Bacillus pallidusD-AI (BpDAI)

Pseudomonas cichoriiD-TE (PcDTE)

Pseudomonas stutzeri L-RhI (PsRhI)

non-rare sugar

Rare sugar

23

D‐seriesL‐series

D‐Glucose

D‐Galactose

D‐PsicoseD‐Allose

D‐Mannitol

D‐Altrose

D‐AltritolD‐Talitol

D‐Talose

D‐Idose

D‐Tagatose

D‐Sorbose

D‐Mannose

D‐Iditol

L‐Idose

L‐ Iditol

Galactitol

Allitol

L‐AlloseL‐Psicose

D‐GulitolL‐Gulcitol

L‐Fructose

L‐Mannitol

L‐Mannose

L‐ Altrose

L‐Tagatose

L‐TalitolL‐Altritol

L‐Talose

L‐Gulose

L‐Sorbose D‐GulcitolL‐Gulitol

L‐Galactose

L‐Glucose D‐Gulose

D‐,L‐series

D‐Fructose

Izumoring

立体構造解析に基づく希少糖生産酵素の反応機構の解明

吉田裕美1, 吉原明秀2, 石井知彦3, 何森 健2,  神鳥成弘1

香川大学 1総合生命科学研究センター, 2希少糖研究センター, 3工学部

STUDY ON CATALYTIC REACTION MECHANISIMS OF ENZYMES FOR RARE SUGAR PRODUCTION BASED ON X-RAY STRUCTURES

Hiromi Yoshida 1, Akihide Yoshihara 2, Tomohiko Ishii 3, Ken Izumori 2, Shigehiro Kamitori 1

1 Life Science Research Center, 2 Rare Sugar Research Center, 3 Faculty of Engineering, Kagawa University

N-terminus→

←C-terminus

共同研究における参加学生 Students from collaborating groups

希少糖生産 Rare sugar production strategy

希少糖研究センター，工学部石井研究室からの参加学生とその共同研究の業績。

Students from collaborating groups, Rare Sugar Research Center (Faculty ofAgriculture) and Prof. Ishii’s lab. (Faculty of Engineering) and their publications.

共同研究による業績 Publication list with collaborating laboratories.1. Yoshida, H., Teraoka, M. Yoshihara, A., Izumori, K. & Kamitori, S. (2011). Overexpression, crystallization and preliminary X-ray diffraction

analysis of L-ribose isomerase from Acinetobacter sp. strain DL-28. Acta Crystallogr. Sect. F 67, 1281-1284.2. Kamitori, S., Ueda, A., Tahara ,Y., Yoshida, H., Ishii, T., Uenishi ,J. (2011) Crystal structures of rare disaccharides, α-d-glucopyranosyl β-d-

psicofuranoside, and α-d-galactopyranosyl β-d-psicofuranoside. Carbohydr. Res., 346, 1182-1185.3. Yoshida, H., Takeda, K., Izumori, K. & Kamitori, S. (2010) Elucidation of the role of Ser329 and the C-terminal region in the catalytic activity

of Pseudomonas stutzeri L-rhanmose isomerase. Protein Eng. Des. Sel., 23, 919-927.4. Takeda, K., Yoshida, H., Izumori, K. & Kamitori, S. (2010). X-ray structures of Bacillus pallidus D-arabinose isomerase and its complex with

L-fucitol. BBA - Proteins and Proteomics, 1804, 1359-1368.5. Yoshida, H., Yamaji, M., Ishi, T., Izumori, K. & Kamitori, S. (2010). Catalytic reaction mechanism of Pseudomonas stutzeri L-rhamnose

isomerase deduced from X-ray structures. FEBS J., 277, 1045-1057.6. Watanabe, Y., Yoshida, H., Takeda, K., Ishii, T. & Kamitori, S. (2009). -D-Altrose. Acta Crystallogr. Sect. E 65, o280.7. Takeda, K., Yoshida, H., Takada, G., Izumori, K. & Kamitori, S. (2008). Overexpression, purification, crystallization and preliminary X-ray

crystal analysis of Bacillus pallidus D-arabinose isomerase. Acta Crystallogr. Sect. F 64, 945-948.8. Yoshida, H., Yamada, M., Nishitani, T., Takada, G., Izumori, K. & Kamitori, S. (2007). Crystal Structures of D-Tagatose 3-Epimerase from

Pseudomonas cichorii and its Complexes with D-Tagatose and D-Fructose. J. Mol. Biol. 374, 443-353.9. Yoshida, H., Yamada, M., Nishitani, T., Takada, G., Izumori, K. & Kamitori, S. (2007). Purification, crystallization and preliminary X-ray

diffraction studies of D-tagatose 3-epimerase from Pseudomonas cichorii. Acta Crystallogr. F 63, 123-125.10. Yoshida, H., Yamada, M., Ohyama, Y., Takada, G., Izumori, K. & Kamitori, S. (2007). The structures of L-rhamnose isomerase from

Pseudomonas stutzeri in complexes with L-rhamnose and D-allose provide insights into broad substrate-specificity. J. Mol. Biol. 365, 1505-1516.

