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This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.
566 L. REIMER
Keimblätter in der Wanne betrug etwa 300 mg für die Dunkelversuche und 50 mg für die Hellversuche. — Der Gasraum enthielt außer der Kohlensäure wechselnde Gemische von Kohlenoxyd mit Sauerstoff oder von Argon mit Sauerstoff. Wurde der Stoffwechsel in Argon und Kohlenoxyd verglichen, so waren immer die Anfangsdrucke an Sauerstoff gleich, die sich im Lauf der Versuche nicht weit von den Anfangsdrucken entfernen sollten. — Die Gefäße wurden im Thermostaten bei 20 °C mit einer Frequenz von 200 pro Min. horizontal bewegt.— Belichtet wurde mit einer Metallfadenlampe, in der aus Abb. 1 ersichtlichen Weise, wobei die Filter 20 cm
Wasser, 1 cm 1 -proz. CuS04-5 H20 und 2 mm Rotglas II von Schott waren. Dieses rote Licht wird von dem 0 2
übertragenden Haemin nicht adsorbiert und konnte also die Kohlenoxydhemmungen nicht beeinflussen. Der auf die Keimblätter auftreffende Energiestrom betrug etwa 90 mm3 Quanten pro Minute. „Weißes“ Licht der gleichen Intensität hob die CO-Hemmungen auf.
Versuchsbeispiel. Hemmung von Atmung und Photosynthese durch ein Gemisch von 3 Vol.-% 0 2 in CO. Für beide Gefäße v = 22,5 cm3, ?/f = 3,2 cm3. Berechnung der Hemmungen aus den Druckänderungen dp /d t, Hellwerte korrigiert für Dunkelatmung. 20 °C.
Quantitative Untersuchung zur Massenabnahme von Einbettungsmitteln
(Methacrylat, Vestopal und Araldit) unter Elektronenbeschuß
Von L u d w i g R e i m e r
Aus dem Physikalischen Institut der Universität Münster i. W.(Z. Naturforschg. 14 b, 566— 575 [1959] ; eingegangen am 4. Juni 1959)
Mit einer Elektrometer-Anordnung zur Messung des Elektronenstromes in der Bildschirmebene werden aus dem elektronenmikroskopischen Kontrast vergleichende Ergebnisse zur Massenabnahme von Dünnschnitten aus Methacrylat, Vestopal und Araldit gewonnen. Bei Methacrylat-Schnitten gelingt eine Trennung des Massenverlustes in Beiträge durch Oberflächen-Verdampfung und innere Umwandlung infolge des Verlustes der Nichtkohlenstoff-Komponenten. Es kann ferner nachgewiesen werden, daß eine Bedeckung mit einer Kohleschicht die Verdampfung des Methacrylates verhindert.Der Substanzabbau der Methacrylat-Folien wird außerdem durch IR-Spektren quantitativ verfolgt.Oberflächen-Abdrücke bestrahlter Schnitte zeigen den Vorteil von Vestopal- oder Araldit-Schnitten mit relativ geringem Massenverlust gegenüber Methacrylat-Schnitten.
1. Problemstellung
Die im Jahre 1949 durch N e w m a n , B o r y s k o und S w e r d l o w 1 eingeführte Einbettung biologischer Objekte in Methacrylat hat die Anwendung der Dünn- schnitt-Technik in der Elektronenmikroskopie sehr stark gefördert und die systematische Untersuchung der sublichtmikroskopischen Feinstruktur ermöglicht. Ein großer Nachteil des Methacrylates ist aber die starke Schrumpfung (10 — 15%) während der Polymerisation, die zu Objektschädigungen (z. B. Zerreißen von Membransystemen) führen kann oder Blasenbildung neben dem Objekt verursacht, welche die Stabilität des Blockes für den Schneidevorgang herabsetzt. Es sind daher in letzter Zeit Einbettungsmittel erprobt worden, die vor allem diese starke Schrumpfung vermeiden. Von diesen haben insbesondere Vestopal W ( R y t e r und K e l l e n b e r g e r 2)
und Araldit ( G l a u e r t und Mitarbb. 3) größere Verbreitung gefunden. Vestopal W erfährt bei der Po lymerisation nur eine Schrumpfung von 7 — 10% und
1 B . N ew m an , E. B orysko u . M. S w e rd lo w , J. Res. nat. Bur.Standards 43, 183 [1949].
2 A. R yte r u . E. K ellenb erg er , J. Ultrastructure Res. 2, 200[1958]; Experientia [Basel] 12,421 [1956].
Araldit sogar nur um 2 Prozent. Leider haben diese Einbettungsmittel im monomeren Zustand Mol.-Gew. von 2000 — 3000 und dringen daher wesentlich schlechter in das Gewebe ein als monomeres Methacrylat mit einem Mol.-Gew. von etwa 140.
Neben der Schrumpfung während der Polym erisation zeigt Methacrylat aber auch einen großen Massenverlust unter Elektronenbeschuß (s. a. L i p -
p e r t 4) , der gemäß Abb. 1 zu einer Veränderung des Präparates führen kann, die sich z. B. in einer unscharfen Abbildung von Membransystemen (insbesondere Doppel-Lamellen) äußert. Aber auch fadenförm ige oder globuläre Elemente können sich verlagern und die Deutung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen bei sehr hohen Vergrößerungen erschweren. Demgegenüber zeigen in Vestopal oder Araldit eingebettete Gewebe in den Dünnschnitten wesentlich schärfere Membransysteme, weil der Massenverlust durch Elektronenbeschuß geringer ist und Artefakte nach Abb. 1 nicht in dem Maße auftreten können. Es soll ein Ziel der vorliegenden Arbeit
3 A. M. G la u e r t , G . E. R ogers u . R . H. G la u e r t , Nature [London] 178. 803 [1956] ; J. Biophys. Biochem. Cytol. 4, 191 [1958].
4 W. L ip p e r t , Optik 15. 293 [1958].
MASSENABNAHME VON EINBETTUNGSMITTELN UNTER ELEKTRONENBESCHUSS 567
unbesfrahlt
Abb. 1. Veränderung der Objektstruktur in einem Meth- acrylat-Schnitt (insbesondere Doppel-Lamellen) bei Massen
verlust des Schnittes durch Elektronenbeschuß.
sein, die Massenverluste der drei Einbettungsmittel quantitativ miteinander zu vergleichen.
