Prueba bioquímicaLas pruebas bioquímicas son una serie de análisis clínicos que sirven a la Medicina como apoyo a la hora de diagnosticar infecciones por bacterias.

Las principales pruebas son:

1 IMVIC o 1.1 Indol o 1.2 Rojo de Metilo o 1.3 Voges Proskauer o 1.4 Citrato

2 Enzimáticas o 2.1 Oxidasa o 2.2 Catalasa o 2.3 Coagulasa o 2.4 Ureasa o 2.5 Reducción Nitratos o 2.6 β - D - Galactosidasa o 2.7 Descarboxilasas

3 Otras o 3.1 Agar TSI o 3.2 Óxido - Fermentativa o de Hugh-Leifson o 3.3 Ácidos y gases o 3.4 Hidrolisis Gelatina

4 Índice Analítico de Perfil 5 Enlaces externos

IMVIC

El IMVIC se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. Su finalidad es identificar un organismo del grupo de los coliformes. La presencia de estos indica contaminacion fecal.

Resultados de una prueba IMViC

Indol

La prueba del indol estudia la capacidad de degradar el triptófano con producción de Indol y metabolitos indólicos.

Rojo de Metilo

Estudia la fermentación ácido mixta con producción de ácidos estables en el tiempo.

Voges Proskauer

Estudia la fermentación butanodiólica con formación de un metabolito intermediario neutro.

Técnica: Sembrar la muestra en el medio e incubar de 24 a 48h a 37 °C. Según el volumen del medio añadir a partes iguales el volumen de los reactivos, agitar para exponer el medio al O2. VP POSITIVO: Color rojo-rojizo en menos de 1h. VP NEGATIVO: Amarillo en superficie.

Citrato

Estudia la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono.

Enzimáticas

Oxidasa

prueba de Oxidasa

La oxidasa estudia la presencia del enzima citocromo c oxidasa que actúa en la cadena respiratoria del organismo.

Catalasa

Estudia si el microorganismo posee el enzima catalasa que actúa descomponiendo el peróxido de hidrógeno.

Reacción de la catalasa

Coagulasa

Coágulos formados por la reacción de la coagulasa en un tubo de ensayo.

Estudia la producción del enzima coagulasa, capaz de coagular el plasma. Diferencia Staphylococcus aureus de otras especies.

Ureasa

prueba de ureasa

Estudia si el microorganismo posee el enzima ureasa que cataliza la hidrólisis de la urea.

Reducción Nitratos

Estudia la capacidad de los microorganismos para reducir los nitratos por la presencia de un conjunto de enzima denominado nitrato reductasa

β - D - Galactosidasa

Estudia la capacidad de producir β - D - galactosidasa, enzima necesario para metabolizar la lactosa.

Descarboxilasas

Estudia si el microorganismo produce los enzimas que descarboxilan los aminoácidos presentes en el medio.

Otras

Agar TSI

El agar TSI estudia la utilización de la glucosa y lactosa, la producción de gas y ácido sulfhidrico (como producto metabolico final de los aminoacidos azufrados).

Resultados de un agar TSI: (de izquierda a derecha) preinoculado (como control), P. aeruginosa, E. coli, Salmonella Typhimurium , Shigella flexneri.

Óxido - Fermentativa o de Hugh-Leifson

Estudia si el microorganismo es capaz de metabolizar un hidrato de carbono por via oxidativa o por via fermentativa.

Ácidos y gases

Estudia la capacidad de utilizar un hidrato de carbono con la producción de ácidos y la formación de gas.

Hidrolisis Gelatina

Estudia la capacidad proteolítica del microorganismo por degradación de la gelatina.

Índice Analítico de Perfil

API 20NE Sistema de detección a las 24 horas de incubación.

El Índice Analítico de Perfil (Analytical Profile Index o API) son un conjunto de pruebas bioquímicas que se concentran en muy poco espacio mediante el uso de pocillos con el reactivo correspondiente ya preparado para ser usado.

Se llenan los pocillos siguiendo las instrucciones del fabricante con la muestra problema. Se sellan los pocillos que sean obligatorios. Se incuba la estufa a unos 37º C normalmente. Posteriormente se comprueba los resultados pasado el tiempo indicado en la tira.

Los resultados se apuntan por cada prueba bioquímica en el casillero correspondiente, de manera que al final dará un número de varias cifras. Con este numero se puede buscar en el libro de referencia de las tiras API, el tipo de bacteria que se tiene en la muestra.

Son muy útiles, capaces de identificar en poco tiempo la bacteria problema (actualmente unas 600 especies).

Hay varios modelos dependiendo del uso. Por ejemplo, si la muestra es un coprocultivo se debería usar una tira de enterobacterias.

