Pěstování pokusných rostlin

Přednáška 8.Metody testování osiva

zimní semestr 2008/2009

A. Generativní reprodukce:

opylení

oplození (vznik embrya, endospermu)

semeno (standardní diaspora)

dormance

klíčení

semenáček (klíčenec) – juvenilní fáze

důsledkem je genetická diverzita

Pohlavní (generativní) rozmnožování Pohlavní (generativní) rozmnožování

vznik nových jedinců je výsledkem pohlavního procesu – splynutí pohlavních buněk (gamet), dochází ke splývání cytoplasmy i jader obou gamet, pouze chromozomy nesplývají – zygota má diploidní počet chromozomů střídání jaderných fází: oplození 2n redukční dělení (meioza) ngametofyt, sporofytkrytosemenné rostliny: gametofyt potlačen, je nesamostatnou částí sporofytu

Na megasporofytu (pestík) vznikají megasporangia - vajíčka, a haploidní megaspory.Megaspora dává vznik samičímu gametofytu (zárodečnému vaku) s jednou nebo více oosféramiNa mikrosporofytech (tyčinky) vznikají v mikrosporangiích (prašných pouzdrech) mikrospory. Mikrospory dávají vznik samčím gametofytům (vícebuněčným pylovým zrnům), které obsahují samčí gamety (buňky spermatické)

Krytosemenné rostliny

Témata související se vznikem semen a plodů:Témata související se vznikem semen a plodů:

podmínky přechodu do reprodukční fáze: jarovizace, fotoperiodická indukce kvetení, funkce giberelinůvěk rostlinopylení, apomixis, partenokarpie

Semenaembryo (oosféra + gener. buňka pyl. láčky) – v různém stupni diferenciace (mrkev – málo, hrách – vysoce diferencované): embryonální osa + dělohaplumula (embryonální vegetační vrchol), případně základy listůradikula (embryonální vegetační vrchol kořene)endosperm (2n jádro + gener. buňka pyl. láčky)semena s endospermem (mák, Poaceae)semena bez endospermu (Cucurbitaceae)např. u Poaceae – aleuronová vrstva – živé buňkyperisperm z nucellu (2n) – vnitřní bílek zásobní pletivo pro výživu embryatesta – osemení (z vaječných obalů)

fytohormony

Voda v semenech

vliv na všechny vývojové fáze semen: formování a zránístav klidubobtnání a klíčení

Semena podle tolerance k vyschnutí:většina kulturních rostlin vyžaduje pro úplný vývoj fázi vyschnutí, obsah

vody se ustálí v rovnováze s prostředím, mnoho druhů si udrží schopnost klíčit po dlouhé období.

U nás běžně pěstované druhy plodiny – obsah vody 5 – 10 – 15 – 18%

Semena procházející fází vyschnutí – ortodoxní

Tropy – zralá semena obsahují 20 – 40% vody, při poklesu vlhkosti ztrácejí klíčivost – semena rekalcitrantní (Coffea arabica, citrusy, někdy Passiflora)

DormanceDormance semensemen

= stav, ve kterém jsou semena chráněna před klíčením v prostředí, které je normálně pro klíčení nepříznivé, jde o přirozený fyziologický stav

naproti tomuquiescence = klid

vynucený podmínkami prostředí (suchá semena v suchu, velmi nízká teplota)

1. dormance primární:exogenní endogenní

2. dormance sekundární

Primární exogenní Primární exogenní dormancedormance semensemen

Dormance primární (vyvolána v průběhu vývinu semene):

exogenní - semenu nejsou dostupné základní podmínky pro klíčení (voda, kyslík), příčina – semenné obaly:

1. zábrana příjmu vody - tzv. tvrdá semena (Fabaceae, Malvaceae, Liliaceae) – anatomická stavba semenných obalů, vliv genetický, podmínky při dozrávání, které ovlivňují rychlost vysychání (větší výskyt tvrdých semen obvykle souvisí se stresovými vláhovými podmínkami při dozrávání, i během posklizňové úpravy (rychlost a teplota sušení)