Nach Untersuchungen von W a ts o n 5 soll das Meth-
acrylat aus Schnitten durch Erhitzen im Vakuum
durch einen glühenden W o lfram drah t vollständig
verdam pft werden können. Auch bei der Elektronen
bestrahlung von Dünnschnitten ist eine teilweise
V erdam p fung des M ethacrylates zu vermuten, vor
allem weil beim Elektronenbeschuß Depolym erisa-
tion auftreten kann. W a tso n 6 schlägt daher vor, die
Schnitte beidseitig m it Fo lien zu bedecken, indem
die der Form varfo lie abgekehrte Seite mit einer
zweiten Formvarschicht oder einer K oh le -A u f dam pf
schicht bedeckt w ird . G leichartige Versuche von
W illia m s und K a l lm a n 7 zeigten jedoch nicht den
gewünschten E rfo lg . In der vorliegenden A rbe it
w urde der Versuch unternommen, auch diese D is
krepanz durch quantitative Untersuchungen des M as
senverlustes zu klären.
2. Meßverfahren
Die Erfassung des Massenverlustes erfolgte über die Messung der Abnahme des elektronenmikroskopischen Kontrastes. Dieser wurde durch Messung des Elektronenstromes in der Leuchtschirmebene mit einem abgeschirmten F a r a d a y - Käfig (3 mm2 Öffnung) und einem Schwingkondensator-Elektrometer (Frieseke & Hoepfner) erhalten. Abb. 2 zeigt die schematische Anordnung. Es kann entweder durch ein Loch im angeklappten Leuchtschirm (wie in Abb. 2 gezeichnet) eine 0,3 mm2 große Fläche des Endbildes auf ihre
5 M. L. W atson , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 10,349 [1953].
6 M. L. W atson , J. Biophys. Biochem. Cytol. 3, 1021 [1957].7 R. C. W il l ia m s u . F. K a l l m a n , J. Biophys. Biochem. Cytol.
1, 301 [1955].
© ©
Methacrylat
7777777,Y yForm vary
Intensität abgetastet werden oder durch vollständiges Hochklappen des Leuchtschirmes die gesamten 3 mm2 der Öffnung des F a r a d a y - Käfigs ausgenutzt werden. Die Elektrometer-Anordnung läßt Strommessungen mit einer Empfindlichkeit von 10-17 A zu, wenn der Ableitwiderstand auf 1013 Ohm erhöht wird.
Um die Bestrahlungsdosis der Schnitte gering zu halten und den zeitlichen Verlauf des Massenverlustes erfassen zu können, wurde mit einer ca. 200-fachen Vergrößerung auf dem Endbildschirm des Elmiskop I ge-
Abb. 2. Prinzip der Meßanordnung zur Messung der Elek- tronenstrahl-Intensitäten mit F a r a d a y - Käfig und
Elektrometer.
arbeitet (nur Objektivlinse eingeschaltet) und abwechselnd die Elektronen-Intensität an Stellen mit Trägerfolie und Schnitt-+ Trägerfolie gemessen. Dadurch wird der Einfluß einer Bedeckung durch Kohleschichten, die sich aus den organischen Restgasanteilen durch Elektronenbeschuß niederschlagen und bei L i p p e r t 4 zu einer laufenden Zunahme des Kontrastes führen, eliminiert. Außerdem hat man die gleichen Bedingungen wie in der Praxis bei der Untersuchung der Dünnschnitte vorliegen. Das Schneiden und Auffischen der Schnitte erfolgte nach den bekannten Methoden. Damit Zellstrukturen bei den Kontrastmessungen nicht stören, wurde für diese Untersuchungen leerer Plast geschnitten.
3. Zusammenhang zwischen Streukontrast und Massendicke
Nach Untersuchungen von K ö n i g 8, B r o c k e s , K n o c h
und K ö n ig 9 und B r o c k e s 10 bestehen die Strahlenschädigungen organischer Objekte vornehmlich in einem Herausschießen aller Komponenten (H, N oder O-Atomen) mit Ausnahme des Kohlenstoffes. Wenn daher die Abnahme des Streukontrastes ausgenutzt werden soll, um Aussagen über den Massenverlust der Schnitte zu erhalten, setzt dies voraus, daß beim Verlust von H- oder O-Atomen eine im Verhältnis ihrer Gewichte gleiche Abnahme des Streukontrastes auftritt.
Nach theoretischen Abschätzungen (z. B. von Mo- l i e r e u) gilt für die Zahl A v der in einer Schicht der
8 H. K ö n ig , Z. Physik. 130, 483 [1951].9 A. B ro c k es , M . K noch u . H. K ö n ig , Z. wiss. Mikroskop.
mikroskop. Techn. 62, 450 [1955].10 A. B ro c k es , Z. Physik 149, 353 [1957].11 G. M o l ie r e , Z. Naturforschg. 2 a, 133 [1947].
568 L. REIMER
Dicke Ad gestreuten Elektronen, die in Winkel größer als die Objektivapertur a abgelenkt werden und daher nicht zur Bildaufhellung beitragen:
/!->> 74/3 l^ = - 5 • 1010 (1)
(Z = Ordnungszahl, A = Atomgewicht, y = Dichte, U = Strahlspannung, F * (a /a 0) eine Funktion, welche den Apertureinfluß des Streukontrastes enthält, näheres s. u .).
Diese Formel läßt sich durch Einführung eines Streuquerschnittes o (a ) abkürzen:
= — o (a ) y Ad . (2)r
Integration über die gesamte Schichtdicke d liefert
v = 7 = e - ° ( a) r d (3)V0 Io
wobei v0 die Zahl der Elektronen bedeutet, welche auf die Schicht auffallen und ohne streuende Schicht gemessen werden können, v bedeutet entsprechend die Zahl der Elektronen, die nach Durchlaufen der Schichtdicke d durch die Aperturblende hindurchgelassen werden, also in Winkel kleiner als a gestreut werden. Die Elektronenstrahl-Intensität I bzw. /„ in A/cm2 ist der Zahl v bzw. v0 der Elektronen proportional.
