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Purificazione della GFP
LLC Bologna - 2007
La GFP è una proteina di media grandezza formata da 238 amminoacidi e con un peso molecolare intorno a 26 kDa. Essa venne estratta e purificata per la prima volta dalla medusa Aequorea Victoria nel 1962
La medusa contiene una proteina bioluminescente, detta aequorina, che emette luce blu. La proteina fluorescente verde converte questa luce in luce verde che è quella che davvero vediamo quando la medusa si illumina. Una soluzione di proteina GFP purificata appare gialla alla normale luce da interni ad incandescenza, ma quando viene osservata alla luce ultravioletta, questa soluzione emette un brillante colore verde.
La proteina assorbe infatti le radiazioni UV, e poi le emette come luce verde di minore energia.
Proteina Fluorescente Verde
All’interno di questa struttura estremamente stabile (T. stab 76 °C) è contenuta un’ulteriore a-elica che comprende il cromoforo della proteina. Il corretto ripiegamento della proteina è necessario per ottenere un ambiente rigido e strutturato intorno al cromoforo e per schermare il cromoforo da agenti esterni in grado di deprimere la resa di fluorescenza
Questa proteina possiede una struttura tridimensionale molto particolare, che ricorda un cilindro cavo o un barilotto (in inglese, b-barrel), con un diametro di 24 Å ed una altezza di 42 Å .
Le pareti del cilindro sono formate da 11 ß-foglietti intrecciati a coppie e collegati tra loro mediante delle corte a-eliche che chiudono le due basi della struttura.
Struttura Tridimensionale Delle Proteine Verdi Fluorescenti
Utilizzi proteina GFP
LLC Bologna - 2009
Utilizzi proteina GFP
Trasformazione Batterica
Osservazione espressione fenotipica
I batteri vengono sottoposti ai seguenti passaggi:
LLC Bologna - 2007
Trattamento con CaCl2 per rendere i batteri
competenti Shock termico - Inserimento del plasmide
Aggiunta di terreno di coltura liquido ed incubazione
Semina in piastre con terreni selettivi
Incubazione overnight
Separare la Green Fluorescent Protein dal contesto cellulare e dal pool molecolare in cui si trova in soluzione
Finalità
LLC Bologna - 2007
lisozima
lisi
Lisi della cellula batterica
LLC Bologna - 2007
UV
Centrifugazione
pellet
surnatante
Centrifugazione
LLC Bologna - 2007
Tecnica che consente la
separazione dei singoli
componenti di una miscela in
base alle loro caratteristiche
chimico-fisiche
Cromatografia
LLC Bologna - 2007
Atomi polari1011
Atomi apolari706
GFP
LLC Bologna - 2007
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GFP in soluzione acquosa
Idrofilo-idrofobo
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GFP in soluzione salina
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+Ione ammonio
Ione solfato
LLC Bologna - 2007
Modello della struttura della GFP in soluzione acquosa
Residuo aminoacidico idrofiloResiduo aminoacidico idrofoboMolecola H2O
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Modello della struttura della GFP in soluzione salina
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Residuo aminoacidico idrofiloResiduo aminoacidico idrofoboMolecola H2O+
Ione ammonio
Ione solfato
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Colonna cromatografica ad interazione idrofobica
(HIC)
LLC Bologna - 2007