2. zábrana výměny plynů a odvodu inhibičních látek z embrya – např. u semen některých peckovin a jádrovin s obsahem amygdalinu –kyanovodík nemůže unikat a inhibuje klíčení, nebo mechanický odpor obalů, kdy semeno nemá dostatek energie k proniknutí tkáněmi obalových vrstev (salát, rajče, celer)

Způsoby odstranění primární exogenní Způsoby odstranění primární exogenní dormancedormance::

v přírodě – činností mikroorganismů nebo fyzikálními změnami v půdě (zamrzání, rozmrzání), změnami pH

úprava semen:1. skarifikace – mechanické narušování semenných

obalů, teplotními šoky, krátkým ponořením do vroucí vody, působením radiace

2. chemicky – slabý roztok H2SO4,NaCl, H2O2, po aplikaci nutno omýt a osušit

3. selektivními enzymy – celuláza, pektináza

kritický faktor – délka expozice

Primární endogenní Primární endogenní dormancedormance semensemenje výsledkem vrozených vlastností semen, odpovídá druhovým a odrůdovým charakteristikámje ovlivněna podmínkami prostředí v období vývinu semen a zráníhlavní složky endogenní dormance:přítomnost inhibičních látek (ABA, kumarin, kys. ferulová, fenolové kyseliny, kys. abscisová), přítomnost org. kyselin v dužnatých plodech (např. rajče), silice – např. petržel, kmín, fenykl

tvorbu a obsah inhibitorů klíčení ovlivňuje:1. délka dne v závěru zrání semen: dlouhý den indukuje dormanci

u Beta vulgaris, Amaranthus retroflexus, Lactuca sativa, vznikají také tvrdší obaly

2. vláhové podmínky – vodní deficit a doba kdy k němu dojde (např. u ječmene po kvetení dormanci aktivuje, ale ke konci zrání působí opačně)

3. pozice semene na rostlině a v květenství – např. u Apiaceae –nejsilnější dormance u okolíků 1. řádu

4. stáří mateřské rostliny v době kvetení – souvisí s výživou dusíkem a vláhovými podmínkami

5. teploty v době zrání

Metody odstranění primární endogenní Metody odstranění primární endogenní dormancedormance::

1. vyluhování látek – např. u řepy; také semena rajčat klíčí po jejich odstranění z plodu - šťáva působí jako osmotická inhibice

2. teplotní ošetření – změní se poměr mezi stimulátory a inhibitory klíčení – u semen nabobtnalých za nízkých teplot, u semen suchých za vyšších teplot

3. stratifikace semen – nabobtnalá semena jsou vystavena nízké teplotě (peckoviny, jabloně, javor, lísky, hloh, buk, jasan, smrk, borovice)

4. ošetření fytohormony - gibereliny

Stratifikace semen peckovin

DormanceDormance sekundárnísekundární

nově vyvolaný výskyt dormance u zralých, nedormantníchsemen v podmínkách nepříznivých pro klíčenítermodormancefotodormance – vliv světla (např. salát – určité světelné spektrum)skotodormance – vliv tmyvliv vody, obsah některých plynů apod.indukce dormance může nastat i několika cyklech během skladování semennejčastěji je dormance spojována s chováním semen plevelů a planě rostoucích druhů v půděperiodické změny v sekundární dormanci jsou vysvětlením pro postupné vzcházení některých plevelů v průběhu roku

Stárnutí (Stárnutí (senescencesenescence), ), deterioracedeteriorace a ztráta a ztráta životaschopnostiživotaschopnosti

deteriorace – postupné snižování kvality semendruhové a odrůdové rozdílynové poznatky fyziologie – deteriorace osiva není nezvratný proces kvalitativních změnCoolbeat (1995) – při dobrých skladovacích podmínkách se může v semenech aktivovat mechanismus, který může tento proces zvrátit

