementären Stränge zu trennen. Dabei werden die Wasserstoffbrücken-

bindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, aufgebrochen.

2. Primerhybridisierung: Durch die Senkung der Temperatur auf 4 °C unterhalb des

Schmelzpunktes der DNA-Oligonukleotide können sich diese hochspezifisch an die

zu amplifizierende DNA-Sequenz anlagern (Hybridisierung).

3. Elongation: Die DNA-Synthese erfolgt durch Änderung der Temperatur auf das

Optimum der jeweilig verwendeten DNA-Polymerase (Elongation). Die Zeit, die

dieser Schritt benötigt, ist abhängig von der verwendeten DNA-Polymerase und der

Länge des DNA-Fragments, das vervielfältigt werden soll.


22

Durch Wiederholung der Zyklen wird eine nahezu exponentielle Vervielfältigung der Ziel-

DNA erreicht, weil jeder Zyklus theoretisch die Matrizenanzahl verdoppelt, die dann für

den folgenden Zyklus zur Verfügung steht.

Für die Klonierung in Vektoren enthalten die Primer normalerweise bereits die Sequenzen

für die 5’- und die 3’-Restriktionsschnittstellen, mit deren Hilfe eine Insertion in den

Zielvektor gelingt.

Im Folgenden wird ein typischer Ansatz für eine Polymerase-Kettenreaktion dargestellt:

1-150 ng DNA (Matrize oder Zielsequenz)

1x PCR-Puffer

10 mM je dATP, dGTP, dCTP, dTTP

0-10 % (v/v) DMSO

10 pmol DNA-Oligonukleotide (Primer)

1-2 U Phusion-Polymerase / Pfu-Polymerase / Taq-Polymerase

ad 50 µl H2O

Die Amplifikations-PCR von rpL5 und rpL23a mit der Phusion-DNA-Polymerase wurde

nach folgendem Schema durchgeführt:

1. Denaturierung 98 °C 2 Minuten

2. Denaturierung 95 °C 30 Sekunden

3. Primer-Hybridisierung X °C 30 Sekunden

4. Elongation 72 °C 1-3 Minuten

40 Zyklen

5. Abschlußelongation 72 °C 10 Minuten

Die Temperatur „x“, bei der die Hybridisierung der DNA-Oligonukleotide stattfindet,

hängt von der Schmelztemperatur derselben ab. Für die Hybridisierungstemperatur wird

für gewöhnlich ein Wert 4° C unterhalb des Schmelzpunkts der Oligonukleotide gewählt.

Die optimale Elongationstemperatur variiert zwischen den Polymerasen. Für die ebenfalls

verwendete Pfu-Polymerase beträgt sie 68°C. Abweichungen von diesem Programm und

die Spezifizierung der Hybridisierungstemperatur werden im Ergebnisteil angegeben.


23

2.2.1.1.2 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen

Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische Basensequenzen in DNA-Doppelhelices

und hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nukleotiden. Man findet

diese Enzyme in Prokaryoten, wo sie dem Abbau von Fremd-DNA dienen. Dabei bleibt

die eigene DNA aufgrund von Methylierungen an spezifischen Stellen ungeschnitten.

Die Nukleasen erkennen dabei Sequenzen mit zweifacher Rotationssymmetrie

(Palindrome) und schneiden die Doppelhelix meist so, dass überhängende Enden (sticky

ends) entstehen. Diese überhängenden DNA-Enden hybridisieren leicht mit

komplementären Sequenzen. So wird das gerichtete Einsetzen der mit bestimmten

Restriktionsenzymen geschnittenen Zielsequenz in einen mit denselben Enzymen

geschnittenen Vektor ermöglicht.

Ein typischer Ansatz von 20 µl enthält:

1 µg DNA

1x Restriktionsenzympuffer

1 U Restriktionsendonuklease für 3’ Schnittstelle

1 U Restriktionsendonuklease für 5’ Schnittstelle

ad 20 µl H2O

Der Ansatz wird für eine Stunde bei 37 C inkubiert und zur anschließenden Inaktivierung

der Restriktionsenzyme für 5 Minuten bei 95 C belassen. Danach werden die

geschnittenen Fragmente durch Agarosegelelektrophorese (2.2.1.1.6) analysiert und

gegebenenfalls für folgende Schritte aus dem Gel isoliert (2.2.1.1.8).

2.2.1.1.3 DNA-Dephosphorylierung am 5´-Ende

Um Rezirkularisierungen von bereits geschnittenem Vektor zu vermeiden, wird jeweils das

5´-Phosphat der überhängenden Enden entfernt. Die Religation kann ausgeschlossen

werden, da die T4-DNA-Ligase nur 5´-Phosphate mit 3´-Phosphaten verknüpfen kann. So

wird die Ligationseffizienz des gewünschten Fragmentes erheblich gesteigert.


24

Nach der Spaltung des Vektors mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen werden

zu dem hitzeinaktivierten Ansatz 2 U CIP (calf intestinal alkaline phosphatase) pro µg

Vektor-DNA hinzugegeben und für 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Danach erfolgt die

Isolation des geschnittenen und dephosphorylierten Vektors durch Agarosegelelektro-

phorese (2.2.1.1.6) und anschließende Elution der DNA aus dem Agarosegel (2.2.1.1.8).

2.2.1.1.4 DNA-Ligation

DNA-Ligasen katalysieren die Bildung einer Phosphodiesterbindung benachbarter

Nukleotide. Dabei werden zwei DNA-Einzelstränge zu einem einzigen verknüpft. Bei

Klonierungen benutzt man diese Enzyme zur Verknüpfung von Fragment und Vektor nach

der Hybridisierung der überliegenden Enden. Meistens wird hierfür die Ligase des

Bakteriophagen T4 verwendet. Die von der Ligase katalysierte Kondensationsreaktion ist

energetisch an die Hydrolyse von ATP zu AMP und Pyrophosphat gekoppelt, weshalb im

Ligationsansatz auch immer ATP enthalten sein muss.

Ein typischer Ligationsansatz setzt sich wie folgt zusammen:

2 U T4-DNA-Ligase

x M Plasmid

y M Zielsequenz

1x T4-DNA-Ligase-Puffer

ad 20 µl H2O

Dabei wird das Zielgen in 4-fach molarem Überschuss in Relation zum Plasmid eingesetzt.

2.2.1.1.5 DNA-Sequenzierung

Das Ketten-Abbruch-Verfahren nach Sanger et al., (1977) beruht auf der in vitro-Synthese

eines DNA-Strangs mit Hilfe einer DNA-Polymerase. Die Synthese wird nur an der Stelle

initiiert, wo ein genau definiertes Oligonukleotid („Primer“) an das Template bindet. Die

Synthese-Reaktion wird durch den Einbau von Nukleotid-Analoga, Fluoreszenz-markierte

2`,3`-Didesoxynukleosid-5`-triphosphate (ddNTPs), abgebrochen. Diesen Analoga fehlen


25

die 3`-OH Gruppen, die für die Elongation der DNA-Ketten notwendig sind. Wird eine

geeignete Mischung aus dNTPs und einem der vier ddNTPs verwendet, dann bricht die

enzymkatalysierte Reaktion statistisch an allen Stellen ab, wo das entsprechende ddNTP

eingebaut werden kann. Der Polymerase, die für die Sequenzierung eingesetzt wird, fehlt

die 5’,3’-Exonuclease-Aktivität, daher bricht die Synthese ab, und es entstehen Fragmente

definierter Länge, die elektrophoretisch aufgetrennt und detektiert werden können.

Mit dem Seq-Mix BigDye Terminator v1.1 von Applied Biosystems kann die komplette

Reaktion in einem einzigen Ansatz durchgeführt werden.

Für einen typischen Sequenzierungsansatz werden pipettiert:

200 ng zu sequenzierendes Fragment (Template)

8 pmol DNA-Oligonukleotid (Primer)

1 µl Seq-Mix

1 µl Seq-Puffer

ad 10 µl H2O

Das Programm für Sequenzierungsreaktionen ist dem unter 2.2.1.1.1 genannten Programm

analog, wobei die optimale Temperatur für die Polymerisation bei 60 °C liegt. Die

Hybridisierungstemperatur ist abhängig von den verwendeten DNA-Oligonukleotiden und

die Elongationszeit von der Länge des zu sequenzierenden DNA-Fragmentes.

Nach der Reaktion werden die Produkte für den Sequenzierungsautomaten gereinigt, um

störende Faktoren wie DNA-Oligonukleotide, Polymerase und restliche ddNTPs zu

entfernen.

Hierzu wird dem Ansatz hinzupipettiert:

1 µl 0,125 M EDTA

1 µl 3 M Natriumacetat

50 µl Ethanol (96 %)

Der Ansatz wird vorsichtig durchmischt, für 5 Minuten inkubiert und anschließend bei

16100 xg für 15 Minuten und bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen, das


26

Pellet in 70 µl Ethanol (70 %) gewaschen und erneut für 5 Minuten zentrifugiert. Das

Pellet wird 2 Minuten an der Luft getrocknet und schließlich in 30 µl Wasser

aufgenommen. Die gereinigten DNA-Fragmente werden in einem Kapillarsequenzierer

analysiert.

2.2.1.1.6 Agarosegelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese wird zur Reinigung, Trennung und Identifizierung von

zirkulärer Plasmid-DNA und DNA-Fragmenten benutzt. Aufgrund der negativen Ladung

ihrer Phosphatgruppen wandern die DNA-Moleküle im elektrischen Feld. Die

Auftrennung erfolgt nach der Größe aufgrund der unterschiedlichen Mobilität

verschiedener DNA-Fragmente innerhalb der gleichmäßig vernetzten Agarose. Es wurden

im Zuge dieser Arbeit ausschließlich 1 %ige Agarosegele benutzt. Die Agarose wird dazu

mit TBE-Puffer versetzt und in der Mikrowelle zum Kochen gebracht. Für das Gel wird

eine Flachbettkammer abgedichtet, die Agaroselösung hineingegossen und ein

Probenkamm in das Gel gesteckt. Nach etwa einer halben Stunde ist das Gel erstarrt und

wird in eine mit 1x TBE gefüllte Elektrophoresekammer gelegt. Zum Laden der DNA-

Proben werden diese mit Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Die

elektrophoretische Trennung erfolgt bei 12 mA/cm2 Gelfläche.

Laufpuffer (TBE) DNA-Probenpuffer (6x)

0,09 M TrisBase 0,5 % (w/v) Bromphenolblau

0,09 M Borsäure 0,5 % (w/v) Xylencyanol FF

0,01 M EDTA pH 8,0 60 % (v/v) Glycerin

2.2.1.1.7 Visualisierung von Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid

Elektrophoretisch getrennte Nukleinsäuren können mit Ethidiumbromid im UV-Licht

sichtbar gemacht werden. Hierzu wird das Gel ca. 30 Minuten in einem

Ethidiumbromidbad (1 µg/ml Ethidiumbromid) inkubiert. Ethidiumbromid interkaliert

dabei zwischen den innerhalb der DNA-Helix gestapelten Basen und fluoresziert intensiv


27

orange. Die DNA wird durch monochromes Licht mit 365 nm Wellenlänge DNA

detektiert.

2.2.1.1.8 DNA-Isolierung aus Agarosegelen

Um die DNA von Enzymen und anderen Verunreinigungen, die im weiteren Verlauf der

experimentellen Prozedur stören könnten, zu befreien, wird sie nach der

elektrophoretischen Trennung gereinigt.

Hierfür wird ein QIAquick Gelextraktionskit der Firma Qiagen verwendet. Die durch

Ethidiumbromid angefärbte DNA (2.2.1.1.7) wird zunächst möglichst knapp aus dem

Agarosegel ausgeschnitten. Dann wird die DNA aus der Agarose herausgelöst und

anschließend an eine Einweg-Säule gebunden. Bei den hier verwendeten Säulen handelt es

sich um schwache Anionenaustauscher.

Nach einem Waschschritt wird die DNA von der Säule eluiert. Alle Arbeitsschritte werden

nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

2.2.2 Zellbiologische Methoden

2.2.2.1 Transformation chemisch kompetenter Zellen

Zum Einbringen von modifizierten Vektoren in Bakterien-Zellen werden

Transformationen durchgeführt. Da jedoch E. coli nicht, wie zum Beispiel Bacillus

subtilis, eine natürliche Kompetenz aufweist, müssen die Zellen mit bestimmten Puffern

chemisch kompetent gemacht werden.

Zu 50 µl kompetenter Zellen werden 20 µl Ligationsansatz oder 1 µg Plasmid-DNA

pipettiert und gemischt. Die Zellen werden dann 20 Minuten auf Eis inkubiert. Für die

DNA-Aufnahme werden die Zellen bei 42°C für 45-60 Sekunden inkubiert und

anschließend 2 Minuten auf Eis belassen. Nach Zugabe von 450 µl antibiotikafreiem 2-

YT-Medium werden die Zellen 60 Minuten bei 37°C unter Schütteln inkubiert. 100 µl des

Transformationsansatzes werden je auf einer Selektionsplatte ausgestrichen, an der Luft

getrocknet und die Platten umgedreht über Nacht bei 37°C inkubiert.


28

2.2.2.2 Präparation von Plasmid-DNA

Zur Amplifikation ganzer Plasmide werden während dieser Arbeit ausschließlich

Plasmidpräparationen im kleinen Maßstab (Mini-Präparation) durchgeführt. Dabei werden

die Vektoren in E. coli XL1-Blue-Zellen transformiert (2.2.2.1) und diese wachsen

gelassen. Die Zellen werden nach den Angaben des Herstellers für Plasmid-Isolations-Kits

geerntet und aufgeschlossen. Die Plasmid-DNA wird von der genomischen DNA und

anderen Zelltrümmern sowie Proteinen über Einweg-Säulen befreit.

Für die Präparation im kleinen Maßstab werden 5 ml Übernacht-Kultur aufgeschlossen

und die DNA nach Herstellerangaben präpariert.

2.2.2.3 Expression rekombinanter Proteine

2.2.2.3.1 Expression rekombinanter Proteine in Escherichia coli im kleinen Maßstab

Für die Etablierung der Expression eines Proteins in Escherichia coli ist es sinnvoll, die

Expressionsrate des Zielproteins in verschiedenen Expressionsstämmen zu vergleichen.

Das rekombinante Plasmid wir hierfür in die zu testenden Zellen transformiert (2.2.2.1).

20ml 2YT-Medium werden mit den entsprechenden Antibiotika in einem sterilen

Glasgefäß vorgelegt und von einer angewachsenen Transformationsplatte angeimpft. Die

Kultur wird bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert und die Expression bei einer optischen

Dichte von OD600 = 0,8 mit IPTG gestartet. Bei den verwendeten pGEX-6P-1-Konstrukten

erfolgt die Induktion durch 500 µM IPTG. Bei Konstrukten mit dem Plasmid pQE80

beträgt die Konzentration c(IPTG)= 100 µM.

Für den Vergleich der Expressionsrate mittels SDS-PAGE (2.2.3.3) wird jeweils eine

Zellprobe zum Zeitpunkt der Induktion sowie drei Stunden nach Induktion genommen.


29

2.2.2.3.2 Überexpression von rekombinanten Proteinen in Escherichia coli

Für die Expression von rekombinanten Proteinen in E.coli wird zunächst eine Vorkultur

mit kleinem Volumen angezogen, die später zur Inokulierung der Expressionskultur dient.

Hierzu werden 20ml 2YT-Medium mit den entsprechenden Antibiotika in einem sterilen

Glasgefäß vorgelegt und von einer angewachsenen Transformationsplatte angeimpft. Die

Vorkultur wird bei 30°C über Nacht anwachsen gelassen. Am nächsten Morgen werden

jeweils 500 ml 2YT-Medium mit den entsprechenden Antibiotika versetzt und mit der

Vorkultur im Verhältnis 1:200 angeimpft. Diese Kultur wird bei 37°C im

Inkubationsschüttler bis zu einer OD600 = 1,6 anwachsen gelassen und dann mit 500 ml

4 °C kaltem 2YT-Medium verdünnt. Dieses frische Medium enthält Di-

Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) mit einer Endkonzentration von 30mM. Durch die

Pufferwirkung von K2HPO4 und die Anhebung des pH-Werts auf pH 8 sollen die

Expressionsbedingungen verbessert werden.

Nach dem Verdünnen wird die Expressionskultur bei OD600 = 0,8 mit IPTG induziert. Bei

Expressionen von in pGEX-6P-1 einklonierten Genen beträgt die benötigte IPTG-

Konzentration 500 µM. Expressionskulturen mit dem Vektor pQE80 werden mit 100 µM

IPTG induziert. Die Expression findet bei 16°C für 16-18 Stunden im Inkubationsschüttler

statt.

Die Ernte der Zellen erfolgt durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C.

2 YT-Medium

1,6 % (w/v) Trypton

1 % (w/v) Hefeextrakt

0,5 % (w/v) NaCl

Sterilisation durch Autoklavieren

2.2.2.3.3 Ernte und Aufschluss einer Expressionskultur

Um rekombinante Proteine aus Bakterienzellen zu isolieren, müssen die Zellen zunächst

geerntet und aufgebrochen werden. Die Ernte erfolgt durch Zentrifugation bei 5.000 xg für

20 Minuten und bei 4 °C. Das Bakterien-Pellet wird einmalig in kaltem PBS (phosphate


30

buffered saline) resuspendiert und erneut bei 4000 xg für 25 Minuten bei 4 °C

zentrifugiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes werden die Zellen entweder sofort

aufgeschlossen oder in flüssigem Stickstoff gefroren und gelagert.

Vor dem Aufschluss der Bakterien-Pellets werden diese in 4° C kaltem Lysispuffer

resuspendiert. Dabei werden für ein Pellet von einem Liter Schüttelkultur (2.2.2.3.2) 20ml

Lysispuffer eingesetzt. Um proteolytische Enzyme zu inaktivieren, wird dem Ansatz eine

halbe Tablette Protease-Inhibitor (protease inhibitor cocktail complete EDTA-free)

zugegeben und diese gelöst. Bei frühen Reinigungsversuchen wurden dem Lysispuffer

3U/ml Benzonase beigefügt, um RNA abzubauen. Hierdurch sollte an Proteine gebundene

RNA entfernt werden. Wegen einer zu niedrigen Effizienz dieser Methode wurde bei

späteren Reinigungen auf eine Zugabe von Benzonase verzichtet. Der Zellaufschluss im

pneumatischen Zelldesintegrator (Fluidizer) wird bei 80psi in 7 Zyklen durchgeführt.

Nach dem Aufbruch der Zellen wird die Suspension in JA30-Zentrifugenröhrchen

überführt und bei 30000 xg für 40 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Nach der Trennung des

Lysates in Zelltrümmer und Überstand werden die Proben über SDS-

Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert.

Der Überstand wird je nach Art des exprimierten Proteins weiterverarbeitet.

PBS Lysispuffer

0,14 M NaCl 2,2 M LiCl

0,01 M NaH2PO4 / Na2HPO4 pH 7,4 50mM Tris-HCl pH 7,5

5 mM MgCl2

2 mM ß-Mercaptoethanol

Die weitere Verarbeitung und Trennung des Überstandes erfolgt durch die in 2.2.4

beschriebenen Methoden.


31

2.2.3 Proteinbiochemische Methoden

2.2.3.1 Einengen von Proteinlösungen durch Zentrifugation

Proteinlösungen werden durch Zentrifugation mit Ultrafiltrationssäulen konzentriert. Diese

Säulen enthalten Filter, welche Substanzen, die kleiner als die Porengröße der Filter sind,

durchlassen und größere Moleküle, in diesem Fall das gewünschte Protein, zurückhalten.

Die Ultrafiltrationssäulen wurden vor Gebrauch mit H20 bei der vorgeschriebenen g-Zahl

gespült. Die Zentrifugationen erfolgen bei 4000 xg bei 4° C. Nach der Zentrifugation wird

jeweils die Konzentration der Proteinlösung bestimmt (2.2.6.1.2).

2.2.3.2 Aufbereitung von Zellproben für eine SDS-PAGE

Die Analyse der Expression eines Zielproteins in einer E.coli-Kultur geschieht mit Hilfe

einer SDS-PAGE (2.2.3.3). Hierzu wird zum gewünschten Zeitpunkt eine Probe mit einem

Volumen von V= 0,1 bis 0,5 ml aus der Kultur entnommen.

Die in der Probe enthaltenen Bakterien werden durch Zentrifugation in einer Eppendorf-

Mikrozentrifuge für 5 min bei 16100 xg abzentrifugiert und der Überstand verworfen.

Anschließend wird das Pellet mit SDS-Probenpuffer (2.2.3.3) resuspendiert. Dabei wird

nach folgender Formel vorgegangen:

0,2 * oD = Menge an SDS-Probenpuffer [ml] (bei 1ml Probe)

Vor dem Laden des SDS-Gels wird die Probe für 5 min bei 95°C auf einem Heizblock

inkubiert.

2.2.3.3 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE - nach Laemmli, 1970) ist eine

elektrophoretische Methode zur Auftrennung von Proteingemischen nach ihrer Größe.

Die Proteinprobe wird hierfür zunächst mit Natriumdodecylsulfat (SDS) und ß-Mercapto-

ethanol versetzt und hitzedenaturiert. ß-Mercaptoethanol reduziert Disulfid-brücken

zwischen Cystein-Seitenketten. Das Detergens SDS denaturiert Proteine, wobei es die


32

ursprüngliche Ladung durch die negative Ladung seiner Sulfatgruppe weitgehend

überdeckt, so dass alle Proteine ein nahezu gleiches Verhältnis von Ladung zu Größe

besitzen. Die Trennung der Proteine im elektrischen Feld erfolgt hauptsächlich nach dem

Molekulargewicht durch den Molekularsiebeffekt des Polyacrylamidgels.

Bei der diskontinuierlichen SDS-PAGE nach Laemmli werden die Proteine außerdem

innerhalb des Sammelgels fokussiert. Das Prinzip dieser Fokussierung beruht auf der

Entstehung eines Feldstärkegradienten in Laufrichtung der Probe. Das untere Trenngel

enthält einen Puffer mit einem pH-Wert von 8,8. Der pH-Wert des darüber geschichteten

Sammelgels ist mit pH 6.8 deutlich niedriger. Beim Anlegen eines Stromflusses bewegen

sich die im Sammelgel vorhandenen Chloridionen mit der höchsten Geschwindigkeit

Richtung Anode. Hinter den Chloridionen bildet sich eine Zone geringerer Ionendichte

und erhöhter Feldstärke, was zur Beschleunigung von Proteinen und Folgeionen führt. Das

aus dem Laufpuffer nachfolgende Glycin liegt bei pH 6.8 als Zwitterion mit niedriger

Mobilität vor, so dass sich ein Feldstärkegradient innerhalb des Sammelgels bildet. Die

Geschwindigkeit der Proteine ist größer als die des Folgeions Glycin, aber langsamer als

die der Leitionen. Es kommt zu einer Fokussierung der Proteine als scharfe Front

innerhalb des Feldstärkegradienten. Beim Auftreffen auf das Trenngel ändern die

Folgeionen aufgrund des erhöhten pH-Wertes ihre Ladung und damit ihre

Ionenbeweglichkeit. Sie überholen die Proteine, die sich dann wieder in einem Gebiet

konstanter Feldstärke bewegen. Die Folge ist eine Auftrennung der am Trenngel

komprimierten Proteinfront. Das Trenngel wirkt dabei als Molekularsieb, da die Proteine

durch die weit engeren Poren des Trenngels in Abhängigkeit ihrer Masse verlangsamt und

so ihrer Größe nach getrennt werden.

