Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Stiinte Biologice Bucuresti

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC

Proiect: PN-II-PT-PCCA-2013-4-0361

Valorificarea superioara a sub-produselor si reziduurilor vegetale pentru a asigura exploatarea durabila a

resurselor naturale

Acronim: HIVEGRES

Contract nr. 145/2014

Etapa de raportare :

Etapa III– Reciclarea reziduurilor si subproduselor vegetale si imbunatatirea randamentelor de extractie;

tehnologii "safe-extraction"; evaluarea si stabilizarea produsilor de extractie (continuare-partea a 3a).

Implementarea de noi instrumente analitice si protocoale pentru evaluarea calitatii materialelor biologice si a

produselor si pentru controlul proceselor (continuare). Realizare model demonstrator extractie MAE.

Perioada de raportare 05.12.2015-02.12.2016

Cuprins Pag

Consortiu, obiective 1

Rezumatul etapei a III a de implementare a proiectului 2

A3.1. Dezvoltarea de metode de extractie "sigure" cu randament crescut de extractie a principiilor active (beta-

carotenoide, antociani)-continuare, partea 2a .A3.2. Evaluarea produsilor de extractie si stabilizarea principiilor

active-partea 2 a. A3.3. Implementare metodologie de extractie dezvoltata. Dezvoltare tehnologie (transfer din 2015)

2

A3.4. Documentatie brevet tehnologie de extractie MAE (transfer din 2015) 15

A3.5. Dezvoltarea de retea de senzori/biosenzori si validarea protocoalelor de analiza pentru determinarea

continutului si activitatii principiilor active la nivel de prototip de laborator-continuare, partea a 2-a

15

A 3.6. Documentatie brevet senzor/biosenzor

A.3.7. Model demonstrator extractie MAE 19

A 3.8. Diseminarea rezultatelor 19

Concluzii 19

Proiectul HIVEGRES este realizat de un consortiu academic-industrial (IMM uri) format din :

Institutul National CD pentru Stiinte Biologice Bucuresti, coordonatorul proiectului, (CO)

Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Chimie (P1)

Centrul de cercetare si prelucrare a plantelor medicinale Plantavorel SA, Piatra Neamt (P2)

Cosfel Actual S.R.L, Bucuresti (P3)

Scopul proiectului este acela de a obtine prin metode sigure un continut imbunatatit de compusi naturali cu

valoare nutraceutica, care sa fie utilizati in obtinerea de produse alimentare ca si suplimente si aditivi de

origine vegetala. (Domeniul 5: Agricultura, siguranta si securitate alimentara, directia prioritara 5.2.

Modernizarea productiei alimentare si obtinerea de produse corespunzatoare principiilor dezvoltarii durabile si

securitatii alimentare)

Obiectivele proiectului HIVEGRES conform contract 145/01.07.2014:

Valorificarea superioara, utilizarea durabila a resurselor naturale prin reciclarea reziduurilor si sub-

produselor vegetale ca urmare a cresterii randamentului de extractie;

Introducerea de noi instrumente pentru controlul si monitorizarea procesului de productie si pentru

evaluarea calitatii produselor: retea de nano-biosenzori;

Crearea de noi oportunitati pentru diversificarea produselor de tip alimente functionale si largirea

segmentului de piata al partenerilor industriali –companii mici si mijlocii- din proiect catre industria

alimentara, pe segmentul de piata care le implica.

Rezumatul etapei a III de implementare a proiectului

Activitatile specifice etapei a III-a de raportare pentru proiectul HIVEGRES au fost

A3.1. Dezvoltarea de metode de extractie "sigure" cu randament crescut de extractie a principiilor

active (beta- carotenoide, antociani)-continuare, partea 2a , A3.2. Evaluarea produsilor de extractie si

stabilizarea principiilor active-partea 2 a, A3.3. Implementare metodologie de extractie dezvoltata. Dezvoltare

tehnologie (transfer din 2015), A3.4. Documentatie brevet tehnologie de extractie MAE (transfer din 2015),

A3.5. Dezvoltarea de retea de senzori/biosenzori si validarea protocoalelor de analiza pentru determinarea

continutului si activitatii principiilor active la nivel de prototip de laborator-continuare, partea a 2-a, A 3.6.

Documentatie brevet senzor/biosenzor, A.3.7. Model demonstrator extractie MAE, A 3.8. Diseminarea

rezultatelor

Rezultatele angajate contractual vizeaza dezvoltarea de protocoale de extractie care sa fundamenteze

formularea de noi tehnologii de extractie a principiilor active de interes continute in materialele vegetale

utilizate ca sursa de obtinere, dezvoltarea si validarea de protocoale de analiza pentru evaluarea produsilor de

extractie obtinuti precum si dezvoltarea de noi instrumente de analiza bazate pe tehnologia biosenzorilor care

ulterior, sa fie incluse intr-o retea de senzori pentru determnarea cantitativa a principiilor active si pentru

estimarea eficacitatii acestora.

In aceasta etapa au fost elaborate tehnologiile de extractie asistată de microunde folosind solventi

”siguri” din punct de vedere al siguranței alimentare și au fost formulate atât extractele de beta-caroten

uleioase, bazate pe procedeul de extracție asistată de microunde, cât și extractele de afin și merișor. A fost

dezvoltata si optimizata tehnologia de obtinere a extractelor uscate de afin, merisor și maces care asigură și

stabilizarea extractelor prin microîncapsulare cu aditivi de tip maltodextrină și aerosil.

Cele două tehnologii au fost optimizate și sunt în fază de implementare. De asemenea, au fost evaluati

produsii de extractie atat din punct de vedere al continutului in principii active cat si al eficientei activitatii

acestora utilizând protocoalele de analiză validate anterior.

A fost realizat demonstratorul MAE, aparatul și procedeul de extracție fiind subiectul unei cereri de

brevet de inventie, dosar depus cu numarul A00877/22.11.2016.

S-a validat raspunsul unităților de biosenzori pentru determinarea polifenolilor și compușilor

polifenolici metoxi-substituiți atat pentru soluții standard cât și pe probe reale.

A3.1. Dezvoltarea de metode de extractie "sigure" cu randament crescut de extractie a

principiilor active (betacarotenoide, antociani)-partea 2 a.

A3.2. Evaluarea produsilor de extractie si stabilizarea principiilor active-partea 2 a.