Projevy Projevy deterioracedeteriorace semensemenAbddul-Baki a Anderson (1972):

snižuje se intenzita dýchánísnižuje se celková aktivita enzymatické činnostimění se poměr zásobních látek v semeni, narůstá podíl polyfenolůnastávají změny struktury buněčných membrán, které zvyšují citlivost semen na podmínky prostředí při klíčení a vzcházenídochází ke změnám v syntéze nových látekdochází ke změnám genetického aparátu – zvyšuje se podíl mutacíakumulace toxických metabolitů

projevy:např. tmavnutí obalových vrstev

každý genotyp má kritickou mez, kolik buněk může být poškozeno, než dojde k narušení životaschopnosti

obvykle nepřekračuje 15%další limitující faktor – kontaminace mikroorganismy

Symptomy projevu stárnutíSymptomy projevu stárnutí

redukce klíčivosti a vzcházivostizpomalení rychlosti klíčenínevyrovnané klíčení a vzcházenínižší vitalita, projevující se zvýšenou citlivostí na podmínky prostředí při klíčení a vzcházeníméně vyvinuté klíční rostlinyanomální klíční rostlinyzvyšování obsahu polyfenolických látek v semenech

Dlouhověkost semenDlouhověkost semenu suchých semen obecně:

1. s každým snížením vlhkosti o 1% se dvojnásobně prodloužídélka jeho životaschopnosti2. s každým snížením teploty uskladnění o 5,6 °C se dvojnásobněprodlužuje délka jeho životaschopnosti

Relativní indexy skladovatelnosti semen (doba snížení klíčivosti na polovinu:

1. (po 1 – 2 letech): kukuřice,žito, sója, slunečnice, mák, salát, cibule2. (po 3 – 5 letech): ječmen, pšenice, oves, pohanka, řepka, bob, len,

zelí, květák, mrkev, paprika3. (po 5 a více letech): vojtěška, řepa, rajče, okurka, vikev, hráchpři vlhkosti nad 30% může docházet ke klíčení semenvlhkost 18 – 30% podporuje rychlou deterioraci semen, zejména v

souvislosti s rozvojem mikroorganismůvlhkost pod 8 – 9% zamezuje rozvoji hmyzuvlhkost 4 – 5% - semena jsou odolná proti napadení hmyzem a

houbovými patogeny

Dlouhodobé uložení osiva

vysušení na 13 - 8% vlhkostihermeticky uzavřené obaly- 20 °C – řada běžných druhůzemědělských plodin Fabaceae – 5 °Cultra dry seed – 3% vlhkosti, skladování při laboratorní teplotě

Klíčení semenKlíčení semenpříjem vody semenem:1. fáze bobtání (imbibice) –

podle fyzikálních zákonů, shodný průběh u všech druhů osiva (dormantních, nedormantních, živatoschopných, neživých), nezávislé na metabolické aktivitě vodní potenciál (tlakový, osmotický, hydratační) voda v.p.=0 (vysoký), suchá semena v.p. = -100 až -400 MPa

2. fáze aktivace biochemických procesů –pouze klíčivá semena (nikoliv semena neživá, semena v dormanci)

3. fáze růstu klíčku – viditelné klíčení a růst klíční rostliny, v.p. semen asi -1 MPa

vliv specifických vlastností semen, vlhkosti a složení substrátu, teploty

vyspělé firmy – prehydratační úpravy semen zeleniny a květin

nežádoucí rychlý příjem vody suchými semeny lze ovlivnit použitím osmotika (roztok s nižším vodním potenciálem než má voda)

Praktický význam fáze bobtnání osiva:

dochází k rychlému, ale přechodnému vyluhování anorganických i organických látek (exsudace) do okolního prostředípříčinou exsudace jsou buněčné membrány, které mohou při vyschnutí ztratit svou celistvostnadměrná exsudace cukrů a aminokyselin –ztráta substrátu pro dýchání a metabolismus, může vést ke stimulaci rozvoje kontaminující mikroflóry

