Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
PulzPulz áállóó mezejmezejőő ggéél l elektroforelektrofor ééziszis(PFGE) optimaliz(PFGE) optimaliz áálláása sa methicillinmethicillin
rezisztens rezisztens staphylococcusokstaphylococcusokklonalitklonalit áássáánaknak vizsgvizsg áálatlat áárara
Pesti Pesti JJóózsefnzsefn éé
Kardos Szilvia, Kardos Szilvia, VolterVolter ImrImr éénnéé, , GhidGhid áánn ÁÁgoston,goston,
Nagy KNagy K áároly, roly, RozgonyiRozgonyi Ferenc Ferenc Semmelweis Egyetem, Orvosi MikrobiolSemmelweis Egyetem, Orvosi Mikrobiol óógiai Intgiai Int éézetzet
Magyar Orvosi LaboratMagyar Orvosi Laboratóóriumi Szakdolgozriumi Szakdolgozóók Egyesk Egyesüületelete(MOLSZE) X. (jubileumi) Nagygy(MOLSZE) X. (jubileumi) Nagygyőőlléésese
Budapest, 2007. augusztus 30 Budapest, 2007. augusztus 30 –– szeptember 01.szeptember 01.
Mit rontottam el ?Mit rontottam el ?
CCéélkitlkit őőzzééss
�� StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus ttöörzsek rzsek öösszetartozsszetartozáássáának genetikai vizsgnak genetikai vizsgáálatalata--MagyarorszMagyarorszáágg--AusztriaAusztria--MacedMacedóóniania
�� EnterotoxinEnterotoxinggééneknek�� HaemolysinHaemolysinggééneknek�� RegulReguláácicióós gs gééneknek�� TapadTapadáási faktoroksi faktorok�� KlonalitKlonalitááss vizsgvizsgáálat (PFGE)lat (PFGE)
Metodika I.Metodika I.
Sejtfal feltSejtfal feltáárr ááss�� PlugPlug kkéészszííttéés s
BaktBaktéérium szuszpenzirium szuszpenzióóLysostaphinLysostaphin oldat (40 oldat (40 µµg/mlg/ml-- 80 80 µµg/ml)g/ml)(1 (1 óóra, EC ra, EC ll ííziszis pufferben), 37 pufferben), 37 ooCC
MembrMembr áán protein emn protein eméésztsztééssProteinProteináázz K (67 K (67 µµg/ml), 3 g/ml), 3 óóra, 50 ra, 50 ooCC(ESTN pufferben)(ESTN pufferben)
MosMosááss3* TE pufferben3* TE pufferben
DNS restrikciDNS restrikcióós ems eméésztsztééseseSmaISmaI enzimmel enzimmel (20 (20 U/plugU/plug, 1 , 1 óóra, 25 ra, 25 ooCC))
PulzPulzáállóó mezejmezejőő ggéél l elektroforelektrofor ééziszis
DetektDetektáálláássEtidiumEtidium --bromiddalbromiddal
Metodika II.Metodika II.
ElektroforElektrofor ééziszis
1 x TBE pufferben, (21 1 x TBE pufferben, (21 óóra, 14 ra, 14 ooCC))
(PFGE, (PFGE, BioRadBioRad))
Metodika mMetodika móódosdosííttáása I. a.sa I. a.
Metodika mMetodika móódosdosííttáása I. bsa I. bsejtfal feltsejtfal feltáárr áás 1 s 1 óórara
M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 M 3 4 1 2 3 4 M1 2 M 3 4 1 2 3 4 M
1.kép2. kép3. kép
11--2: 2: S. S. haemolyticushaemolyticus , , 33--4: 4: S. S. aureusaureus
40 µg/ml lysostaphin80 µg/ml lysostaphin40 µg/ml lysostaphin+ 550 µg/ml lizozim
Metodika mMetodika móódosdosííttáása II. sa II. sejtfal feltsejtfal feltáárr áás 2 s 2 óórara
1 2 3 4 1 2 3 4 M1 2 3 4 1 2 3 4 MM 1 2 3 4 M 1 2 3 4
1.kép2. kép3. kép
11--2: 2: S. S. haemolyticushaemolyticus , , 33--4: 4: S. S. aureusaureus
40 µg/ml lysostaphin80 µg/ml lysostaphin40 µg/ml lysostaphin+ 550 µg/ml lizozim
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 M1 2 3 4 M
Metodika mMetodika móódosdosííttáása III.sa III.sejtfal feltsejtfal feltáárr áás 3 s 3 óórara
M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 M1 2 3 4 1 2 3 4 M
1.kép2. kép3. kép
11--2: 2: S. S. haemolyticushaemolyticus , , 33--4: 4: S. S. aureusaureus
40 µg/ml lysostaphin80 µg/ml lysostaphin40 µg/ml lysostaphin+ 550 µg/ml lizozim
Metodika mMetodika móódosdosííttáása IV.sa IV.
••Sejtfal feltSejtfal feltáárr áás: 18 s: 18 óórara
••MembrMembr áán fehn fehéérje emrje eméésztsztéés: 18 s: 18 óórara
••RestrikciRestrikcióós ems eméésztsztéés (s (SmaISmaI): 18 ): 18 óórara
••ElektroforElektrofor ééziszis: 21 : 21 óórara
VVáálasztlasztáási lehetsi lehetııssééggAz idAz idııppéénznz
A jA j óómunkmunkáához hoz
ididıı kellkell
Sejtfal feltSejtfal feltáárr ááss�� PlugPlug kkéészszííttéés s
BaktBaktéérium szuszpenzirium szuszpenzióó
LysostaphinLysostaphin oldat (40 oldat (40 µµg/ml)g/ml)
LizozimLizozim (550 (550 µµg/ml)g/ml)�� ( ( 3 / 18 3 / 18 óóra,ra, EC EC ll ííziszis pufferben), 37 pufferben), 37 ooCC
MembrMembr áán fehn fehéérje emrje eméésztsztééssProteinProteináázz K (67 K (67 µµg/ml), 3 / 18 g/ml), 3 / 18 óóra, 50 ra, 50 ooCC
(ESTN pufferben)(ESTN pufferben)
MosMosááss3* TE pufferben3* TE pufferben
KromoszKromoszóómmáálislis DNS restrikciDNS restrikcióós ems eméésztsztééseseSmaISmaI enzimmel enzimmel
(20 (20 U/plugU/plug, , 3 / 18 3 / 18 óórara , 25 , 25 ooCC))
PFGE PFGE éés a DNS fragmentumok detekts a DNS fragmentumok detektáálláásasaEtidium-bromiddal
ÖÖsszefoglalsszefoglaláássOptimOptim áális metodikai paramlis metodikai paramééterekterek
KK ööszszöönnööm a figyelmet!m a figyelmet!