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Aula 4 – Espectrometria Molecular UV-VIS
Julio C. J. Silva
Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) Instituto de Ciências Exatas
Depto. de Química
Juiz de For a, 2013
QUI 070 – Química Analítica V Análise Instrumental
Espectrometria de Absorção Molecular no Ultravioleta/Visível
Espectrometria de Absorção Molecular no Ultravioleta/Visível
Espectrometria de Absorção Molecular no Ultravioleta/Visível
Espectrometria de Absorção Molecular no Ultravioleta/Visível
• Busca do diagnóstico na tentativa de evitar a contaminação
• O episódio do isolamento do HIV-1 no Brasil e na América Latina, que culmina com a publicação do
artigo que descreve o trabalho na revista Memórias do Instituto Oswaldo Cruz em 1987, tem início
dois anos antes, de forma bastante pitoresca. Em 1985, o casal de pesquisadores Hélio e Marguerite
Pereira – ela, chefe do Laboratório de Saúde Pública de Londres; ele, renomado virologista brasileiro
naturalizado inglês – forneceu a Bernardo Galvão duas garrafinhas que abrigavam células humanas
infectadas pelo vírus da Aids. O material, cedido a Peggy – como Marguerite era conhecida – pelo
pesquisador norte-americano Robert Gallo, envolvido no isolamento do HIV-1 nos Estados Unidos,
serviu de base para os estudos que levaram ao isolamento do vírus da Aids na América Latina.
• Com o material em mãos, o primeiro passo dos pesquisadores do IOC foi trabalhar para implantar as
técnicas necessárias para a identificação sorológica da infecção causada pelo HIV-1, dando início ao
processo de desenvolvimento do primeiro kit diagnóstico brasileiro, realizado por
imunofluorescência – técnica que sinaliza, por iluminação ultravioleta, a presença de antígenos
ligados a anticorpos específicos. “Quando recebemos as amostras de vírus cedidas por Robert
Gallo, o HIV-1 já havia sido isolado na França e nos Estados Unidos. O mais urgente, para nós, era
desenvolver um método de diagnóstico que permitisse a confirmação da doença em casos suspeitos”,
Galvão ressalta.
Espectrometria de Absorção Molecular no Ultravioleta/Visível
• Região do espectro 160 – 780 nm
• Medidas de absorção da radiação UV-Vis ampla aplicação na quantificação de espécies inorgânicas e orgânicas
• Espectrometria UV-Vis Transmitãncia (T), Absorvância (A), Células transparentes, Caminho ótico (b)
• Concentração (c) relação linear com A
Transmitância
Po P
b
c
• Quando um feixe de radiação monocromática atravessa uma solução contendo uma espécie absorvente, uma parte dessa energia é absorvida, enquanto a outra é transmitida • Transmitância atenuação sofrida pelo feixe de radiação incidente • Absorvância depende do número de centros absorventes (concentração)
absorbância:
transmitância: 100 x %T ou
o o P
P
P
P T = =
log log log P
P
P
P T A o
o
= - = - =
feixe incidente, Po
feixe emergente, P
reflexão espalhamento
Medidas de Transmitância e Absorbância
P
P
P
P A o
soluçã
solvente log log
o
=
0 %T: realizado na ausência de radiação, compensar a corrente de escuro
100 %T: compensar absorbância do solvente
Distribuição Espectral
Transmitância ou Absorvância versus
Lei de Lambert-Beer • A quantidade de radiação monocromática absorvida por uma
amostra é descrita pela lei de Beer-Bernard-Bouguer-Lambert
• Bouguer e Lambert quando a energia é absorvida a energia transmitida decresce exponencialmente com o caminho ótico.