Klíčení semenKlíčení semen

začíná příjmem vody a končí startem prodlužování embryonální osy, zpravidla kořínkuřada biochemických, fyzikálních a biologických procesů (hydratace protein, strukturální buněčné změny, dýchání, makromolekulární syntéza, prodlužování buněk) – embryo se transformuje z dehydratovaného stavu do stadia se životaschopným metabolismem

u vzorku osiva:

a, b - rychlé a vyrovnané klíčení

c – nevyrovnanost dlouhé období klíčení

e – výskyt dvou odlišných skupin osiva ve vzorku

Základní podmínky klíčeníZákladní podmínky klíčení

voda: bobtnání – 1. fáze klíčení, až do 2. fáze semena zpravidla nereagují na přerušení tohoto pochodu a ani po vyschnutí a opakovaném bobtnání nemusí docházet k porušení klíčku; jakmile je již klíčení spojeno s buněčným dělením a růstem klíčku, k následné poruše již dochází

kyslík: na počátku spotřeba prudce narůstá, po skončení hydratace pletiv stagnuje, nárůst opět ve 3. fázi;nedostatek se projevuje poklesem klíčivosti, některé druhy jsou přizpůsobené podmínkám a klíčí bez přístupu kyslíku (rýže)v půdním prostředí ovlivňuje klíčení také CO2 a etylénnormální obsah kyslíku v půdě je 19%, může se snížit až na 1% (při vytvoření půdního škraloupu), inhibice klíčení při 1 – 3% kyslíkusemena jsou různě citlivá na obsah kyslíku: např. mrkev – inhibice při 9 – 10%,

teplota: efekt teploty se vyjadřuje existencí tři kardinálních bodů –minimum, optimum, maximum (optimum pro většinu semen je15- 30°Czávisí na druhu, odrůdě, podmínkách prostředí, kvalitě osivanízké teploty sice klíčení zpomalují, ale mohou být využity k odstranění dormance)

Specifické podmínky klíčeníSpecifické podmínky klíčení

světlo: u většiny plodin není nezbytnou podmínkou klíčení, u některých druhů intenzita nebo spektrální složení světla klíčení ovlivňuje, např. některé odrůdy salátu klíčí jen na světle – pozitivně fotoblastickésvětlo působí prostřednictvím fytochromovéhosystémufotoblastické chování semen má adaptační význam. semena stimulovaná světlem mají zpravidla nedostatek zásobních látek a klíční rostliny musí rychle dosáhnout přechodu na autotrofní výživu

chemické látky

ŽŽivotaschopnost osiva: ivotaschopnost osiva: je vlastnost semen, která umožňuje za vhodných podmínek prostředí jejich klíčenírozdílné hledisko fyziologické a semenářskéMetodiky testování klíčivosti a vzcházivosti osiva: Ústřední kontrolní a

zkušební ústav zemědělský, Odbor osiva a sadby, Brno

Doporučené metody hodnocení vitality osivaDoporučené metody hodnocení vitality osiva::

1. test růstu a vývinu kořínků: hodnocení délky kořínků klíčních rostlin v stanovených časových intervalech

2. Hiltnerův test: test laboratorní vzcházivosti – klíčení v substrátu, cihlové drti nebo písku v hloubce setí

3. chladový test kukuřice 4. konduktometrický test vodivosti výluhu5. test urychleného stárnutí 6. test řízené deteriorace7. topografický tetrazoliový test 8. aleuronový tetrazoliový test

1. Zkouška klíčivostikategorie:

normální klíčenci, abnormální klíčenci (poškození, deformovaní, shnilí -nejsou schopni se vyvinout v normální rostlinu v půdě dobré jakosti za optimálních podmínek)nevyklíčená semena (tvrdá, svěží nevyklíčená, mrtvá)

materiál:filtrační papír (biologický test Phleum pratense, Agrostis gigantea,

Festuca rubra var. commutata)písek (fytotoxicita – hořčice bílá, pšenice)zeminapřístroje:Jakobsenovo klíčidlo, skříň pro klíčení, klimatizační komorapozice semen:na povrch, mezi vrstvy papíru, v písku, zeminěteplo, světlo:v závislosti na testovaném druhu