A3.3. Implementare metodologie de extractie dezvoltata. Dezvoltare tehnologie (transfer din

2015)

In conformitate cu obiectivele specifice ale HIVEGRES care se circumscriu obiectivului

principal – utilizarea sustenabila si eficienta a resurselor agro-alimentare naturale, primul dintre

obiective implica reciclarea reziduurilor si a sub-produselor vegetale si imbunatatirea randamentului

de extractie prin tehnologii inovative pentru o extractie sigura si eficienta. In perioada de

implementare a proiectului HIVEGRES s-au dezvoltat metode de extractie din reziduuri si sub-

produse vegetale dedicate, care țin seama de solubilitatea specifică, de polaritate și de adresabilitatea

ca utilizare a principiilor active de interes (vezi raport etapa II).

Rezultatele obtinute privind tehnologiile de extracție, evaluarea și stabilizarea produșilor de

extracție precum și implementarea tehnologiilor dezvoltate in faza de laborator sunt prezentate în

continuare conform celor două direcții de dezvoltare a tehnologiilor de extracție, bazate pe

caracteristicile specifice de solubilitate a principiilor active de interés și pe fenomenele cares tau la

baza procesului de extracție, întrucât continuarea activităților de cercetare-dezvoltare ale consorțiului

s-a făcut pe cele două direcții stabilite anterior, în etapa a II-a, pentru dezvoltarea tehnologiilor de

extracție, și anume

A. utilizarea fenomenelor de cavitatie in prima etapa a procesului de extractie, ultrasunete si

microundele, atat pentru extractele nepolare (ulei comestibil) cat si pentru cele polare

(apoase/hidroalcoolice) continuate cu stabilizarea produșilor de extracție

B. extractia lichid-lichid și stabilizarea produșilor de extracție.

Metodele optimizate de extracție s-au bazat, in special pentru produșii nepolari, pe extracția

asistată în câmp de microunde (MAE). Devoltarea și optimizarea acestor protocoale și tehnologii au

fost rezultatul colaborării între coordonator și partenerul P3-COSFEL.

A. Utilizarea fenomenelor de cavitatie pentru obținerea de extracte nepolare și polare;

stabilizarea produșilor de extracție

A1. Elaborarea tehnologiei de extracție a 𝜷-carotenului utilizand extracția asistată de

microunde. Evaluarea produsilor de extracție; stabilizarea produsilor de extracție.

Pornind de la modelul de extractor elaborat in etapa anterioară, s-au optimizat parametrii

tehnologici și a fost construit un extractor MAE destinat elaborării de tehnologii de extracție în câmp

de microunde la frecvența de 2450 MHz.

Fig. 1 Extractor MAE. 1.Lampa prezenta tensiune; 2. Cheie comanda; 3.Buton START; 4.

Buton STOP; 5. Buton reglare nivel putere microunde; 6. Led functionare microunde; 7. Indicator si

regulator temperatura; 8. Indicator putere microunde; 9.Capac vas de reactie; 10. Semnalizare

protectie usa; 11. Omogenizator

β-carotenul este solubil în solvenți organici, în timp ce utilizarea apei ca și solvent conduce la

emulsionărea acestuia. Extracția β-carotenului se poate realiza în mod convențional prin utilizarea

solvenților adecvați, tehnica de extracție fiind simplă și relativ necostisitoare. Problemele pe care le

ridică însă metoda convențională constau în durata mare a extracșiei care, implcit, conduce la

degradarea componenților activi, și, respectiv, utilizarea unor solvenți toxici cu impact negativ

asupra sănătății și asupra mediului înconjurător.

Cercetările din ultimele două decenii asupra extracției compușilor naturali au condus la

identificarea unor tehnici si metode inovative mai rapide si ecologice. Am demonstrat în etapa

anterioară că extracția carotenoidelor se poate realiza prin tehnici ecologice, utilizând fenomenele de

cavitație cum sunt microundele sau ultrasunetele. Extractia antioxidanților asistată cu ultrasunete este

aplicată pe larg datorită vitezei de extracție și a eficienței ridicate, în timp ce extracția asistată de

microunde ajută la eliberarea în scurt timp a compușilor bioactivi, din matricea probei în solvent.

Unul dintre aspectele limitative ale extractiei β-carotenului este ca acesta e un compus termosensibil,

limitarea fiind generată de temperatura de lucru care, penrtu evitarea degradării compusului activ,

trebuie să fie situată sub 65°C.

In acest context trebuie ținut seama de proprietățile specifice ale materialului biolog

(vegetal), întrucât este cunoscut faptul că materialul biologic absoarbe o parte din energia

microundelor, ceea ce conduce la creșterea temperaturii în material. Această creștere de temperatură

va determina o creștere a presiunii interne la o valoare mai mare decat capacitatea de expansiune a

peretilor celulari, conducând astfel la ruperea acestora. In acest fel, substanțele active de interes vor

migra spre exteriorul materialului biologic și vor fi dizolvate în solvent.

Problema tehnică pe care o rezolvă tehnologia elaborată de COSFEL cu suportul consorțiului

HIVEGRES constă în utilizarea unui procedeu de extracție asistat cu microunde a β-carotenului din

morcovi, folosind un solvent adecvat ”sigur”, care are impact minim asupra sănătății umane și

impact redus asupra mediului, solvent care poate fi definit ca și solvent neconvențional, și anume

uleiul de floarea soarelui sau uleiul de măsline, deci trigliceride naturale.

Aplicarea acestei metode neconvenționale pentru extracția asistată cu microunde a β-

carotenului în regim controlat conduce la următoarele avantaje:

extracția are loc intr-o singură etapă

durata de extracție se reduce de la ore la zeci de minute

extracția are loc intr-un solvent ecologic

extracția se produce in absenta radiatiei UV

ponderea de substanta activa in masa de produs final este de x – x+k%.

Pentru extracția β-carotenului conform acestei tehnologii se utilizează un reactor cu

microunde tip multimod în regim dinamic, cu termostatare. Sistemul de generare de microunde al

reactorului lucrează în domeniul de frecvență 2,450 GHz, putand avea o densitate de putere in

microunde de 15 – 3500 W/kg amestec de extracție, de preferință între 50 si 1500 W/kg. Durata de

atingere a temperaturii de lucru este de 1 până la 30 minute. Pentru realizarea extracției, se menține

amestecul la temperatura de lucru pe durata a 5 – 55 minute, în câmpul de microunde. Extracția se

realizeaza sub atmosfera de azot.

Reactorul in care are loc extracția este confectionat din materiale transparente la microunde:

sticla anorganică, cuarț, teflon.

Etapele procesului de extracție sunt: (1) aducerea materialului biologic într-o formă divizată;

(2) uscarea controlată a materialului biologic divizat; (3) asigurarea prezenței unei componente

dispersate, care absoarbe radiația de microunde; (4) contactarea materialului biologic subdivizat cu

un agent de extracție transparent sau parțial transparent la microunde; (5) expunerea amestecului de

extracție, sub agitare, la acțiunea microundelor; (6) separarea materialului rezidual.

