Embed Size (px)
Citation preview
MUNICIPIO
Número de bacilos esporulados
con genes
cry1 específicos
Perfil de genes cry1
específicos
Chía
3
1
1Aa
Susa
5
4
1Aa, 1Ab, 1Ac, 1Ba, 1Ca
Raquira
2
2
1Aa, 1Ba
Santa Sofía
2
1
1Aa, 1Ab, 1Ac, 1Ba, 1Ca
Villa de Leyva
3
2
1Aa, 1Ab.
Sutamarchán
2
1
1Aa, 1Ab, 1Ba, 1Ca
Garzón
1
1
1Aa
Betulia
3
3
1Aa, 1Ab, 1Ba, 1Da
Mesa de los Santos
4
4
1Aa
Piedecuesta
6
6
1Aa, 1Ab,
1Ac, 1Ba, 1Ca, 1Da
Lebrija
1
1
1Aa, 1Ab, 1Ac, 1Ca
Girón
1
1
1Aa, 1Ca, 1Da
Rionegro
1
1
1Ca
Total
34
28
Número de bacilos
esporulados con genes cry1s
Bacillus thuringiensis (Bt), es uno de los microorganismos más exitosos utilizado para el control de insectos lepidópteros plaga en una variedad de cultivos agrícolas, representando una alternativa al uso de insecticidas químicos, que generan contaminación ambiental y el desarrollo de resistencia en insectos (Theoduloz et al, 2003). Bt es una bacteria aérobica, Gram positiva, que se caracteriza por la producción de una inclusión paraesporal durante su fase de esporulación, la cual contienen proteínas insecticidas de cristal (ICPS´s) (Höfte y Whiteley, 1989), también denominadas ä-endotoxinas, las cuales son codificadas por los genes cry que controlan insectos plaga del orden lepidóptera, coleóptera y díptera (Schnepf et al., 1998). Se han reportado a la fecha 45 grupos de genes cry1 que codifican toxinas antilepidopteras. Colombia está ubicada en la franja ecuatorial la cual posee una gran biodiversidad de insectos (tanto plagas como benéficos), además de organismos entomopatógenos como Bt, provenientes del suelo, de los diferentes ecosistemas de nuestro País. Se justifica estudiar y evaluar la biodiversidad de genes específicos de esta familia para poder identificar cepas con mejores y nuevas actividades.En este trabajo se estableció una colección de cepas nativas de Bacillus thuringiensis provenientes de muestras de suelo en cuatro departamentos de Colombia: Boyacá, Cundinamarca, Huila y Santander, y fueron caracterizadas microscópica, bioquímica y molecularmente, como un paso previo a la realización de bioensayos, que son en ultimas los que confirman la actividad de una cepa.
Se recolectaron 26 muestras de suelo en 4 departamentos de Colombia: 4 en Cundinamarca (Chía y Susa), 8 en Boyacá (Villa de Leiva, Sutamarchán, Raquirá y Santa Sofía), 2 en Huila (Garzón), 14 en Santander (Betulia, Mesa de los Santos, Piedecuesta, Lebrija, Girón, Rionegro y Floridablanca) Figura 1. Se aislaron bacilos esporulados, los cuales se caracterizaron macroscópica y microscópicamente con tinción de Gram y azul de bromofenol observando y cuantificando cristales y esporas. Posteriormente, los aislamientos positivos para la presencia de cristales paraesporales se sometieron a una caracterización bioquímica por medio de electroforesis de proteínas totales en gel denaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE). Seguidamente se realizó extracción de ADN plasmidico y total de cada bacilo nativo y se llevó a cabo la amplificación por PCR de los genes cry1 utilizando primers generales. Las cepas positivas para la presencia de genes cry1 fueron sometidas a dos rondas de PCR Multiple a partir de 2 mezclas de 6 oligonucleótidos cada una, reconociendo 6 genes específicos.
