Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem ... · Prinzip der Fluoreszenz und Durchführung der Messung 5 1.4. Fragestellung der Arbeit 8 2. Materialen und Methoden

Aus der Medizinischen Klinik 1 des Marienhospitals Herne - Universitätsklinik -

der Ruhr-Universität Bochum Kommisarischer Direktor : Prof. Dr. med. Voigtmann

_______________________________________________ Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-

Syndrom und Regulation der Radikalenbildung durch Angiotensin Rezeptoren

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Susanne Stemmler

aus Würzburg 2001

II

Abstract

Stemmler

Susanne

Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-

Syndrom und Regulation der Radikalenbildung durch Angiotensin

Rezeptoren

Reaktive Sauerstoffradikale (ROS) spielen eine wesentliche Rolle bei der

intrazellulären Signaltransduktion. Hohe ROS-Konzentrationen führen aber zu

einer Schädigung von Proteinen, Enzymen oder Transkriptionsfaktoren und

damit zu einer Störung der regulären Zellfunktion bei einer Reihe von

Erkrankungen. Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS)

haben häufig eine arterielle Hypertonie und eine erhöhte kardiovaskuläre

Mortalität. In der Untersuchung sollte jetzt geprüft werden, ob Veränderungen

von intrazellulären ROS bei Patienten mit OSAS vorliegen und welchen Einfluß

Angiotensin AT-2-Rezeptoren bei der Bildung der ROS haben.

Die ROS-Konzentration wurden fluoreszenzspektrophotometrisch in den

mononukleären Leukozyten bestimmt. Innerhalb von 30 Minuten kam es zu

einem spontanen Anstieg von intrazellulären ROS in den mononukleären

Leukozyten von Patienten mit OSAS um 2.8±0.4 (MW ± SEM, n=13) und von

den gesunden Kontrollpersonen um 3.9±0.6 (n=18). Die Stimulation der Zellen

mit Phorbol-myristat-acetat (PMA) führte zu einem Anstieg von intrazellulären

ROS bei Patienten mit OSAS um 10.4±1.6 und bei den gesunden

Kontrollpersonen um 13.8±1.5. Die Vorgabe des Singlet-oxygen-scavengers

Natriumazid, des Peroxynitrit-scavengers Ebselen und des ACE-Hemmers

Captopril führte zu einer signifikanten Verminderung der PMA-stimulierten

intrazellulären ROS-Bildung (jeweils p<0.01). Die Angiotensin AT-2-Rezeptor-

agonisten und der Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist führten ebenfalls zu

einer signifikanten Verminderung der PMA-stimulierten intrazellulären ROS-

Bildung (jeweils p<0.05), der Angiotensin AT-1-Rezeptoragonist und der

Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonist zeigten jedoch keine Wirkung.

Die Arbeit zeigt, daß Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom keine

signifikanten Veränderungen von intrazellulären reaktiven Sauerstoffradikalen

aufweisen. Weiterhin scheint eine Regulation der Bildung von intrazellulären

reaktiven Sauerstoffradikalen über den Angiotensin AT-2-Rezeptor zu erfolgen.

III

.

.

Dekan : Professor Dr. med. G. Muhr

Referent : PD Dr. med. M. Tepel

Koreferent : Frau Professor Dr. med. M. Schläfke

Tag der mündlichen Prüfung : 14.01.2003

IV

Meiner Familie

V

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1. Schlaf-Apnoe Syndrom 1

1.2. Sauerstoffradikale und Calcium 3

1.3. Prinzip der Fluoreszenz und Durchführung der Messung 5

1.4. Fragestellung der Arbeit 8

2. Materialen und Methoden 9

2.1. Patienten und Kontrollpersonen 10

2.2. Blutentnahme, Präparation von mononukleären Leukozyten und

Versuchsablauf 12

2.2.1. Fluoreszenzmessung von reaktiven Sauerstoffradikalen 13

2.2.2. Fluoreszenzmessung von Calcium 13

2.3. Statistik 15

3. Ergebnisse 16

3.1. Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-

Apnoe-Syndrom und bei gesunden Kontrollpersonen 16

3.2. Wirkung von Scavengern und ACE-Hemmern auf die Bildung

reaktiver Sauerstoffradikale 24

3.3. Wirkung am Angiotensinrezeptor 27

3.4. Konzentrationsmessung von Calcium und von reaktive Sauerstoff-

radikalen unter Zugabe verschiedener Sauerstoffradikalstimulatoren

(PMA und Thapsigargin) 32

4. Diskussion 34

5. Zusammenfassung 39

6. Literaturverzeichnis 41

7. Danksagung 48

8. Lebenslauf 49

VI

Abbildungsverzeichnis

Abb.1 : Schematische Darstellung der Entstehung von reaktiven

Sauerstoffradikalen (ROS)

Abb.2 : Entstehung der Fluoreszenz/Emission

Abb.3 : Aufbau eines Fluorometers

Abb.4 : Präparation der mononukleären Leukozyten

Abb.5 : Fluoreszenz-Spektrum des radikalsensitiven Farbstoffes DCF-DA

Abb.6 : Konzentrationsmessung von Natriumazid

Abb.7 : Konzentrationsmessung von Captopril

Abb.8 : Konzentrationsanstieg von ROS über 60 Minuten

Abb.9 : spontane reaktive Sauerstoffradikalbildung von OSAS-Patienten im

Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe

Abb.10 : PMA induzierte ROS-Bildung von OSAS-Patienten im Vergleich zu

einer gesunden Kontrollgruppe

Abb.11 : Wirkung von verschiedenen Substanzen/Scavengern auf die

ROS-Bildung bei Patienten mit OSAS

Abb.12 : Mechanismus der ROS-Bildung über die Angiotensin AT-1 und

AT-2-Rezeptoren

Abb.13 : Wirkung eines Stickstoffmonoxiddonors (SNAP) auf die ROS-

Entwicklung unter dem Einfluß verschiedener Radikalenstimulatoren

Abb.14 : Mechanismus der ROS-Bildung/Calciumionenkonzentration

Tabellenverzeichnis

Tabelle1 : klinische und biochemische Daten von Patienten mit OSAS

und gesunden Kontrollpersonen

1

1. Einleitung

1.1. Schlaf-Apnoe-Syndrom

Die Prävalenz des obstruktiven Schlaf-Apnoe-Syndroms (OSAS) liegt bei ca.