Für die Vorbereitung einer SDS-PAGE werden vier Gele in einer Mehrfachgießkammer

gegossen. Hierbei wird nach der Anleitung des Herstellers vorgegangen.

Die Proteinproben werden 1:1 (v/v) mit SDS-Probenpuffer versetzt und in die Taschen des

Gels geladen. Zellsuspensionsproben werden wie unter 2.2.3.2 beschrieben für die SDS-

PAGE aufbereitet. Nach dem Auftragen der Proben erfolgt die elektrophoretische

Auftrennung bei einer angelegten Stromstärke von 30mA.


33

Trenngel (15 %) Sammelgel (5 %)

15 % Acrylamid, 0,4 % Bisacrylamid 5% Acrylamid, 0,13 % Bisacrylamid

0,375 M Tris/HCl pH 8,8 0,125 M Tris/HCl pH 6,8

0,1 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) SDS

0,1 % (v/v) TEMED 0,1 % (v/v) TEMED

0,05 % (w/v) Ammoniumpersulfat 0,05 % (w/v) Ammoniumpersulfat

Protein-Laufpuffer SDS-Probenpuffer (2x)

0,025 M Tris-HCl 0,0625 M Tris-HCl pH 6,8

0,192 M Glycin 0,07 M SDS

0,1 % (w/v) SDS 50 % (v/v) Glyzerin

0,1 % (w/v) Bromphenolblau

5 % (v/v) 2-Mercaptoethanol

2.2.3.4 Visualisierung von Proteinen durch Coomassie Brilliant Blue

Elektrophoretisch getrennte Proteine können mittels einer Coomassie Brilliant Blue G

250/R250-Lösung sichtbar gemacht werden, wobei die Nachweisgrenze je nach Protein bei

cirka 200-400 ng/0,5cm Bande liegt. Dabei wird das Gel nach der Elektrophorese für

mindestens 30min in einem Färbebad geschwenkt. Das Entfärben erfolgt danach für

mehrere Stunden in Wasser. Durch wiederholtes Färben und Entfärben kann eine

kontrastreichere Bandenfärbung erzielt werden.

Färbelösung

10 % (v/v) Ethanol (96 %)

5 % (v/v) Essigsäure

0,002 % (w/v) Coomassie G/R250

2.2.3.5 Proteolytische Spaltung von GST-Fusionsproteinen

Die ausgehend von dem Vektor pGEX-6P-1 exprimierten Proteine besitzen eine N-

terminale Glutathion-S-Transferase-Affinitätssequenz (GST-Sequenz). Nach der


34

Reinigung über eine GSH-Sepharose wird die GST-Sequenz proteolytisch vom Zielprotein

abgespalten. Zwischen dem Zielprotein und der Glutathion-S-Transferase-Affinitäts-

sequenz befindet sich eine Erkennungssequenz für die PreScission-Protease. Diese besteht

aus den sieben Aminosäuren Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro. Die PreScission-

Protease schneidet hochspezifisch zwischen den Aminosäuren Gln und Gly.

Für einen beliebigen proteolytischen Ansatz wird pro mg GST-Fusionsprotein etwa 50 µg

PreScission-Protease eingesetzt und die Lösung für mindestens 10 Stunden bei 4 °C auf

dem Taumelrollenmischer inkubiert.

Nach der Behandlung mit der Protease wird die Vollständigkeit der proteolytischen

Spaltung durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (2.2.3.3) analysiert.

2.2.4 Chromatographische Methoden

2.2.4.1 Affinitätschromatographische Reinigung von GST-Fusionsproteinen

GST-Fusionsproteine besitzen eine Glutathion-S-Transferase-Sequenz, mit deren Hilfe es

möglich ist, das Fusionsprotein affinitätschromatografisch über Glutathion-Sepharose 4B

zu reinigen. Das Enzym Glutathion-S-Transferase bindet spezifisch an das Substrat

Glutathion (γ-Glutamylcysteinylglycin).

GSH-Sepharose-Säulen besitzen kovalent an die Säulenmatrix gekoppelte Glutathion-

gruppen, an die das gewünschte Fusionsprotein über seine GST-Sequenz bindet. Nach

einem Waschschritt wird das immobilisierte Zielprotein durch Zugabe von reduziertem

Glutathion von der Säule eluiert.

Die in dieser Arbeit verwendete 30 ml GSH-Sepharose (General Electrics Health Care)

muß zunächst mit Puffer A equilibriert werden. Anschließend wird der Überstand des

zentrifugierten Aufschlusses (30000 x g, 4 °C, 40 Minuten) auf die Säule geladen. Es folgt

ein Waschschritt mit dem für den Aufschluss verwendeten Lyispuffer (2.2.2.3.3), um

gebundene RNA zu entfernen. Die kompetitive Verdrängung, und damit die Elution,

erfolgt durch 20 mM Glutathion in Puffer C. Das Eluat wird fraktioniert. Alle

Affinitätschromatographien von GST-Fusionsproteinen mit GSH-Sepharose 4B konnten

auch bei 20°C durchgeführt werden.


35

Laufpuffer A Waschpuffer B ( = Lysispuffer vgl. 2.2.2.3.3)

50 mM Tris-HCl pH 7,5 50 mM Tris-HCl pH 7,5

500 mM NaCl 2,2 M LiCl

2 mM ß-Mercaptoethanol 5mM MgCl2

2mM ß-Mercaptoethanol

Elutionspuffer C

50 mM Tris-HCl pH 7,5 (pH 8,0 für GST-rpL23a)

500 mM NaCl

20 mM Reduzierte Glutathion


2.2.4.2 Affinitätschromatographische Reinigung über Ni+-NTA-Sepharose

Bei dieser affinitätschromatographischen Methode nutzt man die Eigenschaft von

Histidin-Seitenketten, stabile Komplexbindungen mit zweiwertigen Nickel-Kationen

auszubilden. Proteine, die mit N- oder C-terminaler His-Sequenz exprimiert werden, lassen

sich so selektiv reinigen. Die Nickel-Ionen sind meist an Nitrilotriessigsäure-Sepharose

(NTA) immobilisiert. Die beiden verbleibenden freien Koordinationsstellen stehen für die

Bindung von mobilen Liganden zur Verfügung.

Das in dieser Arbeit verwendete Protein rpL23a, exprimiert aus dem Vektor pQE80,

besitzt eine N-terminale Sequenz aus 10 Histidinen. Die Imidazol-Gruppen dieser

Histidin-Seitenketten binden hochaffin an die Nickel2+-Ionen.Die Elution des Proteins

erfolgt durch einen Imidazol-Gradienten. Imidazol verdrängt die Histidin-Seitenketten mit

steigender Konzentration kompetitiv von den Nickel-Ionen und sorgt so für die Elution des

Proteins von der Säule.

In dieser Arbeit wurden HisTrapChelating Ni-NTA-Sepharose-Säulen (5 ml, General

Electrics Health Care) benutzt. Alle Chromatographien dieser Art wurden bei 4 °C

durchgeführt. Die Säule wird zunächst mit Puffer A equliibriert. Anschließend wird der

Überstand des zentrifugierten Aufschlusses (30000 x g, 4 °C, 40 Minuten) auf die Säule

geladen. Es folgt ein Waschschritt mit Puffer B, um unspezifische gebundene Proteine zu

entfernen (2.2.2.3.3). Im Anschluss wird die Säule in Puffer C umequilibriert. Die


36

kompetitive Verdrängung, und damit die Elution, erfolgt durch einen Imidazolgradienten

(Puffer C – Puffer D). Das Eluat wird fraktioniert.

Puffer A Puffer C

50 mM HEPES pH 7,0 50 mM Tris pH 7,5

1M LiCl 300 mM NaCl

5 mM MgCl2 2 mM 2-Mercaptoethanol

2 mM 2-Mercaptoethanol

Puffer B wie Puffer A

+ 20 mM Imidazol

Puffer D wie Puffer C

+ 800 mM Imidazol

2.2.4.3 Kationenaustauschchromatographie über SP-Sepharose

Bei der Ionenaustauschchromatographie werden geladene Moleküle nach ihrer Ionenstärke

bei einem bestimmten pH-Wert aufgetrennt. Die Trägermatrix eines Ionentauschers besitzt

kovalent gebundene positiv geladene (Anionenaustauscher) oder negativ geladene

Gruppen (Kationenaustauscher). Entgegengesetzt geladene Moleküle, die in einer

flüssigen Phase gelöst sind (in diesem Fall Proteine), können über elektrostatische

Wechselwirkungen an die funktionellen Gruppen der Säulenmatrix binden. Ausmaß und

Stärke der Bindung an den Ionentauscher hängen von pH und Ionenstärke des Puffers, dem

isoelektrischen Punkt des Proteins und der Dichte der Ladungen auf der Matrix ab. Die

Auftrennung von unterschiedlichen, an die Gegenionen der Matrix gebundenen Molekülen

erfolgt über kompetitive Verdrängung durch stärkere Ionen im Elutionspuffer. Schwach

geladene Moleküle eluieren früher als stark geladene. Auf diese Weise können z. B.

Proteine nativ nach ihrem isoelektrischen Punkt pI getrennt werden.

Der Substituent der SP-Sepharose, eine Sulphopropylgruppe, besitzt relativ starke

anionische Eigenschaften, da die negative Ladung der funktionellen Sulphonat-Gruppe

mesomeriestabilisiert ist. Daher werden Kationen mit hoher Affinität an die Säulenmatrix

gebunden. Der pH-Wert des Puffers wird so eingestellt, dass er mindestens 2 Einheiten

unterhalb des isoelektrischen Punkts des Zielproteins liegt, um sicherzustellen, dass das


37

Zielprotein als Kation mit hoher Nettoladung vorliegt und über basische

Aminosäureseitenketten an die Sulphonat-Gruppen binden kann. Für Arbeiten während

dieser Diplomarbeit wurde eine 24ml SP-Sepharose FF-Säule von GE Healthcare

verwendet.

Vor der Benutzung wird mit 5 Säulenvolumina Puffer A äquilibriert. Die Elution erfolgt

über einen ansteigenden NaCl-Gradienten (Puffer A – Puffer B). Hierbei kommt es zu

einer kompetitiven Verdrängung der an die Sulphonatgruppen gebundenen basischen

Aminosäureseitenketten durch Cl--Ionen und somit zu einer zeitversetzten Elution der

verschiedenen gebundenen Proteine.

Es werden 5 ml-Fraktionen gesammelt, die später via SDS-PAGE analysiert werden. Die

Fraktionen mit dem gesuchten Protein werden vereinigt und für weitere Reinigungsschritte

bei 4° C aufbewahrt.

Puffer A Puffer B

50 mM Tris-HCl pH 7,7 für rpL5

pH 8,4 für rpL23a

50 mM Tris-HCl pH 7,7 für rpL5

pH 8,4 für rpL23a

300 mM NaCl 1 M NaCl

2 mM ß-Mercaptoethanol (nur für rpL5) 2mM ß-Mercaptoethanol (nur für rpL5)

2.2.4.4 Ausschlusschromatograpisches Umäquilibrieren von Proteinen

Proteine, bei denen eine Affinitätschromatographie über einen Ionentauscher den finalen

Reinigungsschritt darstellt, müssen vor dem letzten Schritt der Präparation in den finalen

Puffer überführt werden. Hierfür wird eine HiPrep 26/60 Desalting-Entsalzungssäule

verwendet. Hierbei handelt es sich im Prinzip um eine ausschlusschromatographische

Säule. Auf Grund der grobporigen Beschaffenheit des Säulenmaterials (Sephadex™ G-25

Fine) werden größere Moleküle, wie Proteine, jedoch kaum noch nach ihrer Masse

getrennt.

Zunächst wird die Säule mit dem dreifachen Säulenvolumen an Puffer äquilibriert. Bis zu

10 ml Probe können pro Säulenlauf über eine Auftragungsschleife geladen werden. Die

Proben des Absorptionsmaximums werden nach dem Lauf vereinigt, konzentriert (2.2.3.1)

und die Proteinkonzentration bestimmt (2.2.6.1.2). Eine anschließende Qualitätskontrolle


38

des präparierten Proteins, z.B. zum Nachweis von Polymeren, mittels einer analytischen

Ausschlusschromatographie (2.2.4.6), ist notwendig. Für längere Lagerung wird das

Protein in Aliquots von 100 µl in flüssigem Stickstoff weggefroren und bei -80°C gelagert.

Finaler Puffer für rpL5 und rpL23a Finaler Puffer für rpL23aBIB


300 mM NaCl 100 mM NaCl

2 mM ß-Mercaptoethanol 2 mM ß-Mercaptoethanol

2.2.4.5 Präparative Ausschlusschromatographie von Proteinen

Die HiPrep 26/60 Superdex 200 Säule (General Electrics Health Care) eignet sich zur

Trennung von Proteinen mit einer Molekülmasse von 10 bis 600 kDa. Ihre Gelmatrix

besteht aus Allyldextran, das kovalent zu N,N’-Methylenbisacrylamid verknüpft ist.

Für die Präparation von Proteinkomplexen werden die jeweiligen Proteine vor Beginn des

Säulenlaufs in einem definierten Verhältnis (siehe Ergebnisse) und einem Gesamtvolumen

von 5 ml für eine Stunde bei 4° C inkubiert. Im Anschluss wird eventuell vorhandenes

Präzipitat durch Zentrifugation bei 13000 xg für 10 min und bei 4° C in einer Eppendorf-

Tischzentrifuge entfernt.

Nach Äquilibrierung der Säule mit 1,5-fachem Säulenvolumen des entsprechenden Puffers

wird die Probe über eine 5 ml-Auftragsschleife injiziert. Die Proteinprobe wird von der

Säule mit Puffer eluiert und in 3 bis 5ml großen Fraktionen gesammelt. Die

Ausschlusschromatographie erfolgt für alle Proteine bei 4 °C und einer Fließgeschwin-

digkeit von 1,5 ml/Minute. Die Analyse der Fraktionen erfolgt anschließend durch SDS-

Polyacrylamidgelelektrophorese (2.2.3.3).


39

Puffer für den Komplex

Imp7/rpL23a

Puffer für den Komplex

Imp7/rpL5



2 mM ß-Mercaptoethanol 2 mM ß-Mercaptoethanol

Puffer für die Präparation von

rpL23a-BIB

Puffer die Komplexe

Imp7/rpL23aBIB

Imp7C598/rpL23aBIB

Impß 127-641/rpL23aBIB



1mM MgCl2 2 mM ß-Mercaptoethanol


2.2.4.6 Analytische Ausschlusschromatographie von Proteinen

Analytische Ausschlusschromatographiesäulen sind für die Präparation von Proteinen im

großen Maßstab aufgrund der geringen auftragbaren Probevolumina (> 500µl) eher

ungeeignet. Sie eignen sich jedoch gut für die Analyse von Proteinkomplexen. Da stabile

Komplexe während der Elution in der Regel intakt bleiben, lassen sich aus ihrem

Elutionsvolumen Rückschlüsse auf Eigenschaften wie z.B. das Molekulargewicht ableiten.

Für die analytische Gelfiltration wird eine Superdex S200 10/300 GL Säule von General

Electrics Health Care verwendet.

Für die Analyse von Komplexen der ribosomalen Proteine L5 bzw. L23a mit

Importrezeptoren werden die jeweiligen Proteine vor Beginn des Säulenlaufs in einem

Verhältnis von 2:1 (Rezeptor : ribosomales Protein) und einem Gesamtvolumen von

250 µl für eine halbe Stunde bei 4° C inkubiert. Im Anschluss wird eventuell vorhandenes


40

Präzipitat durch Zentrifugation bei 16100 xg für 10min und bei 4° C in einer Eppendorf-

Tischzentrifuge entfernt. Danach wird die Probe auf die zuvor mit Puffer gewaschene

Säule aufgetragen und eluiert. 0,5 ml große Fraktionen werden gesammelt und im SDS

Polyacrylamidgel analysiert.

Elutionspuffer

50 mM Tris/HCl pH 7.5

500 mM NaCl

2.2.4.7 Kalibrierung einer Auschlusschromatographiesäule

Das Retentionsvolumen eines Proteins korreliert bei einer ausschlusschromatographischen

Säule innerhalb eines bestimmten Trennbereichs direkt mit dem Molekulargewicht. So ist

es möglich, aus den Retentionsvolumina einer Reihe von globulären Proteinen mit

bekanntem Molekulargewicht eine Kalibrierungsgerade für eine Ausschlusschromato-

graphiesäule zu erstellen. Die Retentionsvolunina der Proteine sind hierbei proportional

zum Logarithmus des Molekulargewichts. Aus der Auftragung des Logarithmus der

Molekulargewichte der Proteine gegen die Retentionsvolumina lässt sich durch lineare

Regression die Funktion einer Kalibrierungsgerade errechnen. Hierfür wurden 25 µl Gel

Filtration Standard der Firma Bio-Rad (2.1.7) auf eine Superdex S200 10/300 GL-Säule

geladen und mit einer Flussgeschwindigkeit von 0,5 ml/min in dem unter 2.2.4.6

angegebenen Puffer eluiert. Die Kalibrierungsfunktion der Supderdex S200 10/300 GL-

Säule ist unter 3.1.2.5 angegeben.

2.2.5 Isotherme Titrationskalorimetrie

Die Methode der isothermischen Titrationskaloriemetrie (ITC) ermöglicht die

thermodynamische Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen. Fast jede

chemische Reaktion ist mit einer Freisetzung oder Absorption von Wärme verbunden. Mit

Hilfe der ITC ist es möglich, diese Wärme hochsensitiv über einen Leistungskompen-

sationsmechanismus im µcal·s-1-Bereich zu messen. Dabei wird die Wärmeenthalpie


41

bestimmt, die bei der Assoziation eines Liganden mit seinem Bindepartner umgesetzt

wird. Die Titrationsexperimente wurden in einem VP-ITC Mikrokalorimetersystem

(Microcal Inc., MA) durchgeführt.

Das ITC besteht aus einer Referenzzelle (RZ) und einer Messzelle (MZ), die jeweils ein

Volumen von ca.1.4 ml fassen. Sie sind von einem adiabatischen Mantel umgeben, der den

Temperaturausgleich mit ihrer Umgebung verhindert. Während die RZ den Puffer der

Probe enthält, wird die MZ mit der Lösung des ersten Reaktionspartners befüllt. In die

MZ wird eine Spritze eingeführt, welche die Lösung des zweiten Reaktanden enthält.

Diese Spritze fasst ein Volumen bis zu 285 µl. Das Ende der Spritzennadel dient als

Rührpaddel und ermöglicht eine Durchmischung des Reaktionsvolumens. In festgelegten

Zeitintervallen wird so ein definiertes Volumen des zweiten Reaktanden computergesteuert

in die MZ injiziert.

Die RZ wird mit einer geringen Leistung im µW-Bereich beheizt. Dieses Heizsystem wird

als „Referenz-Offset“ bezeichnet. Sowohl zwischen der RZ und MZ als auch zwischen den

Zellen und dem Mantel des Gerätes werden ständig die Temperaturdifferenzen ∆T1 und

∆T2 ermittelt. Die Temperatur der Zellen und des Mantels werden jeweils auf die der

Referenzzelle durch die Aktivierung eines weiteren Heizsystems, dem „Jacket Feedback“,

abgestimmt. Kommt es aufgrund einer Reaktion innerhalb der MZ zu einer Absorption

oder Freisetzung von Energie in Form von Wärme, ist eine Temperaturdifferenz ∆T1

detektierbar. Dies führt zur Erzeugung eines dem ∆T1-Wert proportionalen elektrischen

Signals, welches über ein Rückkopplungsglied das sogenannte „Cell Feedback“ aktiviert.

Dies ist das dritte Heizsystem, welches durch eine Reduktion (exotherme Reaktion in der

MZ) oder Verstärkung (endotherme Reaktion in der MZ) der Heizleistung zu einem

Temperaturausgleich zwischen RZ und MZ (∆T1=0) führt. Dieses elektrische

Kompensationssignal wird als Funktion der Zeit aufgezeichnet.

In der vorliegenden Arbeit wurde die ITC dazu genutzt, die bei der Bildung von

Komplexen aus Kernimportrezeptoren (Impß und Imp7) und ribosomalen Proteinen

umgesetzten Bindungsenthalpien, -entropien und -affinitäten zu detektieren sowie die

auftretenden Stöchiometrien zu ermitteln. Dabei wurden die Importrezeptoren in eine

Messzelle vorgelegt und das jeweilige ribosomale Protein hinzutitriert. Die verwendeten

Proteinkonzentrationen sind in den jeweiligen Ergebnisteilen angegeben. Die

Proteinkonzentrationen der Importrezeptoren wurden nach Bearden und die der

ribosomalen Proteine über die Absorption bei 280 nm bestimmt (2.2.6.1.2).


42

Alle Lösungen wurden vor Gebrauch bei 8 °C entgast (ThermoVac, Microcal) und unter

Vermeidung von Luftblasen in die mehrmals mit Puffer gespülte Messzelle des

Titrationskalorimeters (VP-ITC, MicroCal) eingebracht. Die Puffer- und Konzentrations-

bedingungen der einzelnen Experimente sind im jeweiligen Ergebnisteil aufgeführt. Die

Referenzzelle enthielt stets den gleichen Puffer wie die Messzelle. Beim Befüllen der

computergesteuerten Injektionseinheit wurde darauf geachtet, dass keine Luftblasen in das

System gelangten und der als Rührer dienende abgeflachte Spritzenkopf gut gereinigt

wurde. Alle ergebnisrelevanten Messungen wurden bei 10 °C durchgeführt, da einige der

entstehenden Proteinkomplexe zum Präzipitieren neigten und dadurch die Messsignale

verfälschten. Zu Beginn jedes ITC-Experiments wurden zunächst 4 µl injiziert. Die

darauffolgenden Injektionsvolumina waren jeweils 10 µl groß. Die Auswertung der

Rohdaten erfolgte über MicroCal Origin Version 7.0.

Folgende Puffersysteme wurden verwendet:

ITC-Puffer 1 (NaCl/Tris Puffer) ITC-Puffer 2 (Kaliumacetat-Puffer)

20 mM Tris / HCl pH 7,5 20 mM Kaliumphosphat pH 7,5

300 mM NaCl 20 mM Tris / HCl pH 7,5

1mM MgCl2 300 mM Kaliumacetat

1mM MgCl2

2.2.6 Spektroskopische Methoden

2.2.6.1 Absorption

Alle Absorptionsmessungen werden an einem Ultraspec2100pro Spektrophotometer in

100µl Küvetten durchgeführt.


43

2.2.6.1.1 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäure-Lösungen

Die Konzentration wässriger Nukleinsäurelösungen wird quantitativ im Photometer bei

260 nm gegen einen Leerwert bestimmt. Folgende Umrechnungswerte werden hierbei

herangezogen:

1 A 260nm = 50 µg/ml doppelsträngige DNA

1 A 260nm = 40 µg/ml einzelsträngige DNA

1 A 260nm = 33 µg/ml Oligonukleotid

Die Reinheit der Nukleinsäurelösung wird über den Quotient der Extinktionen bei 260 nm

und 280 nm ermittelt.