Als Kontrast K ist die Größe
K = log = 0 (a ) y d (4)
definiert, welche also proportional zur sogenannten „Massendicke“ ist, welche die Dimension g/cm2 besitzt oder in zweckmäßigeren Einheiten: ,«g/cm2.
Bei fester Strahlspannung U und konstanter Apertur a ist der Streuquerschnitt als Proportionalitätsfaktor zwischen Kontrast und Massendicke noch von der atomaren Zusammensetzung der streuenden Schicht über den Faktor Z4,3/A abhängig. Außerdem hängt a0 und damit die Funktion F * (a /a 0) noch von dieser Größe ab. Wenn man dagegen von vornherein hinreichend kleine Objektivaperturen benutzt (etwa 20//-Blenden), so hat die Funktion F * für alle Elemente einen Zahlenwert nahe 1, so daß in der Abhängigkeit (4) des Kontrastes von der Massendicke die Stofleigensdiaft nur noch im Glied Z i,3/A eingeht. Experimentelle Ergebnisse von H a l l 12 ergaben jedoch Proportionalität mit Z/A . Nach Abb. 3 ist die Größe Z/A praktisch unabhängig von Z, während Zi!3/A nach schwereren Elementen zu stark ansteigt. Auch neuere theoretische Untersuchungen ergeben Proportionalität mit Z/A , wenn man die Elektronendichte-Verteilung im Atom genauer berücksichtigt ( L e n z 13) .
Um auch unter den hier benutzten Bedingungen diese Abhängigkeit des Streuquerschnittes von der atomaren Zusammensetzung der Schicht zu prüfen, wurde der Kontrast von Aufdampfschichten auf Formvarunterlage untersucht. Abb. 4 zeigt die Messung des Kontrastes
12 C. E. H a l l , Introduction to Electron Microscopy, NewYork 1953.
Ag•Sb
PtAu j
1•iU
Mij»Al
Ni—
.'CrTi
•Gej
VoPd
Z13/Za
•C
•Be
Z.,40 0 °o O 0 00 0 O O CD > 0
0 10 20 30 HO 50 60 70 80 90z ------►
Abb. 3. Abhängigkeit der Grüßen Z*l3/A und Z /A von der Ordnungszahl Z (A = Atomgewicht).
Massendicke [fj.gr/cm 2]
Abb. 4. Abhängigkeit des Kontrastes von der Massendicke für Aufdampfschichten aus verschiedenen Elementen und Verbindungen mit Ordnungszahlen zwischen 6 und 92 (Objektivapertur: a = 4,6-10-3 (20-^-Blende), Strahlspannung 60 kV).
bei 60 kV an Schichten aus Elementen und Verbindungen mit mehreren Ordnungszahlen zwischen Kohlenstoff und Uran. Die Massendicken dieser Schichten wurden direkt durch Wägung von Glasobjektträgern (ca.18 cm2) vor und nach der Bedampfung erhalten (Genauigkeit der Wägung: ± 0,05/yg/cm2) . Es wurden dabei nur solche Substanzen verwendet, die eine amorphe oder feinstkristalline Schichtstruktur zeigen. Nachfrüheren Untersuchungen des Verfassers14 könnnen nämlich grobkristalline Schichten auf Grund B r a g g scher Reflexion an den Netzebenen und Oberflächen- Rauhigkeit Abweichungen vom Exponentialgesetz (3) aufweisen. Abb. 4 zeigt deutlich, daß der Kontrast nicht von Zil3/A abhängen kann, da dann beim Uran nach Abb. 3 der Kontrast bei gleicher Massendicke um einen Faktor 2 größer sein müßte als bei Kohlenstoffschichten. Die Gerade, durch welche alle Meßergebnisse in
13 F. L enz , Z. Naturforschg. 9 a, 185 [1954].14 L. R eim er , Z. angew. Physik 9, 34 [1957].
MASSENABNAHME VON EINBETTUNGSMITTELN UNTER ELEKTRONENBESCHUSS 569
Abb. 4 gut angenähert werden können, liefert daher eine Eichkurve zur Ermittlung der Massendicke aus dem Kontrast unabhängig von der atomaren Zusammensetzung der Schicht. Da zwischen Kohlenstoff und Uran unter den Meßbedingungen kein wesentlicher Unterschied im Streuverhalten gefunden wurde, wird auch Wasserstoff einen gleichen, seinem Massenanteil entsprechenden Beitrag zum Kontrast liefern.
4. Massenverlust von Methacrylat-Schnitten
Die zeitliche Abhängigkeit der Massendicke bei konstanter Bestrahlungs-Intensität zeigt für verschiedene Schnittdicken den in Abb. 5 dargestellten Ver-
Abb. 5. Zeitlicher Verlauf der Massendicke von Methacrylat- Schnitten verschiedener Dicke (Methyl- : Butyl-Methacrylat
= 20 : 80) unter Beschuß mit 60 kV-Elektronen.
lauf. Man erhält größenordnungsmäßig einen Anhalt für die Dicke der Schnitte in Ä , wenn man die Ausgangswerte der Massendicke in jug/cm2 mit 1 0 0
multipliziert. Sämtliche Bestrahlungen erfolgten bei einer Beschleunigungsspannung von 60 kVolt.
ls L. R e i m e r , Naturwissenschaften 44, 335 [1957].