1-2% der Bevölkerung. Hauptsächlich sind Männer zwischen dem 40-60

Lebensjahr betroffen. Bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom

kommt es zu schlafbezogenen Atempausen, die länger als 10 Sekunden

andauern. Der Schlafapnoe-Index (AHI) gibt die Anzahl der Atempausen pro

Stunde an. Dabei sind Werte über 10/h pathologisch.

Zur Diagnosefindung ist die Anamnese (starkes Schnarchen, Kopfschmerzen,

Abgeschlagenheit, Tagesmüdigkeit mit Einschlafneigung und Leistungsknick)

einschließlich der Partnerbefragung von großer Bedeutung. Meßtechnisch wird

als erstes ein Screening mittels ambulantem Schlafmonitoring durchgeführt und

bei Hinweisen auf ein obstruktives Schlaf-Apnoe-Syndrom wird noch zusätzlich

eine polysomnographische Langzeitmessung im Schlaflabor herangezogen.

Während der Atempausen steigt der Streßfaktor bei den Patienten an. Dadurch

werden vermehrt Hormone, z.B. Katecholamine, ausgeschüttet, welche zu einer

Erhöhung des Energieumsatzes führen. Bei Oxidationsreaktionen, z.B. bei der

Gewinnung von ATP, fallen häufig reaktive Sauerstoffradikale (ROS) an. Freie

Radikale verursachen Schäden an biologischen Strukturen, so z.B. bei Lipiden,

Proteinen, Kohlenhydraten oder der DNS. Bei den Lipiden kann es durch die

Einwirkung der reaktiven Sauerstoffradikale zu Peroxidationen ungesättigter

Fettsäuren in Zellmembranen kommen. Bei den Proteinen führt dies zu einer

oxidativen Denaturierung, bei den Kohlenhydraten kommt es zu einer Spaltung

(Depolymerisation) von Polysaccharieden und bei der DNS führt dies zu

Hydroxylierungen von Basen, Strangabbrüchen und Quervernetzungen.

Daher werden verschiedene klinische Zustandsbilder mit freien Sauerstoff-

radikalen als zusätzliches mitverursachendes Agens in Zusammenhang

gebracht, wie z.B. bei Arthritiden, Herzkreislauf-Krankheiten (Herzinfarkt),

Lungenödem, Schock sowie Diabetes mellitus.

Das Risiko für Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom diese

Krankheiten zu bekommen, könnte bei vermehrter reaktiver Sauerstoffradikalen-

Bildung erhöht sein. Es ist klinisch jedoch schwer dies abzugrenzen, da die

2

Patienten meist noch zusätzliche Risikofaktoren für z.B. Herzinfarkt (Diabetes

mellitus, Adipositas, Hypertonie, Rauchen) aufweisen.

Durch die Gewinnung von mononukleären Leukozyten aus dem Blut von

Patienten, kann selektiv in vitro die Sauerstoffradikalenfreisetzung stimuliert und

mittels fluoreszenzspektrophotometrischer Messung bestimmt werden. In einem

zweiten Arbeitsgang kann man unter Zugabe verschiedener Substanzen (z.B.

von Scavengern oder bestimmten Medikamenten) versuchen, die gebildeten

Sauerstoffradikale zu vermindern.

In anderen Studien wurde bereits gezeigt, daß biologische Scavenger vor

Radikalen schützen. So wurde z.B. von Ballmer (Ballmer et al., 1988)

beschrieben, daß Allopurinol durch Blockierung der Xanthinoxidasereaktion die

Bildung von Superoxidradikalanionen (O2-) und von Wasserstoffperoxid (H2O2)

verhindert. Im Tierversuch wurden die postischämisch entstandenen Radikale

vermindert.

Aber auch der Körper selbst verfügt über einige Enzyme, die die reaktiven

Sauerstoffradikalen vermindern können, wie die Superoxiddismutase (SOD), die

Catalase und die Glutathionperoxidase. Treten öfters hypoxische Phasen auf,

kann dies laut Duan (Duan et al., 1998) zu einer Toleranzentwicklung des

Körpers gegenüber diesen Phasen führen, wobei die reaktiven Sauerstoff-

radikale (ROS) und ihre spezifischen Scavengerenzyme eine Rolle spielen.

Die Durchführung von fluoreszenzspektrophotometischen Bestimmungen

unterschiedlichster Art wird seit vielen Jahren angewandt. Es können direkt

fluoreszierende Substanzen aber auch mit einem Fluoreszenzfarbstoff

angefärbte Substanzen gemessen werden. So wendeten bereits Orie (Orie et al.,

1999), Nofer (Nofer et al., 1999) und Neusser (Neusser et al., 1999) die Methode

der Fluoreszenzspektrophotometrie für ihre Studien an.

3

1.2. Sauerstoffradikale und Calcium

Unter " Radikal " versteht man eine atomare oder molekulare Einheit, die ein

oder mehrere ungepaarte Elektronen auf der äußeren Hülle besitzen. Radikale

können andere Moleküle durch Entzug eines Elektrons oxidativ schädigen. So

kann z.B. die DNA verändert werden.