T = P/Po = 10-kb
LogT = logP/Po = -kb
• Beer e Bernard lei similar para a dependência da T com a concentração
T = P/Po = 10-kc
LogT = logP/Po = -kc
Lei de Lambert-Beer • Combinando as duas equações:
T = P/Po = 10-abc
LogT = logP/Po = -abc
• Como a A = -logT, temos:
A = -LogT
A = - LogT = logP/Po = abc
• A concentração é diretamente proporcional a concentração
• A constante “a” é chama de absortividade e é dependente do e da natureza do material absorvente
• a = coeficiente de absortividade (L g-1 cm-1)
• = coeficiente de absortividade molar (L mol-1 cm-1)
Lei de Lambert-Beer
Representação gráfica da Lei de Beer, para soluções de KMnO4 em l = 545 nm e um caminho óptico de 1 cm.
a) Em %Transmitância %T versus “c” b) Em Absorbância A versus “c”
• Desvios reais: • Lei de Beer é obedecida para soluções diluídas (C 0,01 mol L-1) conc. maiores ocorre interação entre as espécies absorventes: - espécies muito próximas - alteração na distribuição de cargas - alteração na capacidade de absorção • Soluções diluídas, com alta concentração de eletrólito inerte: - interações eletrostáticas - alteração no coeficiente de absortividade molar • Coeficiente de absortividade molar varia com o índice de refração da solução (soluções coloridas)
Limitações da Lei de Beer
• Desvios aparentes: • Causa física relacionados as limitações dos instrumentos:
- Faixa espectral isolada (radiação policromática) - Radiação estranha (espúria) - Instabilidade da fonte - Resposta não linear do detector
• Causa química -Associações e dissociações moleculares - Deslocamento de equilíbrios (ex. Cr2O7 e CrO4)
Limitações da Lei de Beer
desvio químico: ocorre devido à dissociação, reações com solvente
Desvio da Lei de Beer para solução não-tamponada de um indicador HIn
HIn H+ + In-
cor 1 cor 2
• ponto no qual duas espécies em equilíbrio químico possuem o mesmo coeficiente de absortividade molar
Ponto isosbéstico do azul de bromotimol (501 nm):
(A) pH 5,45 (B) pH 6,95 (C) pH 7,50 (D) pH11,60
Ponto Isosbéstico
radiação espúria geralmente tem comprimento de onda muito
diferente do selecionado não é, portanto, absorvida pela solução
desvio instrumental: efeito da radiação espúria
Efeito da largura da fenda
• fendas mais estreitas: - melhor resolução - menor potência de radiação
vidro de didímio
Display
Ajuste de Zero
Ajuste de 100 %
Seleção de
Compartimento da cubeta
Instrumentos
Fonte de Radiação Espelho colimador
Rede de difração Detector
Cela de amostra
Instrumentos
Tipos de Instrumentos
• Figura – Diagrama de blocos de um espectrofotômetro
Todos os espectrofotômetros envolvem alguns componentes básicos
• Uma fonte de energia radiante
• Um dispositivo para isolar o de interesse (monocromador)
• Um módulo de recipiente para a amostra
• Um detector que converte a energia radiante em sinal elétrico
• Um dispositivo para medir a grandeza do sinal elétrico
Fonte de Energia radiante
• Deve gerar radiação contínua, estável na região do espectro e alta intensidade
• Lâmpada com filamento de tungstênio 350 a 750 nm (visível)
• Lâmpada de tungstênio-iodo (visível)
• Lâmpada de descarga de hidrogênio (U.V.) 185 a 375 nm
• Emissor de Nernst e oglobar (I.V.)
