Reakční kinetika enzymových reakcí;

regulace činnosti enzymů

  invertasa

sacharosa + H2O glukosa + fruktosa

  hexosafosfátisomerasa D-glukosa-6-fosfát D-fruktosa-6-fosfát

Reakční kinetika enzymových reakcí

Časová závislost koncentrace substrátu [S] a produktu [P] monomolekulární přeměny S  P.

k1 = 0,01 s-1, k-1 = 0 s-1 pro případ 1 ("nevratná reakce")

k1 = 0,006 s-1 a k -1 = 0,00375 s-1 pro případ 2 (vratná reakce)

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0 100 200 300 400 500 600

t [s]

[S]

a [P

] [m

ol/l]

1[P]

2[P]

2[S]

1[S]

Reakční kinetika enzymových reakcí

Základní definice: pro náš případ: = -

Základní model: k1 k2

E + S ES(EP) P + E k -1 k -2

 

Zanedbat zpětnou reakci?

k1 k2

E + S ES P + E k-1

vdc

dt

i

i =

.

vd P

dt =

[ ] d S

dt

[ ]

Reakční kinetika enzymových reakcí

monomolekulární přeměna S  P

Další důležité pojmy: definice limitní rychlosti: Vlim = k2 . [Eo]  = číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu  

Katalytická aktivita enzymového preparátu ( množství aktivního enzymu) K čemu to? - kupuji enzym (cena za jednotku) - kolik potřebuji enzymu pro reakci - koncentrace katalytické aktivity (kat/ml) - klin. biochemie Katalytickou aktivitu 1 katalu (1 U) vykazuje enzymový preparát, který za definovaných podmínek (pH, pufr, teplota) při nasycení substrátem přemění 1 mol (1 mol) substrátu za 1 sec (1 min).

V

Ek k

ocat

lim

[ ] 2

počet molů substrátu, které je 1 mol enzymu schopen přeměnit při saturacisubstrátem za jednotku času = kolik molekul substrátu je za stejných podmínek

schopna přeměnit 1 molekula enzymu za jednotku času

když [E0] = [ES]

Číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu

Reakční kinetika enzymových reakcí

Jak určit hodnoty KM a Vlim?

metoda počátečních reakčních rychlostí: závislost vo na [S]

Metoda nelineární regrese:Odhad KM = 1,8 mmol.dm-3 a Vlim = 2,5 mmol.dm-3.min-1

"Správné" hodnoty: KM = 2,04  0,43 mmol.dm-3,

Vlim = 2,04 0,16 mmol.dm-3.min-1

Reakční kinetika enzymových reakcí

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

0 1 2 3 4 5 6

[S] [mmol/l]

v o

[mm

ol/l

/min

]

Michaelisovská závislost počáteční reakční rychlosti na koncentraci

substrátu.

Závislost počáteční reakční rychlosti na pH a teplotě

- následný mechanismus (postupný, sekvenční)

- náhodný - uspořádaný  - "ping-pongový"

E-P + S1 E-P* + P1

E-P* + S2 E-P + P

S1 + S2 P1 + P2

A

E EAB EPQ E E B Q

P

Q

VÍCESUBSTRÁTOVÁ KINETIKA

"ping-pongový„ mechanismus

- positivní homotropní allosterický efekt (allosterické enzymy)- heterotropní allosterický efekt

vV S

K So

n

n=

.[ ]

+ [ ]

lim

"NEMICHAELISOVSKÉ" ENZYMY

Alosterické enzymy

Regulace enzymové aktivity

•na úrovni transkripce a translace (konstitutivní a induktivní)

•pomocí změn kovalentní struktury (řízeno specifickými enzymy)

- nevratné (aktivace štěpením peptidové vazby - proenzymy)

- vratné (fosforylace, adenylace...)