大山祐矢 Y. Ohyama農学部4年生2005.7 - 2006.3（希少糖研究センター）

山地理嗣 M. Yamaji工学研究科修士2年生2006.4 - 2007.3

武田耕青 K. Takeda愛媛大学連合大学院博士3年生2007.4 - 2010.3(希少糖研究センター）

西谷岳頼 T. Nishitani農学部4年生2006.4 -2007.3（希少糖研究センター）

渡部優史 Y. Watanabe工学研究科修士2年生2007.9 - 2009.3

田原康宏 Y. Tahara工学研究科修士2年生2009.4 - 2011.3

茅原静佳 S. Kayahara工学研究科修士1年生2011.4 -

Rare Sugars and Izumoring

工学部 石井研究室からの学生希少糖研究センターからの学生

1. Epimerization

HCOHHOCHR1

R2

R1

R2

3. Reduction

HCOHC=OR1

R2

R1

R2

2. Aldose-ketoseisomerization

HCOHC=OH2COH

R1

HC=O

R1

Rare Sugar Production Strategy by Three Enzymes from a Non-Rare Sugar D-fructose

D-Tagatose 3-epimerase (D-TE)

Pseudomonas cichorii D-Tagatose 3-epimerase(D-TE) catalyzes the epimerization of D-tagatoseto D-sorbose and is also able to epimerizebetween D-fructose and D-psicose.

D-Arabinose isomerase (D-AI)

D-Arabinose isomerase from Bacillus pallidus (D-AI) can catalyze the isomerization between D-arabinose and D-ribulose, L-fucose and L-fuculose and so on.

L-Rhamnose isomerase (L-RhI)L-Rhamnose isomerase from Pseudomonas stutzeri (L-RhI)catalyzes the reversible isomerization of not only L-rhamnoseto L-rhamnulose but also D-psicose to D-allose.

希少糖生産酵素 Enzymes for rare sugar production

単糖とは，糖の基本単位で，炭素原子3つ以上からなるポリヒドロキシアルデヒド（アルドー

ス）あるいはポリヒドロキシケトン（ケトース）である。その構造中，不斉炭素が多くあり，例えば，炭素原子６つからなるアルドースでは，D‐グルコース等のアルドヘキソースで16種，D‐フルクトース等のケトヘキソースで8種，計24種もの立体異性体が存在する。しかしながら，天然に存在する単糖はかぎられており，ヘキソースであれば，D‐グルコース，D‐フルクトース，D‐ガラクトース，D‐マンノースのみが多量に存在し，その他のものは，ごく微量にしか存在が確認でき

ない「希少糖」と呼ばれている。香川大学の希少糖研究センターでは，種々の単糖異性化酵素（エピメラーゼとイソメラーゼ）を用いて，天然に豊富に存在するD‐グルコースおよびD‐フル

クトースから，「希少糖」を大量に生産する技術開発に成功し，現在では，数多くの種類の希少糖が比較的安価で市販されるようになり，希少糖を用いた研究が可能となった。

Monosaccharides are polyhydroxy aldehydes (aldose) or polyhydroxy ketone (ketose)consisting of more than three carbons, being the most basic units of carbohydrates. Thepresence of many chiral centers gives rise to numerous potential stereoisomers.Hexoses, such as glucose, can exist as 16 aldohexose isomers, and as 8 ketohexoseisomers. Among them, D-glucose, D-fructose, D-galactose and D-mannose areabundant, and other hexoses are so-called “rare sugars” which exist in small amountsin nature. Rare Sugar Research Center, Kagawa university, succeeded in developmentof a rare sugar production strategy from D-glucose and D-fructose using enzymes(epimerases and isomerases). Now some of rare sugars can be supplyed as a low-costcommercial product, enabling the research using rare sugars.

希少糖の生産ストラテジーの最初の段階では，D‐フルクトースの3位をエピマー化（不斉炭素のキラリティーを反転）するエピメラーゼを用いてD‐プシ

コースを生産する。次に，ケトース⇔アルドースの異性化を行うイソメラーゼを作用させる。イソメラーゼの種類によってD‐アロースとD‐アルトロースが生じる。このように，エピメラーゼとイソメラーゼを順次作用させて，24種の

立体異性体が生産できる。さらに，それぞれの単糖を化学的に還元することにより10種の糖アルコールが合成でき，合計34種の単糖（ほとんどが希

少糖）生産ストラテジーが提案されている。本研究では，これら希少糖生産に用いられる酵素の立体構造を決定することにより、それらの希少糖を認識する機構および触媒反応機構を解明し，より選択的で効率的な希少糖生産酵素の分子設計を行うことを目指している。

The first step of the rare sugar production strategy is theepimerization of 3-carbon of D-fructose to produce D-psicose usingthe enzyme of 3-epimerase. The next step is the aldose-ketoseisomerization of D-psicose. Depending on the enzymes (isomerases),D-altrose or D-allose can be produced. By the combinations ofepimerization and isomerization of monosaccharides, total of 24stereoisomes of hexose can be obtained. Chemical reductions ofhexoses give 10 sugar alcohols. The X-ray structures of the enzymesfor rare sugar production have been determined to elucidate their raresugar recognition and catalytic reaction mechanisms. Furthermore,we have performed the molecular design for more effective rare sugarproduction based on the structural information.