“Pruebas Bioquímicas”

Bibliografía

Microbiología / Thomas D. Brock, Michael T. Madigan

2a. ed. en español, 1993. México ; Englewood Cliffs : Ed. Prentice Hall Hispanoamericana.

Microbiología / Michael J. Pelczar, Jr., Roger D. Reid

2a. ed. en español., 1982. México : Ed. McGraw-Hill.

Tratado de microbiología : con inclusión de inmunología y

genética molecular / Bernard D. Davis

2a. ed., 1978. Barcelona : Ed. Salvat.

Internet:

http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html

http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html

http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html

http://edicion-micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html

Prueba de la Oxidasa

El objetivo de la prueba “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa.

Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura.

Procedimiento:

Con un pequeño papel de filtro añadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algún cambio.

Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo.

Se considera positva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra.

Resultados:

(+) Pseudomonas aeruginosa

( - ) Escherichia coli

Prueba de la Catalasa

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa

El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + ½ O2).

Prodecimiento:

Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liíquida de peróxido de hidrogeno y debemos observar la reacción de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.

Resultados:

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Streptococcus spp.

Prueba de la Coagulasa

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.

Procedimiento:

Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

Resultados:

Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:

1: pequeños coágulos no oganizados

2: pequeños coágulos oganizados

3: gran coágulo organizado

4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.

Se consideran positivos los niveles 3 y 4.

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Staphylococcus epidermis.

Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-Ornitina)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina.

Procedimiento:

Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Reacción Interpretación

Enturbiamiento del

Agar.Hay movilidad

Agar transparente de-

sarrollo solo en picadaNo hay movilidad

Azul (alcalino) Descarboxila ornitina

Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila

Rojo (anillos) Indol (+)

Amarillo (anillos) Indol ( - )

Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de SH2.

Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:

bacterias fermentadoras de la glucosa

bacterias fermentadoras de la lactosa

bacterias fermentadoras de sacarosa

bacterias aerogénicas

bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.

Procedimiento:

Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.

Resultados:

Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp.

Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.

Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico. Salmonela spp.

Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli.

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.

Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)

Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Procedimiento:

Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Reacción Interpretación

Azul (alcalino) Hay movilidad

Rojo No hay movilidad

Engrecimiento Descarboxila ornitina

Ruptura del Agar No descarboxila

Fondo Amarillo y

Tendido púrpuraDescarboxilación de lisina

Pruebas Bioquímicas IMViC:

Agar Citrato

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Procedimiento:

Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir  falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.

Resultados:

(+)Klebsiella spp.

( - ) Escherichia Coli

Indol

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Procedimiento:

Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

Resultados:

(+) Escherichia coli

( - ) Klebsiella pneumoniae

Rojo Metilo

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.  El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.

Procedimiento:

Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

Resultados:

(+) Escherichia coli ( - ) Enterobacter aerogenes

Vogues Proskauer

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

Procedimiento:

Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia  luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva.

Resultados:

(+) Enterobacter aerogenes

(-)Escherichia coli

Microorganismos utilizados en las Pruebas Bioquímicas

MICROORGANISMO

FAMILIA TINCION FORMA MOVILIDAD

PSEUDOMONA SPP.ENTEROBACTE

RGRAM -

BACILOS CORTOS,

CURVADOS O RECTOS

POSEE FLAGELOS POLARES

SALMONELLAENTEROBACTE

RGRAM -

BACILOS CORTOS

FLAGELOS PERÍTRICOS

SHIGUELLA SPP.ENTEROBACTE

RGRAM -

BASTONCILLOS

NO TIENE

ESCHERICHIA COLIENTEROBACTE

RGRAM -

BACILOS CORTOS NO

ESPORULADOS

FLAGELOS PERÍTRICOS

STAPHYLOCOCCUS MICROCACEAE GRAM + COCACEA NO TIENE

AUREUS

Resultados Experimentales

Grupo 1: Sebastián Leyton - Carlos Vera

Grupo 2: Yuri Gálvez - David Fuica

Grupo 3: Graciela Quintero - Carolina

Grupo 4: Carolina Iribarra - Jessica Pizarro

Oxidasa

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

PSEUDOMONA SPP. + + + +

SALMONELLA + + + +

SHIGUELLA SPP. - - - -

ESCHERICHIA COLI + + + +

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

- - - -

Catalasa

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

PSEUDOMONA SPP. + + + +

SALMONELLA + + + +

SHIGUELLA SPP. - + - +

ESCHERICHIA COLI + + + +

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

+ + + +

Coagulasa

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

+ + + +

Indol

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

ESCHERICHIA COLI + + + +

Agar Citrato

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

ESCHERICHIA COLI - - - -

Vogues-Proskauer

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

ESCHERICHIA COLI - - - -

Rojo Metilo

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

ESCHERICHIA COLI + + + +

LIA

MICROORGANISMO(S)

DETECTADO(S)

GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

SALMONELLADESCARBOXIL

ACION DE ORNITINA

DESCARBOXILACION DE ORNITINA

DESCARBOXILACION DE ORNITINA

DESCARBOXILACION DE ORNITINA

SHIGUELLA SPP.