Reaktive Sauerstoffradikale mit potentiell schädigender Wirkung sind das

Superoxidradikal Anion (O2-), das Hydroxylradikal (OH⋅), das Wasserstoffperoxid-

molekül (H2O2), verschiedene Superoxidradikale (RO⋅, R = Fettsäure) und der

Singulettsauerstoff (1/2 O2).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Entstehung freier Sauerstoffradikale

und des Wirkortes der Enzyme, welche eine "Scavenger" Funktion haben, von

Pfaffendorf aus " Sauerstoffradikale und Arteriosklerose "

Sauerstoffradikale können im Körper große Schäden auslösen, so verursachen

sie eine Depolymerisation von Bindegewebe, Denaturierung von Enzymen,

Schädigung von Zellmembranen mit Gefäßpermeabilitätsveränderungen und

nachfolgender Zellschädigung (Man kennt diesen Vorgang auch als "ranzig-

werden" von Fetten und Ölen). Ist die DNS mitbetroffen, so geht die Zelle

zugrunde oder aber es treten Strangabbrüche mit der Gefahr der fehlerhaften

Reparatur und der Begünstigung von Mutationen auf. Dieser Mechanismus ist für

4

die krebserregende, aber auch für die therapeutisch genutzte zellzerstörende

Wirkung energiereicher Strahlung und einiger Zytostatika verantwortlich. So

bilden z.B. die Zytostatika Bleomycin und Doxorubicin in vitro und in vivo spontan

Radikale. Durch die energiereiche Strahlung entstehen z.B. durch homolytische

Spaltung von Wasser ein Hydrogen- und ein Hydroxydradikal.

Andererseits nutzt der Körper aber auch die freien Radikale, so z.B. zur Abwehr

von Krankheitserregern. Makrophagen bilden während der Phagozytose große

Mengen an Superoxidradikal Anionen. Die Bedeutung für das menschliche

Leben wurde erst in den letzten Jahren im vollen Umfang erfaßt.

Die intrazelluläre Calciumregulation spielt eine große Rolle bei dem Ablauf

entscheidender zellulärer Prozesse, wie bei verschiedenen Metabolismen, der

Proliferation, der Proteinbiosynthese sowie bei exokrinen und endokrinen Funk-

tionen. Im Zytoplasma liegt eine Calciumionenkonzentration von ca. 0,01-

0,1µmol/l vor. Dies ist eine um mehrere Größenordnungen niedrigere Konzen-

tration als im Plasma, wo die Calciumionen etwa zur Hälfte an Proteinen

gebunden und zur anderen Hälfte in freier Form vorliegen. Durch primär-aktiven

Transport und sekundär-aktiven Gegentransport werden die Calciumionen aus

der Zelle ausgeschleußt. Der Einstrom erfolgt zum einen passiv (durch das

Konzentrationsgefälle) und zum anderen aktiv durch z.B. Aktionspotentiale oder

über second messengers. Durch die äußeren Reize werden die Calciumkanäle

vorübergehend geöffnet, die Calciumionen binden an bestimmte Proteine und

lösen so in der Zelle eine Reaktion aus.

5

1.3. Prinzip der Fluoreszenz und Durchführung der Messung

Manche Moleküle können Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbieren.

Dabei wird ein Außenelektron eines bestimmten Atoms in ein höheres

Energieniveau angehoben. Kehrt dieses Elektron wieder auf sein Ausgangs-

niveau zurück, gibt es einen Teil der Energie in Wärme und einen Teil in Licht

längerer Wellenlänge (geringere Frequenz) und somit geringerer Energie ab

(Emission/Fluoreszenz). Dies geschieht nach außerordentlich kurzer Zeit.

Abbildung 2: Entstehung der Fluoreszenzstrahlung / Emission, von Kaiser und

Henning aus physikalischer Chemie

A-B : Ein Elektron absorbiert Energie und geht damit vom Zustand A nach B

über

B-C : Die aufgenommene Energie wird schnell wieder abgegeben. Dies

geschieht teilweise als Wärme

C-D : und teilweise als energieärmeres Licht

Die Fluoreszenz wird mit bestimmten Meßinstrumenten (z.B. Fluoreszenz-

Spektrophotometer) nachgehalten. Je mehr Moleküle eines fluoreszierenden

Stoffes in einer Probe vorhanden sind, um so mehr Licht wird absorbiert und um

so höher ist daraufhin die Emission/Fluoreszenz. Die Intensität der Fluoreszenz

kann dann umgerechnet werden und damit die Konzentration der jeweiligen

Stoffe ermittelt werden.

Das Licht, mit dem die Fluoreszenz angeregt wird, heißt Primärstrahlung, das

durch die Fluoreszenz erzeugte Licht nennt man Sekundärstrahlung.

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Die Fluoreszenzspektrophotometrie ist eine Methode, mit der unter anderem

Blutbestanteile und deren Reaktion auf bestimmte Reize in definierter

Versuchsanordnung untersucht werden können. Zur Aussendung der Primär-

strahlung wird hier eine Xenon-Lampe benutzt. Die von der Xenon-Lampe

ausgehende Strahlung tritt durch einen Filter (Exzitationsfilter), der nur für

Strahlung einer definierten Wellenlänge durchlässig ist, und trifft dann als

sogenannte Exzitationsstrahlung auf die Probe. Diese regt die Moleküle in der

Probe in einen höheren Energiezustand an, der jedoch nicht stabil ist. Die

angeregten Moleküle geben ihre zusätzliche Energie ab, teilweise in Wärme und

teilweise indem sie Strahlung aussenden, und gelangen somit in ihr

Ausgangsniveau zurück (Fluoreszenz). Diese Strahlung gelangt durch einen

Emissionsfilter, der wiederum nur eine bestimmte Wellenlänge passieren läßt.

Diese trifft dann auf einen Detektor, der die Strahlung registriert.

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Abbildung 3: Aufbau eines Fluorometers, von K. Dörner aus Klinische Chemie.