Während die aromatischen Basen der Nukleinsäuren ein Absorptionsmaximum bei 260 nm

besitzen, absorbieren die aromatischen Aminosäuren der Proteine vor allem im Bereich

von 280 nm. Reine DNA liegt bei einem Quotienten von 1,8 bis 2,0 vor. Mit Proteinen

verunreinigte DNA-Lösungen besitzen einen kleineren Quotienten der Absorptionen bei

260 nm bzw. 280 nm.

2.2.6.1.2 Konzentrationsbestimmung von Protein-Lösungen

Es wurden drei verschiedene Methoden zur quantitativen Bestimmung von

Proteinlösungen verwendet:

Methode nach Bearden (1978) („Bradford-Assay“):

Proteine lassen sich in phosphorsaurer Lösung mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue

anfärben. Die Proteinkonzentration kann mittels Absorption bei 595 nm photometrisch

bestimmt werden, da sich das Absorptionsspektrum des Farbstoffes in einem Bereich von

OD595 0,1 – 0,9 proportional zur Proteinkonzentration ändert.

20 µl Proteinprobe werden mit 1 ml 1:5 in Wasser verdünnter Bradfordreagens (1 mg/ml

Coomassie Brilliant Blue G 250 in 85%iger H3PO4) versetzt und nach 10 Minuten die

Absorption bei 595 nm gegen einen Leerwert gemessen. Aus dem Vergleich zu einer

durch verschiedene Konzentrationen an BSA erstellten Eichkurve lässt sich die

Proteinmenge der unbekannten Probe ermitteln.


44

Proteinbestimmung über die Absorption bei 280 nm:

Bei dieser Methode wird die Proteinkonzentration durch Messung der Absorption bei einer

Wellenlänge von 280 nm ermittelt. Hierfür wird der native Extinktionskoeffizient (ε280)

benötigt. Extinktionskoeffizienten nativer Proteine bei 280 nm (ε280) werden mit einem

modifiziertem Protokoll nach Gill und von Hippel, ausgehend vom Lambert-Beerschen

Gesetz errechnet:

dcA ××= ε

Dabei entspricht ε dem molaren Extinktionskoeffizienten [M-1cm-1], c der Konzentration

[M] und d der Schichtdicke der Küvette [cm]. Der Extinktionskoeffizient eines

denaturierten Proteins (ε280denat) lässt sich von der Aminosäuresequenz ableiten

(Protparam, Expasy), während die Absorption bei 280 nm (A280) einer nativen und einer

denaturierten Proteinprobe gleicher Konzentration (c) in einer Küvette gleicher

Schichtdicke (d) messbar sind. Dabei gilt:

denat

natdenatnat A

A×=

εε

Die Konzentrationen der Proteinlösungen müssen dabei so eingestellt werden, dass die

Absorption A280 zwischen 0,2 und 0,8 beträgt und damit im linearen Bereich liegt. Für die

Messung wird bei allen Proteinen jeweils der finale Präparationspuffer (vgl. 2.2.4.4,

2.2.4.5) verwendet. Die zu denaturierten Proben werden zusätzlich mit 6 M

Guanidiniumhydrochlorid versetzt und für zwei Stunden bei 37 °C inkubiert. Die

Messungen werden jeweils drei Mal und bei 10 °C durchgeführt. Ist der native

Extinktionskoeffizient eines Proteins bei 280 nm (ε280) bekannt, so kann die

Proteinkonzetration über Messung der Absorption bei 280 nm errechnet werden. Nach

dem Lambert-Beerschen Gesetz gilt:

d

Ac

×=

ε

Dabei entspricht ε dem molaren Extinktionskoeffizienten [M-1cm-1], c der Konzentration

[M] und d der Schichtdicke der Küvette [cm].


45

Methode nach Ehresmann et al. (1973):

Diese Methode ist nützlich für die Konzentrationsmessung von Proteinen, die mit RNA

verunreinigt sind. Da RNA bei Wellenlängen von 228,5 und 234,5 nm eine identische

Absorption zeigt, ist es möglich, ihre Interferenz durch einen Korrekturfaktor zu

eliminieren. Dadurch fließt nur noch die Absorption des Polypeptidrückrades der Proteine

in die Berechnung mit ein. Es gilt:

14,35,2345,228 AA

c−

=

Dabei entspricht A228,5 der Absorption bei einer Wellenlänge von 228,5 nm, A234,5 der

Absorption bei einer Wellenlänge von 234,5 nm und c der Proteinkonzentration [mg/ml].

2.2.7 Kristallographische Methoden

2.2.7.1 Kristallisation von Proteinen

Bei der Kristallisation eines Proteins wird mit der Hilfe von Salzen, Puffern und

Präzipitantien eine Proteinlösung in den übersättigten Zustand überführt. In diesem

metastabilen Zustand gibt es zwei Möglichkeiten, wie sich ein Protein verhalten kann:

1. Es fällt aus, die Konzentration an gelöstem Protein sinkt dadurch drastisch ab.

Dieser Vorgang ist stark exergonisch, da so der höchste Grad an Entropie erreicht

werden kann.

2. Das Protein bildet Kristallisationskeime aus, aus denen Proteinkristalle wachsen

können. Dieser Prozeß geschieht in der Regel deutlich langsamer als die

Präzipitation und ist energetisch auch nicht so günstig, da nicht die maximale

Entropie erreicht wird.

In der Kristallographie werden Bedingungen gesucht, die den zweiten Fall ermöglichen.

Dazu werden zu Beginn initiale Kristallisationstests durchgeführt, um erste

Kristallisationsbedingungen für ein Protein zu finden. Hierbei handelt es sich um eine

Sammlung von empirisch ermittelten Eingangsbedingungen, die relativ häufig zur

Kristallisation verschiedener Proteine geführt haben. Das gereinigte Protein wird dabei zu

Anfang meist in einer Konzentration von mehr als 5mg/ml eingesetzt.


46

Sobald Bedingungen gefunden sind, die für eine Kristallisation günstig sind, wird in einem

Raster um die Bedingungen herum optimiert. Dabei können die Konzentrationen der

enthaltenen Salze, Puffer und Präzipitantien variiert werden, es können aber auch

Substitutionen getestet werden.

Für die Kristallisation im so genannten sitzenden Tropfen werden Kristallisationsplatten

mit 24 Ansätzen verwendet, deren einzelne Kammern eine zentrale Säule mit darin

liegender Vertiefung, dem so genannten well, und ein darunter liegendes Reservoir

besitzen. In das Reservoir wird eine Bedingung vorgelegt, die dann in der zentralen

Vertiefung mit dem Protein zu einem Tropfen vermischt wird. Es besteht also ein

Konzentrationsgradient an Salzen und Präzipitantien zwischen Tropfen und Reservoir, da

der Tropfen neben dem Protein nur 50 % der Salz- und Präzipitans-Konzentration des

Reservoirs enthält. Durch die Dampfdiffusion des Wassers aus dem Tropfen in das

Reservoir wird das Volumen des Tropfens in der zentralen Vertiefung nun langsam

verringert und das enthaltene Protein konzentriert. Dabei wird der Punkt der Übersättigung

erreicht und es kann als Ausweg aus diesem metastabilen Zustand eine

Proteinkristallisationskeimung stattfinden.

Zunächst werden 500 µl der zu testenden Kristallisationsbedingung in das Reservoir

pipettiert. Aus diesem wird nun 1 µl entnommen und in die Vertiefung überführt.

Anschließend wird 1 µl der Proteinlösung hinzupipettiert und die gesamte

Kristallisationsplatte mit Klarsichtklebeband verschlossen, um einem Austrocknen

vorzubeugen. Der Tropfen wird in regelmäßigen Abständen auf beginnende Kristallisation

kontrolliert. Bilder der verschiedenen Tropfen werden mit einer Digitalkamera, die auf ein

Binokular aufgesetzt wird, aufgenommen und am Computer bearbeitet.

Ein Teil der in dieser Diplomarbeit durchgeführten Kristallisationsansätze wurde mit

einem Kristallisationsroboter der EMBL-Outstation in Hamburg pipettiert (EMBL

Hamburg c/o DESY, Notkestraße 85, 22603 Hamburg, Germany). Dabei handelte es sich

ebenfalls um eine „Kristallisation im sitzenden Tropfen“. Allerdings wurden bei dieser

automatisierten Technik 200 nl Reservoir mit 200 nl Protein gemischt. Die Auswertung

der pipettierten Screens erfolgte über das Internet. In regelmäßigen Abständen wurden von

einem vollautomatischen Lagerungs- und Überwachungssystem digitale Fotos aller

Bedingungen aufgenommen und auf einen per Passwort verfügbaren Internet-Server

geladen.


47

2.2.7.2 Micro-Seeding zur Verbesserung der Kristallordnung

Wenn sich Kristalle formiert haben, die eine ungünstige innere Ordnung besitzen z. B. von

unregelmäßiger Gestalt und geringer Auflösung im Röntgendiffraktometer sind, so können

Bruchstücke dieser Kristalle in verdünnten Lösungen (z. B. 1:200 in einer frischen

Proteinlösung) Kristallisationskeime für Kristalle höherer Ordnung sein.

Hierzu werden Kristalle aus der Originalbedingung in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit

einer Lösung der Originalbedingung überführt und mechanisch durch einen Vortexer in

Kristallisationskeime zerlegt.

Diese Kristallisationskeime werden mithilfe eines Katzenschnurrhaares in neue Tropfen

überführt, „gesät“. Deren Inhalte sind analog zum ersten, mit einer Ausnahme: Die

Präzipitans- oder die Proteinkonzentration in diesen Tropfen müssen gegenüber dem ersten

verringert sein, da es sonst zu einer sofortigen Präzipitation des Proteins in den neuen

Tropfen kommen kann.

Ergebnisse

48

3 Ergebnisse

Der Ergebnisteil ist in zwei Abschnitte gegliedert.

Im ersten Abschnitt werden zunächst die Ergebnisse der Expression und Reinigung des

ribosomalen Proteins rpL5 aus Xenopus laevis dargestellt. Des Weiteren wird die

Präparation eines Komplexes von rpL5 mit dem Kernimportrezeptor Importin 7 (ebenfalls

X. laevis) sowie der Versuch einer Kristallisation dieses Komplexes beschrieben.

Der zweite Abschnitt behandelt zunächst die Ergebnisse der Expression und Reinigung des

ribosomalen Proteins rpL23a aus Homo sapiens. Auch dieses Protein wurde als Komplex

mit Importin 7 präpariert und für Kristallisationsversuche eingesetzt.

Ferner werden die Ergebnisse einer funktionellen Untersuchung der Bindung zwischen

rpL23a und den Importrezeptoren Impß und Imp7 dargestellt. Hierfür wurden die

Methoden der analytischen Ausschlusschromatographie und der isothermen

Titrationskalorimetrie eingesetzt.

Der letzte Teil des zweiten Abschnitts beschreibt zunächst die Klonierung und Präparation

der Bindedomäne von rpL23a (AS 32 - 74) für die Importrezeptoren Imp7 und Impß. Im

Anschluss wird die Präparation von Komplexen der Bindedomäne mit den

Importrezeptoren Imp7 (Volllänge), Imp7C598 (AS 598 - 1038) und Impß127-641 (AS

127-641) erläutert. Auch diese Komplexe wurden in Kristallisationsexperimenten

eingesetzt.

Ergebnisse

49

3.1 Biochemische Arbeiten mit dem Protein rpL5 aus Xenopus laevis

3.1.1 Klonierung und Expression von rpL5

3.1.1.1 Subklonierung von rpL5 aus Xenopus laevis in den Vektor pGEX-6P-1

Zu Beginn der Diplomarbeit wurde das codierende Gen für rpL5 aus Xenopus laevis

(accession number BC042258; NCBI), kloniert in den Expressionsvektor pGEX-5X-1,

von T. Pieler (Universität Göttingen) zur Verfügung gestellt. Dieses Konstrukt ermöglicht

die Expression von rpL5 als Fusionsprotein mit einer N-terminalen Gluathion-S-

Transferase (GST)-Affinitätssequenz. Die ausgehend von pGEX-5X-1 exprimierten

Fusionsproteine besitzten zur Entfernung der GST-Sequenz jedoch nur eine Schnittstelle

für die Protease Faktor Xa. Diese Protease war nicht verfügbar und im Labor nicht

praxiserprobt. Daher wurde eine Subklonierung in den Vektor pGEX-6P-1 durchgeführt.

Die Expressionsprodukte dieses Vektors sind ebenfalls Fusionsproteine mit einer N-

terminalen GST-Sequenz. Sie besitzen jedoch zwischen Affinitätssequenz und Zielprotein

eine Schnittstelle für die Protease PreScission.

Für die Subklonierungs-PCR (2.2.1.1.1) wurden die DNA-Oligonukleotide

rpL5_BamHIfor und rpL5_XhoIrev (2.1.8) verwendet und das amplifizierte Gen über

BamHI- und XhoI-Schnittstellen in pGEX-6P-1 inseriert. Das Vektorkonstrukt pGEX-6P-

1-rpL5 wurde in E. coli XL1-Blue transformiert (2.2.2.1) und in einer anschließenden

Mini-Präparation (2.2.2.2) amplifiziert.

Zur Kontrolle der Subklonierung wurde eine Sequenzanalyse (2.2.1.1.5) unter

Verwendung der DNA-Oligonukleotide pGEX_f und pGEX_r (2.1.8) durchgeführt.

3.1.1.2 Expression von rpL5 mit GST-Affinitätssequenz

Ein erstes Ziel war es zunächst, einen geeigneten Expressionsstamm sowie geeignete

Wachstumsbedingungen für eine maximale Expressionsausbeute von rpL5 zu finden. Da

Ergebnisse

50

das Protein für Kristallisationsansätze verwendet werden sollte, wurde eine Ausbeute von

mehreren mg/L Expressionskultur angestrebt.

Mehrere E.coli-Stämme (BL21(DE3), BL21(DE3) RP, Rosetta 2 (DE3), BL21(DE3)

STAR) wurden mit dem zuvor amplifizierten Plasmid pGEX-6P-1-rpL5 transformiert

(2.2.2.1). Die Expression erfolgte nach dem unter 2.2.2.3.1 beschriebenen Protokoll. Die

stärkste Expression des Zielproteins zeigte sich in den Stämmen BL21(DE3) RP und

BL21(DE3) Rosetta 2. Beide Stämme wurden für die Überexpression eingesetzt und

lieferten etwa gleiche Mengen des Fusionsproteins GST-rpL5. Abbildung 9 zeigt eine

SDS-PAGE mit Proben der Expression von GST-rpL5 in Rosetta 2 (DE3).

Die Überexpression von GST-rpL5 im präparativen Maßstab erfolgte wie unter 2.2.2.3.2

beschrieben.

Abbildung 9: SDS-PAGE der Expression von GST-rpL5 in pGEX-6P-1 in E.coli Rosetta 2 (DE3). (vI = vor Induktion, nI = nach Induktion, M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel)

3.1.1.3 Zellernte und Aufschluss von GST-rpL5

Die Expressionskulturen wurden durch Zentrifugation bei 5000 xg für 20 Minuten und bei

4 °C geerntet und wie unter 2.2.2.3.3 beschrieben aufgeschlossen. Bei den ersten

Versuchen einer Affinitätsreinigung mit einer GSH-Sepharose-Säule waren größere

Mengen RNA aus E. coli unspezifisch an rpL5 gebunden (Daten nicht gezeigt). Mit Hilfe

einer hohen Konzentration von LiCl war es jedoch möglich, die gebundene RNA von rpL5

zu lösen. Daher wurde ein Lysispuffer mit 2,2 M LiCl für den Aufschluss der

Ergebnisse

51

Bakterienpellets eingesetzt (siehe 2.2.2.3.3). GST-rpL5 war im Aufschlusspuffer

größtenteils löslich. Wie eine SDS-PAGE der Proben von Überstand und Pellet nach der

Zentrifugation bei 30000 xg (vgl. 2.2.2.3.3) zeigt (Abbildung 11), befand sich der größte

Teil des Fusionsproteins im Überstand.

3.1.2 Reinigung von rpL5 aus Xenopus laevis

3.1.2.1 Affinitätschromatographische Reinigung über Glutathion-Sepharose

Nach dem Aufschluss der Bakterienpellets (2.2.2.3.3) und der anschließenden

Zentrifugation wurde der Überstand auf eine 30 ml GSH-Sepharose geladen (2.2.4.1)

(Abbildung 10).

Abbildung 10: Chromatogramme eines Säulenlaufs mit einer 30 ml GSH-Sepharose 4B –Säule zur Reinigung von GST-rpL5. (A) Laden des Überstandes mit anschließendem LiCl-Waschschritt; (B) Elution von GST-rpL5 mit 20mM reduziertem Glutathion. Die Fraktionen 3 – 12 wurden für die weitere Reinigung vereint, beschriftet mit E beim SDS-Gel von Abbildung 11.

Ergebnisse

52

Abbildung 11: SDS-PAGE von Überstand (Ü), Pellet (P), Fraktionen der Beladung (F) und den vereinigten Elutionsfraktionen (E). Roter Pfeil: GST-rpL5 (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

Im Anschluss an die Beladung wurde ein Waschschritt mit dem ebenfalls für den

Aufschluss verwendeten Lysispuffer durchgeführt, um verbliebene RNA von GST-rpL5 zu

lösen. Die während des Absorptionsmaximums des Waschschritts eluierte Fraktion

(Fraktion 9) wurde mittels SDS-PAGE analysiert (Abbildung 11). Neben einer geringen

Menge an GST-rpL5 (Molekulargewicht 60,4 kD) wird auch ein Protein von etwa 50 kDa

von der Säulenmatrix gelöst. Die Elution von GST-rpL5 erfolgte durch einen Puffer mit 20

mM reduziertem Glutathion (2.2.4.1). GST-rpL5 lag nach der ersten Säule schon relativ

rein vor (Abbildung 11). Charakteristisch war jedoch eine schwache Verunreinigung durch

das gleiche etwa 50 kDa große Protein, das zuvor schon bereits größtenteils beim

Waschschritt mit LiCl entfernt wurde.

Die Ausbeute der vereinigten Fraktionen der GSH-Sepharose-Reinigung betrug

durchschnittlich 12 -13 mg/L Expressionskultur, bestimmt nach der Methode von Bearden

(2.2.6.1.2) (Übersicht der Ausbeuten in Tabelle 4 unter 3.1.2.4).

3.1.2.2 Spaltung des Fusionsproteins GST-rpL5 durch PreScission Protease

Die etwa 26 kDa große N-terminale Glutathion-S-Transferase-Affinitätssequenz (GST-

Sequenz) von GST-rpL5 wurde im Anschluss an die affinitätschromatische Reinigung mit

Hilfe der Protease PreScission proteolytisch von rpL5 gespalten (2.2.3.5). Hierzu wurden

Ergebnisse

53

die nach der GSH-Sepharose vereinigten Fraktionen für mindestens 12 Stunden bei 4° C

mit der Protease PreScission im Massenverhältnis 1:200 inkubiert. Die GST-Sequenz

wurde fast vollständig abgespalten, wie anhand einer mittels SDS-PAGE (Abbildung 12)

analysierten Probe ersichtlich ist.

Bei ersten Reinigungsversuchen kam es im Verlaufe des Schneideprozesses zu starker

Präzipitatbildung in Folge einer zu niedrigen NaCl Konzentration (300mM NaCl). Dieser

Effekt konnte jedoch durch Verwendung eines Puffers mit 500mM NaCl weitestgehend

eliminiert werden (2.2.4.1).

Als wichtig erwies sich, dass alle auf die proteolytische Abspaltung der GST-Sequenz

folgenden Reinigungsschritte bei möglichst niedrigen Temperaturen durchgeführt werden

(4°C), da rpL5 bei Raumtemperatur zur Präzipitation neigt. Wichtig war auch die Zugabe

von Protease-Inhibitoren vor dem Laden der Probe auf die nachfolgende SP-Sepharose-

Säule (2.2.4.3), da rpL5 sensitiv für einen Abbau durch Proteasen ist (Daten nicht gezeigt).

3.1.2.3 Kationenaustauschchromatographische Reinigung von rpL5

Nach der proteolytischen Abspaltung der N-terminalen GST-Sequenz von rpL5 wurde als

nächstes eine chromatographische Reinigung mit Hilfe eines Sulphopropyl-Sepharose-

Kationentauschers (SP-Sepharose) durchgeführt (2.2.4.3). Hauptziel dieses Reinigungs-

schrittes war die Trennung der abgespaltenen GST-Affinitätssequenz von rpL5. GST

bildet unter den gegebenen Pufferbedingungen (2.2.4.1) Dimere mit einem

Molekulargewicht von ca. 52 kD und kann daher durch Gelfiltrationssäulen nur schwierig

von rpL5 (34,4 kDa) getrennt werden. Der pI (isoelektrischer Punkt) von GST liegt bei pH

6,8, weshalb das Protein bei pH 7,5 in Puffer A (vgl.2.2.4.3) eine negative Nettoladung

besitzt und nach dem Beladen der Säule im Durchfluss eluiert wird.

Die Auftrennung der gebundenen Proteine erfolgte über einen Salzgradienten von 0,3 bis 1

M NaCl (Abbildung 12). Bei einer Konzentration von etwa 750-800 mM NaCl wurde rpL5

von der Säulenmatrix verdrängt. Eine Analyse von Proben des Absorptionsmaximums

mittels SDS-PAGE zeigte, dass rpL5 in hochreiner Form vorlag. Die Fraktionen 28 bis 34

wurden vereinigt und für die weitere Verarbeitung bei 4° C gelagert.

Ergebnisse

54

Abbildung 12: (A) Chromatogramm des SP-Sepharose-Laufs. Das Chromatogramm der Beladung ist nicht gezeigt. Bei dem Absorptionsmaximum auf der linken Seite handelt es sich um den letzten Teil des Durchflusses der Beladung. (blaue Linie: Absorption bei 280 nm, der Elutionsgradient ist grün dargestellt). (B) SDS-PAGE der SP-Sepharose-Reinigung. In der ersten Spur nach dem Marker wurde eine Probe des auf die SP-Sepharose geladenen proteolytischen Verdaus von GST-rpL5 aufgetragen. Die Zahlen der Beschriftung beziehen sich auf die Nummern der gesammelten Fraktionen im Chromatogramm. In Fraktion 1 ist die mit dem Durchfluss von der Säule eluierte GST-Affinitätssequenz erkennbar. (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

3.1.2.4 Finales Umpuffern von rpL5

Der letzte Teil der Präparation von rpL5 bestand darin, das Protein in den finalen Puffer

(2.2.4.4) zu überführen. Hierür wurde ein ausschlusschromatographischer Lauf mit einer

High Prep Desalting 26/10-Entsalzungs-Säule durchgeführt (2.2.4.4).

Die vereinigten Fraktionen der SP-Sepharose-Reinigung wurden zunächst durch

Zentrifugation in einem Konzentrator auf ein Volumen von V = 10ml eingeengt (2.2.3.1).