Es sei bemerkt, daß unter normalen Aufnahmebedingungen (10 000-fache Vergrößerung) diese Veränderung der Massendicke ca. 2000-mal so schnell verläuft, also im Bruchteil einer Sek. beendet ist. In einer früheren Arbeit des Verfassers liJ
50
W
£ 30£
I Kohle
Methacrylaf 'M ethyl-: Butyl- =20-80
im
10 20 30 W 50 m0 Massendicke [[igr/cm2] vor Beschuß — ►
Abb. 6. Zusammenhang zwischen der Massendicke m e am Ende des Massenverlustes und m0 zu Beginn der Bestrahlung für (X ) Methacrylat-Schnitte (Methyl-: Butyl-Methacrylat = 20 : 80) auf Formvarfolie und (O ) desgleichen mit einer Kohle-Aufdampfschicht bedeckt (s. schematische Zeichnung).
zur Schnittdicken-Bestimmung von Methacrylat- Schnitten aus der Elektronen-Durchlässigkeit wurde die Eichkurve nach den jetzt vorliegenden Erfahrungen unter Bedingungen gewonnen (niedrige Bestrahlungsdosis), bei denen der Massenverlust noch sehr gering war, so daß die damals erhaltene Eichkurve nicht auf bestrahlte Schnitte anwendbar ist, welche mit einer für eine Aufnahme erforderlichen Dosis bestrahlt sind und bei der schon der Massenverlust nach Abb. 5 seinen stationären Endwert erreicht hat.
Neben der Bestrahlungszeit ist in Abb. 5 die auf das Objekt gefallene Strahlendosis in Asec/cm2 vermerkt. Nach einer Dosis von ca. 10~ 2 Asec/cm2 wird bei allen Schnitten konstanter Kontrast erreicht. Die Messungen erstredeten sich z. T. bis zu 5-mal höheren Strahlendosen, als in Abb. 5 dargestellt sind. Um die durch den Elektronenbeschuß verursachten durchgreifenden Änderungen der Struktur organischer Folien besser verstehen zu können, muß man sich darüber im klaren sein, daß nach Rechnungen von L i p p e r t 4 eine Bestrahlungsdosis von 1 0 ~ 2 Asec/cm2
einer Dosis von 7,5 • 109 Röntgen ( ! ) bei 60 kV entspricht.
570 L. REIMER
Es fällt in Abb. 5 auf, daß der prozentuale Massenverlust (durch Pfeile markiert) mit abnehmender Schichtdicke größer wird. Wenn man die Endmassendicke ttie gegen die Anfangsmassendicke m0 aufträgt, lassen sich nach Abb. 6 die Meßpunkte (Kreuze) oberhalb m 0 = 10 //g/cm2 durch eine Gerade darstellen, die aber nicht durch den Nullpunkt geht.
Dies Ergebnis läßt sich interpretieren, wenn man annimmt, daß der Massenverlust durch zwei Prozesse hervorgerufen w ird: 1. einen „inneren Massenverlust“ als Volumeneffekt durch den Verlust der Nichtkohlenstoff-Komponenten und 2. einer Verdampfung von Methacrylat-Molekülen als Oberflächeneffekt. Von der gesamten Schnittdicke kann nur ein konstanter Beitrag verdampfen (m y — 2,3 //g pro cm2), weil schließlich der Rest der Methacrylat- Moleküle durch den Elektronenbeschuß derartig verändert ist, daß der Dampfdrude wesentlich geringer wird. Bei sehr dünnen Schnitten muß dagegen Proportionalität zwischen m e und m 0 bestehen, da stets ein gleicher Bruchteil verdampft oder durch innere Umwandlung „fix iert“ wird. In einem Anhang werden diese Gesetzmäßigkeiten durch einen formalen Ansatz theoretisch abgeleitet.
Die Änderung der Massendicke nach Bestrahlung kann auch sehr gut mittels Interferenzfarben lichtoptisch in einem Auflichtmikroskop verfolgt und nachgewiesen werden. Derartige Farbaufnahmen zusammen mit einer für die Praxis sehr nützlichen Farbskala der Interferenzfarben in Abhängigkeit von der Schnittdicke werden an anderer Stelle veröffentlicht 16.
Durch die gute Reproduzierbarkeit der Massenabnahmen ist hiermit eine Trennung zwischen Verdampfung und innerer Umwandlung gelungen. Um den Einfluß einer doppelten Bedeckung der Schnitte nach W a t s o n 6 ( s . Abschnitt 1) zu erfassen, wurden auf Formvarfolien liegende Schnitte auf der anderen Seite mit Kohle (ca. 1 0 0 — 2 0 0 Ä ) bedeckt. Abb. 7 zeigt den zeitlichen Verlauf der Massenabnahme für einen „dicken“ und „dünnen“ Schnitt. Es ist bemerkenswert, daß jetzt die prozentuale Massenabnahme weitgehend schichtdicken-unabhängig ist. Dies zeigen noch weitere Meßpunkte in Abb. 6 (K re ise ). Eine Gerade durch den Nullpunkt parallel zur Geraden für die unbedeckten Schnitte (Kreuze) bei großen Schnittdicken nähert diese Meßpunkte ausgezeichnet an. Das heißt aber, daß der verdampfte Anteil mv wegfällt und eine Doppelbedeckung der Schnitte einen günstigen Einfluß auf den Massenverlust von
Methacrylat-Schnitten hat. Ob sich dies in einer Verbesserung der Strukturwiedergabe von angeschnittenen Zellbestandteilen äußert, hängt von der Schnittdicke und den speziellen Objektstrukturen ab. Man ersieht aus Abb. 7, daß der größte prozentuale Einfluß einer Doppelbedeckung auf den Massenverlust bei sehr dünnen Schnitten zu erwarten ist (dünner als 600 Ä ) .
Bestrahlungsdosis [Asec/cm2] -
Abb. 7. Zeitlicher Verlauf der Massendicke von Methacrylat- Schnitten (Methyl- : Butyl-Methacrylat=20 : 80) auf Form-
varfolie mit Kohlebedeckung.
In der Abb. 8 * soll ein Beispiel zum Einfluß der Doppelbedeckung auf die Schichtstruktur gezeigt werden. Es handelt sich um zwei Schnitte der gleichen Objektstelle aus einer Schnittserie, von denen die Aufnahme a unter normalen Bedingungen gewonnen wurde und b mit einer Formvarfolie doppelt belegt war, so daß der Schnitt vollständig zwischen Formvarfilmen eingebettet ist **. Man erkennt in Abb. 8 b deutlich die schärferen Membranstrukturen, wenn auch natürlich die Kontraste mit doppelter Folie flauer erscheinen. Neben der Verhinderung der Verdampfung, die natürlich den stärksten Einfluß auf eine Schnittdicken-Abnahme gemäß Abb. 1 verursacht, wird eine doppelte Folie außerdem wahrscheinlich die Membransysteme an ihrem anderen Ende fest- halten, so daß diese nicht nach Abb. 1 umknicken können.