Materialul biologic (morcovii) este adus într-o forma divizată sub formă de taitei; materialul

biologic astfel divizat este supus unei uscări controlate astfel încât umiditatea remanentă să fie situată

in domeniul 10 – 40%, de preferință între 20 si 35%. Ca agent de extractie a β-carotenului se

utilizeaza trigliceride naturale cu constanta dielectrica la 20°C cuprinsă între 2,1 si 4,6, de preferință

situată în intervalul 2,3 - 3,2. Raportul masic solvent: material biologic este situat in intervalul 10:1

până la 1:1, de preferinta intre 6:1 si 2:1. Omogenizarea amestecului se realizează utilizând un

agitator elicoidal, viteza de agitare controlată fiind in domeniul 1 - 80 rpm, cea aplicată fiind, de

preferință, în intervalul 5 -30 rpm. Utilizarea agitării amestecului asigură atât un contact bun al

materialului biologic cu solventul cât și omogenizarea temperaturii în masa amestecului. Expunerea

amestecului la microunde presupune două perioade de timp:

-perioada de încălzire, în care amestecul este adus la temperatura de operare; cu o durată de cca 30

minute;

-perioada de extracție propriu-zisă, când are loc menținerea în regim izoterm a amestecului; pentru

aceasta etapă durata este de cca 35 minute.

Separarea fazei extrase de materialul biologic rezidual se face prin filtrare sau centrifugare.

Echipamentul utilizat pentru extractia asistata cu microunde constă dintr-o camera de reacție

care presupune o incintă metalică realizata din metal (oțel inoxidabil, aluminiu, fier) utilizată ca

aplicator de microunde. Aparatul (vezi schema din figura 2) este format din incinta metalica 1 de

forma cilindrica sau paralelipiped dreptunghica prevazuta la parte superioara cu un capac, 2, care se

montează pe incinta. Pe fundul incintei este prevăzut un gol tehnologic pentru montarea ghidului de

unda 3 iar in lateral este montat un termometru in infrarosu 4 pentru masurarea temperaturilor din

vasul de reactie. La celalalt capat al ghidului de unda, 3, este montat un magnetron, 5, ce lucreaza la

frecventa de 2450 MHz, impreuna cu transformatorul aferent. In incinta metalica este amplasat vasul

de extractie, 6, închis cu un capac, 7, ambele fiind realizate din material transparent la microunde.

Capacul vasului de extractie are un stut de alimentare cu gaz inert, 8, o evacuare a gazului din vas 9

care are montat un retroregulator cu reglaj, 10. Pe capacul 7 este montat un sistem de agitare a masei

de extractie constituit dintr-un motor electric 11 și agitator elicoidal 12. Sistemul este prevăzut să

lucreze la diferite turații, fiind dotat cu un convertizor de frecventa. Asigurarea izolării termice a

vasului de extracție se realizează prin utilizarea unui material termoizolator transparent la microunde,

13, care umple spatiul liber dintre vas și incinta metalică. Ca material termoizolant transparent la

microunde se poate folosi vată minerală din alumină, alumina cu zirconiu sau alte materiale oxidice

refractare sub diferite forme: vata, blocuri, panouri. Temperatura in masa de extracție este reglată cu

ajutorul unui controler de temperatură, 14, cu posibilitatea de a opera in diferite regimuri termice.

Pentru monitorizarea presiunii de operare este montat pe capacul reactorului un manometru de joasă

presiune, 15.

Fig. 2. Schema echipamentului de extrație asistată de microunde

A1.1. Extractia β-carotenului în câmp de microunde utilizînd extractorul MAE

construit

Pentru a demonstra capabilitățile aparatului de extracție MAE construit, în continuare se vor

exemplifica două aplicații de extracție a β-carotenului, extracția realizându-se din aceeași cantitate de

material vegetal, la același raport material vegetal-solvent de extracție și în același regim de

temperatură, folosind însă diferite tipuri de aplicare ale câmpului de microunde.

Condițiile de extracție: se efectuează extracția β-carotenului dintr-o masa vegetală de 300 g tăiței

de morcovi cu umiditatea de 26 %, peste care se adaugă 1200 g ulei de floarea soarelui degumat, cu

un continut in acizi liberi de 0,10%., într-un aparat de extracție realizat conform descrierii. După

montarea capacului la vasul de extracție se montează capacul incintei metalice. Se porneste agitarea

cu o viteza de 25 rpm, care se menține pe toată durata procesului de extracție. Se barbotează în vasul

de extractie azot gazos. Se purjeaza de 3 până la 6 ori gazele din vasul de extracție tinand

retroregulatorul pe poziția deschis. Se închide retroregulatorul și se realizează o presiune de 1,5 bar.

Dupa setarea controlerului de temperatura la valoarea de 35°C, se porneste încalzirea cu microunde.

In prima aplicație încalzirea cu microunde se realizează utilizând o densitate de putere

de 426 W/kg. Dupa 26 de minute, temperatura amestecului de extracție atinge valoarea maximă

setată. Amestecul de extractie este mentinut în regim izoterm timp de 30 minute, utilizând un

temporizator. Dupa perioada de extracție, se opreste sistemul de agitare și se eliberează presiunea din

vasul de extracție. Se demontează capacul de la incintă, respectiv capacul vasului de extracție și se

filtrează gradual, utilizand un filtru de ulei cu cartus filtrant.

In cea de a doua aplicație procesul este identic până la încalzirea cu microune care este

realizată cu gradient termic controlat, utilizand o densitate de putere de 200 W/kg. Dupa 30 de

minute, temperatura amestecului de extracție atinge valoarea maximă setată.. Amestecul de extractie

este mentinut în regim izoterm timp de 30 minute, utilizând un temporizator. Dupa perioada de

extracție, se opreste sistemul de agitare și se eliberează presiunea din vasul de extracție. Se

demontează capacul de la incintă, respectiv capacul vasului de extracție și se filtrează gradual,

utilizand un filtru de ulei cu cartus filtrant.

A1.2. Evaluarea produsilor de extracție

Din extractele obtinute conform exemplelor 1 si 2 au fost prelevate probe care au fost

analizate pentru determinarea continutului de β-caroten. Conform datelor bibliografice și în acord cu

rezultatele obținute în etapa anterioară de realizare a proiectului, dintre compuşii carotenoizi

identificaţi în extractele de morcov beta-carotenul este singurul compus majoritar regăsit în toate

tipurile de extracte formulate fie utilizând solventi organici convenţionali fie utilizând solvenţi

alternativi pentru extracţii sigure. Ca urmare s-a considerat că standardizarea extractelor de

carotenoide se va face în echivalent beta-caroten. Analizele s-au efectuat pe un sistem UFLC

Prominence Shimadzu cu următoarele componente: pompe LC-20AD SP Shimadzu, degazor

Shimadzu DGU-20A5-Degasser, detector Shimadzu SPD-M20A Diode Array Detector, CTO-20AC

Column Oven, software LCMS solution, coloană Kromasil C18, 5 μm, 250 x 4.6 mm. Faza mobilă a

fost filtratã printr-o membranã CHROMAFIL® 0-20/25 PTFE 0,22 μm şi sonicatã cu ajutorul unei

bãi de ultrasunete TRANSSONIC 460/H pentru eliminarea aerului dizolvat în soluţie. Probele au fost

filtrate prin filtre Millex Syringe Driven Filter Unit, 0,22μm (Millipore) înainte de a fi injectate în

aparat.