Das Licht einer Xenon-Lampe tritt durch einen Exzitationsfilter, der nur für

Strahlung einer definierten Wellenlänge durchlässig ist, und trifft dann als

sogenannte Exzitationsstrahlung auf die Probe. Dies regt die Moleküle in der

Probe in einen höheren Energiezustand an, der jedoch nicht stabil ist. Die

angeregten Moleküle geben ihre zusätzliche Energie ab, teilweise in Wärme und

teilweise indem sie Strahlung aussenden, und gelangen somit in ihr

Ausgangsniveau zurück (Fluoreszenz). Diese Strahlung gelangt durch einen

Emissionsfilter, der wiederum nur eine bestimmte Wellenlänge passieren läßt.

Diese trifft dann auf einen Detektor, der die Strahlung registriert.

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1.4. Fragestellung der Arbeit

Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom weisen vermehrte, längere

nächtliche Atempausen auf. Dabei stellt sich die Frage: Kommt es durch diesen

Sachverhalt zu einer vermehrten oxidativen Schädigung des Gewebes durch

erhöhte reaktive Sauerstoffradikalenbildung?

In der Arbeit wurden folgende Fragestellungen bearbeitet:

1. Bestehen Veränderungen der Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen

(ROS) in mononukleären Leukozyten bei Patienten mit obstruktiver Schlaf-

Apnoe-Syndrom im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen?

2. Wie verändern ROS-Scavenger oder Angiotensin Converting Enzym

Inhibitoren die Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen in mononu-

kleären Leukozyten?

3. Über welchen Mechanismus führen Angiotensin Converting Enzym

Inhibitoren zu einer Hemmung der ROS-Bildung in mononukleären

Leukozyten?

4. Besteht ein Zusammenhang zwischen der Bildung von reaktiven

Sauerstoffradikalen und der Steigerung der intrazellulären freien

Calciumionenkonzentration?

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2. Materialien und Methoden

Die reaktive Sauerstoffradikalenbildung (ROS) wurde fluoreszenzspektrophoto-

metisch mit dem Fluoreszenz-Spektrometer F 2000 in den mononukleären

Leukozyten von Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) und

von gesunden Kontrollpersonen gemessen. Die Untersuchungen wurde bei 13

Patienten mit OSAS und bei 18 gesunden Kontrollpersonen durchgeführt.

Desweiteren wurden Messungen zur Frage der Angriffspunkte der reaktiven

Sauerstoffradikale an der Zelloberfläche (z.B. am Angiotensin Subtyp AT-1- und

AT-2 Rezeptor), zur Reduktion der intrazellulären ROS-Konzentration sowie zur

Bestimmung der intrazellulären Calciumionenkonzentration vorgenommen.

Als intrazelluläre Farbstoffe wurde 2.7.-Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA)

zur reaktiven Sauerstoffradikalenmessung und 1-[2-(5-Carboxyoxazol-2-yl-6-

aminobenzofuran-5-oxyl]-2´amino-5´-methylphenoxy-ethan-N,N,N´,N´-tetraessig-

säure (Fura-2) zur Calciumionenkonzentrationsmessung verwendet. Zur

Sauerstoffradikalenstimulation wurde entweder Phorbol-myristat-acetat (PMA)

oder Thapsigargin zu der jeweiligen Probe hinzugegeben. Gemessen wurde bei

einer Emissionswellenlänge von 534nm und einer Exzitationswellenlänge von

488nm über einen Zeitraum von 60 Sekunden nach 0, 30 und 60 Minuten

Einwirkzeit der zugegebenen Substanzen (ROS-Bildung) sowie bei einer

Emissionswellenlänge von 510nm und einer Exzitationswellenlänge von 340nm

und 380nm über einen Zeitraum von 400 Sekunden nach 2 Minuten Einwirkzeit

der zugegebenen Substanzen. Gleichzeitig wurde bei jeder Messung eine

Eichung mit Ionomycin und EGTA durchgeführt (Calciumionenkonzentration).

10

2.1. Patienten und Kontrollpersonen

Es wurden insgesamt 13 Patienten im Alter von 32 bis 68 Jahren mit gesichertem

obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom untersucht. Durch eine Polysomnographie-

untersuchung im Schlaflabor wurde die Diagnose bestätigt. Zur klinischen und

biochemischen Charakterisierung der Patienten wurden verschiedene Daten z.B.

Lebensalter, Blutdruck/arterielle Hypertonie, Puls, einige Laborwerte und der

Bodymass-Index (BMI) gemessen, statistisch ausgewertet und gegen die Daten

der gesunden Kontrollpersonen in einer Tabelle eingetragen (Tabelle1). Die

Daten sind Durchschnittswerte der einzelnen Parameter für das jeweilige

Kollektiv.

Als Kontrollgruppe wurden 18 gesunde Personen im Alter von 24 bis 85 Jahren

untersucht. Auch bei diesen Personen wurden klinische und biochemische Daten

erhoben, die in Tabelle1 zusammengefaßt sind.

11

Tabelle1: Klinische und biochemische Daten von Patienten mit obstruktivem

Schlaf-Apnoe-Syndrom im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen

Patienten mit OSAS Gesunde Kontrollperson

Alter (Jahre) 53,8±10,0 51,1±20,6

Anzahl 13 18

Bodymass-Index (kg/m2) 33,2±5,0 23,2±3,7

Puls (Schläge/Minute) 75±9,3 85±22,8

Blutdruck

Systolisch (mmHg) * 128±17,6 130±16,9

Diastolisch (mmHg) * 76±9,2 75±10,4

Leukozyten (g/l) 5,7±1,0 9,4±3,7

Hämoglobin (g/dl) 15,4±0,9 13,5±2,1

Thrombozyten (g/l) 222±37,0 263±66,3

Kreatinin (mg/dl) 0,84±0,1 1,91±1,7

Harnstoff (mg/dl) 37±4,3 61±32,8

Calcium (mmol/l) 2,30±0,1 2,39±0,2

Kalium (mmol/l) 4,1±0,4 4,23±0,5

Natrium (mmol/l) 141±2,5 138±3,0

Hypertonie (%) 53,8 16,7

Koronare Herzkrankheit (%) 23,1 11

Diabetes mellitus (%) 8,0 33

Raucher (%) 23,1 11

* bei arterieller Hypertonie mit Antihypertonika eingestellt

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2.2. Blutentnahme, Präparation von mononukleären Leukozyten und