S j ö s t r a n d 17 schlägt für hohe Auflösungen sogar den umgekehrten Weg vor, die Schnitte freitragend auf Lochfolien aufzufangen. Gegen diese Methode muß
16 L. R eim er , Photogr. u. Wiss., Agfa Mitteil., im Druck.* Abb. 8, 9 u. 10 s. Tafel S. 572 a u. b.** Diese Aufnahme wurde freundlicherweise von Frl. Dr. R.
G ieseking (Pathol. Inst. d. Univ. München) zur Verfügunggestellt.
17 F. S. S jöstrand , Exp. Cell Res. 10, 657 [1956].
MASSENABNAHME VON EINBETTUNGSMITTELN UNTER ELEKTRONENBESCHUSS 571
jedoch insofern Bedenken erhoben werden, als dabei von beiden Schnittoberflächen Verdampfung erfolgen kann. Der Erfolg der einen oder der anderen Methode wird außerdem stark vom speziellen Objekt abhängen. Die quantitativen Messungen und die Aufnahme 8 sollten jedoch dazu anregen, die doppelte Bedeckung für Vergleichszwecke des öfteren anzuwenden, wenn man nicht überhaupt vom Methacrylat zu Vestopal W oder Araldit mit geringerem Massenverlust ohne Verdampfung (s. u.) übergeht.
Es muß in diesem Zusammenhang auch erwähnt werden, daß die im Einbettungsmittel eingeschlossenen Zellbestandteile ebenfalls je nach ihrer chemischen Zusammensetzung einen mehr oder weniger großen Massenverlust erleiden (Untersuchungen an Modellsubstanzen sind in Vorbereitung). Es sei auch bemerkt, daß alle gemessenen Massen Verluste der Schnitte nicht unbedingt eine gleich große Abnahme der Schnittdicke zur Folge haben, da durch den Massenverlust der verbleibende Kohlenstoff in einer auf gelockerten Form vorliegt, also die Dichte des bestrahlten Schnittes stets etwas geringer als die Ausgangsdichte ist. Derartige Messungen liegen z. B . von B r o c k e s 10 an Kollodiumschichten vor.
Der starke Massenverlust der Methacrylat-Schnitte (besonders der verdampfte Anteil m v) führt aber trotzdem zu einer so starken Schnittdicken-Änderung bei der Bestrahlung, daß z. B. Membranstrukturen gemäß Abb. 1 aus dem bestrahlten Schnitt heraus
ragen. Die Ausbildung dieses Oberflächenprofils soll in Abb. 9 mit einem Pseudoabdruck demonstriert werden. Hierbei ist der bestrahlte Schnitt mit Platin so stark schräg beschattet (unter 30° zur Schnittebene), daß die Gewebestrukturen unterdrückt werden und nur das Oberflächenrelief erscheint. Der Methacrylat-Schnitt ist also nicht unter der Platinschicht weggelöst. Es handelt sich außerdem in Abb.9 um die Negativ-W iedergabe der Aufnahme, damit die Schatten dunkel erscheinen.
Bei den geringen Bestrahlungs-Intensitäten, die zur Messung des zeitlichen Verlaufs der Massenabnahme angewandt wurden, beträgt die Erhöhung der Objekttemperatur nach den ungünstigsten A b schätzungen einige Grade. Bei höheren Bestrahlungsdosen, wenn die Objekttemperatur-Erhöhung größer als 1 0 C wird, kann unter Umständen eine schnellere Verdampfung an der Oberfläche auftreten, weil der Dampfdruck des Methacrylates erhöht wird, so daß die verdampfte Masse m v etwas größer wird. Es empfiehlt sich daher auf jeden Fall das in der Praxis viel benutzte Verfahren der langsamen V orbestrahlung der Schnitte bei niedrigen Strahlintensitäten. Dies ist allein deshalb erforderlich, weil das Polymethacrylat bei geringen Temperaturerhöhun
Wellenlänge ■
Abb. 11. IR-Spektrum von einer unbestrahlten und mit 4 ,10~3 Asec/cm2 (60 kV) bestrahlten Methacrylat-Folie.
572 L. REIMER
gen weicher wird und dann sehr große Verzerrungen in der Schnittebene möglich sind. Durch innere Umwandlung bei niedrigen Bestrahlungs-Intensitä- ten können die Schnitte dagegen „gehärtet“ werden.
5. Ab lau f des Massenverlustes
Um über die Art des Massenverlustes nähere Aussagen zu gewinnen, wurden analog zu Versuchen von B r o c x e s 10 an Kollodium und Polystyrol-Folien IR-Kur- ven von bestrahlten und unbestrahlten Methacrylat- Folien mit einem Leitz-IR-Spektrographen auf genommen. Die Herstellung der Folien erfolgte durch Eintrocknen einer Lösung von polymerisiertem Methacrylat (Methyl- : Butyl = 20 : 80) in Toluol in einer flachen Petrischale bei Temperaturen um 60 °C. Es ließen sich die Folien nach der Trocknung unter Wasser leicht mit einer Pinzette vom Glas abheben. Dünnere Filme mit durchstrahlbaren Dicken lassen sich auch nach der bekannten Eintauchmethode, wie sie z. B. zur Herstellung von Formvarfolien benutzt wird, erzeugen und auf Wasseroberflächen von den Glasträgern abflotieren. Die gefundenen Massenverluste der so hergestellten Schichten sind in voller Übereinstimmung mit den oben mitgeteilten Ergebnissen an Schnitten.