•efektory (aktivátory a inhibitory)

Regulace enzymové aktivity

Regulace enzymové aktivity

INHIBICE:

- nevratná-vratná: a) substrátem b) kompetitivní (competitive) c) akompetitivní (acompetitive) d) nekompetitivní (noncompetitive)

KE I

EII =

[ ].[ ]

[ ]v

V S

KI

KS

o

MI

=.[ ]

. +[ ]

]

lim

[1

KM´ = , V´lim = VlimK

I

KM

I. +

[ ]1

Kompetitivní inhibice

Kompetitivní inhibice

KES I

ESII =

[ ].[ ]

[ ]

Akompetitivní inhibice

v

V

I

K

S

KI

K

So

I

M

I

=

+[ ]

]

+[ ]

]

lim.[

[

1

1

Akompetitivní inhibice

Nekompetitivní inhibice

KE S

ES

EI S

ESIS =

[ ].[ ]

[ ]

].[ ]

[ ]

[

KE I

EI

ES I

ESII =

[ ].[ ]

[ ]

].[ ]

[ ]

[

v

V S

I

KK S

o

IS

=.[ ]

+[ ]

+ [ ]

lim

.1

VI

KI

lim

([ ]

)1V´lim =

Nekompetitivní inhibice

Regulace enzymové aktivity

Allosterická inhibice (aktivace)

PříkladPříklad

Při studiu enzymové reakce byly pro následující výchozí koncentrace substrátu změřeny počáteční rychlosti reakce:

S [mol/dm3] 6,25 .10-6 7,5 . 10-5 1,0 .10-4 1,0 .10-3 1,0 .10-2

vo [nmol/dm3 . min] 15 56,25 60 74,9 75

a) Odhadněte hodnoty Km a Vlim.

b) Jaká bude počáteční rychlost při koncentracích substrátu

2,5 . 10 –5 a 5 . 10-5 mol/dm3 ?

Imobilizace enzymů

Vazba na nosič Zachycení (entrapment)

sorpcí Kovalentní vazbou V matrici geluOpouzdření

(encapsulation)

Imobilizované enzymy

Definice IUPAC - enzymy, které jsou fyzicky ohraničeny nebo lokalizovány, zachovávají si svoji aktivitu a mohou být použity opakovaně a kontinuálně

BiotechnologieBiotechnologie

Definice?

Aplikace biologických vědních oborů a inženýrských disciplin k přímému nebo nepřímému využití živých organismů nebo jejich součástí v jejich přirozené nebo modifikované podobě.

Přednosti:

surovinová základna, energetická nenáročnost, šetrnost k životnímu prostředí

Nevýhody:

Vysoké náklady na V a V, malá efektivnost?

Biotechnologické směryBiotechnologické směry

1. Průmyslová mikrobiologie

a) Fermentační (ethanol, kyselina citronová)

b) Produkty biosynthes (primární a sekundární metabolity, biopolymery),

c) Biotransformace

d) Biomasa

2. Průmyslové biotechnologie

3. Biotechnologie životního prostředí (bioremediace)

4. Živočišné biotechnologie

5. Biotechnologie užitkových rostlin

6. Veterinární a medicínské biotechnologie

Využití enzymů → aplikovaná enzymologieVyužití enzymů → aplikovaná enzymologie

využití enzymů, resp. enzymových systémů, včetně celých buněk:

průmysl potravinářský a nepotravinářský

klinická biochemie (diagnostika a stanovení analytů)

farmaceutika

Technologicky významné enzymy Hydrolasy (80%) – 50% proteasy, 50% glykosidasy Isomerasy GI (12% !) Oxidoreduktasy – (GOD - analytika) Ostatní (5 - 7%)

Zdroje technických preparátů enzymů: Mikrobiální (bakterie a plísně) - extremofilní MO rekombinantní technologieživočišné a rostlinné

PříkladyPříklady Biodetergenty

(proteasy, amylasy, lipasy, celulasy, peroxidasy)

Hydrolýza škrobu (amylasy, GI, transferasy)

Mlékárenství (chymosin)

Hydrolýza proteinů

……. až po „biostoning“ (celulasy)