În urma testelor efectuate în etapa anterioară a fost elaborată şi optimizată metoda de

identificare şi cuantificare a compuşilor de interes, beta-caroten, licopen şi luteină, parametrii de

operare ai sistemului cromatografic fiind următorii: • fază mobilă A: ACN şi B: MeOH: CH2Cl2

(50:50, v:v) ; • mod izocratic de eluţie, A:B (40:60, v:v) ; • debitul fazei mobile 0.8mL/min.

Volumul de injecţie folosit a fost de 20 uL iar detecţia specifică a analiţilor de interes s-a realizat la

următoarele lungimi de undă: λmax= 456 nm – β-caroten.

Metoda HPLC optimizată a fost validată în termeni de linearitate, limită de detecţie, limită de

cuantificare, exactitate şi precizie. S-a realizat curba de calibrare pe un domeniu de linearitate

cuprins între 0.0001 şi 0.050 mg/ml cu un coeficient de corelaţie de 0.9978 pentru beta-caroten,

totodată calculându-se limita de detecţie de 0.00013 mg/ml şi limita de cuantificare de 0.00045

mg/ml. Studiul efectuat a demonstrat că metoda este exactă şi precisă, permiţând determinări

cantitative repetate în aceeaşi zi (repetabilitate) dar şi în zile diferite (precizie intermediară) cu o

abatere standard relativă (RSD%) mai mică de 5 %. Valoarea RSD% calculată pentru repetabilitate a

fost de 1.64% pentru timpul de retenţie şi 1.31% pentru aria peak-ului. Valoarea abaterii standard

relative calculată pentre precizia intermediară a fost de 3.65% pentru timpul de retenţie şi 5.55%

pentru aria peak-ului analitului de interes.

Figura 3. Cromatograma HPLC-DAD a extractului de betcaroten obtinut prin extracție MAE

Pentru cele două exemple de aplicație ale tehnologiei de extracție asistată de microunde rezultatele

obținute, exprimate în µg continut de β-caroten pe gram de substanță uscată (taitei morcov uscati)

precum și eficienta antioxidanta determinată prin metoda ORAC sunt date in tabelul 1.

Tabel 1. Conținutul de β-caroten și eficiența antioxidanta a extractelor de morcov in ulei vegetal

obținute prin procedeul de extractie asistată de microunde

Proba (tip extractie) Continut β-caroten

(µg/g substanta uscata)

Eficienta antioxidanta

ORAC, µmol/g

426 W/kg, continuu 916,05 561,81

200 W/kg gradient de putere 846,04 636,08

După cum se observă, ambele procedee conduc la obtinerea unui conținut ridicat de caroten,

în timp scurt de extractie, cu menținerea unei eficiente antoxidante satisfăcătoare.

A1.3. Stabilizarea produsilor de extracție

Odată obținute randamente de extracție bune și extracte care demosntrează eficiență

antioxidantă deși au fost obținute prin tehnologii asistate de microunde trebuie rezolvată, în

continuare, problema stabilității acestor extracte. Ținând seama de caracteristicile de solubilitate ale

conservanților frecvent utilizați în industria suplimentelor nutriționale și farmaceutice s-a considerat

util studiul stabilității produșilor formulați prin extracție asistată de microunde în prezența

butilhidroxianisolului (BHA), într-o concentrație de 3% procent masă:volum. Studiile de stabilitate

s-au desfașurat pe termen lung, analiza conținutului în β-caroten s-a realizat iniţial imediat dupa

extracție, la 7, 21 şi respectiv 30 de zile, apoi din lună în lună până la 5 luni, la temperatură

ambientală şi întuneric, respectiv la o temperatură de 4°C (frigider) și s-au efectuat în raport cu probe

martor, extracte de β-caroten obținute în aceleasi condiții de extracție și păstrate în aceleași condiții

dar în care nu a fost adăugat conservant BHA.

Pe această perioada de studiu a fost determinată și capacitatea antioxidantă a extractelor, în

aceleasi conditii, utilizând protocolul de analiză stabilit în laboratoarele coordonatorului, INCDSB,

bazat pe metoda ORAC și aplicat în sistem micelar (figura 4).

Rezutatele obținute la determinarea cantitativă a β-carotenului în extractele MAE sunt

prezentate in tabelul 2.

Tabelul 2. Stabilitatea ca și conținut de β-caroten ( µg / g substanță uscată), a extractelor MAE

formulate, cu si fără adaos de BHA

Timp

stocare

Conditii stocare

Figider Temperatura

camerei

0%

BHA

3%

BHA

0%

BHA

3%

BHA

1 849 898,7 849,0 898,7

7 667,9 716,9 637,7 699,5

21 608,3 776,3 607,3 703,6

45 591,8 593,7 568,2 550,7

60 581,7 616,2 448,3 519,4

90 590,2 643,2 451,2 476,3

120 515,6 588,4 319,9 435,5

150 601,8 664,8 365,6 455,1

Figura 4. Variația în timp a capacității antioxidante a extractelor de β-caroten formulate in

sistem MAE, solvent ulei comestibil

În decurs de 60 de zile s-a constatat o scădere a conţinutului de β-caroten din extractele

uleioase de morcov, pierderi semnificative au avut loc la extractele păstrate la temperatura camerei şi

întuneric dar și acestea, după o perioadă de aproximativ 90 de zile, înregistrează un trend de

stabilizare a concentraţiei de β-caroten. Extractele păstrate la frigider, care au și un adaos de BHA,

prezintă o scădere a concentrației de compus activ de cca 26% în 150 zile,

Cea mai eficientă metodă de extracţie şi de conservare pentru o perioda de timp mai

îndelungată a compusului de interés, β-carotenul, o reprezintă metoda de extracţie asistată de

microunde şi păstrarea extractelor obţinute la temperaturi de ± 4° C (frigider); adăugarea de BHA nu

contribuie semnificativ la menținerea concentrației de β-caroten, și, după cum se observa, după 60 de

zile nici la mentinerea capacității antioxidante, probabil păstrarea extractelor formulate în fiole vidate

sau adaosul de acid citric din extracte de plante fiind mai eficientă decât adaosul de conservanți de

sinteză, aceste două sisteme de stabilizare fiind de testat pentru formula finală de extract uleios de β-

caroten, în ultima etapa de implementare a proiectului.