4. 4. KonduktometrickéKonduktometrické vodivostnívodivostní testytesty

vycházejí z biologické podstaty vitality, ze změn vlastností buněčných membránpoškození semen během bobtnání v důsledku rychlého příjmu vody je monitorováno měřením konduktometrické vodivosti vody, ve které semena bobtnalavodivost exsudátu závisí na množství látek iontové povahy vyluhovaných ze semen a souvisí s integritou membrán

Postup – osivo hrachu:

vzorek osiva v Erlenmayerově baňce v destilované nebo deionizované vodě o teplotě 20 °C po dobu 24 hodin

předem – stanovení vlhkosti osiva, kalibrace konduktometru

měření vodivostihodnocení výsledku – osivo hrachu:

do 24 µS.g-1 osivo je vhodné pro časný výsevnad 43 µS.g-1 hrách není vhodný k setí

5. Testy urychleného stárnutí (AA)5. Testy urychleného stárnutí (AA)

perspektivní, ale nutná standardizacepodstatou je hodnocení rozdílů v klíčivosti před expozicí zvýšené teploty (zpravidla 41 – 45 °C) a vlhkosti (absolutní relativní vlhkost) a po expozicidoba expozice 48 – 144 hodinsemena vysoce vitální – odolnost k extrémním podmínkámsemena s vysokou životností si uchovávají po zkoušce urychleného stárnutí vysokou klíčivostu semen s nízkou životností se klíčivost snížívliv řady faktorů, např. velikosti semen, odrůdy

7. Topografický 7. Topografický tetrazoliovýtetrazoliový test test –– TTCTTC(biochemická zkouška životaschopnosti semen)(biochemická zkouška životaschopnosti semen)

zejména pro druhy, které mají dlouhou dobu klíčení, u semen s dormancí, u vzorků s vysokým podílem svěžích nevyklíčených semenpodstatou TTC testu je barevná reakce, která je důsledkem redukčních pochodů probíhajících v živých buňkách

7. Topografický 7. Topografický tetrazoliovýtetrazoliový test test –– TTCTTC(biochemická zkouška životaschopnosti semen)(biochemická zkouška životaschopnosti semen)

indikátorem těchto reakcí je bezbarvý roztok 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloridu nebo bromidu, který při bobtnání semene proniká do pletivv živých buňkách se působením dehydrogenáz uvolňuje vodík, který reaguje s TTC za vzniku stabilní nedifundující červené látky – trifenylformazanu

tím je možné odlišit červeně zbarvená (živá) pletiva od bezbarvých (mrtvých)

Vedení řezu při přípravě semen před barvením:

1-4 obilky

5-6 Lactuca

7 Apiaceae 8 jehličnany

9 řez na obou koncích

u některých semen – určitý podíl nekrotické tkáněo jejich klasifikaci rozhoduje poloha a rozsah nekróz, nikoliv intenzita zabarvení tkáně

Postup:1. semena – předběžné vlhčení (podle druhu)2. máčení semen ve vodě (bobtnání semen)3. preparace pletiv, propichování, řezy, vyříznutí embrya,

odstranění osemení – pro usnadnění pronikání roztoku 4. barvení 0,1 – 1,0% roztok pH 6,5 – 7,5 (pufr), někdy

přídavek antibiotik (Prevenol), ve tmě

Příklad: Postup TTC

Agrostis (psineček):předběžné vlhčení: při 20 ºC – VeF 16 hod, voda

2hpříprava: propíchnout poblíž embryabarvení: 1,0% při 30 °C 18 hodpříprava pro hodnocení: obnažit embryomax. plocha nezbarveného pletiva: 1/3 kořene