Die Folien (etwas dicker als 10 /j) wurden über ringförmige Halterungen mit einer freien Öffnung von 1 cm Durchmesser gespant und in der Endbildschirm-Ebene mit ca. 2 * 10- 7 A/cm2 bestrahlt. Bei größeren Intensitäten zerrissen die Folien. Daher waren sehr lange Bestrahlungszeiten erforderlich (mehrere Stdn.). Abb. 11 zeigt IR-Kurven von unbestrahlten und mit 4 • 10- 3
Asec/cm2 bestrahlten Methacrylat-Folien. Im Gebiete der Valenzschwingungen bei kleinen Wellenlängen sind die C — H-Bindungen und die Estergruppe-COOR gut zu erkennen (vgl. Strukturformel des Methacrylates in Tab. 1). Für die bei größeren Wellenlängen liegenden Deformations-Schwingungen ist die Zuordnung der Absorptionsmaxima zu den einzelnen Molekülgruppen schwieriger. Nach der Bestrahlung verschwinden diese zahlreichen kleineren Maxima und auch die Absorptions-
Foliendicke
Abb. 12. Eichkurven zur quantitativen Auswertung der Absorptionsbanden der CH3-, —CH2- und — COOR-Gruppen
(als Parameter ist die zugehörige Wellenzahl angegeben).
banden der CH3- und — CH2-Gruppen bei 3,5 /u und der Estergruppe — COOR bei 5,8 ju werden schwächer. Um aus den Intensitäten der Absorptionsbanden quantitative Rückschlüsse ziehen zu können, wurden Methacrylat-Folien verschiedener Dicke untersucht und die Extinktion
E = log ^ (D = Durchlässigkeit in %) (5)
gegen die Foliendicke aufgetragen (Abb. 12). Nach dem exponentiellen B e e r sehen Absorptionsgesetz lie-
Abb. 13. Abnahme der C —H- und —COOR-Gruppen von Methacrylat-Folien unter Elektronenbeschuß in Abhängigkeit
von der Bestrahlungsdosis.
gen die Meßpunkte dann auf einer Geraden durch den Nullpunkt. Diese Geraden liefern Eichkurven, um aus der Extinktion in bestrahlten Schnitten auf den Bruchteil der noch vorhandenen und intakten Molekülgruppen zu schließen.
Das Ergebnis ist in Abb. 13 wiedergegeben. Wenn man den Abfall der Estergruppe bei einer Bestrahlungsdosis von 4 • 10~ 3 Asec/cm2 mit der Massenabnahme in Abb. 5 vergleicht, so liegt 'eine gute Übereinstimmung vor, insbesondere weil der Verlust der O-Atome aus der Estergruppe den stärksten Beitrag zum Massenverlust liefert. Der schwächere Abfall der C — H-Bindungen in Abb. 13 ist vielleicht auf eine höhere Beständigkeit gegen Elektronenbeschuß zurückzuführen oder es überlagert sich noch eine Absorption aus Doppelbindungen, deren Lage der Resonanzstellen in Abb. 11 vermerkt ist. Das bei den bestrahlten Schnitten bei 5.6 ju deutlich auftretende neue Absorptionsmaximum ist vermutlich auch auf Doppelbindungen zurückzuführen. Diese treten natürlich bei einer Depolymerisation auf, aber auch jede Entfernung eines H-Atoms hat die Bildung einer C = C-Doppelbindung zur Folge.
Diese Versuche stehen also im Einklang mit der Hypothese, daß alle Molekülbausteine mit Ausnahme der Kohlenstoffatome durch Elektronenbeschuß entfernt werden. Da der Aufbau der Polymethacrylat- Ketten chemisch sehr einfach zu übersehen ist (Tab.
L. R e im e r , Quantitative Untersuchung zur Massenabnahm e von Einbettungsm itteln (M eth acry la t, Vestopal und A ra ld it ) unter Elektronenbeschuß (S . 566)
Abb. 8. Aufnahme der gleichen Objektstelle aus zwei verschiedenen Methacrylat-Schnitten einer Schnittserie: a) auf Form-varfolie aufgefischt und b) mit Formvarfolie beidseitig belegt.
Abb. 9. Pseudoabdruck mit Platin (30°) von einem bestrahlten Methacrylat-Schnitt (Negativkopie).
Z e itsch rift fü r Natu rforschung ] 1 b, S e ite 572 a.
Abb. 10. a) Aufnahme und b) Pseudoabdruck (Pt) der gleichen Objektstelle eines Vestopal-Schnittes nach Elektronenbeschuß (im Gegensatz zu Abb. 9 ist der Pseudoabdruck in normaler Positivtechnik wiedergegeben).
Z e itsch rift fü r N aturforschung 14 b, S e ite 572 b.
MASSENABNAHME VON EINBETTUNGSMITTELN UNTER ELEKTRONENBESCHUSS 573
1 ), läßt sich der Kohlenstoffgehalt berechnen und ergibt für das Gemisch Methyl-:Butyl-Methacrylat 2 0 : 8 0 das Verhältnis C /M = 0,661. Der Beitrag des Polymerisations-Initiators (Benzoylperoxyd)
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*/
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\X\
<?
XX *X
20 30 HOm0 Massendicke [igr/crn2] vor Beschuß -
50
Abb. 14. Zusammenhang zwischen der Massendicke am Ende des Massenverlustes und m0 zu Beginn der Bestrahlung
für Folien aus reinem Methyl-Methacrylat.
zum Massenverlust ist zu vernachläsigen. Dieser W ert ist in sehr guter Übereinstimmung mit der Steigung der Geraden in Abb. 6 (0 ,66 ). Um dies Ergebnis weiter zu prüfen, wurden reine Methyl- Methacrylat-Folien (hergestellt aus Lösungen in Toluol s. o.) auf ihren Massenverlust untersucht.
5C8H20
60
32
M = 100
M
M e th y l-M e th a c ry la t
OS
C - O - C H jI
- c h 2- c - I c h 3
B u ty l-M e t h a c r y la t
Oy
C - 0 - C H 2- C H 2- C H 2- C H 3 I
- C H ä - C - I c h 3
8C14H20
961432
M - - 142
M = 67’6%
M e t h y l - : B u t y l- = 20 : 80
C 20.60 + 80.67,6
M ~ 10066,1 Prozent.
Tab. 1. Strukturformel eines Kettengliedes und Kohlenstoffgehalt von Methacrylaten.