A2. Elaborarea tehnologiei de extracție a antocianilor și polifenolilor utilizand extracția asistată

de microunde. Evaluarea produsilor de extracție; stabilizarea produsilor de extracție.

Utilizand același sistem de extracție MAE ca și pentru carotenoide, dar înlocuind solventul de

tip trigliceride naturale cu etanol, au fost formulate extracte polare cu conținut îmbunătățit de

polifenoli și polifenoli metoxi-substituiți, stabilizarea acestor extracte fiind realizată, conform

concluziilor din etapa II, cu acid citric, 1%. Studiile de stabilitate au fost realízate utilizând și probe

de control care suportă același proces de extracție, în aceleași condiții, și care sunt stocate, de

asemenea, în aceleași condiții ca și extractele MAE cu 1% acid citric.

3%…

3%BHA,…

0

50

100

150

200

1 2 3

CA

µm

ol/

g

0 30

150 zile

Extractele au fost stocate în următoarele condiții: la temperatura camerei, la 4°C și la -17°C,

analizele la nivel de conținut de principii active și eficacitate antiradicalica (ABTS, DPPH) fiind

realízate imediat dupa formulare și apoi la 7, 21, 30 zile si din 30 in 30 zile până la 150 zile.

Tabelul 3. Variația în timp a capacității antiradicalice a extractelor de afin și merișor

formulate in sistem MAE, solvent alcool etilic:apă (70:30, v:v)

Proba

TEAC µmol/g substanta uscata (±SD)

Afin MAE

0% acid citric

Afin MAE

1% acid citric

Merișor MAE

0% acid citric

Merișor MAE

1% acid citric

Timp

de

stocare

(zile)

T

camerei 4°C -17°C

T

camerei 4°C -17°C

T

camerei 4°C -17°C

T

camerei 4°C -17°C

0 9757 (±0.25) 12153 17439 (±0.25) 18461 (±0.50)

7 9225

(±0.25)

9309

(±0.65)

9471

(±0.12)

12169

(±0.25)

12169

(±0.41)

10450

(±0.67)

16832

(±0.37)

19738

(±0.37)

17428

(±0.27)

17705

(±0.22)

16576

(±0.36)

16708

(±0.56)

21 9006

(±0.65)

9352

(±0.33)

8981

(±0.25)

12072

(±0.25)

12111

(±0.12)

10242

(±0.60)

14477

(±0.40)

19555

(±0.31)

17415

(±0.17)

17721

(±0.12)

16158

(±0.56)

16555

(±0.34)

30 8475

(±0.25)

8555

(±0.65)

8593

(±0.53)

10700

(±0.65)

11304

(±0.42)

10029

(±0.25)

14350

(±0.12)

18267

(±0.21)

17039

(±0.31)

16209

(±0.11) 16023

(±0.19)

15966

(±0.16)

60 7280

(±0.43)

8544

(±0.32)

8115

(±0.65)

10558

(±0.42)

11188

(±0.61)

10027

(±0.65)

14312

(±0.25)

16178

(±0.27)

15743

(±0.61) 15286

(±0.11)

15515

(±0.12)

16462

(±0.56)

90 7180

(±0.22)

8508

(±0.22)

7918

(±0.25)

10408

(±0.45)

11207

(±0.35)

10007

(±0.21)

13555

(±0.22)

16846

(±0.25)

11577

(±0.56)

15462

(±0.25) 15349

(±0.25)

15207

(±0.36)

120 7025

(±0.20)

8260

(±0.22)

6674

(±0.12)

10371

(±0.25)

1051

5(±0.25)

9889

(±0.33)

13520

(±0.17)

15845

(±0.25)

11039

(±0.33)

14384

(±0.11)

15298

(±0.16)

14103

(±0.46)

150 7020

(±0.12)

8001

(±0.10)

6074

(±0.41)

10387

(±0.31)

10297

(±0.56)

9639

(±0.16)

13422

(±0.33)

15721

(±0.11)

11021

(±0.16)

14087

(±0.11)

15240

(±0.56)

10331

(±0.12)

În conformitate cu concluziile din cea de a doua etapa de realizare a proiectului, extractele de

merisor și afin obținute prin procedee MAE au fost dublu standardizate, la conținutul continutul de

antociani (echivalent cianidin/ cianidin –glucozida), respectiv polifenoli (echivalent acid clorogenic).

Rezultatele obținute ca și variație a conținutului în substantă activă în timp sunt prezentate în tabelul

4.

Tabelul 4. Variația conținutului în principii active pentru extractele de afin și merișor MAE

formulate

Proba

Afin 0% acid citric Afin 1% acid citric Merisor

0% acid citric

Merisor

1% acid citric

Cianidin

mg/g

Ac

clorogenic

µg/g

Cianidin

mg/g

Ac clorogenic

µg/g

Cianidin

mg/g

Ac

clorogenic

µg/g

Cianidin

mg/g

Ac

clorogenic

µg/g

Conditii

stocare 4°C 4°C 4°C 4°C

Tcam

4°C 4°C 4°C 4°C

0 3.23 146.21 3.55 200.80 0.73 35.22 1.22 c

7 0.75 113.51 1.17 113.51 0.73 28.94 0.75 30.46

21 0.87 35.09 1.08 47.85 0.71 27.19 0.74 25.80

30 0.88 23.64 1.00 24.63 0.68 15.36 0.73 15.28

90 0.87 20.15 0.91 23.11 0.63 15.17 0.70 15.16

După cum se poate observa, în acest caz acidul citric contribuie la creterea activității

antiradicalice și la menținerea acesteia în timp. Cel mai bun sistema de stocare este la 4°C, deoarece

atât rezultatele determinărilor efectuate pentru eficiența antiradicalică, TEAC –tabelul 3- cât și

concentrația de compuss activ de interes la care sunt normalizate extráctele de afin și merișor -

tabelul 4- au un trend de stabilizare mai rapidă și pentru valori relativ mai mari ale concentrației în

substanță activă.

B - extractia lichid-lichid și stabilizarea produșilor de extracție.

Pornind de la studiile de extractie si alegerea variantelor optime pentru fiecare material

vegetal, din etapa II, in aceasta etapa au fost elaborate de catre partenerul P2, PLANTAVOREL,

tehnologiile pentru obtinerea extractelor uscate - faza de laborator.