DESCARBOXILACION DE

LISINA

DESCARBOXILACION DE

LISINA

DESCARBOXILACION DE

LISINA

DESCARBOXILACION DE

LISINA

MIO

MICROORGANISMO(S)

DETECTADO(S)

GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

PSEUDOMONA

SPP.

DESCARBOXILACION DE ORNITINA

DESCARBOXILACION DE ORNITINA

DESCARBOXILACION DE ORNITINA

DESCARBOXILACION DE ORNITINA

ST. AUREUS

NO DESCARBOXIL

A

ORNITINA

NO DESCARBOXIL

A

ORNITINA

NO DESCARBOXIL

A

ORNITINA

NO DESCARBOXIL

A

ORNITINA

TSI

MICROORGANISMO(S)

DETECTADO(S)

GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

SALMONELLA

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

PRODUCCION

DE ACIDO

SULFHIDRICO

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

PRODUCCION

DE ACIDO

SULFHIDRICO

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

PRODUCCION

DE ACIDO

SULFHIDRICO

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

PRODUCCION

DE ACIDO

SULFHIDRICO

SHIGUELLA SPP.

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

Batería de Pruebas Bioquímicas

Aquí están algunas de las Pruebas Bioquímicas más frecuentes:

· Fermentación de la lactosa (Mc Conkey) · Agar Hierro de Kliger (KIA) · Prueba del Indol · Citrato de Simmons · Agar Hierro Lisina (LIA) · Agar Urea de Christiansens · Prueba de la Fenilalanina (PPA) · Reducción de los Nitratos · Movilidad · RM - VP · Oxidasa y Catalasa

Fermentación de la lactosa (Mc Conkey)

El agar Mc Conkey es un medio sólido, diferencial y selectivo. Se usa para la discriminación de bacterias con capacidad de fermentar la lactosa (Lac + y -).Composición g/l :

- Peptona 20.0 : fuente de nitrógeno y carbono para las Lac -.

- Lactosa 10.0 : fuente de carbono para las Lac +.

- Sales biliares 2.5 : le confiere carácter selectivo, inhibiendo el crecimiento de Gram +.

- Cloruro sódico 5.0 : para mantener la tonicidad del medio (evitar osmosis).

- Rojo neutro 0.05 : indicador que va hacer que el medio vire de coloración. Si las bacterias son Lac +, producirán ácidos derivados de la fermentación que darán al medio un aspecto rosáceo; si por el contrario son Lac -, el medio se basificará por el uso de la peptona y se tornará amarillo.

- Cristal violeta 0.001 : interfiere junto con las sales biliares en la selectividad del medio.

- Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.

Lac +        Lac -

Agar Hierro de Kliger (KIA)

El agar Hierro de Kliger (KIA), es un medio sólido y diferencial. El fundamento se basa en la capacidad de fermentación de dos azucares (glucosa y lactosa), en la producción de ác. sulfhídrico y en la producción de gas. Composicion g/l:Extracto de carne 3.0 Extracto de levadura 3.0

Peptona 20.0 Lactosa 10.0

Glucosa 1.0 Cloruro sódico 5.0

Citrato férrico amónico 0.5Tiosulfato sódico 0.5 : fuente de azufre, las bacterias lo reducen produciendo ác. sulfhídrico (precipitado negro)

Rojo de fenol 0.03 : indicador, si vira a rosáceo , indica basicidad del medio, si es amarillo indica acidificación (derivada de ác. de la fermentación)Interpretación del Kliger:

NC o SC: no cambio o sin cambio LC, Alk o K : alcalinidad

H2S o subíndice s: si produce ác. sulfhídrico G: productora de gas

Ejemplo: A/As indica que es fermentador de glucosa, lactosa y productor de sulfhídrico

1Fermentador glucosa, productor ác. sulfhídrico y de gas.

2

3 Fermentador glucosa, lactosa y productor de gas.

Prueba del Indol

Pone de manifiesto la presencia de la encima Triptofanasa en nuestras bacterias, si esta presente degradará el triptofano y liberará al medio Indol, para revelar su presencia usaremos el reactivo de Kovac; si hay indol se formará un anillo rojo en la superficie, sino este será amarillo. Para esto sembramos en caldo con triptofano.