Se aislaron 96 cepas nativas de Bacilos esporulados de 4 departamentos en Colombia (Tabla 1), que se caracterizaron macroscópica y microscópicamente evidenciando la pureza de las cepas por medio de coloración de Gram y la presencia de cristales paraesporales con el colorante azul de Bromófenol, encontrando formas: bipiramidal, redondas, amorfas y triangulares en el 23,1%, 67,7%, 7,25% y 1,9% de los aislamientos respectivamente (Figura 2). Posteriormente los aislamientos positivos para la presencia de cristales se analizaron por medio de la electroforesis de proteínas en geles denaturantes de poliacrilamida SDS-PAGE. Para la estandarización de esta metodología se utilizó un medio de cultivo con dos fuentes de nitrógeno, extracto de levadura y sulfato de amonio, con este suplemento se aumenta la producción de cristales (Galán et al., 1996), además la combinación de factores nutricionales orgánicos e inorgánicos son esenciales en la síntesis de las delta-endotoxinas (Bravo y Cerón, 2004). De esta forma se facilito el tratamiento de la muestra (cepas nativas), y se siguió el protocolo descrito por Laemmli, (1970).La determinación de las bandas de proteínas Cry1 se realizó teniendo en cuenta los pesos moleculares que están entre 40-130 KDa que al ser comparadas con las cepas de referencia Bt var aizawai HD137 y Bt var kurstaki HD1 permitieron identificar diferentes proteínas Cry (Figura 3). Finalmente, se realizó la amplificación de genes cry1 para ello se extrajo ADN plasmidico y total de buena calidad [30-100 ng/ml] (Figura 4). Se identificaron un total de 34 cepas nativas que presentan genes cry1 (35,4% del total de cepas evaluadas) (Tabla 2, Figura 5). Estas 34 cepas se sometieron a PCR-Multiple identificando genes cry1Aa en el 76% de los aislamientos, siendo los más comunes y cry1D en el 8,8% siendo los más raramente encontrados (Tabla 3, Figura 6). Se observaron aislamientos con uno, dos, cuatro y hasta seis genes, mostrando una gran biodiversidad de cepas. Esta metodología estandarizada selecciona las cepas de acuerdo a su actividad biológica potencial, como un paso previo a los ensayos biológicos que son en últimas los que muestran el verdadero potencial de una cepa de Bacillus thuringiensis.
INTRODUCCIÓN
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Ramírez Lorena¹, Ramírez Natalia¹, Hernández Javier²*¹Estudiantes de Microbiología Industrial, PUJ, ² Docente-Investigador, UJTL.
*Autor para correspondencia: [email protected];
METODOLOGÍA
Figura 1: Recolección de muestras de los 14 municipios en Colombia
BRAVO, A., CERÓN, J. 2004. Bacillus thuringiensis en el Control Biológico. Editorial Buena Semilla. Primera edición. 107, 111, 73, 154 p.
GALAN, J. L; GARCIA, S. S; SANTOS, M. E; QUINTERO, I. 1996. Avances recientes em la biotecnologia de Bacillus thuringiensis. Monterrey. México. Universidad de Nuevo leon. 30-46 p.
HÖFTE, H. y WHITELEY, H.R. 1989. Insecticidal cristal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol Rev. 53: 242-255 pp
JUÁREZ-PÉREZ, V. 2004. Genética y Biología molecular de Bacillus thuringiensis. En Bacillus thuringiensis en el control biológico. Bravo, A. y Cerón, J. eds. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, Colombia. pp. 17-47.
LAEMMLI, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685, ().
SCHNEPF, E., CRICKMORE, N., VAN RIE, J., LERECLUS, D., BAUM, J., FEITELSON, J., ZEIGLER, D.R., FEAN, D.H. 1998 Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiology Molecular Biology Review 62: 775-806 pp
THEODOLUZ, C., VEGA, A., SALAZAR, M., GONZÁLEZ, E., MEZA-BASSO, L. 2003. Expression of a Bacillus thuringiensis ä- endotoxin cry1Ab gene in Bacillus subtilis an Bacillus licheniformis strains that naturally colonize the phylloplane of tomato plants (Lycopersicum esculentum, Mills). Journal of Applied Microbiology. 94: 375-381 p.