Versuchsablauf

Es wurden jeweils 15-20ml Vollblut bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-

Syndrom (OSAS) sowie bei gesunden Kontrollpersonen entnommen und zur

Gerinnungshemmung mit 1ml Heparin (Heparin-Natrium von Merck, Darmstadt)

versetzt. Zur Präparation der mononukleären Leukozyten wurde das Vollblut 15

Minuten bei 2000U/min mit der Zentrifuge von Heraeus (Heraeus Holding GmbH)

zentrifugiert , das überstehende Plasma verworfen und die Zellen 1:1 mit HBSS-

Lösung (Hund´s balanced salt sodium mit: Natriumchlorid, 7,94g/L,

Kaliumchlorid, 0,40g/L, Kaliumdihydrogenphosphat, 0,06g/L, D-Glucose, 1,0g/L,

Calciumchlorid, 0,147g/L, Hepes, 2,383g/L, Natriumdihydrogenphosphat, 0,06g/L

und Magnesiumchlorid, 0,203g/L bei einem pH-Wert von 7,40) vermischt. Nun

wurde jeweils 3ml Histopaque (Sigma-Aldrich Company, Taufbeuren) in einem

Reagenzglas vorgelegt, 5ml der Blut/HBSS-Mischung darübergeschichtet und

erneut 15 Minuten bei 2000U/min. zentrifugiert. Dadurch wurden die Leukozyten

von den übrigen Blutzellen getrennt und konnten mittels einer Pipette isoliert

werden.

Blutprobe

↓ +Heparin

↓ +Zentrifugation

Blutzellen

↓ +HBSS 1:1

↓ +Histopaque

↓ +Zentrifugation

mononukleäre Leukozyten

Abbildung 4: Präparation der mononukleären Leukozyten

13

2.2.1. Fluoreszenzmessung von reaktiven Sauerstoffradikalen

Nach dem Waschen der mononukleären Leukozyten wurden diese mit 2ml

HBSS-Lösung aufsuspendiert, mit 20µl DCF-DA (2.7.-Dichlorofluorescein-

diacetat) gefärbt und für 20 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach

erneuter Zentrifugation bei 2000U/min für 5 Minuten und Isolation der

mononukleären Leukozyten wurden diese mit 12ml HBSS versetzt, jeweils 1ml

der Suspension in eine 10x10mm Quarzglasküvette von der Firma Helma

gegeben, die zumessende Substanz zugegeben und nach 0, 30 und 60 Minuten

wurde die Probe fluoreszenzspektrophotometrisch (Fluoreszenz-Spektrometer F

2000 Hitachi Ltd. Tokyo, Japan) in einem Intervall von 2 Hz über 60 Sekunden

bei einer Exzitationswellenlänge von 488nm und einer Emissionswellenlänge von

534nm gemessen.

2.2.2. Fluoreszenzmessung von Calcium

Bei dieser Messung wurden die mononukleären Leukozyten nach dem Waschen

mit 2ml HBSS-Lösung aufsuspendiert und mit 20µl des Farbstoffes Fura-2 ( 1-[2-

(5-Carboxyoxazol-2-yl-6-aminobenzofuran-5-oxyl]-2´amino-5´-methylphenoxy-

ethan-N,N,N´,N´-tetraessigsäure ) und 10µl Pluronic versetzt und für 45 Minuten

bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach der Zentrifugation für 5 Minuten bei

2000U/min und der Isolation der mononukleären Leukozyten wurde das

Reagenzglas mit 12ml HBSS aufgefüllt, je 1ml dieser Suspension in eine

10x10mm Quarzglasküvette gegeben und über 400 Sekunden mit einem Intervall

von 0,5 Sekunden bei den beiden wechselden Exzitationswellenlänge von 340

und 380nm und einer Emissionswellenlänge von 510nm gemessen.

Die jeweilige Substanzzugabe erfolgte 2 Minuten vor Meßbeginn. 50 Sekunden

nach dem Start der Messung wurden 10µl Phorbol-myristat-acetat (PMA), 150

Sekunden später, zur Eichung der Messung, 10µl Ionomycin und weitere 100

Sekunden danach 50µl EGTA hinzugegeben. Auch hier wurde das Fluoreszenz-

Spektrometer F2000 Hitachi Ltd. verwendet.

14

Abbildung 5: Fluoreszenz-Spektrum des Radikal-sensitiven Farbstoffes 2.7-

Dichlorofluorescein. Die Fluoreszenz von DCF wurde bei 534nm mit einer

Exzitationswellenlänge von 400nm bis 520nm gemessen nach Zugabe von

steigenden Konzentrationen von Wasserstoffperoxid. Die eingefügte Abbildung

zeigt die Fluoreszenz bei 534nm bei einer Exzitationswellenlänge von 488nm in

Abhängigkeit der Wasserstoffperoxid-Konzentration.

400 450 5000

1000

2000

3000

Excitation (nm)

Fluo

resc

ence

(arb

itrar

y un

its)

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

1000

2000

3000

H2O2 (g/dL)

15

2.3. Statistik

Zum Vergleich der Ergebnisse wurde der U-Test von Wilcoxon, Mann und

Whitney benutzt. Dieser Test für unverbundene Stichproben ist verteilungs-

unabhängig. Man bringt die (m+n) Stichprobenwerte in einer gemeinsamen

aufsteigenden Rangfolge. Die Summe der Rangzahlen von Stichprobe 1 sei R1,

die von Stichprobe 2 sei R2.