Die Äquilibrierung und Beladung der Säule sowie die Elution des Proteins wurden, wie

unter 2.2.4.4 beschrieben, durchgeführt. In Abbildung 13 ist das Chromatogramm des

Entsalzungslaufs dargestellt. Die Fraktionen 5 bis 9 wurden vereinigt und auf eine

Konzentration von c = 9,6 mg/ml (bestimmt nach Bearden – 2.2.6.1.2) eingeengt.

In Tabelle 2 sind die nach den jeweiligen Reinigungsschritten ermittelten Ausbeuten

aufgelistet. Die finale Ausbeute betrug 4,0 mg/L Expressionskultur, bestimmt nach der

Methode von Bearden. Eine Bestimmung der Ausbeute über die Absorption bei 280 nm

(A280) sowie nach Ehresmann (2.2.6.1.2) lieferte abweichende Ergebnisse (Tabelle 2). Für

Ergebnisse

55

die Proteinbestimmung durch Messung von A280 wurde der native Extinktionskoeffizient

(2.2.6.1.2) von rpL5 bestimmt (Tabelle 1).

Tabelle 1: Vergleich von denaturiertem und nativen Extinktionskoeffizienten von rpL5.

Denaturierter Extinktions-

koeffizient ε280 [M-1/cm-1]

Nativer Extinktions-


Abweichung

34060 37670 + 10.6 %

Tabelle 2: Auflistung der mit verschiedenen Methoden bestimmten Ausbeuten von rpL5.

Säule Methode Ausbeute

[mg/L]

Abweichung im Vergleich zu

der Bestimmung nach Bearden

GSH-Sepharose Bearden 12 -13 -

SP-Sepharose Bearden 4,2 -

Bearden 4,0 -

Absorption 280 nm 2,0 -50 % Desalting-HiPrep

26/60 Ehresmann 2,1 - 49%

Abbildung 13: (A) Chromatogramm des Entsalzungslaufs von rpL5 mit einer „Sephadex G−25 Fine HiPrep Desalting 26/10“ 53ml - Säule. Die Fraktionen 5 bis 9 wurden vereinigt (blaue Linie: Absorption bei 280 nm, rote Linie: gemessene Leitfähigkeit). (B) SDS-Gel mit einer aufgetragenen Probe der finalen Präparation von rpL5 (M=Größenstandard BR, FP = „Finale Präparation“ , 15%iges SDS-Gel).

Zum Abschluss der Prparation wurde ein UV-Absorptionsspektrum von rpL5 gemessen.

Hierdurch sollte nachgewiesen werden, dass das Protein frei von RNA-Verunreinigungen

Ergebnisse

56

vorlag. Abbildung 14 zeigt den Vergleich der UV-Spektren einer früheren Reinigung von

GST-rpL5 ohne LiCl (Daten nicht gezeigt) und der finalen Präparation von rpL5 unter

Verwendung des etablierten Reinigungsprotokolls. Bei früheren Reinigungen ohne LiCl

konnte ein Absorptionsmaximum nahe der Wellenlänge von 254 nm beobachtet werden

(Abbildung 14 A). Dies ist ein deutliches Zeichen für RNA-Verunreinigungen. Die

Verwendung von LiCl hingegen führte zur Entfernung der RNA. Hier konnten in den

Absorptionsspektren von GST-rpL5 nach der GSH-Sepharose-Reinigung (Daten nicht

gezeigt) und rpL5 nach der SP-Sepharose-Reinigung (Abbildung 14 B) keine RNA-

Verunreinigung mehr beobachtet werden. Die Absorptionsmaxima lagen nahe der für

Proteine typischen Wellenlänge von 280 nm.

Abbildung 14: Absorptionsspektren verschiedener Reinigungen von rpL5. (A) Absorptionsspektrum einer frühen Reinigung von GST-rpL5 über GSH-Sepharose. (B) UV-Absorptionsspektrum von rpL5 nach der finalen Präparation.

3.1.2.5 Ausschlusschromatographische Analyse des gereinigten rpL5

Die Reinigungsschritte der Präparation von rpL5 ergaben keine Informationen über den

vorliegenden Oligomerisierungsgrad. Daher wurde ergänzend eine analytische

Gelfiltration mit einer Sephadex S200 10/300 GL - Säule durchgeführt (2.2.4.6). Hierfür

wurden 350 ng rpL5 (bestimmt nach Bearden, 2.2.6.1.2) mit einer 500 µl-Schleife auf die

Säule geladen. Für die analytische Gelfiltration wurde ein 500 mM NaCl enthaltender

Elutionspuffer verwendet (2.2.4.6). rpL5 neigt bei Raumtemperatur zur Präzipition. Dieser

Ergebnisse

57

Effekt ist bei Puffern mit bis zu 300 mM NaCl stark ausgeprägt, lässt sich aber durch

Verwendung eines 500 mM NaCl-haltigen Puffers abschwächen.

Das Retentionsvolumen von rpL5 betrug 15,05 ml (Abbildung 15A). Um ausgehend vom

Retentionsvolumen das Molekulargewicht ausrechen zu können wurde wie unter 2.2.4.7

beschrieben eine Kalibrierungsgerade für die Säule erstellt. In Tabelle 3 sind die

Molekulargewichte und Retentionsvolumina der eingesetzen Standardproteine angegeben.

Die Funktion der errechneten Kalibrierungsgerade lautet:

Molekulargewicht = 10(4,5859 – 0,2017 * V) (V = Retentionsvolumen)

Hieraus ergibt sich für rpL23a ein zugehöriges Molekulargewicht von 35,5 kDa. Dies

entspricht fast dem realen Molekulargewicht von 34,4 kDa. Es kann daher davon

ausgegangen werden, dass rpL5 als Monomer gereinigt wurde.

Abbildung 15: (A) Chromatogramm eines analytischen Gelfiltrationslaufs von rpL5 mit einer Superdex S200 10/300 GL-Säule. (blaue Linie: Absorption bei 280 nm, rote Linie: Absorption bei 254 nm). (B) Zugehöriges SDS-Gel. Die Fraktionen 28, 30-32 und 34 wurden aufgetragen. Sie beinhalten rpL5 (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

Tabelle 3 Molekulargewichte und Retentionsvolumina der Proteine der Kalibrierung.

Molekulargewicht [kDa] log(MW) V [ml]

670 2,8261 8,72

158 2,1987 11,77

44 1,6435 14,71

17 1,2304 16,64

3,13 0,4955 20,24

Ergebnisse

58

3.1.3 Kristallisationsversuche mit dem Komplex Imp7/rpL5

Ein Hauptziel dieser Diplomarbeit war die Untersuchung der Interaktionen der

ribosomalen Proteine rpL5 und rpL23a mit dem Kernimportrezeptor Importin 7 aus

Xenopus laevis. Zu diesem Zweck wurde ein Komplex der rekombinant gewonnenen

Proteine rpL5 und Importin 7 präpariert. Der gereinigte Imp7/rpL5-Komplex sollte zur

Kristallisation gebracht werden, um eine Aufklärung der dreidimensionalen Struktur durch

Röntgenbeugungsexperimente zu ermöglichen.

3.1.3.1 Präparation eines Komplexes aus rpL5 und Importin 7

Der Kernimportfaktor Imp7 aus Xenopus laevis wurde nach einem Protokoll von Daniel

Wohlwend (Universität Göttingen) gereinigt. Für die Präparation des Imp7/rpL5-

Komplexes wurden 57.6 nmol rpL5 (2,0 mg - bestimmt nach Bearden, 2.2.6.1.2) und

40 nmol Imp7 (4,8 mg - bestimmt nach Bearden, 2.2.6.1.2) für 60 Minuten auf Eis

inkubiert. Der gebildete Komplex wurde mit Hilfe einer präparativen Gelfiltration mittels

einer Superdex S200 XK 26/60-Säule bei 4° C isoliert (2.2.4.5). Hierfür wurde die Säule

zunächst mit einem Säulenvolumen „Komplexpuffer Imp7/rpL5“ (2.2.4.5) equilibriert.

Anschließend wurde der Ansatz über eine 5 ml Auftragungsschleife auf die Säule geladen

und der Säulenlauf mit „Komplexpuffer Imp7/rpL5“ durchgeführt. Ein Absorptions-

maximum nach 164 ml Elutionsvolumen enthielt den isoliert vorliegenden Imp7/rpL5-

Komplex (Abbildung 16). Die Fraktionen 14 bis 20 wurden vereinigt und auf 9,4 mg/ml,

bestimmt nach Bearden (2.2.6.1.2), konzentriert (2.2.3.1). Aus der SDS-PAGE einer Probe

der Präparation ging hervor, dass Imp7 einen stabilen Komplex mit rpL5 gebildet hatte

(Abbildung 16). Der präparierte Komplex wurde bei 4° C gelagert und für

Kristallisationsexperimente verwendet (3.1.3.2).

Ergebnisse

59

Abbildung 16: (A) Chromatogramm der Komplexpräparation von Imp7/rpL5 mit einer Superdex S200 XK 26/60 - Säule. (B) Zugehöriges SDS-Gel. Es wurden 5 �l (links) und 10 �l (rechts) Imp7/rpl5 in 1:1 SDS-Probenpuffer (2.2.3.3) aufgetragen (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

3.1.3.2 Versuch einer Kristallisation des Imp7/rpL5-Komplexes

Ein Ziel der vorliegenden Diplomarbeit sollte die Kristallisation des Komplexes aus

Importin 7 und rpL5 sein. Alle hierfür mit dem Komplex pipettierten

Kristallisationsansätze sind in Tabelle 4 aufgeführt. Zu Beginn wurden die

Kristallisationsscreens Footprint I und II (2.1.9) bei 20°C mit einer Konzentration von 9,4

mg/ml pipettiert, um das Präzipitationsverhalten zu analysieren (2.2.7.1). Nachdem der

Imp7/rpL5-Komplex in etwa 90% aller Bedingungen von Footprint I und II präzipitierte,

wurde die Proteinkonzentration auf 4,8 mg/ml verdünnt. Ein Großteil der folgenden

Kristallisationsscreens wurde mit einem Kristallisationsroboter der EMBL-Outstation in

Hamburg pipettiert. Die Auswertung dieser Kristallisationsansätze erfolgte über das

Internet (2.2.7.1)

Ergebnisse

60

Tabelle 4: Darstellung aller pipettierten Bedingungen für Imp7 / rpL5.

Screen Imp7 / rpL5

[mg / ml]

Footprint 1-2 9,4

Crystal Screen 1 + 2 4,8*

Wizard 1 + 2 4,8*

JB 1-8 4,8*

PACT 4,8*

JCSG 4,8*

Salt RX 4,8*

pH Clear 4,8

Alle Screens wurden bei 20°C pipettiert und gelagert, die mit * gekennzeichneten Screens wurden mit einem Kristallisationsroboter der EMBL-Outstation in Hamburg pipettiert (Screens vgl. 2.1.9).

Bislang konnte in keinem Kristallisationsansatz eine Kristallbildung beobachtet werden.

Auffallend ist jedoch die höhere Löslichkeit des Komplexes in Bedingungen mit den

Alkoholen MPD und Ethanol. Hierbei sind besonders die Kristallisationsscreens JB7 und

JB8 hervorzuheben, bei denen MPD bzw. Ethanol ein Grundbestandteil der

Kristallisationsbedingungen ist.

Zusätzlich wurden auch die Kristallisationsscreens Footprint I-III für rpL5 ohne

Bindungspartner mit einer Proteinkonzentration von 9,6 mg/ml pipettiert. Hier zeigte sich

eine schnelle Präzipitation in fast allen Bedingungen, lediglich bei einigen Bedingungen

mit kurzkettigen Polyethylenglykolen (PEGs) und 0,1M HEPES pH 7,5–8,2 wurde eine

bessere Löslichkeit beobachtet.

3.1.4 Klonierung verkürzter Fragmente von rpL5

Verschiedene verkürzte Fragmente von rpL5 wurden für Kristallisationsversuche mit Imp7

und für funktionelle Untersuchungen kloniert. Die Auswahl der Fragmente erfolgte auf

Basis des Sekundärstrukturvorhersageprogramms PSIPredict (2.1.10) sowie durch einen

mit dem Programm Protscale (2.1.10) errechneten Polaritätsindex. Hierbei wurde darauf

Ergebnisse

61

geachtet, dass die Enden der Fragmente nicht innerhalb von sekundärstrukturtragenden

Sequenzabschnitten lokalisiert sind. Dadurch sollte eine Strukturstabilisierung der

Fragmente erreicht werden. Des Weiteren wurde darauf geachtet, dass die neue terminale

Aminosäure des Fragments eine ionische Seitenkette besitzt. Dies sollte die Löslichkeit der

Fragmente verbessern.

Für die Klonierung der rpL5-Fragmente wurde das in den Vektor pGEX-6P-1 klonierte

Volllänge-Gen als Matrize verwendet (3.2.1.1). Die Amplifikations-PCR (2.2.1.1.1)

erfolgte unter Verwendung der in Tabelle 5 angegebenen Oligonukleotide (2.1.8). Die

amplifizierten Genfragmente wurden über die Endonukleasen BamHI und XhoI in pGEX-

6P-1 inseriert (2.2.1.1.2) und ligiert (2.2.1.1.4). Zur Kontrolle der Klonierung wurde eine

Sequenzanalyse (2.2.1.1.5) unter Verwendung der DNA-Oligonukleotide pGEX_f und

pGEX_r (2.1.8) durchgeführt. Die Konstrukte pGEX-6P-1-rpL5/nostop* (AS 1-48),

pGEX-6P-1-rpL5/nostop* (AS 1-189) und pGEX-6P-1-rpL5/nostop* (AS 1-234) werden

bis zum Stopcodon der multiple cloning side translatiert, so dass nach den rpL5-

Fragmenten die Aminosäuresequenz LERPHRN folgt.

Tabelle 5 Übersicht über die Vektorkonstrukte der verkürzten Fragmente von rpL5.

Vektor-Konstrukte (2.1.5) Verwendete Oligonukleotide (2.1.8)

pGEX-6P-1-rpL5/nostop* (AS 1-48) rpL5_BamHIfor, rpL5_N48rev



pGEX-6P-1-rpL5 (AS 48-296) rpL5_C48for, rpL5_XhoIrev



Ergebnisse

62

3.2 Biochemische Arbeiten mit dem Protein rpL23a aus Homo sapiens

3.2.1 Expression, Zellernte und Aufschluss von rpL23a

3.2.1.1 Subklonierungen von rpL23a in die Vektoren pGEX-6P-1 und pQE80

Zu Beginn der Diplomarbeit wurde das Gen von rpL23a aus Homo sapiens (accession

number BC014459; NCBI), in dem Expressionsvektor pQE70, von D. Doenecke

(Universität Göttingen) zur Verfügung gestellt (2.1.5). rpL23a wird ausgehend von pQE70

als Fusionsprotein mit einer N-terminalen 4z-Affinitätssequenz exprimiert. Mit „z“ wird

hierbei die IgG-Bindedomäne des Proteins A von Staphylococcus aureus bezeichnet, mit

deren Hilfe eine affinitätschromatografische Reinigung des Fusionsproteins über eine IgG-

Sepharose-4B-Säule möglich ist (Jäkel und Görlich, 1998). Da eine solche Affinitätssäule

nicht verfügbar war, musste eine Subklonierung, des für rpL23a codierenden Gens, in

geeignete Expressionsvektoren durchgeführt werden.

Es wurden zwei verschiedene Strategien zur Reinigung von rpL23a geplant:

Zum einen sollte das Protein mit einer N-terminalen Deca-Histidin-Affinitätssequenz,

ausgehend von dem Vektor pQE80 (2.1.5) exprimiert werden, um mittels einer Ni+-NTA-

Sepharose-Säule gereinigt werden zu können. Des Weiteren sollte, wie für rpL5 auch, eine

Affinitätsreinigung mittels GSH-Sepharose etabliert werden. Hierfür wurde eine

Subklonierung in den Vektor pGEX-6P-1 (2.1.5) durchgeführt.

Für die Subklonierung von rpL23a aus pQE070 in den Vektor pQE80 (2.1.5) wurde eine

Subklonierungs-PCR (2.2.1.1.1) mit den DNA-Oligonukleotiden rpL23a_BamHIfor und

rpL23a_HindIIIrev (2.1.8) durchgeführt. Das amplifizierte Gen wurde über BamHI- und

HindIII-Schnittstellen in pQE80 inseriert. Das Vektorkonstrukt pQE80-rpL23a wurde in

E. coli XL1-Blue transformiert (2.2.2.1) und in einer anschließenden Mini-Präparation

(2.2.2.2) amplifiziert. Zur Kontrolle der Subklonierung wurde eine Sequenzanalyse

(2.2.1.1.5) unter Verwendung der DNA-Oligonukleotide pQE80_for und pQE80_rev

(2.1.8) durchgeführt. Analog erfolgte die Subklonierung von rpL23a in den Vektor pGEX-

6P-1 (2.1.5). Hierfür wurden die Oligonukleotide rpL5_BamHIfor und rpL5_BamXhoIrev

eingesetzt ((2.1.8) und das amplifizierte Gen über die BamHI- und XHhoI-Schnittstellen in

Ergebnisse

63

pGEX-6P-1 inseriert. Die Sequenzanalyse (2.2.1.1.5) erfolgte unter Verwendung der

DNA-Oligonukleotide pGEX_f und pGEX_r (2.1.8).

3.2.1.2 Expression von rpL23a

Nach der Klonierung wurden zunächst Testexpressionen verschiedener E. coli-Stämme für

die beiden verwendeten Vektorkonstrukte durchgeführt. Mehrere E. coli-Stämme wurden

mit den Plasmiden pQE80-rpL23a bzw. pGEX-6P-1-rpL23a transformiert (2.2.2.1). Die

Expression erfolgte nach dem unter 2.2.2.3.1 beschriebenen Protokoll.

Für die Expression von N(His)10-rpL23a wurden die E.coli-Stämme M15 und SG3009

(pREP4) getestet. Das Expressionssignal war in beiden Stämmen etwa gleich stark (Daten

nicht gezeigt). M15 wurde für die Überexpression von N(His)10-rpL23a weiterverwendet.

Für die Expression von GST-rpL23a wurden die E.Coli-Stämme BL21 (DE3), BL21

(DE3) Star, BL21 (DE3) RP, BL21 (DE3) Rosetta 2 und Origami getestet (Daten nicht

gezeigt). Die Expression war in BL21 (DE3) RP und BL21 (DE3) Rosetta 2 am stärksten,

weshalb diese Stämme für die Überexpression von GST-rpL23a ausgewählt wurden.

Die Überexpression von N(His)10-rpL23a und GST-rpL23a im präparativen Maßstab

erfolgte wie unter 2.2.2.3.2 beschrieben. In Abbildung 17 sind die SDS-Gele für die

Proben der Expression von N(His)10-rpL23a und GST-rpL23a abgebildet. Es wurde

jeweils eine Probe zu Expressionsbeginn sowie zum Zeitpunkt der Zellernte aufgetragen.

Abbildung 17: (A) SDS-PAGE der Expression von N(His)10-rpL23a in pQE80 in E. coli M15. (B) SDS-PAGE der Expression von GST-rpL23a in pGEX-6P-1 in E.coli Rosetta 2 (DE3). (roter Pfeil = GST-rpL23a bzw. N(His)10 N(His)10-rpL23a, vI = vor Induktion, nI = nach Induktion, M = Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel)

Ergebnisse

64

3.2.1.3 Zellernte und Aufschluss der Expressionskulturen

Die Zellernte der Expressionskulturen für N(His)10-rpL23a und GST-rpL23a erfolgte

analog zur Zellernte der GST-rpL5-Expressionskulturen (vgl. 3.1.1.3) nach dem unter

2.2.2.3.3 beschriebenen Protokoll. Die Analyse des Aufschlusses von N(His)10-rpL23a

durch SDS-PAGE ist in Abbildung 18 (3.2.2.1) abgebildet. N(His)10-rpL23a befindet sich

nach der Zentrifugation bei 30000 xg für 40 min bei 4° C fast vollständig im Überstand.

Das SDS-Gel des Aufschlusses von GST-rpL23a ist in Abbildung 20 (3.2.2.2) dargestellt.

Auch GST-rpL23a befindet sich nach der Zentrifugation fast vollständig im Überstand.

3.2.2 Reinigung von rpL23a aus Homo sapiens

3.2.2.1 Versuch einer Reinigung von rpL23a mit Deca-Histidin-Sequenz

Zu Beginn der Diplomarbeit wurde versucht, N(His)10-rpL23a durch Affinitätschromato-

graphie mit einer HisTrapChelating Ni-NTA-Sepharose-Säule nach dem unter 2.2.4.2.

beschriebenen Protokoll zu reinigen. Das Protein konnte mit 450 – 600 mM Imidazol von

der Säule eluiert werden. Problematisch war jedoch eine starke Verunreinigung mit RNA,

die dazu führte, dass N(His)10-rpL23a im Laufe von 24 Stunden teilweise präzipitierte und

bei nachfolgenden Gelfiltrationen (Daten nicht gezeigt) ausschließlich im Ausschluss-

volumen eluiert wurde. Abbildung 19 zeigt ein UV-Spektrum der vereinigten Fraktionen

von N(His)10-rpL23a nach der Nickel-Säule. Auffällig ist die hohe Absorption bei 254 nm,

die charakteristisch für RNA ist.

Ergebnisse

65

Abbildung 18: (A) Chromatogramm der Elution von rpL 23a(His)10 von einer HisTrapChelating Ni-NTA-Sepharose-Säule. Die roten Balken markieren die vereinigten Fraktionen 15-25 (blau: UV-Absorption 280 nm, rot: Leitfähigkeit, grün: Anteil Elutionspuffer). (B) Zugehöriges SDS-Gel. (F = Probe nach Aufschluss, Pellet, Ü = Überstand, D = Durchfluss, W = Waschen mit Lysispuffer, 1-40 = Elutions-fraktionen, Gua = Abschließende Reinigung der Säule mit 6M Guanidiniumhydrochlorid)

(His)10-rpL23a nach HisTrap-Säule

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300

[nm]

Abs

orpt

ion

Abbildung 19: UV-Spektrum von (His)10-rpL23a nach der Reinigung mit einer HisTrapChelating Ni-NTA-Sepharose-Säule


Die Reinigung des Fusionsproteins GST-rpL23a exprimiert aus dem Vektor pGEX-6P-1

erfolgte weitgehend analog zur Reinigung von GST-rpL5 (3.1.2).

Ergebnisse

66

In Abbildung 20 ist neben den Chromatogrammen auch ein SDS-Gel mit Proben von

Aufschluss, Beladung, Durchfluss, Waschschritt und Elution abgebildet. Bei dem nach der

Beladung durchgeführten Waschschritt mit Lysispuffer wurde eine kleine Menge des

gebundenen GST-rpL23a von der Säule gelöst. Die Elution von GST-rpL23a erfolgte

durch einen Puffer mit 20 mM reduziertem Glutathion (vgl. 2.2.4.1). GST-rpL23a lag in

den vereinigten Elutionsfraktionen noch schwach verunreinigt vor (mehrere Banden

unterhalb von 40 kDa). Die Ausbeute der vereinigten Fraktionen der GSH-Sepharose-

Reinigung betrug durchschnittlich 12 mg/L, bestimmt nach der Methode von Bearden

(2.2.6.1.2) (Übersicht der Ausbeuten in Tabelle 7 unter 3.2.2.4).