Die Messungen in Abb. 14 ergeben gute Übereinstimmung des Massenverlustes mit theoretischen Berechnungen in Tab. 1 (C / M = 0 ,60 ). Bemerkenswert ist auch, daß die Methyl-Methacrylat-Folien offenbar keinen Verdampfungseffekt an der Oberfläche zeigen, weil die Gerade durch die Meßpunkte und durch den Nullpunkt geht.
6. Vestopal- und Araldit-Schnitte
Der zeitliche Verlauf der Massenabnahme von Vestopal W- oder Araldit-Schnitten (Abb. 15) erfolgt bei gleicher Bestrahlungsdosis wie beim Metha-
Bestrahlungsdosis [A sec/cm.*] -
Abb. 15. Zeitlicher Verlauf der Massendicke von Vestopal W- und Araldit-Schnitten unter Beschuß mit 60 kV-Elektronen.
crylat. Auch hier ist nach einer Bestrahlung mit etwa 10~ 2 Asec/cm2 der Massenverlust beendet. Bei Araldit wurde bei mittleren Bestrahlungsdosen stets ein etwas steilerer Teil der Kurve gefunden, während Vestopal-Schnitte wieder einen annähernd exponentiellen Abfall der Massendicke zeigen. Aus Abb. 15 und 16 ist zu entnehmen, daß der Massenverlust bei diesen Einbettungsmitteln wesentlich geringer ist (13% bei Vestopal W und 20% bei A ra ldit) als bei den Methacrylat-Schnitten mit 34%, wenn bei diesen durch Doppelbedeckung die Verdampfung verhindert wurde. D ie Proportionalität zwischen m e und m0 in Abb. 16 zeigt, daß Vestopal W und Araldit keine Verdampfungsverluste an der Oberfläche erleiden.
Die Zusammensetzung des Vestopal W (Polyester mit Styrol-Zusatz) oder des Araldits (Epoxy-Resin mit Weichmacher) ist sehr komplex, so daß einfache Berechnungen des Kohlenstoffgehaltes wie in Tab. 1 nicht möglich sind. Da aber für einen quantitativen
574 MASSENABNAHME VON EINBETTUNGSMITTELN UNTER ELEKTRONENBESCHUSS
I J0
I1! »
0 10 20 30 W 50 m0 Massendicke [tg r /c m ] vor Beschuß — ►
Abb. 16. Zusammenhang zwischen der Massendicke tue am Ende des Massenverlustes und m 0 zu Beginn der Bestrahlung für Vestopal W- und Araldit-Schnitte (zum Vergleich ist der
Verlauf der Kurve für Methacrylat-Schnitte aus Abb. 6 gestrichelt eingezeichnet).
Vergleich nur der Kohlenstoffgehalt interessiert, wurde von diesen Kunststoffen eine Verbrennungsanalyse durchgeführt (Tab. 2 ). Zur Kontrolle wurde auch ein Methacrylat untersucht (2 0 :8 0 ) , dessen C- und H-Gehalt sich auch nach Tab. 1 berechnen läßt und gut mit dem Analysenergebnis übereinstimmt. Die Hypothese, daß alle Nichtkohlenstoff- Komponenten durch Elektronenbeschuß verloren gehen, welche für Methacrylat-Schnitte überraschend gute Resultate lieferte, läßt sich auf Vestopal und Araldit also nicht verallgemeinern. Der Massenverlust durch Entweichen der H- und O-Atome wird
Stoff C[% ]
H[% ]
mE/fflo[% ]
Methacrylat (20: 80) 66,3 9,3 66Vestopal W 68,8 5,8 87Araldit 69,7 8,4 80
Tab. 2. C- und H-Gehalt der Kunststoffe nach Verbrennungsanalysen und der experimentell gefundene Massenverlust
mjz,/m0 .
also vermutlich noch von der chemischen Konstitution des betreffenden Stoffes abhängen, indem z. B. Sauerstoff in Ester-, Aldehyd- oder Hydroxylgruppen verschieden leicht abgespalten werden kann. Es ist durchaus möglich, daß man bei noch höheren Bestrahlungsdosen eine vollständige Verkohlung des Objektes erreichen kann. Für das in dieser Arbeit angeschnittene Problem des Massenverlustes von Dünnschnitten interessieren aber in erster Linie die schnell ablaufenden Veränderungen, da diese unter den normalen Arbeitsbedingungen so schnell ablau
fen, daß ihr Einfluß auf die Bildstrukturen nicht erfaßt werden kann. Zur Klärung dieser offen stehenden Fragen zum Massenverlust organischer Substanzen sind weitere Untersuchungen vorgesehen, in denen der Massenverlust verschiedener organischer Folien auch unter höheren Dosen untersucht wird.
Abb. 10 soll mit einem Pseudoabdruck eines Ve- stopal-Schnittes demonstrieren, daß die Lamellensysteme nicht wie bei den Methacrylat-Schnitten (Abb. 9) nach der Bestrahlung aus dem Schnitt herausragen. Es ist derselbe Schnitt vor und nach der Schrägbeschattung gezeigt. Die Schrägbeschattung erfolgte hier so dünn, daß die osmium-kon- trastierten Gewebestrukturen noch gut zu erkennen sind, um die Orientierung im Objekt an Hand der Vergleichsaufnahme ohne Beschattung zu erleichtern *. Nur die kreisförmig angeschnittenen Kollagen- fasern zeigen einen schwadien Schattenwurf. Man muß berücksichtigen, daß die Gewebestrukturen auch Massenverluste erleiden, die natürlich von deren chemischer Konstitution abhängen.
Anhang
Um den Massenverlust von Methacrylat-Schichten in der Form von mE = f (m 0) nach der ausgezogenen Kurve in Abb. 6 auf Grund einfacher Modellvorstellungen theoretisch abzuleiten, soll eine Näherung für dünne Schnitte (nach Abb. 6 dünner als 6 — 8 ^g/cm2) und für sehr dicke Schnitte (dicker als 1 0 jug/cm2) durchgeführt werden.