U1=mxn+0,5xmx(m+1)-R1

U2=mxn+0,5xnx(n+1)-R2

U1+U2=mxn

Die Nullhypothese wird verworfen, wenn U als der kleinere Wert von U1 und U2

kleiner oder gleich dem tabellierten kritischen Wert U (m,n;a) ist.

Die statistische Auswertung erfolgte mit der Computer Software Graph Pad

Prism Version 3,0 (Graph Pad, San Diego, USA).

Die Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwertes

(SEM).

16

3. Ergebnisse

Zum einen wurde in dieser Arbeit untersucht, ob ein Unterschied in der reaktiven

Sauerstoffradikalenbildung (ROS) von Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-

Syndrom (OSAS) und einer gesunden Kontrollgruppe besteht. Zum anderen

wurden verschiedene Substanzen getestet, die die Sauerstoffradikalenbildung

hemmen oder fördern könnten, um so einen möglichen Reaktionsmechanismus

und/oder -weg herauszufinden (insbesondere den Reaktionsmechanismus über

den Angiotensin Subtyp AT-1- und AT-2-Rezeptor) und als dritte Untersuchung

wurde der Calciumgehalt in den mononukleären Leukozyten gemessen.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden in mehreren Abbildungen

gegliedert. Bei den einzelnen Messungen wurde die gemessene Fluoreszenz

meist zu einem Kontrollwert in Relation gesetzt (entweder zu den mit Phorbol-

myristat-acetat (PMA) stimulierten mononukleären Leukozyten oder zu der

spontanen reaktiven Sauerstoffradikalen(ROS)-Entwicklung [ohne Stimulation]).

Dabei wurde der Kontrollwert als 100% gewertet und die jeweiligen Ergebnisse

im Verhältnis dazu gesehen.

3.1. Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-

Apnoe-Syndrom und bei gesunden Kontrollpersonen

Um die benötigte Konzentration zur maximalen Hemmung der reaktiven

Sauerstoffradikalenbildung (ROS) in mononukleären Leukozyten herauszufinden,

wurden den Proben unterschiedliche Konzentrationen der jeweiligen Substanz,

hier als Beispiel Captopril und Natriumazid (NaN3), zugegeben. Es wurden

jeweils eine Kontrollmessung ohne Substanzzugabe und 6 Messungen mit

steigender Konzentration unter Stimulation mit dem Radikalenbildner Phorbol-

myristat-acetat (PMA) durchgeführt.

Abbildung 6 zeigt die Natriumazidmessung (n=6). Es wurden Endkonzen-

trationen von 0,01 bis 1,0µmol/L eingesetzt. Die maximale Hemmung der

reaktiven Sauerstoffradikalenbildung (ROS) nach Stimulierung mit 10µmol/L

Phorbol-myristat-acetat (PMA) wurde bei einer Endkonzentration von ca.

0,1µmol/L erreicht. Die PMA induzierte ROS-Bildung ließ sich auf 29,3%±3,1%

nach 60 Minuten vermindern.

17

Abbildung 7 zeigt die Messung mit Captopril (n=6). Es wurden Endkonzentra-

tionen von 0,1 bis 10,0µmol/L eingesetzt. Die maximale Hemmung der ROS-

Bildung nach Stimulierung mit 10µmol/L PMA wurde bei einer Endkonzentration

von ca. 5,0µmol/L erreicht. Die PMA induzierte ROS-Bildung ließ sich auf

65,4%±4,6% nach 60 Minuten vermindern.

Um zu zeigen, das die gemessene reaktive Sauerstoffradikalen-Bildung in den

mononukleären Leukozyten geschieht, erfolgten Leermessungen. Dabei wurde

einerseits HBSS und andererseits Plasma mit dem Farbstoff Dichlorofluorescein-

diacetat (DCF-DA) versetzt und die reaktive Sauerstoffradikalen-Bildung (ROS)

über 1 Stunde kontrolliert. Es konnte weder bei der HBSS- noch bei der

Plasmamessung ein Anstieg der reaktiven Sauerstoffradikale (ROS) festgestellt

werden. Daher ist davon auszugehen, daß der ROS-Anstieg in den Proben in

den mononukleären Leukozyten stattfindet.

18

Abbildung 6: Konzentrationsabhängigikeit der Verminderung der Phorbol-

myristat-acetat (PMA) induzierten Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen

(ROS) in mononukleären Leukozyten durch Natriumazid (n=6). Die Messung von

ROS in mononukleären Leukozyten erfolgte fluoreszenzspektrophotometrisch mit

Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA). Die Veränderungen

der Fluoreszenz nach Zugabe von 10 µmol/L PMA über 60 Minuten wurden

gemessen und als 100% dargestellt. Die Veränderungen der Fluoreszenz nach

Zugabe von 10 µmol/L PMA bei Anwesenheit von steigenden Konzentrationen

von Natriumazid (NaN3) sind dargestellt.

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

25

50

75

100

[NaN3] (µmol/L)

RO

S (%

of c

ontr

ol)

19

Abbildung 7: Konzentrationsabhängigkeit der Verminderung der Phorbol-

myristat-acetat (PMA) induzierten Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen

(ROS) in mononukleären Leukozyten durch Captopril (n=6). Die Messung von

ROS in mononukleären Leukozyten erfolgte fluoreszenzspektrophotometrisch mit

Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA). Die Veränderungen

der Fluoreszenz nach Zugabe von 10µmol/L PMA über 60 Minuten wurden

gemessen und als 100% dargestellt. Die Veränderungen der Fluoreszenz nach

Zugabe von 10µmol/L PMA bei Anwesenheit von steigenden Konzentrationen

von Captopril sind dargestellt.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.00

25

50

75

100

[Captopril] (µmol/L)

RO

S (%

of c

ontr

ol)

20

Die fluoreszenzspektrophotometrische Messung von Patienten mit obstruktivem

Schlaf-Apnoe-Syndrom und von den gesunden Kontrollpersonen wurde jeweils

über 60 Minuten beobachtet. Dabei wurde jede Probe 3 Mal (nach 0, 30, 60

Minuten) für je 60 Sekunden in das Fluoreszenzspektrophotophotometer

eingebracht und die gemessene Fluoreszenz gemittelt. Dabei konnte ein

kontinuierlicher Anstieg der reaktiven Sauerstoffradikale (ROS) über 60 Minuten

nachgewiesen werden.