Die Verwendung von LiCl in Lysis- und Waschpuffer (2.2.2.3.3 und 2.2.4.1) führte zu

einer Verbesserung der Löslichkeit im Vergleich zu frühen Reinigungsversuchen ohne

LiCl (Daten nicht gezeigt). Eine Messung eines Absorptionsspektrums für GST-rpL23a

nach der GSH-Sepharose-Reinigung deutete jedoch darauf hin, dass immer noch RNA-

Verunreinigungen vorhanden waren (siehe Abbildung 23 unter 3.2.2.3).

Zur Entfernung der GST-Affinitätssequenz wurde GST-rpL23a, analog zu GST-rpL5,

(vgl.2.2.3.5 und 3.1.2.2) mit der Protease PreScission in einem Masseverhältnis von 1:200

für mindestens 12 Stunden über Nacht bei 4° C inkubiert. Eine im Anschluss durch SDS-

PAGE analysierte Probe zeigte die vollständige Spaltung des Fusionsproteins (siehe

Abbildung 22 unter 3.2.2.3).

Ergebnisse

67

Abbildung 20: Chromatogramme und SDS-PAGE der GSH-Sepharose-Reinigung von GST-rpL23a (A). Laden des Überstands auf die 30ml GSH-Sepharose-Säule. (B) LiCl-Wäsche mit Lysispuffer. (C) Elution mit 20 mM Glutathion. Die roten Balken markieren die vereinigten Fraktionen 6-30. (D) SDS-PAGE von Pellet (P), Überstand (Ü), Durchfluss (D), LiCl-Waschschritt (W) und den vereinigten Elutionsfraktionen (E) mit GST-rpL23a (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

3.2.2.3 Kationenaustauschchromatographische Reinigung von rpL23a

rpL23a wurde genau wie rpL5 nach der proteolytischen Abspaltung der N-terminalen

GST-Sequenz mit Hilfe eines Sulfopropyl-Sepharose-Kationentauschers (SP-Sepharose)

gereinigt (vgl. 2.2.4.3 und 3.2.2.3 ). Die Trennung der gebundenen Proteine erfolgte durch

einen Salzgradienten von 0,3 bis 1 M NaCl (Abbildung 21).

Bei der Reinigung von rpL5 wurde die SP-Sepharose-Säule hauptsächlich für die

Entfernung der abgespaltenen GST-Affinitätssequenz verwendet. Für rpL23a erfüllte der

Reinigungsschritt zusätzlich den Zweck einer wirksamen Methode zur Entfernung von

komplexierter RNA. In Abbildung 23 sind die UV-Spektren von GST-rpL23a nach der

GSH-Sepharose-Reinigung und von rpL23a nach der SP-Sepharose-Reinigung dargestellt.

Ergebnisse

68

Deutlich zu erkennen ist die Verschiebung des Absorptionsmaximums in Richtung 280 nm

nach der SP-Sepharose-Reinigung, was auf die Entfernung der RNA-Verunreinigungen

hindeutet. Die Analyse der Fraktionen des Absorptionsmaximums mittels einer SDS-

PAGE (Abbildung 22) zeigte, dass rpL23a hochrein von der Säule eluiert wurde. Die

Fraktionen 30 bis 35 wurden vereinigt und für die weitere Verarbeitung bei 4° C gelagert.

Abbildung 21: Chromatogramme der SP-Sepharose-Reinigung von rpL23a. (A) Beladung der Säule. (B): Elution von rpL23a durch einen Gradienten von 0,3 bis 1M NaCl. Die roten Balken markieren die vereinigten Fraktionen 30-35.

Abbildung 22: SDS-PAGE der Beladung der SP-Sepharose sowie der finalen Präparation von rpL23a. links: SDS-Gel mit einer Probe der Beladung der SP-Sepharose-Säule. Die GST-Sequenz wurde durch die Protease PreScission vollständig von rpL23a abgespalten. rechts: Auftragung verschiedener Konzentrationen von rpL23a nach der Reinigung über eine SP-Sepharose-Säule und dem anschließenden Umpuffern mit einer HiPrep Desalting-Säule (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

Ergebnisse

69

Abbildung 23: (A) UV-Spektrum von GST-rpL23a nach der Sepharose-Reinigung. (B) UV-Spektrum von rpL23a nach der SP-Sepharose-Reinigung.

3.2.2.4 Finales Umpuffern von rpL23a

Im letzten Schritt der Präparation von rpL23a wurden die vereinten Fraktionen der SP-

Sepharose-Säule auf ein Volumen von 10 ml konzentriert (2.2.3.1) und mit einer High

Prep Desalting 26/10-Entsalzungs-Säule in den finalen Puffer überführt (2.2.4.4). In

Abbildung 24 ist das Chromogramm des Säulenlaufs dargestellt. Das zugehörige SDS-Gel

ist in Abbildung 22 abgebildet (3.2.2.3). In Tabelle 7 sind die nach den jeweiligen

Reinigungsschritten ermittelten Ausbeuten aufgelistet. Die finale Ausbeute betrug 3,6

mg/ml (bestimmt nach Bearden - siehe 2.2.6.1.2).

Eine Bestimmung der Konzentration über die Messung von A280 sowie nach der Methode

von Ehresmann (2.2.6.1.2) wurde ebenfalls durchgeführt und lieferte die aufgeführten,

abweichenden Ergebnisse (siehe Tabelle 7). Für die Proteinbestimmung über die Messung

von A280 wurde der native Extinktionskoeffizient von rpL23a bestimmt (Tabelle 6).

Tabelle 6: Vergleich von theoretischem und nativen Extinktionskoeffizienten von rpL23a.





Abweichung

7450 7596 + 2.0 %

Ergebnisse

70

Tabelle 7: Auflistung der mit verschiedenen Methoden bestimmten Ausbeuten von rpL23a.


[mg/L]

Abweichung von der

Bestimmung nach Bearden

GSH-Sepharose Bearden 12 -

SP-Sepharose Bearden 3,9 -

Bearden 3.6 -

A280 2.1 - 42% Desalting-HiPrep

26/60 Ehresmann 1,7 - 52%

Abbildung 24: Chromatogramm der Umpufferung von rpL23a mittels einer HiPrep-Desalting 26/10 - Entsalzungssäule. Die rot markierten Fraktionen 4-8 wurden vereinigt (blaue Linie: Absorption bei 280 nm, rote Linie: gemessene Leitfähigkeit) (SDS-PAGE - siehe Abbildung 22).

3.2.2.5 Ausschlusschromatographische Analyse des gereinigten rpL23a

Im Anschluss an die Präparation wurde der Oligomerisierungsgrad von rpL23a durch

analytische Gelfiltration mit einer Superdex S200 10/300 GL - Säule untersucht. Hierzu

wurden 350 µg Protein (bestimmt nach Bearden - 2.2.6.1.2) geladen und die Gelfiltration

wie unter 2.2.4.6 beschrieben durchgeführt. Das Retentionsvolumen von rpL23a betrug

15,13 ml. Aus der Funktion einer für die Säule ermittelten Kalibrierungsgerade (2.2.4.7,

3.1.2.5.) ergab sich ein zugehöriges Molekulargewicht von 34,2 kDa. Es kann daher davon

ausgegangen werden, dass rpL23a (Molekulargewicht = 18 kDa) als Dimer gereinigt

wurde.

Ergebnisse

71

Abbildung 25: (A) Chromatogramm eines analytischen Gelfiltrationslaufs von rpL23a mit einer Superdex S200 10/300 GL-Säule (blaue Linie: Absorption bei 280 nm, rote Linie: Absorption bei 254 nm). (B) Zugehöriges SDS Gel. Die Fraktionen 29-33 wurden aufgetragen (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

3.2.3 Kristallisationsversuche mit dem Komplex Imp7/rpL23a

3.2.3.1 Präparation eines Komplexes aus rpL23a und Importin 7

Für die Präparation des Imp7/rpL23a-Komplexes wurden 94,4 nmol rpL23a (1,7 mg -

bestimmt nach Bearden, 2.2.6.1.2) zu 55,8 nmol Imp7 (6,7 mg - bestimmt nach Bearden,

2.2.6.1.2) gegeben und für 60 Minuten auf Eis inkubiert. Die Isolierung des Komplexes

durch eine präparative Gelfiltration erfolgte analog zur Präparation von Imp7/rpL5

(3.1.3.1). Es wurde jedoch der „Komplexpuffer Imp7/rpL23a“ (2.2.4.5) verwendet. Ein

Absorptionsmaximum nach 166 ml Elutionsvolumen enthielt den isoliert vorliegenden

Imp7/rpL23a-Komplex. Die Fraktionen 20 bis 28 wurden vereinigt und auf 5,4 mg/ml

konzentriert (2.2.3.1). Die SDS-PAGE einer Probe der Präparation zeigte, dass Importin 7

einen stabilen Komplex mit rpL23a gebildet hatte. Ein Teil des präparierten Komplexes

wurde bei 4° C gelagert und für Kristallisationsexperimente verwendet (siehe 3.2.3.2). Der

andere Teil wurde in flüssigem Stickstoff gefroren und bei T = -80°C gelagert. Eine

anschließende analytische Gelfiltration (2.2.4.6) mit dem wieder aufgetauten Komplex in

dem für die Komplexpräparation verwendeten Puffer (2.2.4.5) zeigte, dass der Komplex

Ergebnisse

72

auch nach dem Einfrieren noch stabil war. Das aus dem Retentionsvolumen von 11,95 ml

mit Hilfe einer Kalibrierungsgerade (2.2.4.7, 3.1.2.5) ermittelte Molekulargewicht des

Imp7/rpL23a-Komplexes betrug152 kDa. Dies entspricht dem bei einer 1:1 Stöchiometrie

vorliegenden Molekulargewicht des Komplexes von 138kDa.

Abbildung 26: (A) Chromatogramm der Komplexpräparation von Imp7/rpL23a mit einer Superdex S200 XK 26/60 - Säule. (B) Zugehöriges SDS-Gel (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

Abbildung 27: (A) Chromatogramm eines analytischen Gelfiltrationslaufs mit einer Superdex S200 10/300 GL-Säule für den Komplex Imp7/rpL23a. Der Komplex war zuvor bei T= -80°C gelagert worden. (blaue Linie: Absorption bei 280 nm, rote Linie: Absorption bei 254 nm). (B) Zugehöriges SDS-Gel. Die Fraktionen 19, 21, 23 und 25 wurden aufgetragen. Die Fraktionen 21 und 23 beeinhalten den Komplex Imp7/rpL23a (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

Ergebnisse

73

3.2.3.2 Kristallisationsversuche mit Imp7/rpL23a

Das Präzipitationsverhalten des Imp7/rpL23a-Komplexes wurde zunächst durch Ansetzen

der Footprint-Screens mit 5,4 mg/ml (bestimmt nach Bearden, 2.2.6.1.2) überprüft.

Nachdem sich noch am selben Tag in der großen Mehrheit der Ansätze (> 90 %) Präzipitat

gebildet hatte, wurde die Proteinkonzentration für weitere Kirstallisationsansätze auf 2,5

mg/ml verdünnt.

Tabelle 8: Darstellung aller pipettierter Bedingungen

Kristallisationsscreen Proteinkonzentration

[mg/ml]

Footprint 1-3 5,4 / 3,8

Crystal Screen 1-2 3,0 / 2,5

Crystal Screen Lite 2,5

JB Screen 1-7, 9-10 2,5

Crystal Screen Cryo 2,5

Structure Screen 2,5

Magic Screen 1-4 2,5

PEG-Ion Screen 2,5

Nextal: The MPDs 2,5

Alle Ansätze wurden bei 20°C und mit

einem 1:1 Verhältnis von Präzipitans und

Protein pipettiert.

In Bedingung B1 des Kristallisationssreens JB 9 waren nach einem Tag Protein-

Sphärolithe gewachsen (Abbildung 28).

Abbildung 28: Protein-Sphärolithe in Bedingung B1 Screens JB 9. Zusammensetzung: 0,1 M Hepes, 0,2 M Tri-NaCitrat, 15% (w/v) Isopropanol, Kristallisationversuch bei 20°C im „sitzenden Tropfen“, Konzentration Imp7/rpL23a: c = 2,5 mg/ml, 1:1 Verhältnis von Präzipitans und Protein.

Ergebnisse

74

Eine Reproduktion dieser Sphärolithe konnte jedoch bisher nicht erreicht werden:

Folgende Parameter der Originalbedingung wurden hierfür variiert: pH-Wert,

Proteinkonzentration, Tropfengröße, Konzentration von Tri-NaCitrat und Isopropanol.

Ebenfalls durchgeführt wurde ein micro-seeding (2.2.7.2) mit Sphärolithen aus der

Originalbedingung sowie eine Präparation der Komplexe ohne Gelfiltration. Bei letzteren

wurden sowohl die molaren Verhältnisse der Komplexpartner als auch die

Proteinkonzentrationen variiert.

3.2.4 Funktionelle Untersuchungen der Bindung von rpL23a durch

Kernimportrezeptoren

3.2.4.1 Kartierung der Importin ß-Bindedomäne von rpL23a

Für die funktionelle Charakterisierung des Komplexes wurden zwei verschiedene

Methoden verwendet. Durch analytische Gelfiltrationsläufe (2.2.4.6) mit verkürzten

Fragmenten von Impß sollte die Bindungsstelle für rpL23a in Impß lokalisiert werden.

Ergänzend sollten die Bindungseigenschaften ausgewählter Komplexe durch isotherme

Titrationskalorimetrie (2.2.5) bestimmt werden.

3.2.4.1.1 Kartierung durch analytische Ausschlusschromatographie

Für die Kartierung der rpL23a-Bindungsstelle in Importin ß wurden verkürzte Fragmente

von Importin ß auf ihre Fähigkeit hin untersucht, stabile Komplexe mit rpL23a zu bilden.

Hierfür wurden die verschiedenen Impß-Fragmente jeweils mit rpL23a inkubiert und die

Entstehung von Komplexen durch analytische Gelfiltrationsexperimente (2.2.4.6) mit einer

Superdex S200 10/300 GL-Säule überprüft. In

Tabelle 9 ist eine Übersicht der untersuchten Impß-Fragmente aufgeführt. Die

Beschriftung bezieht sich dabei auf die nicht verkürzte Seite der Fragmente (N = Amino-

Terminus, C = Carboxy-Terminus). Beispielsweise umfasst das Fragment ImpßN641 die

Aminosäuren 1-641 des Volllängenproteins, vom N-Terminus aus betrachtet. Das

Ergebnisse

75

Fragment ImpßC127 dagegen beinhaltet die Aminosäuren 127-876. Die Mengen und

molaren Verhältnisse von inkubierten Impß-Fragmenten und rpL23a sind in Tabelle 4

angegeben. Alle Arbeitsschritte der Probenaufbereitung sowie der analytischen

Gelfiltration wurden wie unter 2.2.4.6 beschrieben durchgeführt.

Die Komplexbildung der Impß-Fragmente ImpßN641, Impß127-641, ImpßC127,

ImpßC210 und ImpßC304 mit rpL23a konnte nachgewiesen werden (SDS-Gel: siehe

Abbildung 29). Das Fragment ImpßN396 hingegen war nicht mehr in der Lage, rpL23a zu

binden. Daraus ergibt sich eine vorläufige Eingrenzung der minimalen rpL23a-

Bindungsstelle auf die Aminosäuren 304 bis 641 von Impß. Allerdings geben diese Daten

allein noch keinen Aufschluss darüber, ob ein Impß-Fragment, das nur diese Aminosäuren

umfasst, für eine physiologisch relevante Bindung ausreichend ist.

Tabelle 9: Übersicht der Bindungsansätze zur Kartierung der rpL23a-Bindungsdomäne.

Komplexname Eingesetzte

Menge Impß

[µg]/[nmol]

Eingesetzte

MengerpL23a

[µg]/[nmol]

Molares

Verhältnis

Impß/rpL23a

Impß (97 kDa) + rpL23a (18 kDa) 500 / 5,15 278/15,5* 1:3

Impß N641 (71,4 kDa) + rpL23a 400 / 4 200 /11,1 1: 2,8

Impß N396 (44,3 kDa) + rpL23a 300 / 6,8 245 /13,6* 1:2

Impß C127 (83,5 kDa) + rpL23a 450 / 194 / 10,8 1:2

Impß C127-641 (58 kDa) + rpL23a 400 / 6,9 250 / 13,8 1:2

Impß C210 (74 kDa) + rpL23a 631 / 8,5 384 / 21,3 1:2,5

Impß C304 (63,4 kDa) + rpL23a 500 / 7,9 355 / 19,7 1:2,5

Ergebnisse

76

Abbildung 29: SDS-PAGE der über eine Superdex S200 10/300 GL - Säule nachgewiesenen Komplexe von Impß-Fragmenten mit rpL23a. v.l.n.r.: Impß Volllänge/rpL23a, ImpßN641/rpL23a, ImpßN396/rpL23a, ImpßC127/rpL23a, Impß127-641/rpL23a, ImpßC210/rpL23a, ImpßC304/rpL23a (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

3.2.4.1.2 Kartierung durch isotherme Titrationskalorimetrie

Ziel dieser Experimente war eine Aufklärung der Energetik und Affinität der Bindung von

Impß und rpL23a mit Hilfe von isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) (2.2.5). Mit dieser

Methode ist es es möglich, die Bindungsenthalpien und Bindungskonstanten (Kd-Werte)

von geeigneten Bindungspartnern zu ermitteln.

Erste ITC-Experimente für die Messung der Bindungsenthalpie von Impß und rpL23a

wurden in verschiedenen Puffern durchgeführt, die 100-500mM NaCl und 20mM Tris

pH 7,5 enthielten, wie z.B. „ITC-Puffer 1“ (siehe 2.2.5). In diesen Puffern kam es jedoch

im Verlaufe der ITC-Messungen zu starker Präzipitatbildung. Eine Grundvorraussetzung

für die Vergleichbarkeit der ITC-Daten von verschiedenen Proteinkomplexen ist aber, dass

alle Bindungspartner in genau demselben Puffersystem vorliegen. Bindungsenthalpien, die

in verschiedenen Puffersystemen gemessenen wurden, können je nach pH-Wert und

Ionenzusammensetzung der verwendeten Puffer stark voneinander abweichen. Es war

daher notwendig ein System zu finden, in dem alle zu vergleichenden Proteinkomplexe

löslich waren. Durch die Einführung eines Puffersystems mit 300 mM Kaliumacetat und

Ergebnisse

77

20 mM Kaliumphosphat pH 7,5, (siehe „ITC-Puffer 2“ 2.2.5), konnten schließlich ITC-

Messungen ohne merkliche Präzipitation durchgeführt werden (2.2.5.).

Zunächst wurde die Bindung von Impß an rpL23a mittels ITC untersucht. Für eine

Eingrenzung der vollständigen Bindungsstelle in Impß wurde zusätzlich die Bindung des

Fragments Impß127-641 analysiert. Für diese ITC-Experimente wurde die

Proteinkonzentration von rpL23a durch Messung von A280 bestimmt (2.2.6.1.2). Die

Konzentrationsbestimmung von Impß und Impß127-641 erfolgte nach Bearden (2.2.6.1.2).

In Tabelle 10 sind die eingesetzten Proteinkonzentrationen, die ermittelten Stöchiometrien

(N), die Bindungsenthalpien (∆H), Dissoziationskonstanten (Kd) und Entropien (∆S) für

die Komplexe Impß/rpL23a und Impß127-641/rpL23a angegeben. Dabei wurden für

Impß/rpL23a (N ≈ 0,88) und Impß127-641 (N ≈ 0,36) unterschiedliche Stöchiometrien

ermittelt. Die real vorliegenden Stöchiometrien waren nicht eindeutig bestimmbar, da je

nach angewendeter Proteinbestimmungsmethode unterschiedliche Proteinkonzentrationen

für rpL23a gemessen wurden (3.2.2.4). Daher besitzen die vorliegenden Ergebnisse der

ITC-Messung nur eine eingeschränkte Aussagekraft (4.1.3).

Deutlich erkennbar ist jedoch die Tendenz einer niedrigeren Affinität von Impß (AS 127-

641) für rpL23a im Vergleich zu Impß in voller Länge (siehe Kd-Werte in Tabelle 10). Die

gemessenen Bindungsenthalpien ∆H sind positiv, was bedeutet, dass es sich bei der

Bindung von Impß an rpL23a um einen endothermen Prozess handelt. Für beide

Komplexe konnte zudem eine Zunahme der Entropie ∆S beobachtet werden.

Ausgehend von einem Modell der Bindung von Impß an rpL23a mit einer 1:1

Stöchiometrie sowie von Impß127-641 mit einer 1:2 Stöchiometrie wurde eine

willkürliche Anpassung der rpL23a-Konzentrationen durchgeführt. Die sich hieraus

ergebenen ITC-Daten sind in Tabelle 10 in Klammern aufgeführt.

Ergebnisse

78

Tabelle 10: Daten der ITC-Experimente mit Impß, Impß (AS 127-641) und rpL23a.

Impß + rpL23a Impß (AS 127-641)

Konzentration der

Bindungspartner [µM]*

Impß: 5,26

rpL23a: 66,43

Impß127-641: 5,0

rpL23a: 35,0

Zahl der Injektionen 27 27

Modell Eine Bindungsstelle Eine Bindungsstelle

N 0.879 ± 0.00537

(1,000 ± 0,00650)

0.363 ± 0.0120

(0,500 ± 0,016)

K

[M -1]

1,55*107 ± 1.51*106

(1,29*107 ± 1.31 * 106)

2.11*106 ± 2.37*105

(1,66*106 ± 1,89*105)

Kd

[nM]

64,5

(77,5)

473,9

(602,4)

∆H

[kJ/Mol]

43,97 ± 0,43)

(39,01 ± 0,40)

53,75 ± 2,31

(38,16 ± 1,58)

∆S

[J/Mol*K]

292,6

(273,8)

310,6

(253,7)

*Die Werte beruhen auf einer Proteinkonzentrationsbestimmung von Impß und Impß (AS 127-641) nach Bearden und von rpL23a über Messung von A280 (2.2.6.1.2). Bei den in Klammern stehenden Werten wurden die Stöchiometrien durch Veränderung der rpL23a-Konzentration in Rechnung angepasst.

Abbildung 30: Diagramme der ITC-Experimente mit Impß, Impß (AS 127-641) und rpL23a. (A) Diagramme der ITC-Messungen der Bindungsansätze Impß + rpL23a (schwarz) und Impß127-641 (rot) auf Basis einer Konzentrationsbestimmung von rpL23a über Messung von A280. Es handelt sich hierbei um eine Auftragung der bei den einzelnen Injektionen detektierten Wärmeenthalpien �H [kJ/mol] gegen die molare Menge an eingesetztem rpL23a. B) Diagramme der ITC-Messungen der Bindungsansätze Impß + rpL23a (schwarz) und Impß127-641 + rpL23a (rot) mit einer Anpasssung der Stöchiometrien auf N=1 für Impß + rpL23a und N= 0,5 für Impß127-641 + rpL23a.