B1.1. Elaborarea tehnologiei de extractie a principiilor active din fructe uscate de

maces, merisor si afin la faza de laborator

Pentru cresterea stabilitatii extractelor lichide din punct de vedere al continutului de principii active,

conservabilitatii (cresterii termenului de valabilitate) si al reducererii dezvoltarii microorganismelor,

in aceasta etapa a fost dezvoltata tehnologia de laborator bazata pe operatia de uscare prin

pulverizare (microîncapsulare). Tehnologia de microîncapsulare este tot mai des utilizata in industria

suplimentelor alimentare cu scopul de a proteja principiile active sensibile la lumină si oxigen si

pentru evitarea degradarii datorate radicalilor liberi. Pentru realizarea acestei metode de stabilizare

sunt utilizati agenti de încapsulare cu următoarele proprietăți: formează rapid sisteme de tip peliculă,

au proprietăți de emulsionare, sunt biodegradabile, rezistente la nivelul tractului gastro-intestinal, cu

vâscozitate și higroscopicitate scăzute si, nu in ultimul rând, un cost scăzut.

Aceatsa tehnologie de stabilizare a extractelor a fost utilizata pentru principiile active polare, care se

găsesc în extractele de măceș, merișor și afine. Pentru microăncapsularea acestor extracte au fost

folosite maltodextrina (DE 19) si un amestec de maltodextrina (DE 19) si aerosil.

Extractele lichide concentrate au fost uscate utilizând un uscător tip spray - Mini Spray Dryer B-

290 Advanced Buchi. In funcție de natura solvenților de extracție Mini Spray Dryerul functionează

în sistem deschis sau sistem închis. Sistemul deschis este folosit dacă probele pentru uscare sunt

apoase (contin maxim 20% solvent organic) și utilizează ca agent purtător aer comprimat. Sistemul

închis este folosit dacă probele conțin amestecuri de solvenți cu 20-90% solventi organici sau

substanțe sensibile la oxigen. Sistemul utilizează ca agent de purtător azotul.

Figura 5. Mini Spray Dryer B-290 Advanced

– uscarea extractului de afine

Figura 6. Extracte uscate de merișor, măceș și

afine

Tehnologia constă în amestecarea extractului concentrat cu materialul suport, care protejează

compușii bioactivi după care amestecul este pulverizat, cu ajutorul aerului comprimat, și uscat

instantaneu cu ajutorul Mini - uscatorului B-290. Se obține astfel un extract pulverulent omogen, cu

higroscopicitate redusă și stabilitate crescută.

Pentru extractele care au un continut ridicat de zaharuri cele mai uzuale materiale suport sunt

maltodextrina, aerosilul, amidonul modificat si guma arabica, utilizate individual sau in amestec.

Parametrii esentiali pentru realizarea procesului de uscare optim sunt: debitul agentului purtator,

temperatura de intrare și de ieșire a agentului de uscare, tipul de suport de atomizare și concentrația

acestuia. Extractele concentrate studiate au un continut de alcool mai mic de 20% ceea ce implică

uscarea in sistem deschis cu aer comprimat drept agent de uscare.

S-au realizat teste de uscare pentru solutiile extractive studiate, cu mentinerea debitului de aer

constant și variatia a temperaturii de intrare a aerului: 140° C, 180° C și 190° C precum și a

concentrației de suport de atomizare, respectiv 15%, 20%, 25% maltodextrina (DE 19).

Pentru uscarea extractelor de măceș și merișor s-a adaugat ca suport un amestec de maltodextrină

(DE 19) și 5% aerosil. Aerosilul a fost adăugat în scopul reținerii compușilor ”grași” (carotenoide,

rășini) prezenți in fructele de măceș si merișor pentru a se evita lipirea extractelor pe pereții

ciclonului și turbinei echipamentului.

S-au stabilit conditiile optime de uscare, prezentate in tabelul urmator:

Tabelul 5. Parametrii si rezultatele uscării prin atomizare

Extract conc Material suport Parametrii de uscare Caracteristici extract

uscat

Tip Caracteristici Denumire Conc.

Temp

intrare,

° C

Temp

iesire,

° C

Debit

agent

de

uscare,

L/h

Debit

solutie,

ml/min

Umiditate

, %

Continut

de p.a,

%, g/g

Măceș

s.u-8.98%;

ac.clorogenic-

0.545%(sol)/

6.06% (su)

Maltodextrina

Aerosil

20

5

180 89 670 5 2.3 1.04

Merișor

s.u.-14.76%;

ac.clorogenic-

0.4%(sol)/3.49%(su)

Maltodextrina

Aerosil

20

5

180 96 670 5 2.2 0.989

Afine

s.u.-11.46%

antociani

0.438%(su)/

3.82%(sol)

Maltodextrina

25 180 99 800 5 1.6 0.900

Diagrama flux a procesului tehnologic de obtinere a extractelor uscate de merișor, afin și măceș este

prezentata in figura 7.

Figura 7. Diagrama flux a procesului tehnologic de obtinere a extractelor uscate

B1.2. Evaluarea produsilor de extractie si stabilizarea principiilor

ANALIZA CANTITATIVA A PRINCIPIILOR ACTIVE DIN EXTRACTELE USCATE DE

MACES, MERISOR SI AFINE

Determinarea continutului de substanta uscata a extractelor concentrate si pierderea prin uscare a

extractelor uscate s-a realizat prin metoda gravimetrica utilizand termobalanta, METTLER

TOLEDO-HG 63.

Continutul de principii active, respectiv antociani totali, exprimat in clorura de cianidin-3-

glucozida si polifenoli totali, exprimat in acid clorogenic s-a determinat cu ajutorul

spectrofotometrelor UV VIS CINTRA si CARY 50 , prin metodele prezentate in etapa a II a.

In aceasta etapa a fost elaborata metoda cantitativa HPTLC – densitometrie, efectuata cu

echipamentul de cromatografie pe strat subtire CAMAG. Prin aceasta metoda au fost determinati

markerii stabiliti pentru exprimarea continutului in polifenoli si antociani totali, respectiv, acid

clorogenic si clorura de cianidin-3-glucozida din cele trei extracte.

Alegerea acidului clorogenic pentru exprimarea continutului de polifenoli totali a fost facuta prin

evaluarea profilului cromatografic HPTLC pentru flavone si polifenoli la cele trei materiale vegetale

si la extractele acestora. Dintre cele trei substante de referinta aplicate (acid cafeic, acid clorogenic și

acid galic) acidul clorogenic se evidențiază cel mai bine ca intensitate și culoare și la acelasi Rf în

probele de plantă și extracte.