In Abbildung 8 ist die kontinuierliche ROS-Entstehung wahlweise für die

Substanzen Phorbol-myristat-acetat (PMA), Captopril plus PMA und Natriumazid

(NaN3) plus PMA dargestellt (n=13). Es wurde jeweils eine Endkonzentration von

10µmol/L PMA und Captopril sowie von 1µmol/L Natriumazid eingesetzt.

In Abbildung 9 und 10 ist die reaktive Sauerstoffradikalenbildung in den

mononukleären Leukozyten von Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-

Syndrom (n=13) gegen die der gesunden Kontrollpersonen (n=18) im direkten

Vergleich aufgetragen. Dabei zeigt Abbildung 9 die spontane und Abbildung 10

die mit Phorbol-myristat-acetat (PMA) induzierte Radikalbildung. Es erfolgte ein

spontaner Anstieg der intrazellulären ROS-Konzentration in den mononukleären

Leukozyten nach 30 Minuten von 2,8±0,4 bei den Patienten mit OSAS sowie von

3,9±0,6 bei den gesunden Kontrollpersonen. Nach Zugabe von 10ml PMA zeigte

sich ein Anstieg der intrazellulären ROS-Konzentration nach 30 Minuten von

10,4±1,6 bei den Patienten mit OSAS sowie von 13,8±1,5 bei den gesunden

Kontrollpersonen. In keiner der beiden Meßreihen konnte ein signifikanter

Unterschied zwischen den beiden Gruppen gezeigt werden.

21

Abbildung 8: Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) in

mononukleären Leukozyten (n=13). Die ROS Bildung wurde nach Stimulation mit

10 µmol/L Phorbol-myristat-acetat (PMA) fluoreszenzspektrophotometrisch mit

Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA) bestimmt. Die

Originalabbildung zeigt den typischen Verlauf bei Anwesenheit von PMA, PMA

plus Natriumazid (NaN3) und PMA plus Captopril.

0

1000

2000

10 min

Fluo

resc

ence

(arb

itrar

y un

its) PMA

PMA+Captopril

PMA+NaN3

22


mononukleären Leukozyten. Es wurde die spontane ROS Entwicklung (ohne

Stimulation) über einen Zeitraum von 60 Minuten fluoreszenzspektrophoto-

metrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA)

bestimmt. Die Abbildung zeigt den Vergleich der ROS-Bildung von Patienten mit

obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS, n=13) zu einer gesunden

Kontrollgruppe (Control, n=18). Der Ausgangswert der ROS-Konzentration ist mit

100% angesetzt.

Control OSAS0

250

500R

OS-

incr

ease

(%)

23


mononukleären Leukozyten. Die ROS-Bildung wurde nach Stimulation mit

10µmol/L Phorbol-myristat-acetat (PMA) fluoreszenzspektrophotometrisch in

einem Zeitraum von 60 Minuten mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluorescein-

diacetat (DCF-DA) bestimmt. Die Abbildung zeigt die ROS-Bildung bei Patienten

mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS, n=13) im Vergleich zu einer

gesunden Kontrollgruppe (Control, n=18). Der Ausgangswert der ROS-

Konzentration ist mit 100% angesetzt.

Control OSAS0

500

1000

1500

PMA

-ind

uced

RO

S-in

crea

se (%

)

24

3.2. Wirkung von Scavengern und ACE-Hemmern auf die Bildung

reaktiver Sauerstoffradikale

Zur Überprüfung der gefundenen Werte sowie zur fraglichen Unterscheidung von

Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom gegenüber den gesunden

Kontrollpersonen in der Bildung von unterschiedlichen reaktiven

Sauerstoffradikalen wurden einige Substanzen den Proben zugesetzt, die

bekanntermaßen die Bildung bestimmter Sauerstoffradikalengruppen

unterdrücken.

Die Superoxiddismutase (SOD) führt zu einer verminderten Konzentration des

Superoxidradikal Anions (O2-), die Catalase führt zu einer verminderten

Konzentration des Wasserstoffperoxidmoleküls (H2O2), Natriumazid (NaN3) führt

zu einer verminderten Konzentration von Singulettsauerstoff (1/2 O2) und

Ebselen führt zu einer verminderten Konzentration von Peroxinitrit (ONOO-).

Ro-32 (2-[8 [(Dimethylamino)methyl]-6,7,8,9-tetrahydropyrido[1,2-a]indol-3-yl)-3-

(methyl-1H-indol-3yl)maleimide, HCl) wurde als Hemmstoff der Protein Kinase C

und Tyrphostin als Hemmstoff der Tyrphostin Kinase eingesetzt.

Außerdem wurde bei dem Vergleich von Patienten mit obstruktivem Schlaf-

Apnoe-Syndrom und von gesunden Kontrollpersonen noch die als Medikamente

verwendeten Angiotensin Converting Enzym Hemmer (ACE-Hemmer) Captopril

und Ramiprilat sowie der Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist Losartan (mit

Exp3174 als pharmakologisch aktivem Metaboliten) mit untersucht.

In Abbildung 11 und teilweise in Abbildung 12 sind die jeweiligen Gruppen nach

Zugabe einiger Scavenger-Substanzen und einiger Medikamente dargestellt.