Ergebnisse

79

3.2.4.2 Funktionelle Untersuchung der Bindung von rpL23a und Importin 7

Eine ITC-Messung zur Charakterisierung der Bindung von Imp7 und rpL23a wurde

ebenfalls durchgeführt. Hierdurch sollte untersucht werden, inwieweit sich Imp7 und Impß

bei der Bindung von rpL23a bzgl. der autretenden Affinitäten und Bindungsenthalpien

unterscheiden. In Tabelle 11 ist ein Vergleich der ermittelten Daten der Messungen für die

Komplexe Impß/rpL23a und Impß/rpL23a gezeigt. Wie bereits für Impß/rpL23a

beobachtet wurde (3.2.4.1.2), handelt es sich auch hier bei der Bindung um einen

endothermen Prozess. Beide Komplexbildungen unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der

auftretenden Stöchiometrien. So ergibt sich für Imp7/rpL23aBIB N ≈ 0,38 und für

Impß/rpL23a N ≈ 0,88. Wie schon unter 3.2.4.2 erwähnt, sind die real vorliegenden

Stöchiometrien aufgrund der nicht genau bekannten Konzentration von rpL23a nicht

eindeutig bestimmbar (3.2.2.4). Es ist daher schwierig, einen direkten Vergleich von

Affinitäten und Wärmeenthalpien anzustellen (4.1.4).

Abbildung 31: Diagramme der ITC-Experimente mit Imp7 bzw. Impß und rpL23a. (A) Diagramme der ITC-Messungen der Bindungsansätze Impß + rpL23a (schwarz) und Imp7 (rot) auf Basis einer Konzentrationsbestimmung von rpL23a über Messung von A280. Es handelt sich hierbei um eine Auftragung der bei den einzelnen Injektionen detektierten Wärmeenthalpien �H [kJ/mol] gegen die molare Menge an eingesetztem rpL23a. (B) Diagramme der ITC-Messungen der Bindungsansätze Impß + rpL23a (schwarz) und Imp7 (rot) mit einer Anpasssung der Stöchiometrien auf N=1 für Impß + rpL23a und N= 0,5 für Imp7 + rpL23a.

Ergebnisse

80

Tabelle 11: Daten der ITC-Experimente von Imp7 mit rpL23a und Impß mit rpL23a im Vergleich .

Imp7+ rpL23a Impß + rpL23a

Konzentration der

Bindungspartner [µM]*

Imp7: 4,0

rpL23a: 50,5

Impß: 5,26

rpL23a: 66,43

Zahl der Injektionen 27 27

Modell Eine Bindungsstelle Eine Bindungsstelle

N 0,376 ± 0,0141

(0,500 ± 0,00201)

0.879 ± 0.00537

(1,000 ± 0,00650)

K

[M -1]

3,65*106 ± 5,87*105

(2,56*106 ± 4,21*105)

1,55*107 ± 1.51*106

(1,29*107 ± 1.31*106)

Kd

[nM]

274,0

(390,1)

64,5

(77,5)

∆H

[kJ/Mol]

55,47 ± 2,79

(42,64 ± 2,30)

43,97 ± 0,43)

(39,01 ± 0,40)

∆S [J/Mol*K] 321,4

(273,0)

292,6

(273,8)

*Die Werte beruhen auf einer Proteinkonzentrationsbestimmung von Imp7 und Impß nach Bearden und von rpL23a über Messung von A280 (2.2.6.1.2). Bei den in Klammern stehenden Werten wurden die Stöchiometrien durch Veränderung der rpL23a-Konzentration in der Rechnung angepasst.

3.2.5 Präparation der BIB-Domäne von rpL23a

Die vollständige Kernlokalisationssequenz von rpL23a für den Kernimport durch Imp7

oder Impß umfasst die Aminosäuren 32-74 und wird BIB-Domäne genannt (Jäkel und

Görlich, 1998). Im folgenden Abschnitt wird die Klonierung und Präparation der BIB-

Domäne beschrieben. Das Hauptziel dieser Reinigung war die Präparation von Komplexen

der BIB-Domäne mit Importin 7, Imp7C598 und Impß127-641 für

Kristallisationsversuche. Die BIB-Domäne stellt hierbei einen im Komplex möglichst

unflexiblen Bindungspartner dar. Dies sollte zu einer Erhöhung der Stabilität der

Komplexe in einem möglichen Kristallgitter führen und damit die Wahrscheinlichkeit

einer Kristallisation erhöhen.

Ergebnisse

81

3.2.5.1 Klonierung der BIB-Domäne in den Vektor pGEX-6P-1

Für die Klonierung der BIB-Domäne wurde das in den Vektor pGEX-6P-1 klonierte

Volllänge-Gen als Matrize verwendet (3.2.1.1). Die Amplifikations-PCR (2.2.1.1.1)

erfolgte unter Verwendung der Primer BIB_BamHI_for und BIB_XhoI_rev (2.1.8). Das

amplifizierte Genfragment wurde anschließend über die Endonukleasen BamHI und XhoI

in pGEX-6P-1 inseriert (2.2.1.1.2) und ligiert (2.2.1.1.4). Zur Kontrolle der Klonierung

wurde eine Sequenzanalyse (2.2.1.1.5) unter Verwendung der DNA-Oligonukleotide

pGEX_f und pGEX_r (2.1.8) durchgeführt. Das Konstrukt pGEX-6P-1-rpL23a-

BIB/nostop wird bis zum Stopcodon der multiple cloning side translatiert, so dass nach der

BIB-Domäne die Aminosäuresequenz LERPHRN folgt.

3.2.5.2 Expression, Zellernte und Aufschluss

Die Expression der BIB-Domäne als GST-Fusionsprotein erfolgte in dem E. coli-Stamm

BL21(DE3) RP analog zu Volllänge-GST-rpL23a (3.2.1.2). In Abbildung 32 (siehe

3.2.5.3) ist eine SDS-PAGE der Vor- und Nachinduktionsproben abgebildet. Das 32 kDa

große Fusionsprotein wurde in einem deutlichen Maß exprimiert.

Die Zellernte und der Aufschluss der Zellen erfolgte ebenfalls analog zum

Volllängeprotein (3.2.1.3). Das Fusionsprotein GST-rpL23aBIB befindet sich nach dem

Aufschluss fast vollständig im Überstand (SDS-Gel: siehe 3.2.5.3 Abbildung 32).


Der erste Reinigungssschritt der BIB-Domäne bestand in einer Affinitätsreinigung über

eine GSH-Sepharose-Säule. Hierbei wurde analog zur Reinigung von rpL23a unter

Verwendung der gleichen Puffer vorgegangen (vgl.3.2.2.2). Zur Entfernung der GST-

Affinitätssequenz wurde rpL23aBIB mit der Protease PreScission im Massenverhältnis

Ergebnisse

82

1:200 für mindestens zwölf Stunden bei 4° C inkubiert (vgl.2.2.3.5.). Dabei blieb fast die

gesamte Proteinmenge löslich.

Abbildung 32: (A) SDS-PAGE der Expression von rpL23aBIB in pGEX-6P-1 in E. coli BL21 (DE3) RP (vI = vor Induktion, nI = nach Induktion, M=Größenstandard). (B) SDS-Gel der Reinigung von GST-rpL23aBIB über GSH-Sepharose. V.l.n.r.: Pellet (P), Überstand (Ü), Durchfluss (DF) und vereinigte Elutionsfraktionen (E) (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

3.2.5.4 Ausschlusschromatographische Reinigung der BIB-Domäne

Der zweite und letzte Schritt der Präparation der BIB-Domäne bestand in einer

ausschlusschromatographischen Reinigung mittels einer Superdex S75 XK 26/60

Gelfiltrationssäule. Hierfür wurde die Probe, wie unter 2.2.4.5 beschrieben, vorbereitet, auf

die Säule geladen und eluiert. Abbildung 33 zeigt das SDS-Gel der analysierten Proben der

Elution. Die BIB-Domäne lag nach der Präparation hochrein vor.

Nach der Elution wurden die rpL23aBIB enthaltenden Fraktionen vereinigt und die

Proteinkonzentration mit den drei unter 2.2.6.1.2 beschriebenen Methoden vermessen.

Dabei konnten große Abweichungen der ermittelten Konzentration je nach angewandter

Methode beobachtet werden. Für die Proteinbestimmung über die Messung von A280

wurde der native Extinktionskoeffizient (2.2.6.1.2) von rpL23aBIB bestimmt (siehe

Tabelle 12).

Ergebnisse

83

Abbildung 33: SDS-PAGE der Reinigung mit einer Superdex S200 XK 26/60-Säule. Beschriftung v.l.n.r.: Beladung nach PreScission-Verdau (nPP), ausgewählte Fraktionen der Elution (12 – 34) (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

Tabelle 12: Vergleich von denaturiertem und nativen Extinktionskoeffizienten von rpL23aBIB





Abweichung

2980 2807 -5,8 %

Tabelle 13: Übersicht über die mit verschiedenen Methoden ermittelten Proteinkonzentrationen für rpL23a :


[mg/L]

Abweichung von der

Bestimmung nach Bearden

GSH-Sepharose Bearden 84,2 -

Bearden 3,3

Absorption 280nm 6,3 + 91% Desalting-HiPrep

26/60 Ehresmann 7,3 +121%

3.2.5.5 Komplexpräparationen von rpL23aBIB und den Kernimportrezeptoren

Imp7 und Impß

Die BIB-Domäne wurde für eine Reihe von Ko-Kristallisationsexperimenten eingesetzt.

Hierfür wurden zunächst die Komplexe Imp7/rpl23aBIB, Imp7C598 (AS 598-

1038)/rpL23aBIB und Impß127-641 (AS 127-641) durch präparativer Gelfiltration mittels

Ergebnisse

84

einer Superdex S200 XK 26/60-Säule isoliert (2.2.4.5). Die Präparation erfolgte analog zu

dem Komplex Imp7/rpL5 (3.1.3.1). In diesem Fall wurde jedoch der „Komplexpuffer-

BIB-Domäne“ (2.2.4.5) verwendet. In Tabelle 14 ist eine Übersicht der molaren Mengen

und Verhältnisse der Präparationsansätze angegeben. Die eingesetzen Proteinmengen

wurden nach der Methode von Bearden bestimmt (2.2.6.1.2).

Eine SDS-PAGE mit Proben der Präparation zeigte, dass alle eingesetzten

Importrezeptoren stabile Komplexe mit rpL23aBIB gebildet hatten (Abbildung 34). Die

präparierten Komplexe wurde bei 4° C gelagert und für Kristallisationsexperimente

verwendet (siehe 3.2.3.2)

Tabelle 14: Übersicht der Komplexpräparationen mit rpL23aBIB:

Komplexname

Eingesetzte

Menge Rezeptor

[mg] / [nmol]

Eingesetzte Menge

rpL23aBIB

[mg] / [nmol]

MolaresVerhältnis

Rezeptor/rpL23BIB

Imp7 (120 kDa)

+ rpL23aBIB (6kDa) 7,68 / 64 1,32 / 198 1: 3,1

Imp7C598 (52kDa)

+ rpL23aBIB 4,4 / 85 1,4 / 210 1:2,5

Impß127-641 (58 kDa)

+ rpL23aBIB 4,6 / 79 1,4 /210 1: 2,7

Ergebnisse

85

Abbildung 34: SDS-PAGE der Komplexpräparationen mit rpL23aBIB mit einer Superdex S200 XK 26/60 - Säule. Es wurden jeweils 5 �l (links) und 10 �l (rechts) des präparierten Komplexes in 1:1 SDS-Probenpuffer (2.2.3.3) aufgetragen. Beschriftung v.l.n.r.: Imp7/rpL23aBIB, Imp7C598/rpL23aBIB, Impß 127-641/rpL23aBIB (M=Größenstandard BR, 15%iges SDS-Gel).

3.2.5.6 Versuch einer Ko-Kristallisation der BIB-Domäne mit Imp7 und Impß

In einem ersten Schritt wurde das Präzipitationsverhalten der Komplexe Imp7/rpL23aBIB,

Imp7C598/rpL23aBIB und Impß127-641/rpL23aBIB zunächst durch Ansetzen der

Footprint-Screens 1-3 mit den in Tabelle 15 angegebenen Konzentrationen (bestimmt nach

Bearden, 2.2.6.1.2) analysiert. Innerhalb von 6-8 Stunden nach dem Ansetzen hatte sich in

der Mehrheit der Ansätze Präzipitat gebildet. Hierauf wurde die Proteinkonzentration für

weitere Kristallisationsansätze auf 7,4 mg/ml für Imp7/rpL23a, 5,7 mg/ml für

Imp7C598/rpL23aBIB und 6,9 mg/ml für Impß127-641/rpL23aBIB mit dem für die

Komplexpräparationen verwendeten Puffer verdünnt (2.2.4.5).

Ein großer Teil der verwendeten Kristallisationsscreens wurden mit einem

Kristallisationsroboter der EMBL-Outstation in Hamburg pipettiert. Die Auswertung

dieser Kristallisationsansätze erfolgte am Computer über das Internet (2.2.7.1). In Tabelle

15 ist eine Übersicht aller angesetzten Kristallisationsscreens aufgeführt.

Ergebnisse

86

Bis zum heutigen Zeitpunkt konnte in keiner Bedingung ein Kristallwachstum beobachtet

werden. Es konnten jedoch eine Reihe von Komponenten identifziert werden, die die

Stabilität der Komplexe scheinbar positiv beeinflussen. So zeigten die Alkohole MPD und

Ethanol bei allen Komplexen einen löslichkeitsstabilisierenden Effekt. Auch verschiedene

Polyethylenglycole (PEGs) beeinflussten die Löslichkeit positiv (4.1.2).

Tabelle 15: Darstellung aller angesetzten Kristallisationsbedingungen für Komplexe mit rpL23a-BIB.

Screen

Imp7

+ rpL23aBIB

[mg/ml]

Imp7C598

+ rpL23aBIB

[mg/ml]

Impß127-641

+ rpL23aBIB

[mg/ml]

Footprint 1-3 11,5 7,4 9,5

Crystal Screen 1 + 2 7,4* 5,7* 6,9*

Wizard 1+ 2 7,4* 5,7* 6,9*

JB 1-8 7,4* 5,7* 6,9*

PACT 7,4* 5,7* / 3,8 6,9*

JCSG 7,4* 5,7* / 3,8 6,9*

Salt RX 7,4* 5,7* / 3,8 6,9*

Nextal Classics - 3,8 7,0

Nextal Cations - 5,7 -

Nextal pH Clear - 3,8 -

(Alle Ansätze wurden mit einem 1:1 Verhältnis von Präzipitans und Protein pipettiert und bei 20°C gelagert, die mit * gekennzeichneten Screens wurden mit einem Kristallisationsroboter der EMBL-Outstation in Hamburg pipettiert (2.1.9, 2.2.7.1).

Diskussion

87

4 Diskussion

Im Vordergrund dieser Arbeit stand die strukturelle und funktionelle Untersuchung der

Bindung von Imp7 und Impß an die ribosomalen Proteine rpL23a und rpL5.

Hiefür wurde zunächst eine Expressions- und Reinigungsstrategie für rpL5 und rpL23a

entwickelt. Beide Proteine konnten präpariert werden. Es wurden ausreichende Ausbeuten

sowohl für Kristallisationsversuche als auch für funktionelle Untersuchungen erzielt. Des

Weiteren wurde die Importrezeptorbindedomäne von rpL23a (BIB-Domäne oder

rpL23aBIB) kloniert, exprimiert und gereinigt.

Ein Ziel der Arbeit war die strukturelle Aufklärung von Komplexen aus ribosomalen

Proteinen mit dem Kernimportrezeptor Imp7. Hierfür wurden Komplexe von rpL5, rpL23a

und rpL23aBIB mit Imp7 präpariert und für Kristallisationsversuche eingesetzt. Die

Kristallisation stellt die Vorraussetzung für röntgenkristallographische Strukturanalysen

der Komplexe dar. Die ribosomalen Proteine sollten einen stabilisierenden Einfluss auf die

Konformation von Imp7 im Komplex ausüben und somit die Wahrscheinlichkeit einer

Kristallisation erhöhen. Die Kristallisationsansätze der präparierten Komplexe führten

jedoch bisher nicht zur Bildung von Proteinkristallen.

Ein weiterer Schwerpunkt lag in funktionellen Untersuchungen der Interaktion von

Kernimportrezeptoren mit ribosomalen Proteinen. Hierfür wurde hauptsächlich die

Bindung von Impß und rpL23a untersucht. Dabei wurde die Bindungsstelle für rpL23a in

Impß grob lokalisiert. Ein weiteres Ziel war die Aufklärung der Energetik und Affinität

dieser Bindung mit Hilfe von isothermer Titrationskalorimetrie (ITC). Es konnte gezeigt

werden, dass die Bindung von Impß und Imp7 an rpL23a einen endothermen Charakter

besitzt. Für eine genaue Lokalisierung der minimalen Bindungsstelle für rpL23a in Impß

müssten jedoch noch weitere ITC-Messungen durchgeführt werden.

Diskussion

88

4.1 Biochemische Arbeiten mit rpL23a

4.1.1 Präparation von rpL23a und rpL23aBIB

Die Präparation von rpL23a als Fusionsprotein von GST konnte erfolgreich etabliert

werden. Hierfür wurde rpL23a zunächst affinitätschromatographisch über GSH-Sepharose

gereinigt (3.2.2.2) und im Anschluss über Kationenaustauschchromatographie hochrein

isoliert (3.2.2.3).

Zu Beginn der Diplomarbeit bereitete die Präzipitation von rpL23a durch RNA große

Probleme. Die RNA führte durch Bindung an das basische rpL23a zur Bildung von großen

Aggregaten. Diese Eigenschaft, auch unspezifische Komplexe mit RNA bilden zu können,

ist auch von anderen basischen ribosomalen Proteinen bekannt (Jäkel und Görlich; 2002).

Die Entfernung der RNA von rpL23a konnte durch den Einsatz von LiCl (3.2.1.3, 3.2.2.3)

und durch Kationenaustauschchromatographie (3.2.2.3) erreicht werden. Ein Teil der

gebundenen RNA wurde durch die Verwendung eines Lysis- und Waschpuffers, der LiCl

enthielt, entfernt. Lithiumionen bilden scheinbar auf Grund ihrer geringen Größe und

niedrigen Polarisierbarkeit stabilere Komplexe mit den Phosphatgruppen der RNA als

beispielsweise Natriumionen. Die Lithiumionen sind somit in der Lage, ionische

Wechselwirkungen zwischen den Phosphatgruppen der RNA und basischen Seitenketten

von rpL23a aufzulösen, was zur Dissoziation der RNA führt. Die Verwendung von LiCl

führte zu einer Verbesserung der Löslichkeit von rpL23a nach der GSH-

Sepharosereinigung (3.2.2.2). Es zeigte sich aber, dass rpL23a trotzdem noch durch

gebundene RNA verunreinigt war (3.2.2.3). Durch Kationenaustauschchromatographie mit

einer SP-Sepharose-Säule wurde auch diese restliche RNA schließlich entfernt (3.2.2.3).

Hierbei scheinen die negativ geladenen Sulfopropylgruppen der SP-Sepharose die RNA

kompetitiv von rpL23a zu verdrängen. Verschiedene andere Reinigungsstrategien zur

Entfernung der RNA scheiterten, wie z.B. die Spaltung der RNA durch das Enzym

Benzonase (2.2.2.3.3), die Dissoziation durch hohe NaCl-Konzentrationen (Daten nicht

gezeigt) oder die Fällung durch Streptomycinsulfat (Oxenburgh und Snoswell, 1965).

Eine analytische Gelfiltration ergab, dass rpl23a wahrscheinlich in Form eines Dimers

präpariert worden war (3.2.2.5). Als problematisch erwies sich die Bestimmung der

Diskussion

89

Proteinkozentration, da hier je nach verwendeter Methode große Unterschiede festgestellt

werden konnten (3.2.2.4).

Ein Versuch, rpL23a mit einer Deca-Histidin-Sequenz zu reinigen, wurde zu einem frühen

Zeitpunkt der Diplomarbeit aufgegeben (3.2.2.1). Das Protein konnte zwar mit einer

Nickel-NTA-Affinitätssäule gereinigt werden, neigte jedoch aufgrund von RNA-

Verunreinigungen zur Präzipitation. Infolge desssen wurde es bei Gelfiltrationen mit dem

Ausschlussvolumen eluiert (Daten nicht gezeigt). Eine Entfernung der RNA mit einem

ähnlichen Protokoll wie für GST-rpL23a (3.2.1.3, 3.2.2) ist aber auch bei diesem

Konstrukt möglich.

Eine frühere Untersuchung von rpL23a (Jäkel und Görlich, 1998) hatte gezeigt, dass die

Kernlokalisationssequenz für die Importrezeptoren Imp7 und Impß in einem

Sequenzabschnitt lokalisiert ist, der die Aminosäuren 32 bis 74 beinhaltet. Diese, auch als

BIB-Domäne (für beta-like import receptor binding domain) bezeichnete

Aminosäuresequenz, wurde ebenfalls für Kristallisationszwecke im Rahmen der

Diplomarbeit präpariert (3.2.5).

4.1.2 Kristallisationsversuche für Komplexe mit rpL23a und

rpL23aBIB

Die Strukturaufklärung von Komplexen aus ribosomalen Proteinen und Imp7 stand im

Vordergrund der Diplomarbeit. Zu diesem Zweck wurden auch Komplexe von rpL23a und

rpL23aBIB mit Imp7 präpariert (3.1.3.1) und für Kristallisationsversuche eingesetzt

(3.1.3.2). Hierbei sollten die ribosomalen Proteine eine Stabilisierung der Konformation

von Imp7 im Komplex bewirken. Eine Studie hatte gezeigt, dass ungebundene

Karyopherine eine hohe strukturelle Flexibilität besitzen (Fukuhara et al., 2004). Eine

Bindung von Substraten führte bei den beobachteten Fällen zu einer Stabilisierung der

Konformation. Zutreffenderweise handelt es sich bei den meisten bisher veröffentlichten

Kristallstrukturen von Karyopherinen um Komplexe mit anderen Bindungspartnern

(Madrid und Weis 2005, Conti et al. 2006).

Für erste Kristallisationsversuche wurde die gereinigte BIB-Domäne von rpL23a (3.2.5.4)

verwendet. Hierfür wurden Komplexe der BIB-Domäne mit Imp7, dem C-terminalen

Diskussion

90

Imp7-Fragment Imp7C598 und dem Importin-ß-Fragment Impß127-641 präpariert

(3.2.5.5) und für Kristallisationsversuche eingesetzt (3.2.5.6). Die BIB-Domäne stellt

hierbei einen im Komplex möglichst unflexiblen Bindungspartner dar. Dies sollte zu einer

Erhöhung der Stabilität der Komplexe in einem möglichen Kristallgitter führen und damit

die Wahrscheinlichkeit einer Kristallisation erhöhen.

Ein Großteil der Kristallisationsscreens für die Komplexe Imp7/rpL23aBIB.