Indol+ Indol-

Citrato de Simmons

Cit + Cit -

 

Se usa para determinar si el organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono y compuesto amoniacales como única fuente de nitrógeno. El medio contiene citrato sódico, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador; este se tornará azul cuando el medio se basifica. Las bacterias que metabolizan el citrato liberan iones amonio al medio (degradación del fosfato amónico) lo que provoca que este se alcalinice y el indicador vire azul.

Agar Hierro Lisina (LIA)

Este medio pone de manifiesto:

- Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC). el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol, cuando la lisina se descarboxila, el medio se acidifica y el indicador vira amarillo en el fondo.

- Si es productora de ác. sulfhídrico, en cuyo caso el precipitado negro nos impedirá ver si es LDC + o -.

- Si es productora de gas.

1. LDC -, NO H2S, PRODUCTORA GAS.

2. LDC + ó -, PRODUCTROA H2S Y GAS.

3. LDC - , NO H2S, PRODUCTORA DE GAS

Agar Urea de Christensen

Urea - Urea +

 

Pone de manifiesto la actividad de la enzima ureasa, para degradar la urea en dos moléculas de amoniaco. El medio lleva como indicador Rojo fenol, que se torna amarillo cuando es negativo y rosa cuando es positivo. Hay que tener precaución por que también puede ocurrir que no se produzca cambio de coloración, en este caso es negativo. el medio posee un color rosáceo (mucho menos intenso que los verdaderos positivos) lo que puede llevarnos a error (considerar falsos positivos).

Prueba de la Fenilalanina Desaminasa (PPA)

PPA - PPA +

 

Determina la capacidad e la bacteria para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por acción de la enzima Fenilalanina desaminasa, esto va a producir una acidificación del medio, que se va a poner de manifiesto mediante la aplicación de 0,2 - 0,3 mL de Cloruro férrico al 10 %, si hay en el medio ác. fenilpirúvico aparece una coloración verde-azulada.

Reducción de Nitratos

Va a poner de manifiesto la capacidad de transformar los Nitratos en Nitritos. Para esto inoculamos tres tubos en el medio para dicha prueba y los incubamos 24, 49 y 72 horas respectivamente. Tras 24 h. añadimos 2 o 3 gotas del reactivo "A-B", si aparece coloración rojo cereza indica que es positivo, si no aparece coloración es un presunto negativo, para confirmarlo basta con añadir una punta de espátula de Zinc y si realmente es negativo se tornara rojo. Si el ultimo día (72 h.) la bacteria da negativo, entonces podemos decir con seguridad que no tiene capacidad para reducir los nitratos.

Positivo Presunto negativo

Movilidad

Se realiza una siembra en picadura, y tras incubar 24 h. observamos si se ha producido crecimiento entorno a la zona inoculada.

Positivo Negativo

Rojo de Metilo - Voges Proskauer

Las enterobacterias son anaerobios facultativos que usan la glucosa en dos fases: 1º Degradan la glucosa por la vía oxidativa hasta que consumen el oxigeno del medio. 2º Metabolizan la glucosa por la vía fermentativa, que puede ser de dos tipos:

- Fermentación ácido mixta: los productos finales son ácidos orgánicos, que disminuyen el pH del medio, lo que se manifiesta con el Rojo de metilo.

- Fermentación butilén-glicólica: los productos finales, como butanodiol y etanol, son neutros y producen como intermediarios acetoina, que puede detectarse con el reactivo de Voges Proskauer, el react. A que es KOH, y el B alfa-naftol, estos reaccionan con la acetoina originando coloraciones violáceas.

Para realizar el ensayo, dividimos el medio inoculado y que ha incubado tres días en dos

tubos (la mitad en cada uno) y revelamos con los reactivos.

Rojo de metilo (posit. y negat.) Voges Proskauer (negativo)

Prueba de la Oxidasa y la Catalasa

Ambas pruebas se caracterizan por poder realizarse de forma inmediata a partir de nuestro cultivo problema.

La oxidasa, es una prueba que se usa para poner de manifiesto el sistema citocromoxidasa, que se encuentra en organismos aerobios, anaerobios facultativos y ocasionalmente en microaerófilos, careciendo los anaerobios estrictos de esta. El método más frecuento es el indirecto, se realiza en un trocito de papel de filtro, de forma que colocamos una gota del reactivo de Kovacs en el papel y posteriormente tomamos parte de nuestra colonia con el asa de siembra, que frotaremos sobre el papel. El resultado será positivo se se produce una reacción de color a los pocos segundos.

La catalasa, va a degradar el peroxido de oxigeno que se produce como consecuencia de la acumulación de oxigeno. Para esto en un tubo de ensayo colocamos 2 o 3 ml de peroxido de oxigeno, tomamos muestra con el asa de siembra y la introducimos en el tubo, el resultado será positivo si se observa la producción de pequeñas burbujas.