PRUEBAS SEROLUÉTICASTREPONÉMICAS

PRUEBAS TREPONÉMICAS

• Son pruebas que usan al Treponema pallidum o componentes de éste como antígeno y se basan en la detección de anticuerpos contra componentes treponémicos.

• Estas pruebas se utilizan para verificar la reactividad de las pruebas no treponémicas, pueden ser usadas para confirmar una sospecha con evidencia clínica de sífilis, como ocurre en la sífilis tardía, y cuando las pruebas no treponémicas son no reactivas.

SÍFILIS• Es una enfermedad crónica que se contagia por

contacto directo, transfusiones o por transmisión vertical (de la madre al feto) a través de la placenta. Se caracteriza por presentar etapas sintomáticas separadas por períodos asintomáticos o de latencia.

Ejemplo de una úlcera de sífilis primaria.

Ejemplos de una erupción secundaria en las palmas de las manos (arriba) y una generalizada en el cuerpo (izquierda).

Estadíos y evoluciónPRIMARIO SECUNDARIO LATENTE

PRECOZLATENTE TARDÍO

TERCIARIO

TIEMPO 3 semanas a 3 meses.

Media de 21 días.

Seis semanas a seis meses.

Uno o dos años. De dos a veinte años.

Diez a veinte años.

SEROLOGÍA Variable Positiva Variable Variable Variable

SÍNTOMAS Chancro único o

múltiple.

Linfadenopatía regional.

Alteraciones del LCR en el

40%,

Roseola sifílica.

Pápulas.

Lesiones musculares.

Condilomas.

Alopecia.

Asintomático.

Recaídas en el 25%.

Asintomático.

¿Curación espontánea?

Gummas.

Neurosífilis.

Sífilis cardiovascular.

A partir del tercer mes de gestación, posibilidad de afectación fetal.

• El agente responsable es el Treponema pallidum (TP), tiene forma de espiral y su longitud alcanza unos 10 a 15 µm con un espesor es de 0,15 µm.

PRUEBAS TREPONÉMICAS

MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO

• Los treponemas son tan delgados, que no pueden ser observadas en un microscopio de luz a campo normal, y es necesario un microscopio que tenga campo oscuro.

• Cuando se obtiene hallazgos positivos al campo oscuro se deben realizar obligatoriamente pruebas serológicas confirmatorias.

• Un examen de campo oscuro negativo no descarta la sífilis.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

• Mediante este examen, se puede detectar la presencia de subespecies de T pallidum en tejidos, fluidos corporales, secreciones y exudados de lesiones. La prueba permite diferenciar treponemas patógenos de no patógenos, por una reacción de Ag-Ab.

• La muestra debe ser secada al aire y fijada con acetona, metanol o calor, luego es marcada con anticuerpos humanas o de conejo o monoclonales conjugados con el colorante fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las muestras de tejidos se trabajan de manera similar, pero deben ser fijadas por dos horas con formol neutro, luego deben ser parafinadas.

TPI (T. pallidum immobilization)

• El primer test treponémico fue desarrollado por Nelson y Mayer en 1949.

• Se inhibe la motilidad de treponemas vivos, virulentos, por la presencia de anticuerpos específicos.

• Se enfrenta suero inactivado del paciente con complemento de cobayo y con una suspensión de treponemas vivos obtenidos por inoculación en testículos de conejo con cepa.

• Se incuba a 35°C durante 18-24 horas en atmósfera de nitrógeno- CO2. La lectura se realiza en campo oscuro evaluándose el porcentaje de inmovilización.

• Se considera positiva cuando se logra un 50-100% de inmovilización.

FTA-ABS (Fluorescent treponemal antibody absorption)

• Una dilución 1:5 del suero del paciente se hace reaccionar con una suspensión de treponemas muertos fijados en un portaobjeto.

• Se revela la presencia de anticuerpos con anti-gamma globulina humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína.

• Esta técnica daba falsos positivos en un 25% de sueros normales, esto se debe a antígenos comunes al T. pallidum y treponemas banales.

• Para solucionar esto se trata previamente el suero

con un extracto proteico de treponemas de Reiter (sorbente) para absorber los anticuerpos de grupos presentes con el que se diluye 1:5 el suero de allí el nombre de FTA-abs.

FTA-ABS-DS (FTA-double staining)

• Una variante de esta técnica la constituye la FTA-abs con doble tinción (FTA-abs DS) emplea como anticuerpo revelador anti-IgG humana conjugada con isotiocianato de tetrametil rodamina y como contraste anti-T. pallidum conjugado con isotiocianato de fluoresceína, con lo que se elimina la necesidad de examinar con campo oscuro la presencia de treponemas en el preparado.

• En ambos casos se informa Reactivo, Débil Reactivo y No Reactivo .

19S-IgM-FTA-ABS

• Usa IgM de 19S que es obtenida por ultracentrifugación y tiene como ventaja una mayor especificidad.

• La 19S-IgM permanece por corto tiempo en la sangre después del tratamiento y su reaparición determina una reinfección, en cambio, la IgM total se puede detectar hasta un año después.

• La 19S-IgM-FTA-ABS es de gran utilidad en los siguientes casos: confirmación de la sífilis muy temprana, determinar el éxito terapéutico y diagnosticar una reinfección; no es de utilidad en la sífilis terciaria, porque da falsos negativos.

MHA-TP (Microhemaglutinación para T. pallidum)

• Es una técnica sencilla en la que inicialmente se trata el suero con un medio de absorción (treponemas de Reiter y estabilizadores) luego se enfrenta en placas de microtitulación a una suspensión de eritrocitos de carnero sensibilizados con antígeno de T. pallidum, se debe agregar eritrocitos no sensibilizados como control de reactividad inespecífica.

• Los resultados se informan de acuerdo al patrón de aglutinación, en presencia de anticuerpos específicos los eritrocitos aglutinan (reacción positiva), en ausencia de anticuerpos los eritrocitos sedimentan( reacción negativa).

Nuevas pruebas para el diagnóstico de la

sífilis:

ELISA (Enzyme-Linked lmmunoabsorbent Assay)

• El antígeno o anticuerpo que se utiliza, es inmovilizado sobre un soporte sólido, que es generalmente una placa de poliestireno, por lo que la reacción antígeno-anticuerpo que se produce también queda inmovilizada en el soporte sólido. A esto se le adiciona un sustrato (enzima) marcado con un cromógeno que produce una reacción de color, que es directamente proporcional a¡ analito (antígeno o anticuerpo a ser detectado) y que es cuantificado con un lector de ELISA que es un espectrofotómetro modificado.

Western Blot• Detecta anticuerpos para epítopes específicos en

antígenos, previamente separados por electroforesis de alta resolución. La electroforesis separa los componentes antigénicos por sus diferentes pesos moleculares. Luego estos son transferidos a una membrana de nitrocelulosa reteniendo su posición electroforética y reaccionan con el suero del paciente, si los anticuerpos específicos estuviesen presentes, estos son revelados usando un antianticuerpo conjugado con una enzima a la que se le agrega un sustrato cromogénico, dando como resultado bandas coloreadas en la tira de nitrocelulosa.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

• Amplifica o replica varias veces secuencias específicas de ADN de una muestra, Se utiliza dos porciones cortas de ADN denominados cebadores o iniciadores o "primers", estos son oligonucleótidos sintéticos de ADN o ARN cuya secuencia es conocida, que luego de fusionarse (hibridizarse) a un ADN complementario, actúan como una plantilla para sintetizar nuevo ADN, esto es un proceso enzimático repetido en varios ciclos térmicos.