Imp7C598/rpL23aBIB und Impß127-641/rpL23aBIB wurde mit einem

Kristallisationsroboter der EMBL-Outstation in Hamburg angesetzt (3.2.5.6). Bisher

konnte in keiner der pipettierten Bedingungen eine Bildung von Proteinkristallen

beobachtet werden.

Ausgehend von den pipettierten Kristallisationansätzen lassen sich einige Aussagen über

den Einfluss bestimmter Komponenten auf das Präzipitationsverhalten der verschiedenen

Komplexe machen. Eine Eigenschaft, die für alle Komplexe beobachtet werden konnte,

war der positive Einfluss von Alkoholen wie MPD und Ethanol auf die Löslichkeit. So

zeigte der Komplex Imp7/rpL23aBIB eine erhöhte Löslichkeit in 15-50% MPD. Auch

scheinen pH-Werte im Bereich von pH 7,5-8,5 eine stabilisierende Wirkung auf den

Komplex auszuüben. Auch verschiedene Polyethylenglycole (PEGs) besitzen einen

positiven Einfluss auf die Löslichkeit. So konnte ein löslichkeitsstabilisierender Effekt für

PEG 400 und PEG 4000 in Kombination mit einem basischen pH-Wert beobachtet

werden. Der Komplex Imp7C598/rpL23aBIB zeigte im Bezug auf die eben genannten

Komponenten ein ähnliches Löslichkeitsverhalten. Auffällig war zusätzlich der positive

Effekt von Glycerin für die Löslichkeit. Der Komplex Impß127-641/BIB scheint durch 10-

60% MPD oder auch Ethanol, sowie in verschiedenen PEGs, wie z.B. PEG 400 und

PEG10000, stabilisiert zu werden.

Ein Komplex von rpL23a in voller Länge mit Imp7 wurde ebenfalls in einer Vielzahl von

Kristallisationsbedingungen eingesetzt (3.2.3.2). Auffällig war hier zunächst eine deutliche

Reduzierung der Löslichkeit im Vergleich zu den Komplexen Imp7/rpL23aBIB und

Imp7C598/rpL23aBIB. Möglicherweise führen die zusätzlichen Aminosäuren von rpL23a

in voller Länge zu einer niedrigeren Stabilität des Komplexes. Es konnte keine

Kristallbildung beobachtet werden. Lediglich in der Bedingung JB9-B1 kam es zur

Entstehung von Protein-Sphärolithen (Abbildung 28 unter 3.2.3.2). Diese waren relativ

rund und zeigten nur leichte Ansätze einer Kantenbildung. Eine Beobachtung von

Salzkristallen kann nahezu ausgeschlossen werden. Die Sphärolite zerfielen bei leichter

Diskussion

91

Berührung sofort. Aus den entstandenen Bruchstücken wuchsen innerhalb weniger

Stunden eine Vielzahl neuer Sphärolithe. Bis zum heutigen Zeitpunkt war es jedoch trotz

einer umfangreichen Variation einzelner Komponenten der Bedingung sowie eines micro-

seeding nicht möglich, diese Sphärolithe zu reproduzieren. Auch für den Imp7/rpL23a-

Komplex können einige Aussagen über den Einfluss einiger einzelner Komponenten im

Bezug auf die Löslichkeit gemacht werden. So scheinen hier bestimmte Alkohole wie z.B.

Isopropanol die Löslichkeit ebenso positiv zu beeinflussen wie leicht basische pH-Werte

im Bereich von pH 7,0 – 8,5. Stabilisierend ist auch der Einfluss von Carbonsäure-Salzen

wie NaFormiat, NaAcetat und Tri-NaCitrat.

Für weitere Kristallisationsversuche mit Imp7 erscheint es sinnvoll, im besonderen Maße

verkürzte Fragmente von rpL23a wie z.B. die BIB-Domäne einzusetzen. Diese Komplexe

zeigten eine wesentlich höhere Löslichkeit als der Komplex mit rpL23a in voller Länge.

Eine weitere Möglichkeit bestände darin, die Komplexe bei anderen Temperaturen wie

z.B. 4°C oder 30°C zu pipettieren.

4.1.3 Charakterisierung der Bindung von Impß an rpL23a

Parallel zu den Kristallisationsversuchen mit Komplexen aus Imp7 und den ribosomalen

Proteinen L5 und L23a wurde der Versuch unternommen, durch funktionelle

Untersuchungen mittels analytischer Gelfiltrationsläufe und isothermer

Titrationskalorimetrie mehr über die Eigenschaften der Bindung von Importrezeptoren mit

rpL23a herauszufinden. Hierfür wurde der Importrezeptor Impß verwendet. Bei Impß

handelt es sich um einen äußerst universellen Rezeptor, der eine bedeutende Rolle bei

einer Vielzahl von zellulären Transport- und Entwicklingsprozessen spielt (Harel und

Forbes, 2004).

Ein bereits veröffentlichtes Pull-down-Experiment mit verkürzten Fragmenten von Impß

und der BIB-Domäne von rpL23a grenzte die minimale Bindungsstelle von rpL23aBIB

auf die Aminosäuren 286-462 in Impß ein (Jäkel und Görlich, 1998). Von bereits

kristallisierten Komplexen von Impß mit verschiedenen Bindungspartnern ist jedoch

bekannt, dass sich die Bindungsstellen in Impß oft aus mehreren Komponenten

zusammensetzen. Diese müssen in der Primärsequenz nicht zwangsläufig benachbart sein

Diskussion

92

(Lee et al., 2005, 2003, Liu und Stewart, 2005; Cingolani et al., 2002, 1999). Die

Ergebnisse der Studie lieferten keine Hinweise darauf, inwieweit es sich bei den

Aminosäuren 286-462 um die vollständige, physiologisch relevante Bindungsstelle von

Impß für rpL23a in voller Länge handelt.

Ziel der praktischen Arbeiten mit Impß und rpL23a im Rahmen dieser Diplomarbeit sollte

es daher sein, durch Kombination von analytischen Gelfiltrationsläufen und isothermer

Titrationskalorimetrie sowohl die Lokalisation der vollständigen Bindungsstelle zu

bestimmen, als auch die Energetik der Bindung aufzuklären.

Für die Kartierung der rpL23a-Bindungsstelle in Importin ß wurden zunächst verkürzte

Fragmente von Importin ß auf ihre Fähigkeit hin untersucht, stabile Komplexe mit rpL23a

zu bilden (Abbildung 35). Auf diese Weise wurde die rpL23a-Bindungsstelle zunächst auf

die Aminsoäuren 304 bis 641 von Impß eingegrenzt. Die Ergnisse der analytischen

Gelfiltrationen wurden als Basis für weiterführende ITC-Experimente verwendet.

Abbildung 35: Schematische Darstellung der Kartierung der rpL23a-Bindungsstelle in Impß. (Grafik

modifiziert nach Wohlwend et al., 2006 in Vorbereitung)

Die isotherme Titrationskalorimetrie eignet sich in Kombination mit analytischen

Gelfiltrationsexperimenten als Methode für eine genaue Bestimmung von Bindungsstellen

in Proteinen. Mit dieser Methode ist es möglich, die bei der Bindung zwischen Proteinen

umgesetzte Wärmenthalpie ∆H, die Stöchiometrie N, die Dissoziationskonstante (Kd)

sowie die Gesamtentropie (∆S) zu bestimmen.

Diskussion

93

Bei den ersten ITC-Experimenten mit rpL23a und Impß wurden NaCl-haltige Puffer

eingesetzt, die jedoch eine teilweise Präzipitation der entstandenen Proteinkomplexe im

Verlauf der Titration verursachten (3.2.4.1.2). Schon eine geringe Präzipitatbildung führt

jedoch zu Schwankungen der Basislinie des Wärmedetektors und somit zu einer

Verfälschung der Messwerte. Erst durch die Verwendung eines Kaliumacetat und

Kaliumphosphat enthaltenden Puffers (2.2.5) konnten schließlich ITC-Experimente ohne

störende Präzipitation durchgeführt werden.

Ein Problem bei der Interpretation der gesammelten Daten stellen die Werte der

errechneten Stöchiometrien dar. Wie unter 3.2.2.4 beschrieben wurde, ergeben sich je nach

verwendeter Proteinbestimmungsmethode große Abweichungen für die ermittelte

Konzentration von rpL23a. Für die ITC-Experimente wurde die Konzentration von rpL23a

über die Absorption bei 280 nm bestimmt (2.2.6.1.2). Die Bestimmung der

Konzentrationen der Importrezeptoren erfolgte nach der Methode von Bearden (2.2.6.1.2).

Unter Einsetzung dieser Konzentrationen ergab sich für die Bindung von Impß an rpL23a

eine Stöchiometrie von N ≈ 0,88 (Tabelle 10 unter 3.2.4.1.2). Am nächsten käme diesem

Wert eine 1:1- Stöchiometrie von Impß und rpL23a. Für die Bindung von Impß (AS 127-

641) mit rpL23a ergab sich dagegen eine Stöchiometrie von N ≈ 0,36 (Tabelle 10 unter

3.2.4.1.1). Hierbei könnte es sich sowohl um eine 1:2- als auch um eine 1:3-Stöchiometrie

handeln. Im Falle eines 1:2- Verhältnisses würde dies bedeuten, dass zwei Moleküle

Impß127-641 ein Molekül rpL23a binden würden. Die gleiche Stöchiometrie ergibt sich

auch für die Bindung von Imp7 an rpL23a mit N ≈ 0,38 (Tabelle 11 unter 3.2.4.2).

Auffällig ist auch die Tendenz einer deutlich verringerten Affinität der Bindung von

Impß127-641 an rpL23a im Vergleich zu Impß. Möglicherweise ist Impß127-641 nicht

mehr in der Lage, die Kernlokalisationssequenz (NLS) von rpL23a vollständig zu binden,

so dass stattdessen zwei Moleküle Impß127-641 gemeinsam in unspezifischer Weise an

die NLS binden. Genauere Aussagen auf Basis der ermittelten Kd-Werte sind nicht

sinnvoll, solange kein Nachweis über die vorliegenden Stöchiometrien erbracht ist. Für

eine Klärung der vorliegenden Stöchiometrien wäre es sinnvoll, analytische

Gelfiltrationsläufe mit dem für ITC-Messungen verwendeten Puffer durchzuführen.

Hierfür könnten auch die bei ITC-Experimenten entstehenden Komplexe direkt durch

Gelfiltrationen analysiert werden.

Diskussion

94

Eine vollständige Kartierung der rpl23a-Bindungsstelle in Impß konnte in Rahmen der

Diplomarbeit nicht erreicht werden. Die ITC-Experimente mit dem Impß-Fragment

Impß127-641 haben gezeigt, dass die Aminosäuren 127-641 von Impß wahrscheinlich

nicht die vollständige Bindungsstelle beinhalten. Eindeutig beobachtbar war die Tatsache,

dass es sich bei der Bindung von Impß oder Imp7 an rpL23a unter den gegebenen

Bedingungen um eine endotherme Reaktion mit positiven ∆H handelt. Zudem konnte eine

Zunahme der Entropie während der Bildung der untersuchten Komplexe beobachtet

werden. Diese Entropiezunahme könnte eine Erklärung dafür sein, warum die Bindung der

Importrezeptoren an rpL23a trotz ihrer endothermen Eigenschaften spontan abläuft. Die

Kompensation der umgesetzten Wärmeenthalpie ∆H durch die Entropie ∆S ist eine

allgemeine Eigenschaft von Protein-Protein-Interaktionen. Damit eine Reaktion spontan

ablaufen kann, muss ihre freie Energie ∆G negativ sein. Die Definition von ∆G lautet:

∆G = ∆H – T∆S (∆G = Änderung der freien Energie, ∆H = Änderung der

Wärmeenthalphie, T = Temperatur, ∆S = Änderung der Entropie ).

Daraus folgt, dass Reaktionen, bei denen die umgesetzte Wärmeenthalpie ∆H ein positives

Vorzeichen besitzt, nur bei einer entsprechenden, gleichzeitigen Zunahme der Entropie

stattfinden können. Die beobachtete Entropiezunahme ∆S setzt sich aus mehreren

Teilbeträgen zusammen, deren genaues Verhältnis unbekannt ist. Eine Möglichkeit für die

beobachtete Entropiezunahme wäre das Freiwerden von proteingebundenen Salzionen im

Verlaufe dieser Bindung. So binden die Importrezeptoren Imp7 und Impß an die basische

BIB-Domäne von rpL23a (AS 32-74) (Jäkel und Görlich 1998). Durch einen

Verdrängungsprozess infolge neu entstehender Salzbrücken zwischen geladenen

Seitenketten der beiden Proteine würden die zuvor gebundenen Salzionen in Lösung gehen

und somit eine Zunahme der Entropie verursachen.

Ein weiterer Teilbetrag der Entropieänderung kann in einer Änderung der Freiheitsgrade

der Atome innerhalb der Proteine während der Bindung bestehen. Durch small-angle X-

ray scattering (SAXS)-Studien mit Impß und dem Importrezeptor Transportin (Fukuhara

et al., 2004) und durch Kristallstrukturen von Impß mit verschiedenen Bindungspartnern

(Lee et al., 2005, 2003, Liu und Stewart, 2005; Cingolani et al., 2002, 1999) ist bekannt,

dass Karyopherine große konformelle Änderungen während der Bindung von Substraten

oder RanGTP eingehen können. Eine aktuelle Studie stellt ein Modell auf, wonach

Diskussion

95

Karyopherine bei der Bindung von Substraten Energie speichern können (Conti et al.,

2006). Vereinfacht kann man sich die Karyopherine hierbei als Moleküle mit einer

federartigen Architektur vorstellen (siehe Abbildung 36).

Abbildung 36: Schematische Illustration des federartigen Aufbaus von ß-Karyopherinen. Jede Windung der Feder besteht aus einem HEAT-repeat, der wiederum aus zwei �-Helices aufgebaut ist (A und B) (Abbildung nach Stewart, 2003).

Eine Veränderung der relaxierten Struktur durch Änderung der Konformation bei der

Bindung von Substraten oder RanGTP führt zu einer Erhöhung der inneren Energie der

Karyopherine in der Art einer Federspannung. Die verhältnismäßigen Anteile von

enthalpischen und entropischen Effekten bei einer solchen Änderung der inneren Energie

sind unbekannt. Es könnte jedoch sein, dass die Bindung von Impß an rpL23a durch eine

Konformationsstabilisierung zu einer Verringerung der Freiheitsgrade der Proteinatome

führt. Dadurch würde dieser Prozess einen negativen Teilbeitrag zur Gesamtentropie

leisten, die insgesamt jedoch trotzdem zunimmt.

Auf der Grundlage von Kartierungsexperimenten (Jäkel und Görlich, 1998; sowie 3.2.4.2),

der postulierten Chaperonfunktion von Importrezeptoren (Jäkel und Görlich 2002) sowie

den bereits bekannten Komplexen von Impß mit anderen Bindungspartnern (Lee et al.,

2005, 2003, Liu und Stewart, 2005; Cingolani et al., 2002, 1999) können einige

Vermutungen über die Art der chemischen Wechselwirkungen des Impß/rpL23a-

Komplexes angestellt werden. Die BIB-Domäne von rpL23a besitzt einen äußerst

basischen Charakter. Es ist daher anzunehmen, dass Impß und auch andere funktionelle

Kernimportrezeptoren wie z.B. Imp7 über eine Reihe von sauren Aminosäuren an diese

basischen Reste binden. Impß besitzt eine ungeordnete Schleife von sauren Aminosäuren

(AS 331-341, engl. acidic loop), die zwischen der A- und der B-Helix vom HEAT-repeat 8

Diskussion

96

inseriert ist (Cingolani et al., 1999). Sie liegt damit innerhalb der Sequenz der minimalen

rpL23a-Bindungsstelle, die durch analytische Gelfiltrationen (3.2.4.2) und Pull-down-

Experimente (Jäkel und Görlich, 1998) bekannt ist. Eine Beteiligung dieser sauren

Aminosäuren an der Bindung der Kernlokalisationssequenz ist daher wahrscheinlich. Aus

den Strukturen von Impß im Komplex mit der IBB-Domäne von Impα (Cingolani et al.,

1999) und PTHrP (Cingolani et al., 2002) ist bekannt, dass die Bindung von Impß zur

Ausbildung von Sekundärstrukturmotiven innerhalb der Bindungsstellen der

Interaktionspartner führt. Eine Sekundärstrukturvorhersage von rpL23a mit dem

Programm PSI-Predict (Abbildung 37) zeigte, dass die BIB-Domäne (AS-32-74) eine

relativ ungeordnete Struktur mit wenigen kurzen ß-Strängen besitzt. Eine Entstehung von

Sekundärstrukturmotiven innerhalb der BIB-Domäne infolge einer Bindung von

Importrezeptoren durch einen induced-fit-Mechanismus ist daher vorstellbar.

Abbildung 37: Sekundärstrukturvorhersage für rpL23a durch PSIpredict. Grüne Zylinder, H: Helices, gelbe Pfeile, E: Faltblätter, C: Schleife, Höhe der blauen Balken: Konfidenz der Vorhersage, die Aminosäurepositionen sind unterhalb der Sekundärstruktur nummeriert, rote Pfeile: Anfang und Ende der BIB-Domäne (AS 32-74).

Diskussion

97

Die hier dargestellten Kartierungsexperimente mit Imp7 konnten teilweise zur Aufklärung

der Lokalisation der Bindungsstellen, sowie der Energetik und Kinetik der Bindung

genutzt werden. Für eine genaue Aufklärung der chemischen Wechselwirkungen der

beiden Bindungspartner ist jedoch eine strukturelle Aufklärung des Impß/rpL23a-

Komplexes nötig. Die Identifizierung der vollständigen Bindungsstellen von Impß und

Imp7 für rpL23a ist jedoch ein nützliches Hilfsmittel für eine mögliche spätere

Strukturaufklärung. Kristallisationsversuche mit solchen Rezeptor-Fragment/rpL23a-

Komplexen könnten die Kristallisation postiv beeinflussen, da diese Komplexe

wahrscheinlich eine stabilere Konformation besitzen.

4.1.4 Funktionelle Arbeiten mit Imp7 und rpL23a

Angesichts der Tatsache, dass mehrere Rezeptoren den Kernimport von rpL23a vermitteln

können stellt sich die Frage, inwieweit zwischen den verschiedenen Rezeptoren

Unterschiede bzgl. der Affinität und Bindungsenthalpie bestehen. Für diesen Zweck wurde

auch die Bindung von Imp7 an rpL23a durch eine ITC-Messung untersucht (3.2.4.2). Wie

bereits für Impß beobachtet (3.2.4.1.2) handelt es sich auch bei dieser Bindung um einen

endothermen Prozess. Die ermittelte Stöchiometrie zeigte mit N ≈ 0,38 eine große

Abweichung zur Bindung von Impß an rpL23a (N ≈ 0,88). Der Wert ähnelt eher der

beobachteten Stöchiometrie für das Impß-Fragment Impß127-641 (N ≈ 0,36). Es könnte

sich also auch hier sowohl um eine 1:2- als auch eine 1:3-Stöchiometrie handeln. Dies

würde bedeuten, dass entweder zwei oder sogar drei Moleküle Imp7 ein Molekül rpL23a

binden. Dieser Beobachtung wiederspricht jedoch einer analytischen Gelfiltration des

Komplexes Imp7/rpL23a (3.2.3.1). Das hierbei aus dem Retentionsvolumen ermittelte

Molekulargewicht des Imp7/rpL23a-Komplexes beträgt 152 kDa. Dies entspricht dem bei

einer 1:1 Stöchiometrie vorliegenden Gewichts des Komplexes von 138kDa. Es muss

jedoch gesagt werden, dass die Gelfiltration mit einem anderen Puffer durchgeführt wurde

(2.2.4.6). Es ist nicht auszuschließen, dass sich mit dem für ITC-Messungen verwendeten

Puffer (2.2.5) eine andere Stöchiometrie ergibt. Für die Klärung dieses Problems wäre es,

wie bereits vorgeschlagen (4.1.3), sinnvoll, analytische Gelfiltrationsläufe mit dem für

ITC-Messungen verwendeten Puffer durchzuführen.

Diskussion

98

Auf die Frage nach der Lokalisation der Bindungsstelle für rpL23a in Imp7 gibt es erste

Hinweise. Die erfolgreiche Präparation des Komplexes Imp7C598/rpL23aBIB (3.2.5.5)

grenzt den Bereich einer minimalen Bindungsstelle für rpL23a in Imp7C598 auf den C-

terminalen, die Aminosäuren 598 bis 1038 umfassenden Bereich, von Imp7 ein

(Abbildung 38).

Abbildung 38: (A) Schematische Darstellung von Imp7 mit der Kartierung der bekannten Bindeseiten. (B) Schematische Darstellung des Imp7-Fragments Imp7C598. (Beschriftung: saure Schleife 1 = rot, saure Schleife 2 = orange, Impß-Bindedomäne = gelb) (Grafik modifiziert nach Wohlwend et al., 2006 in Vorbereitung) Innerhalb dieses Sequenzbereichs sind zwei ungeordnete Schleifenstrukturen lokalisiert,

die ein hohe Dichte von sauren Aminosäuren aufweisen (Schleife 1: AS 882-912 und

Schleife 2: AS 927-957). Wie bereits für den Komplex Impß/rpL23a besprochen wurde,

(4.1.3) könnten diese sauren Aminosäuren auch bei der Bindung von Imp7 an rpL23a eine

wichtige Rolle spielen. Hierbei wird eine Bindung der sauren Seitenketten von Imp7 an

basische Bereiche der Kernlokalisationssequenz angenommen.

Eine zusätzliche Bindung von basischen und auch anderen Resten außerhalb der NLS von

rpL23a wäre ebenfalls möglich. Dies könnte in verstärktem Maße der Fall sein, wenn man

davon ausgeht, dass Imp7 eine chaperonartige Funktion für das Importsubstrat rpL23a

besitzt, wie von Jäkel und Görlich postuliert wurde (1.3.3) (Jäkel und Görlich, 2002). Die

Autoren stellten die Theorie auf, dass Imp7 eine effizientere Chaperonfunktion besitzt als

Impß. Basis dieser Vermutung war ein Experiment, bei dem die Komplexe Impß/rpL23a,

Transportin/rpL23a, Imp5/rpL23a und Imp7/rpL23a auf einen CM-Sepharose-

Kationentauscher geladen wurden. Während Impß/rpL23a und Transportin/rpL23a

teilweise an den Kationentauscher gebunden wurden, zeigten die Komplexe Imp5/rpL23a

und Imp7/rpL23a keine Bindung. Daraus schlossen die Autoren, dass Imp7 und Imp5 im

Diskussion

99

Gegensatz zu Impß und Transportin zusätzliche Bereiche außerhalb der BIB-Domäne

gebunden hatten und somit ionische Wechselwirkungen von rpL23a mit dem

Kationentauscher verhinderten. Die Autoren postulierten, dass aus einer Reihe von

funktionellen Importrezeptoren nur bestimmte Rezeptoren eine effiziente

Chaperonfunktion besitzen. Allerdings ist dieses Experiment noch kein direkter Nachweis

für eine Chaperonfunktion von Importrezeptoren. Ein vorstellbares Experiment für einen

Vergleich der Chaperonfunktionen von Impß und Imp7 könnte in einem Nachweis der

RNA-Bindefähigkeit der Komplexe bestehen. Beispielweise wäre es möglich, die

Komplexe Imp7/rpL23a und Impß/rpL23a zunächst an einer Affinitätssäule zu

immobilisieren und im Anschluss mit einer Zelllysatprobe zu inkubieren. Nach einem

Waschschritt und der anschließenden Elution könnte eine spektrometrische Untersuchung

der Komplexe durchgeführt werden. Das Auftreten von gebundener RNA wäre ein

Hinweis auf eine unzureichende Chaperonfunktion des Importrezeptors.