Tabla 1: Número de bacilos esporulados aislados en 14 municipios ubicados en cuatro departamentos en Colombia
Figura 2: Morfología de cristales paraesporales en bacilos esporulados nativos (A: ZSUJ1G76 y B: ZSUJ1G75) y de referencia (C: B. thuringiensis HD1 y D: HD137). Microscopia de contraste de fases 400X, en fresco.
Figura 3: Perfil electroforético de proteínas totales de bacilos esporulados nativos Carril 1 y 12: Broad Range Protein MW (Promega, USA); Carril 2: cepa nativa ZHUJ1G49; Carril 3: Cepa nativa ZSUJ2H61; Carril 4: cepa nativa ZSUJ1I63; carril 5: cepa nativa ZSUJ1I64; Carril 6: cepa nativa ZSUJ2I65; Carril 7: cepa nativa ZSUJ1L86; Carril 8: cepa nativas ZSUJ2M96; Carril 9: B. thuringiensis HD1; Carril 10: cepa nativa ZCUJ2A4; Carril 11: cepa nativa ZCUJ2A7. SDS-PAGE AL 12% teñido con azul de Coomasie.
Genética, Biología Molecular & Bioinformática, Universidad Jorge Tadeo Lozano Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Carreras de Biología Marina & Ambiental, Universidad Jorge Tadeo Lozano, Cra. 4 No 22-61, Bogotá, D.C. Colombia
Figura 4: ADN plasmidico (A) y ADN total (B) de bacilos esporulados nativos. Se utilizo el Kit Ultraclean Microbial DNA (MoBio, USA). Electroforesis de agarosa al 1% teñida con bromuro de etidio.
280 pb
300 pb
Figura 5: Productos de amplificación por PCR de un fragmento de genes cry1s. Carril 1: Hypper Ladder II (Bioline, USA); Carril 2: Control Negativo; Carril 3: B. thuringiensis HD1; Carriles 4-12: bacilos esporulados nativos. Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (Gel-Doc Image System, USA)
Figura 6: Productos de amplificación por PCR-Multiple de genes específicos A. genes específicos cry1Aa (246 pb), cry1Ab (216pb), cry1Ac (180 pb) carril 1: Hypper Ladder II (Bioline, USA); carril 2: Control Positivo B. thuringiensis HD1; carril 3: cepa nativa ZHUJ1G49; carril 4: cepa nativa ZSUJ2H61; carril 5: cepa nativa ZSUJ1I63; carril 6: cepa nativa ZSUJ1I64; carril 7: cepa nativa ZSUJ2I65; y B genes específicos cry1B (367 pb), cry1C (130 pb) y cry1D (290 pb). Carril 1: Hypper Ladder II (Bioline, USA); carril 2: Control positivo B. thuringiensis HD137; carril 3: cepa nativa ZHUJ1G49; carril 4: cepa nativa ZSUJ2H61; carril 5: cepa nativa ZSUJ1I63; carril 6: cepa nativa ZSUJ1I64; carril 7: cepa nativa ZSUJ2I65; carril 8: cepa nativa ZSUJ1L86; carril 9: cepa nativa ZSUJ2M96. Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (Gel-Doc Image System, USA).
Tabla 2: Perfiles de genes cry1 generales y específicos identificados en bacilos esporulados nativos en 14 municipios de Colombia.
Tabla 3: Relación entre genes cry1 específicos con número de bacilos esporulados que los presentan
BIBLIOGRAFÍA
DEPARTAMENTO
MUNICIPIO MUESTRA
ANALIZADA AISLAMIENTOS DE
Bacilos esporulados Total
Cundinamarca
Chía
2
7
15
Susa
2
8
Boyacá
Raquira
2
8
29
Santa Sofía
2
8
Villa de Leyva
2
4
Sutamarchan
2
9
Huila
Garzón
2
11
11
Santander
Betulia
2
7
42
Mesa de los Santos
2
5
Piedecuesta
2
10
Lebrija
2
7
Girón
2
7
Rionegro
2
5
Total
24
96
96
P
%
NA
%
Aa
26
76
8
24
Ab
9
26
25
74
Ac
7
21
27
79
Ba
12
35
22
64
Ca 11 32 23 68
Da
3
8,8
31
91