Bei dünnen Schnitten (einige Moleküllagen) kann man von der Annahme ausgehen, daß alle depolymeri- sierten monomeren Methacrylat-Moleküle die Möglichkeit haben, zur Oberfläche zu gelangen und dort zu verdampfen, wenn sie nicht vorher durch Elektronen-Bom- bardement in ihrer Struktur so verändert worden sind, daß sie dadurch „fixiert“ werden und nicht mehr verdampfen können. Die Zahl der Moleküle dn i , welche durch einen solchen Mechanismus im Zeitintervall dt fixiert werden kann, ist proportional zur Zahl der Moleküle, die noch nicht verdampft oder fixiert ist:
= Ä:; (n0 - n\ - nx) (6 )CU
(rc0 = Zahl der zu Anfang in der Schicht vorhandenen Moleküle, ni Zahl der durch innere Umwandlung fixierten und nv Zahl der verdampften Moleküle). Analog ergibt sich eine zweite Differentialgleichung für die Zahl der verdampfenden Moleküle mit einem anderen Proportionalitätsfaktor ky
^ = ky (n0 n\ riy). (7)
* Herrn Dr. H. T h e m a n n (Inst. f. med. Elektr.-mikr. d. Univ.Münster) danke ich für die Überlassung dieses Vestopal-Schnittes und für wertvolle Diskussionen.
POLARISATIONSMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN AN SPORODERMEN 575
Es interessiert für unser Problem nur die Lösung dieses Systems von 2 linearen Differentialgleichungen für die Zahl der fixierten Atome n\ in Abhängigkeit von der Zeit t :
ni = n * T ~ t i r (*‘+*v)0/Cj “i Ky (8)
Die Anfangsmasse m0 ist proportional zur Zahl n0 und die Endmasse hie zur Zahl rii für großes t ( t —*■ ° o ) , wobei aber noch mit einem Reduktionsfaktor r zu multiplizieren ist, der den Massenverlust der fixierten Moleküle durch Verlust der Nichtkohlenstoff-Komponenten berücksichtigen soll.
mE“ r I + M S m»(9)
Es folgt also für kleine Schnittdicken die in Abb. 6 beobachtete Proportionalität zwischen me und m0. Mit r = 0 , 6 6 ergibt sich das Verhältnis k v /k i-\ -0 ,4 3 aus der Anfangssteigung in Abb. 6 .
Wenn man die Massendicke der Schicht nach (8 ) als Funktion der Zeit aufstellen würde, ergäbe sich ein Abfall nach einer e-Funktion, der durch die Kurvenformen in dieser Arbeit recht gut bestätigt wird und auch von L ip p e r t 4 angesetzt wurde, um den Massenverlust von Methacrylat-Schnitten in ihrem zeitlichen Verlauf analytisch darzustellen.
Bei dicken Schnitten sei von der Annahme ausgegangen, daß im Innern des Schnittes nur innere Umwandlung erfolgt.
rti = n0( l — e * ‘ *) . (10)
Die Verdampfung wird noch aus einer gewissen Tiefe unterhalb der Oberfläche erfolgen können, in der n 0' Moleküle liegen sollen. Die Verdampfung ist dann in erster Näherung proportional zur Zahl der noch nicht durch innere Umwandlung fixierten und damit noch verdampfbaren Moleküle:
d «vd£
k v (n 0’ — n { ) mit n i = n 0' (1 — e k lt ) . (11)
Die Lösung lautet:
n y = n 0 (1 (12)
Da nach hinreichend langer Zeit ni = n0 — n v gilt, folgt:
m£ = r |m0 — m0' ̂ = r (m 0 — mv) , mv = const.
(13)
und liefert damit den in Abb. 6 dargestellten linearen Verlauf für große Schnittdicken. Der Ansatz (11) stellt insofern aber nur eine erste Näherung dar, als durch die Verdampfung der Moleküle die obersten Moleküllagen nahe der Oberfläche gegenüber dem Innern an fixierten Molekülen angereichert werden, so daß der Ansatz für n\ nicht ganz korrekt ist. Eine Verbesserung in dieser Richtung liefert aber keine Änderung in der Gesetzmäßigkeit (13), nach der bei dicken Schichten die verdampfte Menge m y unabhängig von der Ausgangsmasse m0 ist.
Polarisationsmikroskopische Untersuchungen an Sporodermen*
Von P. S i t t e
Aus dem Botanischen Institut der Universität Heidelberg(Z. Naturforschg. 14 b, 575— 582 [1959] ; eingegangen am 22. Mai 1959)
Both fresh and acetolysed exines of some species (of Lycopodium , Dryopteris, Stylites, and B etula ) have been investigated with the polarizing microscope. The following results were obtained:
1. Sporopollenine is isotropic, as far as investigated.2. The exine does not show any intrinsic birefringence; it contains therefore neither cellulose nor
wax in any considerable amount.3. The exines of all investigated spores and pollen grains show a birefringence of form (textural
bir.), due to a very finely layered structure. This indicates, that not only exines, which are found to be layered in the electron microscope (e. g. Lycopodium ) , but also “amorphous” ones (e.g. B etu la ) have the character of a layered composite body.
Von den häufiger vorkommenden und physiologisch bedeutenden Zellwandstoffen der höheren Pflanze (Cellulose, Pektin, Lignin, Suberin, Cutin,Sporopollenin) sind zur Zeit lediglich die Sporopollenine (Spp.) noch nicht polarisationsoptisch untersucht 1; es gilt also, soweit bekannt, immer noch F r e y - W y s s l i n g s Feststellung von 1935 2: „E ine op-
1 Vgl. A. F r e y -W yssling , Die pflanzliche Zellwand. Springer, Berlin 1959.
* Herrn Prof. Dr. A. S perlic h zum 80. Geburtstag gewidmet.
tische Untersuchung des Sporopollenins steht noch aus.“ Das ist z .T . verständlich, weil an Sporodermen kein technisches Interesse besteht und ihre Doppelbrechung — wo überhaupt vorhanden — schwach ist, und die polarisationsoptische Untersuchung nicht aussichtsreich erscheinen ließ 3 (ganz im Gegensatz zu den anderen nach dem Accrustations-Prinzip ge-
2 A . F r e y-W yssling , Die Stoffausscheidung der höheren Pflanzen. Springer, Berlin 1935, S. 83.
3 B. M. A fzeliu s , Grana palynolog. (N.S.) 1/2, S. 24 [1956].