4.2 Biochemische Arbeiten mit rpL5

4.2.1 Präparation von rpL5

Die Präparation von rpL5 konnte erfolgreich etabliert werden (3.1.2). Hierfür wurde rpL5

genau wie rpL23a durch Affinitätschromatographie über GSH-Sepharose und

anschließend über Kationenaustauschchromatographie gereinigt. Auch bei der Reinigung

von rpL5 trat zunächst das Problem auf, dass das Protein infolge von gebundener RNA

präzipitierte (3.1.1.3 und 3.1.2.1). Durch die Verwendung eines Lysis- und Waschpuffers,

der LiCl enthielt, gelang es jedoch schließlich, die gebundene RNA zu entfernen (3.1.2.4).

Auffällig war auch die Anfälligkeit von rpL5 für Proteasen (3.1.2.2). rpL5 weist nach der

Entfernung der GST-Affinitätssequenz eine Temperaturinstabilität auf, so dass es bei 25°C

zur Präzipitation neigt (3.1.2.2). Die Verwendung eines Puffers, der 500 mM NaCl

enthielt, verringerte diesen Effekt, konnte ihn jedoch nicht vollständig eliminieren

(3.1.2.5). Diese Temperaturempfindlichkeit ist auch von früheren Untersuchungen mit

Diskussion

100

rpL5 bekannt (Scripture und Huber, 1995, DiNitto und Huber, 2003). Daher ist es, wie

beobachtet, kaum möglich, analytische Gelfiltrationen bei Raumtemperatur durchzuführen.

4.2.2 Kristallisationsversuche mit Imp7/rpL5 und rpL5

Ein Großteil der Kristallisationsscreens für den Komplex Imp7/rpL5 wurde mit einem

Kristallisationsroboter der EMBL-Outstation in Hamburg pipettiert (3.1.3.2). Bis zum

heutigen Zeitpunkt konnte in keiner der angesetzten Bedingungen eine Kristallbildung

beobachtet werden. Die Alkohole MPD (2-Methyl-2,4-pentandiol) oder Ethanol zeigten

jedoch einen positiven Einfluss auf die Löslichkeit des Komplexes. So konnte in einem

Teil der Bedingungen mit MPD oder Ethanol über einen Zeitraum von fast 4 Monaten

keine Präzipitation von Protein festgestellt werden. Für weitere Kristallisationsversuche

erscheint es daher sinnvoll, die MPD- und Ethanol-haltigen Kristallisationsscreens JB7

und JB8 mit höheren Proteinkonzentrationen als 4,8 mg/ml zu pipettieren. Eine weitere

Möglichkeit bestünde darin, den Komplex bei anderen Temperaturen, wie z.B. 4°C oder

30°C, zu pipettieren. Des Weiteren erscheint die Verwendung von verkürzten N-

terminalen Fragmenten für die Kristallisation sinnvoll, da die von Imp7 erkannte

Kernlokalisationssequenz nur die Aminosäuren 1-25 von rpL5 umfasst (Claußen et. al.,

1999; Rudt und Pieler, 2001).

In einem ergänzenden Versuch wurde rpL5 ohne Bindungspartner in

Kristallisationsansätzen bei 20°C eingesetzt. Hierbei konnte in den meisten Bedingungen

eine rasche Präzipitation beobachtet werden. Ein möglicher Grund hierfür ist eine zu hoch

eingesetzte Proteinkonzentration. Ein weiterer Grund könnte auch die beobachtete

Temperaturinstabilität und niedrige Strukturierung des Proteins sein (4.2.3). Sekundär- und

Tertiärstrukturvorhersagen zeigten, dass rpL5 weite N- und C-terminale Sequenzabschnitte

mit einer geringen Strukturierung besitzt, die eine Kristallisation des Proteins ohne

Bindungspartner behindern könnten (4.2.3).

Diskussion

101

4.2.3 Die Rolle von Importrezeptoren bei Importprozessen mit rpL5

Wie unter 1.3.5 beschrieben wurde, ist der Reimport von im Cytoplasma gespeicherter 5S

rRNA an rpL5 gekoppelt. Angesichts der Tatsache, dass die Biogenese der ribosomalen

Untereinheiten im Nukleolus und im Nukleus stattfindet, stellt sich die Frage, warum im

Verlaufe der Evolution überhaupt ein solcher Transportzyklus für die 5S RNA entwickelt

wurde. Es gibt zum jetzigen Zeitpunkt einige Hinweise aber keine wirklichen Antworten

auf diese Frage. In einer Studie wurde postuliert, dass die Bindung an rpL5 eine

Vorbedingung für den Einbau der 5S rRNA in die große ribosomale Untereinheit darstellt

(Steitz et al., 1988). Eine andere Untersuchung beschreibt ein Modell, indem die Bindung

der 5S rRNA an rpL5 in Form einer Feedback-Regulierung die eigene Transkriptionsrate

reguliert (Pittman et al., 1999). Eine Studie von Lin et al. schließlich stellte die Theorie

auf, dass die 5S rRNA eine chaperonartige Rolle als Faltungshelfer für rpL5 während der

Translation spielt. Die Autoren vermuten weiter, dass es sich hierbei um einen

entwicklungsgeschichtlich sehr alten Mechanismus handeln könnte. Dieser könnte aus

einer Zeit stammen, in der RNA-Moleküle eine Vielzahl von Funktionen besaßen, die

heute von Proteinen ausgeübt werden (Lin et al., 2001).

rpL5 ist ein temperatursensibles Protein. DiNitto und Huber zeigten mit Hilfe von

zirkulärer Dichroismus-Spektroskopie, dass rpL5 aus Xenopus laevis ohne Bindungs-

partner in vitro einen Denaturierungspunkt von Tm= 27°C besitzt. Ein Komplex aus 5S

rRNA und rpL5 besitzt hingegen einen Denaturierungspunkt von Tm = 44°C. Die Autoren

identifizierten größere Sequenzabschnitte in rpL5, vor allem an den N- und C-terminalen

Enden, die eine niedrige Strukturierung aufweisen. Der niedrige Ordnungsgrad scheint für

die Temperaturinstabilität des Proteins verantwortlich zu sein (DiNitto und Huber, 2003).

Ein mit dem Programm Swiss-Model (2.1.10) errechnetes Modell der Aminosäuren 10-232

ist in Abbildung 39 dargestellt. Deutlich erkennbar ist hier eine geringe Strukturierung der

N-terminalen Region sowie einiger zentraler Sequenzabschnitte. Der C-terminale Teil (AS

233-296) fehlt in diesem Modell. Eine Untersuchung der Aminosäuresequenz durch

DiNitto und Huber mit dem Programm PONDR sagt auch für den hier nicht dargestellte C-

terminalen Teil einen niedrigen Strukturierungsgrad vorher (DiNitto und Huber, 2003).

Diskussion

102

Abbildung 39 Schematisches Modell der Struktur von rpL5 (AS 10 – 232) aus Xenopus laevis errechnet mit dem Programm Swiss-Model (2.1.10). (A) Schematisches Modell von rpL5 (AS-10 – 232). Die Sekundärstrukturen sind in einem Farbspektrum von blau (N-Terminus) nach rot (C-Terminus) gefärbt. Die rosa gefärbten Aminosäuren 48, 189 und 234 wurden als Grenzen für die Klonierung von rpL5-Fragmenten ausgewählt (AS 234 nicht dargestellt – stattdessen ist die letzte dargestellte Aminosäure AS232 angefärbt) (3.1.4). (B) Schematisches Model von rpL5 (AS 10-232) mit einer farbigen Illustration der chemischen Eigenschaften der Seitenketten. Beschriftung: basische Reste (blau), saure Reste (rot), polare Reste (gelb), unpolare Reste (grau).

Die Autoren postulierten, dass die Bindung der 5S-RNA in Form eines gegenseitigen

induced-fit-Mechanismus zu einer Stabilisierung von zentralen und C-terminalen

Sequenzabschnitten in rpL5 führt. Besonders die Wechselwirkungen zwischen

aromatischen, im zentralen Bereich der Primärsequenz lokalisierten Aminosäuren mit

verschiedenen Basen der 5S rRNA scheint für die Stabilisierung von rpL5 eine wichtige

Rolle zu spielen (DiNitto und Huber, 2003, 2001). Die N-terminalen Aminosäuren spielten

hingegen keine nachweisbare Rolle bei der Bindung der RNA. Diese Region ist

wahrscheinlich innerhalb des 5S RNPs relativ exponiert und vermittelt verschiedene

Transportprozesse (DiNitto und Huber, 2003). Die ersten 25 N-terminalen Aminosäuren

von rpL5 beinhalten sowohl eine Kernlokalisationssequenz für verschiedene

Importrezeptoren wie Imp7 und Impß als auch eine Kernexportsequenz für einen CRM1

vermittelten Export (1.3.1) (Murdoch et al., 2002; Rudt und Pieler, 2001; Claußen et al.,

1999). Des Weiteren wird vermutet, dass die N-terminale Region von rpL5 eine wichtige

Rolle beim Einbau von 5S RNPs in die große ribosomale Untereinheit spielt (Lin et al.,

1999).

Auch andere Interaktionspartner von rpL5 wie z.B. das MDM-2 Onkoprotein (Marechal et

al., 1994) oder der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (Schatz et al., 1998) könnten einen

strukturstabilisierenden Einfluss auf rpL5 haben. Die Tatsache, dass rpL5 in vivo meist in

Form von 5S RNPs oder in Komplexen mit anderen Bindungspartnern vorkommt, spielt

auch für die Kristallisation von rpL5 mit Importrezeptoren eine wichtige Rolle. Es stellt

Diskussion

103

sich die Frage, welche physiologische Rolle ein Imp7/rpL5- oder Impß/rpL5-Komplex

ohne gebundene 5S rRNA besitzt. Um eine Stabilisierung der Struktur von rpL5 zu

ermöglichen, müssten die Importrezeptoren wahrscheinlich mehr als nur die ersten 25

Aminosäuren binden. Impß und das Impß-Fragment ImpßC127 (AS 127-876) konnten

rpL5 bei analytischen Gelfiltrationen binden, zeigten jedoch eine deutliche

Temperaturinstabilität, so dass ein Teil des Komplexes auf der Säule präzipitierte (Daten

nicht gezeigt). Der Komplex Impß/rpL5 neigte bei einem ITC-Experiment zu starker

Präzipitation (Daten nicht gezeigt). Es erscheint daher möglich, dass Impß in vitro keinen

strukturstabilisierenden Einfluss auf rpL5 ausübt. Dies könnte bedeuten, dass Impß

lediglich mit der N-terminalen NLS-tragenden Region von rpL5 interagiert. Für den

Komplex Imp7/rpL5 fehlen Beobachtungen über eine eventuelle Temperaturinstabilität, da

dieser Komplex ausschließlich bei 4°C präpariert wurde (3.1.3.1).

Wie Untersuchungen des Kernimports von rpL5 in der Vergangenheit gezeigt hatten,

besitzt rpL5 neben einer N-terminalen NLS (AS 1-25) auch eine C-terminale NLS (AS

261-285) sowie eine zentrale, weite Sequenzabschnitte umfassende NLS (AS 31-253). Die

beiden letztgenannten sind nicht in der Lage, den Kernimport eines 5S RNPs zu vermitteln

(Claußen et al., 1999). Während die C-terminale NLS in einem unbekannten Ran-

unabhängigen Mechanismus den Import mediiert, ist der Kernimport über die zentrale

NLS Ran-abhängig (Rudt und Pieler, 2001). Diese Ran-Abhängigkeit ist ein Indiz für den

Kerntransport über ein bisher nicht identifiziertes Karyopherin. Die Tatsache, dass die

zentrale NLS keinen 5S RNP Import vermitteln kann, deutet darauf hin, dass sich die

Bindung des unbekannten Rezeptors und der 5S rRNA gegenseitig ausschließen. Aufgrund

der Größe der NLS (AS 31-253) ist es vorstellbar, dass der hierfür spezifische, unbekannte

Rezeptor eine stabilisierende Rolle, ähnlich der der 5S rRNA, für rpL5 spielt und den

Kernimport von rpL5 ohne 5S rRNA vermittelt. Der Nachweis eines

strukturstabilisierenden, chaperonartigen Einflusses von Importrezeptoren auf rpL5 könnte

ein Ziel weiterer Untersuchungen sein.

Für weitere Arbeiten mit Imp7 und Impß, insbesondere die Kristallisation betreffend, wäre

es wichtig, einen Nachweis für die Strukturstabilisierung von rpL5 zu erbringen. Wie auch

schon für rpL23a vorgeschlagen wurde, könnte der Nachweis der RNA-Bindefähigkeit von

Importrezeptor/rpL5-Komplexen hierfür Hinweise liefern. Auch die Überprüfung der

Temperaturinstabilität von Imp7/rpL5 wäre wichtig. Für weitere Kristallisationsversuche

mit Komplexen aus Importrezeptoren und rpL5 erscheint es in jedem Fall sinnvoll, auch

Diskussion

104

verkürzte N-terminale Fragmente von rpL5 zu verwenden. Dies träfe in besonderem Maße

zu, wenn sich zeigen würde, dass Imp7 keinen strukturstabilisierenden Einfluss auf rpL5

ausübt. Anhand einer Sekundärstrukturvorhersage mit dem Programm PSIPredict (2.1.10)

wurden bereits drei Expressionskonstrukte für die rpL5 Fragmente rpL5 (AS 1-48), rpL5

(AS 1-189) und rpL5 (AS 1-234) kloniert (Abbildung 39, 3.1.4). Das Fragment rpL5 (AS

1-48) konnte bereits gereinigt werden, eine Nachweis der Bindung durch Imp7 steht

jedoch noch aus (Daten nicht gezeigt).

Die Kristallisation von Komplexen aus Imp7 und ribosomalen Proteinen ist von hohem

Interesse, da bis zum heutigen Zeitpunkt keine Struktur von Imp7 aufgeklärt werden

konnte. Darüber hinaus gibt es keine veröffentlichte Struktur eines Kernimportrezeptors im

Komplex mit einem ribosomalen Protein. So könnten durch die Strukturaufklärung solcher

Komplexe auch Antworten auf die Frage nach der Rolle von Importrezeptoren als

Chaperone von ribosomalen Proteinen gefunden werden.

Zusammenfassung

105

5 Zusammenfassung

Im Verlaufe der Biogenese von Ribosomen wird eine Vielzahl von ribosomalen Proteinen

in den Zellkern importiert und nachfolgend zusammen mit verschiedenen rRNAs im

Nukleolus in neu entstehende ribosomale Untereinheiten integriert. Der Kernimport der

ribosomalen Proteine wird dabei durch Importrezeptoren der Importin-ß-Superfamilie

vermittelt. Die Rezeptoren binden die ribosomalen Proteine im Cytoplasma und mediieren

die Kernporenpassage des entstandenen Komplexes. Bekannte Mitglieder dieser Protein-

Superfamilie sind Impß und Imp7. Beide Rezeptoren sind in der Lage, den Import der

ribosomalen Proteine rpL5 und rpL23a zu vermitteln.

In dieser Arbeit wurde die Bindung der ribosomalen Proteine rpL5 und rpL23a an die

funktionellen Importrezeptoren Imp7 und Impß untersucht. Für diesen Zweck wurden

rpL5, rpL23a und die als BIB-Domäne bezeichnete Importrezeptorbindedomäne von

rpL23a kloniert, exprimiert und in hochreiner Form isoliert.

Die Untersuchung von Komplexen aus Imp7, Impß und den zuvor gereinigten ribosomalen

Proteinen, wurde über verschiedene Herangehensweisen angegangen. So wurde versucht

verschiedene Komplexe, bestehend aus Imp7 und den genannten ribosomalen Proteien, zu

kristallisieren, um eine Strukturaufklärung zu ermöglichen. Bisher konnte jedoch keine

Kristallbildung beobachtet werden.

Ferner konnten durch funktionelle Untersuchungen Erkenntnisse über die Interaktion von

Kernimportrezeptoren mit ribosomalen Proteinen gewonnen werden. So wurde durch

Kartierungsexperimente die Bindungsstelle für rpL23a in Impß eingegrenzt. Mit Hilfe von

isothermer Titrationskalorimetrie konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Impß und

Imp7 an rpL23a in vitro einen endothermen Charakter besitzt. Des Weiteren wurden

Hinweise darauf gefunden, dass bestimmte Ansammlungen von sauren Aminosäuren in

niedrig strukturierten Sequenzabschnitten von Impß und Imp7 eine wichtige Funktion bei

der Bindung des ribosomalen Proteins rpL23a einnehmen. Diese sauren Aminosäuren

könnten auch eine Rolle bei der postulierten Chaperonfunktion von Importrezeptoren für

basische ribosomale Proteinen spielen.

Zusammenfassung

106

6 Summary

The process of ribosome biogenesis includes the import of ribosomal proteins into the

nucleus. The subsequent integration of both ribosomal proteins and different rRNAs into

the nascent ribosomal subunits takes place in the nucleolus. The nuclear import of

ribosomal proteins is mediated by import receptors of the importin-ß-superfamily. These

receptors bind to ribosomal proteins in the cytoplasm and mediate the passage of the

formed complexes through the nuclear pore complex. Prominent members of this protein-

superfamily are Imp7 and Impß. Both receptors are capable of importing the ribosomal

proteins rpL5 and rpL23a.

In this diploma thesis, the binding of the ribosomal proteins rpL5 and rpL23a to their

functional import receptors Imp7 and Impß was the focus of investigations. For this

purpose, the two ribosomal proteins and the import receptor binding domain (BIB-domain)

of rpL23a were cloned, expressed and isolated ultrapure. The investigation of complexes

consisting of Imp7, Impß and the previously purified ribosomal proteins was tackled by

different approaches. Crystallisation trials were carried out with complexes of Imp7 and

either rpL5, rpL23a or the BIB-domain in order to obtain crystals for structure

determination. However, a formation of crystals has not been observed so far.

Furthermore, functional investigations enlightened some properties of interactions between

importreceptors and ribosomal proteins. The binding site for rpL23a within Impß could be

mapped roughly. Using isothermal titration calorimetry, it could be shown that binding of

Impß and Imp7 to rpL23a is an endothermic process in vitro. Additionally, the interaction

studies with truncated fragments of Impß and Imp7 indicate the involvement of acidic

loops of Imp7 and Impß in the binding of the ribosomal protein rpL23a: These loops might

also be important for the postulated function of import receptors as chaperones for exposed

basic domains of ribosomal proteins.

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Abkürzungsverzeichnis

116

8 Abkürzungsverzeichnis

α alpha

A Absorption

A280nm Absorption bei 280 nm

Å Angström [1 Å = 0.1 nm]

AS Aminosäuren

ATP Adenosintriphosphat

Β beta

bp Basenpaare

bzgl. bezüglich

c Konzentration [M]

C Cytosin

° C Grad Celsius

cal Kalorie

CIP calf intestine phosphatase

cm Zentimeter

d Tage

Da Dalton [g/mol]

ddH2O bidestilliertes Wasser

ddNTP Didesoxynukleotidtriphosphat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dsDNA doppelsträngige DNA

E. coli Escherichia coli

EDTA N, N, N´, N´ Ethylendiamintetraactetat

et al. et altera

EtOH Ethanol

γ gamma

G Guanin

∆G Änderung der freien Energie [J/mol]

GSH reduziertes Glutathion


117

GST Glutathion-S-Transferase

GTP Guanosintriphosphat

h Stunden

∆H Änderung der Wärmeenthalpie [J/mol]

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure

H. sapiens Homo sapiens

Imp Importin

IPTG Isopropyl-β-D-isothiogalactosid

ITC Isotherme Titrationskalorimetrie

k kilo (als präfix)

kb Kilobasen

Kd Dissoziationskonstante [M-1]

J Joule

λ Wellenlänge [nm]

µ mikro (als Präfix)

m milli (als präfix)

M Molarität

mAU Milliabsorptionseinheiten

mRNA Messenger RNA

MTase Methyltransferase

MW Molekulargewicht [g/mol]

n nano (als Präfix)

NPC nuclear pore complex, Kernporenkomplex

nPP nach PreScission-Protease(-Verdau)

OD Optische Dichte

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PCR Polymerasekettenreaktion

prä-rRNA rRNA-Vorläufer

Ran Ras-related nuclear antigen

RanBP Ran binding protein

RanGAP Ran GTPase activating protein

RanGEF Ran guanine nucleotide exchange factor

RNA Ribonukleinsäure


118

rpL ribosomal protein of the large subunit

rRNA ribosomal RNA

s Sekunde

∆S Änderung der Entropie [J/mol * K]

S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

SDS Natriumdodecylsulfat

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

snoRNA small nucleolar RNA

RNP Ribonucleoprotein

Taq Thermus aquaticus

TBE Tris-Borsäure-EDTA-Puffer

TEMED N, N, N´, N´ Tetramethylethylendiamin

Tm Schmelztemperatur

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

tRNA transfer RNA

U Unit (Einheit der Enzymaktivität)

UV Ultraviolett

V Volumen

vgl. vergleiche

v/v Volumenprozent (volume per volume)

w/v Gewichtsprozent (weight per volume)

X. laevis Xenopus laevis

xg Vielfaches der Erdbeschleunigung (g = 9,81 m/s2)

z.B. zum Beispiel

ε molarer Extinktionskoeffizient [M-1 cm-1]

Danksagung

119

9 Danksagung

Herrn Prof. Dr. Ralf Ficner danke ich für die Überlassung dieses interessanten Themas, die

hervorragenden Arbeitsbedingungen und die Förderung der Arbeit durch wertvolle

Diskussionen und fachliche Anregungen.

Herrn Prof. Dr. Oliver Einsle danke ich sehr herzlich für die Übernahme des Korreferates.

Dr. Achim Dickmanns bin ich für die stets motivierende Begleitung und fachliche

Unterstützung dieser Arbeit dankbar.

Mein herzlicher Dank gilt Daniel Wohlwend für die hervorragende Betreuung dieser

Arbeit, die vielen fachlichen Diskussionen, Ratschläge, Ideen und aufmunternden Worte.

Frau Dr. Anja Strasser und Thomas Monecke danke ich für die Durchsicht des

Manuskriptes sowie für die vielen großen und kleinen Hilfen und die nette Atmosphäre im

Laboralltag.

Winfried Lehndeckel danke ich für die Ratschläge bei vielen technischen Fragen.

Mein ganz persönlicher Dank gilt besonders Britta.

Danksagung

120

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Präparation und Kristallisation von ribosomalen Proteinen ... · Wasser gefüllten Kanal. Auf cyto- und karyoplasmatischer Seite wird die zentrale Domäne Auf cyto- und karyoplasmatischer