Efectuarea determinarii. Pe linia de start a placii cromatografice se aplică un numar de 10 tracuri

cu benzi de 9 mm, la distanta de 6 mm , cu margini (dreapta-stanga) de 28, respectiv 10mm, viteza

de aplicare 8s/µl. Banda/volumul de solutie de referinta aplicat: b2/C-2 µl; b3/C-3 µl; b4/C-4 µl;

b7/C-7 µl.; b8/C-8 µl.; b9/C-9 µl . Banda/volumul de proba aplicat : b1/P1- 5 µl, b5/P2-5 µl, b6/P1-6

µl, b10/P2-10 µl. Placa cromatografica se introduce in bacul de developare saturat 30 minute cu

developantul prezentat si se lasa la migrat pana la inaltimea de 70 mm; Se scoate placa si se usuca la

aer. Se examineaza in vizibil, fara tratament chimic. Evaluarea cantitativă a fost realizată la 542 nm,

multilevel (3 concentrații de standard), funcție de înălțimea picului.

Figura 8. Cromatograma HPTLC a standardului cianidin-3-o-glucozida si a extractului

concentrat de afine: track 1, 5, 6, 10 –extract conc de afine, P1, P2 - volum aplicat 5 μl in 2

replicate ; track 2, 3, 4, 7, 8, 9 - standard cianidine-3-o-glucozida – volum aplicat 2, 3, 4 μl in 2

replicate.

In tabelul 6 sunt prezentate rezultatele obținute pentru extractul concentrat de afine în echivalent

cianindin

Tabelul 6. Concentratia densitometrica a cianidin-3-glucozidei in extractul concentrat de afine

Proba Substanta

uscata,%

Volum

aplicat,

l

Cocentratia de cianidin-

3-glucozida, ng/band

Concentratia de

antociani totali,

UV VIS, %, g/g

Concentratia de

cianidin-3-o-

glucozida, %, mg/g

P1 10.32 5 372.68 2.9 72.19

P2 11.37 5 515.85 3.6 90.76

Extractele de măceș și merișor sunt standardizate și în conținut de acid clorogenic, rezultatele

obținute la determinarea densitometrică a conținutului de acid clorogenic din aceste extracte fiind

prezentate în tabelul 7.

Figura 9. Cromatograme HPTLC dupa developare si derivatizare a standardului ac clorogenic si a

extractelor conc de maces si merisor: track 1,6 –extract conc de maces,(Ma)- volum aplicat 12 μl in 2

replicate; track 5,10 extract conc de merisor,(Me) - volum aplicat 7 μl in 2 replicate ; track 2, 3, 4, 7, 8,

9 - standard ac clorogenic- volum aplicat 4,5,6 μl in 2 replicate.

Tabelul 7. Concentrația densitometrică a acidului clorogenic în extractele concentrate de măceș și

merișor

Proba Substanta

uscata,%

Volum

aplicat,

l

Cocentratia de ac

clorogenic, ng/banda

Concentratia de

polifenoli totali,

UV VIS, %, g/g

Concentratia de ac

clorogenic, %, mg/g

Ma 8,98 12 125,4 6.06 34.91

Me 18,45 7 156.57 2.94 36,36

A3.4. Documentatie brevet tehnologie de extractie MAE (transfer din 2015)

A fost elaborată documentația de brevet pentru Aparat si Procedeu de extracție asistată de microunde

a betacarotenului din morcovi, fiind depusa cererea de brevet numarul A00877/22.11.2016

A3.5. Dezvoltarea de retea de senzori/biosenzori si validarea protocoalelor de analiza pentru

determinarea continutului si activitatii principiilor active la nivel de prototip de laborator –

partea 2 a

3.5.1.Unitatea de biosenzori pentru determinarea conținutului în principii active de tip

polifenoli/antociani

Dezvoltarea retelei de senzori si biosenzori pentru determinarea continutului si activitatii principiilor

active a implicat dezvoltarea de unități independente de biosenzori/senzori așa cum a fost descirs pe

larg în etapa anterioară de execuție a proiectului. Au fost realizate două unități de senzori/biosenzori

electrochimici, amperometrici, una dedicată determinării continutului total în polifenoli și

polifenolimetoxi-substituiți din extractele polare, cealaltă pentru determinarea capacității

antioxidante a extractelor formulate, atât polare cât și nepolare.

In această etapă de realizare a proiectului s-a validat raspunsul unității de biosenzori care dau

conținutul de polifenoli totali, unitate pe baza de lacază, în raport cu răspunsul obținut pentru

aceleași tipuri de extracte prin HPLC-DAD.

Intr-o primă etapă s-a realizat validarea raspunsului biosenzorului în raport cu concentrația de acid

clorogenic determinată prin HPLC-DAD pentru soluții de acid clorogenic standard, cu concentrații

curpinse între 1 µg/mL si 73 µg/mL, variația celor două raspunsuri fiind corelată liniar (vezi figura

10), ceea ce confirmă capabilitatea biosenzorului de a oferi informații fiabile cu privire la continutul

în polifenoli totali exprimat în echivalent acid clorogenic.

Figura 10. Variația relativă a răspunsului biosenzorului pe bază de lacază în raport cu

concentrația de acid clorogenic determinată prin HPLC-DAD pentru soluții de acid clorogenic

standard.

Validarea fezabilității ipotezei privind utilizarea biosenzorilor pe bază de lacază pentru determinarea

polifenolilor și compușilor metoxi-substituiti s-a realizat și pe probe reale, reprezentarea relativă a

concentrațiilor de acid clorogenic determinate prin HPLC-MS si prin utilizarea biosenzorului ca

instrument de măsura pentru extractele MAE de afin și merisor conducând, din nou, la o corelație

liniară intre cele două raspunsuri pentru determinarea echivalentului în acid clorogenic (figrua 11).

Figura 11. Variația relativă a răspunsului biosenzorului pe bază de lacază în raport cu

concentrația de acid clorogenic determinată prin HPLC-MS pentru extractele de afin si

merișor formulate MAE (zilele 1, 21 și 30)

3.5.2. Senzor pe baza de fosfatidil-colina pentru determinarea activitatii antioxidante a compusilor

polifenolici din extractele de plante

S-a continuat optimizarea senzorului construit anterior penyru reducerea interferențelor

electrochimce. Utilizarea mediatorilor redox s-a dovedit ineficientă, astfel încât s-a trecut la

utilizarea unor alte materiale conductive pentru depunerea fosfatidil-colinei, rezultatele obtinute

pentru electrozii cu suport de carbune decorat cu nanoparticule de aur conducând la rezultate similare

cu cele obtinute anterior pentru compușii standard și la artefacte cu valori fals pozitive pentru

probele reale, ceea ce determină necesitatea unei separări selective inainte de introducerea probei

pentru analiza în rețeaua de senzori/biosenzori. Rezultatele pentru unitatea de determinare a

activității antioxidante utilizând fosfatidil colina nefiind satisfacatoare în acest se propune ca variantă

corectivă dezvoltarea unei unități pe baza de DPPH depus, continuandu-se, în același timp, eforturile

pentru optimzarea senzorului pe baza de fosfatidil colina.

