Purifikasi Enzim Amilase

Pengendapan dengan Amonium Sulfat

Presipitasi protein dapat dilakukan dengan penambahan amonimum sulfat pada

konsentrasi tinggi secara bertahap Protein yang mengendap akibat penambahan larutan

amonium sulfat tidak mengalami denaturasi. Protein dalam larutan buffer mengalami

hidrasi, dengan kata lain gugus ionik pada permukaan protein menarik dan mengikat banyak

molekul air dengan kuat. Gambar berikut menunjukkan hidrasi molekul protein oleh air

(Anonymous, 2007)

Ekstrak kasar enzim ditambah dengan ammonium sulfat untuk memisahkan fraksi-

fraksi protein dari ekstrak hasil isolasi. Penambahan ammonium sulfat dilakukan secara

perlahan dengan bantuan stirrer supaya lebih homogen dan hasil pengendapan lebih

optimal. Kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu refrigerator untuk menjaga

kestabilan enzim protease, selain itu supaya proses pengendapan lebih efisien.

Endapan yang diperoleh kemudian dilakukan dialisis untuk menghilangkan sisa

garam ammonium sulfat. Selanjutnya dilakukan presipitasi secara bertingkat (dengan

konsentrasi ammonium sulfat 0-60%) untuk memperoleh hasil pengendapan protease yang

maksimal.

Dialisis

Enzim merupakan protein, sehingga setelah tahap isolasi, dapat dilakukan tahap

pemurnian. Protein dapat dipisahkan dari senyawa dengan berat molekul rendah yang ada

dalam ekstrak sel atau jaringan dengan proses dialisis. Molekul besar seperti protein ditahan

dalam dalam kantong yang terbuat dari senyawa berpori dan amat halus seperti selofan.

Jika kantong yang mengandung ekstrak sel atau jaringan dimasukkan ke dalam air, molekul

kecil di dalam ekstrak jaringan, seperti garam, akan melalui pori-pori, tetapi protein dengan

berat molekul tinggi akan tertahan di dalam kantong (Lehninger, 1982).

Masing-masing fraksi hasil pengendapan ammonium sulfat (I,II, dan III) dilarutkan

dalam buffer fosfat 0,2 M pH 8 untuk menjaga kondisi pH bagi protease selama dialisis.

Dialisis dilakukan dengan memasukkan fraksi enzim hasil pengendapan amonium sulfat

tersebut diatas dalam kantong selofan. Penggunaan kantong selofan untuk mengeluarkan

garam dari fraksi yang didialisis. Kemudian kantong selofan dimasukkan dalam larutan

buffer fosfat 0,1 M pH 8 dan dilakukan dialisis dengan bantuan stirrer pada kondisi dingin

selama semalam.

Penggunaan buffer fosfat 0,1 M pH 8 kondisi dingin dengan stirrer selama semalam

untuk proses pemisahan garam amonium sulfat dari enzim dan menjaga agar enzim tidak

terdenaturasi. Konsentrasi buffer fosfat dalam kantong selofan lebih tinggi dibandingkan di

luar kantong selofan (salting out).

Setelah dialisis semalam, larutan buffer dan enzim dalam kantong selofan

dipindahkan pada tabung sentrifuse dan dilakukan penambahan etanol absolut dan

diinkubasi dalam refrigerator selama 1 jam atau sampai terbentuk endapan. Penambahan

etanol absolute dingin 750 µl (1:1) untuk mengendapkan protein (enzim). Inkubasi pada

suhu refrigerator dilakukan untuk memberikan waktu pengendapan etanol terhadap

protein. Sentrifuse dilakukan untuk memisahkan protein yang mengendap dari

supernatannya. Protein yang mengendap (pellet) dikeringanginkan pada suhu refrigerator

dan ditambah dengan buffer tris-Cl (1:1) dan disimpan pada suhu -20 oC untuk menjaga

kestabilannya.

Purifikasi dengan Kolom Sephadex G75

Pemurnian protein juga dapat dilakukan dengan menggunakan metode

kromatografi. Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi,

komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase

gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan

melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan

tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih

cepat (Anonymous, 2009).

Purifikasi enzim yang selanjutnya menggunakan kromatografi kolom sephadex G75.

Sebelumnya disiapkan terlebih dahulu sephadex G75, dimana sebanyak 1 gr sephadex G75

direndam dengan aquadest secukupnya selama semalam (swelling). Kemudian disiapkan

kolom dimana disusun pada bagian kolom paling bawah adalah kertas saring dan kemudian

ditambahkan glass wool diatasnya. Tujuan penggunaan kertas saring dan glass wool adalah

untuk menahan sephadex dalam kolom. Selanjutnya kolom disterilisasi dengan tujuan untuk

menghilangkan kontaminasi.

Setelah dilakukan sterilisasi, kolom dirangkai pada statif dan sephadex yang telah

direndam semalam dimasukkan kedalamnya. Kemudian dalam kolom ditambahkan buffer

tris-Cl dan laju alirannya diatur sampai didapat sekitar 750 µl per menit. Selanjutnya

sebanyak 0,25 ml sampel enzim hasil dialisis dimasukkan dalam kolom dan dilakukan

purifikasi. Purifikasi dalam kolom sephadex dilakukan dengan melakukan elusi sampel

sampai didapat 15 fraksi hasil elusi masing-masing sebanyak 750 µl, dimana 4 fraksi awal

dibuang dan hanya digunakan 11 fraksi selanjutnya untuk dilakukan elektroforesis. Selama

elusi ditambahkan buffer Tris-Cl ke dalam kolom agar fase gerak tidak kurang.

Pustaka

Anonymous. 2007. Basic Biochemical Techniques. Wilburl H. Campbell.Anonymous. 2009. http://.wikipedia.org/wiki/Chromatography. Lehninger. 1982. Principles Of Biochemistry.