Fonte de Energia radiante
Monocromadores • Um monocromador consiste de:
– Lentes e espelhos focalizar a radiação
– Fendas de entrada e saída restringir radiações desnecessários
– Elementos de resolução separar o comprimento de onda de interesse (filtros, prismas, redes de difração)
Figura - Diagrama de um monocromador
Recipientes para a amostra
• Cubetas ou celas cilindricas devem apresentar características de transparência, forma e tamanho apropriado
- Plástico: região visível
– Vidro borossilicato: 380 –2000 nm
– Quartzo ou sílica fundida: região UV
Detectores
• Detector ideal:
– Alta sensibilidade
– Alta razão sinal/ruído
– Resposta constante para ampla faixa de
– Resposta rápida
– Sinal 0 na ausência de radiação (dark current)
Detectores • Células fotovoltáicas
• Células fotoelétricas
• Tubos fotomultiplicadores:
Registradores • Galvanômetros, Multímetro, Microamperímetro ou
Registrador
fotômetros: filtro (ou fonte radiação monocromática)
espectrofotômetros: monocromador (manual ou automático)
feixe simples: amostra e referência são alternadas
feixe duplo: compensa variações da fonte e detector
- mais complexo
multicanal (com arranjo de diodos):
- monocromador fixo
- detecção simultânea
- eletronicamente mais complexo
- radiação policromática é incida na amostra
(mínima fotodecomposição - medida rápida)
Tipos de Instrumentos
Espectrofotômetros Monocanais feixe simples
Espectrofotômetros Monocanais (duplo feixe)
Espectrofotômetros Multicanais (arranjo de fotodiodos)
amostra
fonte
fenda
arranjo de fotodiodos
rede côncava
Aplicações da Espectroscopia UV-VIS
• poucas aplicações em análises qualitativas
• importante em análises quantitativas
- compostos orgânicos e inorgânicos
- limite de detecção 10-4 - 10-5 mol L-1
- seletividade moderada a alta
- boas exatidão e precisão (1 - 3 %)
Determinação da Concentração:
• curva analítica: Absorbância x concentração
• método da adição de padrão
• titulação espectrofotométrica
• minimizar/eliminar o efeito de matriz
• adição de quantidades crescentes de padrão sobre a amostra
• NÃO melhora o limite de detecção
Método da Adição de Padrão
amostra sem adição
concentração da amostra
• Curva analítica
• Curva adição de padrão
Determinação da Concentração
Limite de detecção (LD): menor quantidade que pode ser detectada com razoável certeza para um dado procedimento analítico (IUPAC)
Determinação da Concentração
y = ybco + 3xSdbco em termos de sinal
LD = (Cbco + 3xSdbco)/S em termos concentração
LQ = (Cbco + 10xSdbco)/S em termos concentração
onde: LD = limite de detecção LQ = limite de quantificação (o INMETRO recomenda usar o primeiro ponto da curva analítica de calibração) y = menor sinal medido ybco = sinal do banco Cbco = concentração do branco (considerado = zero) Sdbco = desvio padrão do branco (n= 10 no mínimo) S = Sensibilidade (coef. angular da curva analítica (b))
Determinação de Misturas
• ’s devem ser conhecidos em
todos os comp. onda (’ e ’’)
• espécies independentes
(não existe interação)
• mais de duas espécies
A’ = ’M . b . cM + ’N . b . cN
A’’ = ’’M . b . cM + ’’N . b . cN
• Misturas (não há interação entre as espécies) • Quimiometria
• amostra, titulante ou produto que absorva radiação
• eventualmente pode ser usado um indicador
• modificação no espectrofotômetro para colocar a cela
de titulação (cilíndrica)
• presença de outras espécies absorventes podem não interferir
• não necessita de dados experimentais ao redor do ponto final
Titulação Espectrofotométrica
Titulação Espectrofotométrica
Referências
- Faria, L.C. Notas de Aula. Instituto de Química. UFG. 1995.
- D. A. SKOOG, F. J. HOLLER e T. A. NIEMAN – Princípios de Análise
Instrumental, 5a ed., Saunders, 2002.
- Junior, I.M.R. Notas de Aula. Instituto de Química. Unicamp. 2003.
- James N. Miller & Jane C. Miller. Statistics and Chemometrics for
Analytical Chemistry, fourth edition. Person Education.
- A. I. VOGEL - Análise Analítica Quantitativa, LTC, 6ª ed., Rio de Janeiro.
- D. A. SKOOG, D. M. WEST e F. J. HOLLER – Fundamentals of Analytical
Chemistry, 6a ed., Saunders, 1991.
- Galen W. Ewing. Métodos Instrumentais de Análise Química (Volume 1).
Editora Edgard Blücher/Ed. da Universida
Chemkeys : http://www.chemkeys.com/bra/index.htm