3.5.3. Determinarea capacității antioxidante a unor extracte de afine și merișoare folosind o noua

metodă bazată pe utilizarea de nanoceria

Continuandu-se cercetările prinvind realizarea unei retele alternative de nanosenzori bazați pe oxizi

metalici pentru determinarea capacitășii antioxidante a extractelor, în această etapă au fost realizați

nanosenzori bazați pe oxizi de zinc, magneziu, aluminiu și indiu. pe care s-au spotat soluții de

quercetol cu concentrații cuprinse între 10-2

și 10-4

M. In figura 12.E se prezintă imaginea unei hȃrtii

de filtru neimpregnate cu nanooxizi pe care s-au spotat aceleași soluții de quercetol. Din figura 12.

A-D se poate constata că pentru toți nanooxizii studiați se obțin spoturi colorate pentru concentrații

de quercetina cuprinse între 5 x 10-4

si 10-2

M (pentru hȃrtia netratată în prealabil cu soluție de

NaOH) cu excepția oxidului de aluminiu pentru care domeniul de concentrații este cuprins între 10-3

și 10-2

M. In figura 123.E se prezintă imaginea unei hȃrtii de filtru (neimpregnată cu naomateriale) pe

care s-au spotat soluții de quercetol de aceleași concentrații ca cele menționate anterior, în prezența

sau absența unui tratament al hȃrtiei cu soluție de NaOH. Se poate constata că nici una dintre

soluțiile de quercetol folosite nu generează spoturi colorate pe hȃrtia de filtru neimpregnată cu

nanoxizi (o colorație foarte slabă apare pentru concentrația de 10-2

M). Totuși, dacă hȃrtia este tratată

în prealabil cu soluție de hidroxid de sodiu se formează spoturi colorate pentru concentrații de

quercetol cuprinse între 10-3

și 10-2

. M, ceea ce poate interfera apreciabil în determinări. Ținȃnd

seama de acest lucru, în faza actuală s-a renunțat la tratarea în prealabil a hȃrtiei impregnată cu

nanooxizi, cu hidroxid de sodiu. In etapa următoare se va evalua posibilitatea utilizării hidroxidului

de sodiu în scopul analizei unor amestecuri complexe de antioxidanți naturali folosind metoda

descrisă cu nanooxizi.

Figura 12. Imaginea hârtiilor impregnate cu nanoxizi de zinc, magneziu, aluminiu si indiu, pe care s-au

spotulat solutii de quercitina cu concentratii cuprinse inte 5. 10-4 - 10-2 M. (A) oxid de zinc; (B) oxid de

magneziu; (C) oxid de aluminiu; (D) oxid de indiu. Dimensiunile particulelor au fost < 50 nm, cu excepția

celor de oxid de indiu, < 100 nm. Primul rând (notat cu ”- HO-”) din seria fiecărei concentrații sunt probe

aplicate pe hatia impregnata cu nanooxizi. Pe al II-lea rând (notat cu ”+HO-”) din seria corespunzătoare unei

concentrații s-au aplicat mai întâi 10 µL NaOH 1M, apoi solutia de quercitina.

In tabelul 8 se prezintă calitativ rezultatele experimentale obținute la analiza a 18 antioxidanți

prin metoda studiată folosind nanoxizi de zinc, magneziu, aluminiu și indiu. Cele mai bune rezultate

s-au obținut pentru acid cafeic (pe un domeniu restrâns 5 x 10-4

M - 10-3

M), acid rozmarinic, acid

clorogenic, kaemferol și quercetolul (cu glicozidele, rutin si hiperozida). Curcumina s-a evidențiat

prin aceea că a dat spoturi viu colorate și pe hârtia neimpregnată cu nanoxizi, chiar la concentrații

mici (10-4

M) ceea ce face dificilă determinarea acesteia prin metoda cu nanoxizi depuși pe hȃrtie de

filtru. În figura 13 se prezintă exemple de curbe de calibrare pentru câțiva antioxidanți studiați care

pot fi determinați prin metoda studiată.

A B C D E

Tabelul 8. Rezultate experimentale obținute la analiza unor antioxidanți naturali utilizînd nano-oxizi

Figura 13. Curbe de calibrare pentru quercetol obținute la utilizarea unor nanooxizi: A. oxid de

zinc; B. oxid de magneziu; C. oxid de aluminiu. D. oxid de indiu (III).

y = 3,1411x + 15,273 R² = 0,9943 1

/BC

I x 1

000

log concentratie quercetol (M)

y = 1.6037x + 9.5882 R² = 0.9685

1/B

CI

x 1

000

log concentratie quercetol (M)

y = 1,9175x + 10,425 R² = 0,9363

1/B

CI

x 1

000

log concentratie quercetol (M)

y = 1,744x + 10,265 R² = 0,9658

1/B

CI

x 1

000

log concentratie quercetol (M)

A B

C D

A 3.6. Documentatie brevet senzor/biosenzor

A fost depusa documentația de brevet in noiembrie 2015, a fost publicată cererea de brevet A00824

in mai 2016 pentru biosenzor amperometric pentru determinarea compusilor fenolici metoxi-

substituiti.

A.3.7. Model demonstrator extractie MAE – a fost realizat constructiv si este parte a

documentatiei de brevet A00877/2016

CONCLUZII

In aceasta etapa de executie a proiectului HIVEGRES au fost indeplinite toate obiectivele specifice

etapei, rezultatele estimate fiind realizate:

Au fost elaborate tehnologiile de extractie sigura, bazate procedee metoda inovativă, extractia

asistată de camp de microunde pentru beta-caroten din morcovi și pentru antociani și

polifenoli din afin și merișor.

A fost elaborata tehnologia de ontinere a extracteloruscate de afin, maceș și merișor

Au fost dublu standardizate extractele din afin și merisor, la nivel de continut de antociani

(echivalent cianidin) si la nivel de continut de polifenoli (echivalent acid clorogenic).

A fost realizat prototipul de laborator pentru extractorul MAE si a fost depusă o cerere de

brevet de invenție pentru aparat și procedeu de extracție a beta-carotenului din morcovi.

A fost validat răspunsul unitatii de biosenzori pentru conținutul în polifenoli și compuși

polifenolici metoxi-substituiți.

A fost realizata diseminarea rezultatelor obtinute prin depunerea unei cereri de brevet (dosar numarul

00877/2016, publicarea cererii de brevet A00824/2015 in mai 2016), publicarea unui articol in

revista ISI, participarea la 5 conferințe internationale.