Practica 6 Microbiologia

Fundamento agares

TSI Agar 1.

Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la

fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.

Fundamento

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes

adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de

carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de

cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se

combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de

fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.

Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del

indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio

se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro

proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

*E.coli indicador vira de colo pero no se pone hierro

porque bacterias entricas no producen H2S, gas

positivo

Escherichia coli : Indol + ;Rojo de metilo +; Voges-Proskauer ;Citratos INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Observar el color del medio de cultivo y la

produccin de gas. 1- Superficie alcalina/profundidad cida (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo

solamente fermenta la glucosa.

2- Superficie cida/Profundidad cida (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo

fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.

3- Superficie alcalina/Profundidad alcalina (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no

fermentador de azcares.

4- La presencia de burbujas o la ruptura del medio de cultivo indican que el

microorganismo produce gas

5- El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico.

Lisina Hierro Agar. 2.Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el

desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro. Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio. Interpretacin de los resultados Decarboxilacin de la lisina: Resultado Positivo: superficie alcalina / profundidad alcalina (pico violeta / fondo violeta). Resultado negativo: superficie alcalina /profundidad cida (pico violeta / fondo amarillo). Desaminacin de la lisina: Resultado positivo: superficie rojiza / profundidad cida. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y algunas de Morganella spp. Produccin de SH2 : Resultado positivo: ennegrecimiento del medio de cultivo (especialmente en el lmite entre la superficie y profundidad). Resultado negativo: el medio de cultivo permanece sin cambio de color.

Simmons Citrato Agar 3.

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar

citrato como nica fuente de carbono y energa.

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato

de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el

desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es

cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de

bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de

cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como

nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la

consiguiente produccin de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato

permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da

progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino,

da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen

carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la

produccin de citrato permeasa.

Interpretacin de los resultados

- Positivo: crecimiento bacteriano con un intenso color azul en el pico de flauta.

- Negativo: ausencia de crecimiento y permanencia del color verde del medio de cultivo.

SIM Medio 4.

Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro

de hidrgeno en un mismo tubo.

Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento

El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la

triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso

interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina

con el aldehido del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un compuesto de color

rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen

alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de

sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a

partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Resultados

Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas all de la lnea

de siembra.

Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra.

Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el

medio.

Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de

Kovacs o de Erlich.

Cepas indol negativas: sin cambio de color.

MR-VP Medio 5.Medio utilizado para la realizacin del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer.

Es particularmente til para la clasificacin de enterobacterias.

Fundamento

En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo

bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable.

La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a travs de distintas vas

metablicas. Segn la va utilizada, se originarn productos finales cidos (cido lctico,

cido actico, cido frmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol).

Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podra ser reconocida por la adicin de un

indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos cidos, y por la

adicin de alfa naftol e hidrxido de potasio para evidenciar la presencia de productos

finales neutros.

Voges y Proskauer, describieron una coloracin rojiza que apareca despus de adicionar

hidrxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta

coloracin se debe a la oxidacin del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la

peptona del medio para dar un color rojo.

Revelado de pruebas bioqumicas

a-Prueba del rojo de metilo:

Aadir unas gotas de una solucin de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del

medio.

b-Prueba del Voges Proskauer:

Aadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etlico absoluto y 0.2 ml de hidrxido

de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a

temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie

del medio.

Interpretacin de los resultados Examinar los tubos y revelar las pruebas bioqumicas

Prueba del rojo de metilo: aadir unas gotas de una solucin de rojo de metilo al 0.04%,

observar el color del medio.

POR QU?: Rojo de metilo (M) Fundamento: Detecta la fermentacin cido-mixta. Se

acumulan cidos (actico, frmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio

hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta aadiendo un indicador (rojo de metilo) al

cultivo

Prueba del Voges Proskauer: aadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etlico absoluto y 0.2 ml

de hidrxido de potasio al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a

temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.

Urea medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad 6.

uresica.

Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp.,

otras enterobacterias y estafilococos.

Fundamento

En el medio de cultivo, la triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el

desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y

el rojo de fenol es el indicador de pH.

Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando

amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar

el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentacin de la glucosa

activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos

organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o

Klebsiella.

Interpretacin de los resultados Microorganismos que hidrolizan la urea: el medio de

cultivo es de color rosado-rojizo. Microorganismos que no hidrolizan la urea: el medio de

cultivo permanece de color amarillo. E.coli amarillo!

Caldo glucosa: 7.

USO Medio desarrollado por Casellas para estudiar simultneamente la movilidad,

reacciones de oxidacin y fermentacin de glucosa y la reduccin de nitratos a nitritos o

gas nitrgeno libre por bacilos Gram negativos de fcil desarrollo. Permite diferenciar

especies bacterianas.

FUNDAMENTO En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de carne aportan nutrientes

para el desarrollo bacteriano. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, la glucosa

es la fuente de energa y el azul de bromotimol es el indicador de pH. El nitrato de potasio

es el sustrato de la enzima nitrato reductasa. El bajo contenido de agar, otorga la

propiedad de ser un medio semislido que permite determinar la movilidad bacteriana y

tambin la distribucin de los productos cidos en la superficie, profundidad o en todo el

medio de cultivo. El metabolismo de la glucosa puede ser fermentativo u oxidativo. En

ambos casos se acidifica el medio y se produce el viraje del indicador azul de bromotimol

del color verde al amarillo. La movilidad se evidencia por el enturbiamiento del medio o por

crecimiento que difunde mas all de la lnea de siembra del microorganismo en estudio. La

reduccin de nitratos a nitritos o gas nitrgeno por medio de la enzima nitrato reductasa,

es un proceso de oxidacin por el cual el nitrato proporciona oxgeno para ser usado como

aceptor de electrones. El nitrito presente en el medio puede detectarse con el agregado de

los reactivos Griess A y Griess B por la formacin de un compuesto diazoico coloreado. Si

se observan burbujas en el medio, stas corresponden a nitr- geno gaseoso, ya que el

nitrito intermediario inhibe las decarboxilaciones.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Observar la movilidad y el color del medio de

cultivo. Luego realizar el ensayo para determinar la reduccin de nitratos.

Movilidad Resultado positivo: presencia de turbidez que se extiende mas all de la lnea de

siembra.

Resultado negativo: solo se observa turbidez en la lnea de siembra. Color del medio:

metabolismo de la glucosa: Microorganismos oxidativos: color amarillo en la superficie del

medio de cultivo (parte superior del tubo). Microorganismos fermentadores: color amarillo

en todo el medio de cultivo. Microorganismos que no fermentan y no oxidan la glucosa: el

medio permanece verde o adquiere un color azulado.

Caldo lactosa: 8.

Uso Medio recomendado como prueba presuntiva de la presencia de bacterias del grupo

coliforme en aguas y alimentos. Tambin est indicado para el preenriquecimiento no

selectivo en los protocolos de investigacin de Salmonella spp. a partir de alimentos.

Fundamento Es un medio rico en nutrientes y no contiene inhibidores del crecimiento

bacteriano. Permite recuperar clulas injuriadas, diluye sustancias txicas o inhibitorias y

favorece el desarrollo de Salmonella con respecto a otras bacterias. El extracto de carne y

la peptona son la fuente de carbono y nitrgeno mientras que la lactosa es el hidrato de

carbono fermentable. Por la fermentacin de la lactosa se produce cido y gas (el cual se

evidencia al utilizar las campanas Durham).

E.coli crece y produce gas!

9. sacarosa.