Hier konnte sowohl in der Gruppe der Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-

Syndrom (OSAS), Abbildung 11 (n=13), als auch in der Gruppe der gesunden

Kontrollpersonen, Abbildung 12 (n=6-18), eine Verringerung der reaktiven

Sauerstoffradikale (ROS) 60 Minuten nach Zugabe von Dimethylsulfoxid

(DMSO), Natriumazid (NaN3) , Ebselen, des Protein Kinase Inhibitors Tyrphostin,

des Protein Kinase C Inhibitors Ro-32, der ACE-Hemmer Captopril und

Ramiprilat und des Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174

25

nachgewiesen werden. Da Exp3174 kaum wasserlöslich ist, wurde DMSO als

Lösungsmittel verwendet und das Ergebnis in Relation zu DMSO gewertet.

Bei den Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) zeigte sich

eine Verminderung der reaktiven Sauerstoffradikalenkonzentration (ROS) nach

Zugabe von DMSO auf 48,3%±3,0%, von NaN3 auf 29,3%±3,1%, von Ebselen

auf 54,1%±3,7%, von Tyrphostin auf 60,8%±4,5%, von Ro-32 auf 26,4%±4,1%,

von Captopril auf 65,4%±4,6%, von Ramiprilat auf 78,5%±5,4% und von

Exp3174 auf 53,0%±10,6% (28,7%±10,6%) in Bezug auf den Kontrollwert

(jeweils p< 0,02).

Bei den gesunden Kontrollpersonen ging die ROS-Konzentration nach Zugabe

von DMSO auf 49,2%±4,5%, von NaN3 auf 25,1%±2,3%, von Ebselen auf

55,0%±4,3%, von Tyrphostin auf 59,2%±5,8%, von Ro-32 auf 20,3%±3,1%, von

Captopril auf 67,2%±5,6%, von Ramiprilat auf 71,7%±3,6% und von Exp3174 auf

63,0%±5,3% (31,0%±5,3%) in Bezug auf den Kontrollwert zurück (jeweils

p<0.02).

Im direkten Vergleich der beiden Gruppen konnte kein signifikanter Unterschied

festgestellt werden.

26

Abbildung 11: Wirkung des Superoxid Anion Scavengers Superoxid dismutase

(SOD), Hydrogenperoxid Scavengers Catalase, Dimethylsulfoxid (DMSO),

Natriumazid (NaN3), Peroxinitrit-Savengers Ebselen, Tyrphostin Kinase Inhibitors

Tyrphostin, Protein Kinase C Inhibitors RO32, den Angiotensin Converting

Enzym Inhibitoren Captopril und Ramiprilat sowie des Angiotensin AT-1-

Rezeptorantagonisten Exp3174 auf den durch Phorbol-myristat-acetat (PMA)

induzierten Anstieg von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) in mononukleären

Leukozyten (n=13). Die Messung von ROS in mononukleären Leukozyten

erfolgte fluoreszenzspektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes

Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA). Die Veränderungen der Fluoreszenz

nach Zugabe von 10 µmol/L PMA wurde über 60 Minuten gemessen und

alleiniges PMA als 100 % dargestellt.*** p<0.01 im Vergleich zu PMA.

Con

trol

PMA

SOD

Cat

alas

eD

MSO

NaN

3E

bsel

enT

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ostin

RO

32C

apto

pril

Ram

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0

25

50

75

100

***

***

*** ******

***

RO

S (%

of P

MA

)

27

3.3. Wirkung am Angiotensinrezeptor

In einer weiteren Meßreihe wurde der Wirkungsmechanismus der reaktiven

Sauerstoffradikalenbildung und -hemmung in den mononukleären Leukozyten,

insbesondere die Wirkung an den Angiotensinrezeptoren (Subtyp AT-1/AT-2),

genauer untersucht. Dabei wurde das Blut gesunder Kontrollpersonen

verwendet. Da in der vorherigen Meßreihe bereits die ACE-Hemmer Captopril

und Ramiprilat und der Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist Exp3174

eingesetzt wurden, kamen nun noch die Angiotensin AT-2-Rezeptoragonisten

CGP42112 und Pyrrolidin-dithiocarbamat Ammonium (PDTC), der Angiotensin

AT-1-Rezeptoragonist Angiotensin l, der Angiotensin AT-1- und AT-2-

Rezeptoragonist Angiotensin ll, der Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonist

PD123319, der Calciumantagonist Verapamil sowie ein weiterer ACE-Hemmer,

Lisinopril, hinzu. Wie in Abbildung 12 dargestellt, ließ sich hierbei zusätzlich zu

den obengenannten Substanzen, eine signifikante Verminderung der reaktiven

Sauerstoffradikalenkonzentration (ROS) bei Stimulation mit Phorbol-myristat-

acetat (PMA) bei dem Calciumantagonisten Verapamil auf 70,4%±4,5%, bei dem

Angiotensin AT-1- und AT-2-Rezeptoragonisten Angiotensin ll auf 82,6%±3,7%

und bei dem Angiotensin AT-2-Rezeptoragonisten CGP42112 auf 75,9%±3,0%

feststellen (jeweils p=0,03).

Lediglich der Angiotensin AT-1-Rezeptoragonist Angiotensin l führte zu einer

signifikanten Steigerung der ROS-Bildung auf 107,4%±1,2%.

28

Abbildung 12: Die Wirkung der Angiotensin Converting Enzym Inhibitoren

Captopril, Ramiprilat und Lisinopril, des Calciumantagonisten Verapamil, des AT-

1- und AT-2-Rezeptoragonisten Angiotensin ll, den AT-1-Rezeptoragonisten

Angiotensin1-7 und Angiotensin l, der AT-2-Agonisten CGP42112 und PDTC,

des AT-2-Rezeptorantagonisten PD123319, des AT-1-Rezeptorantagonisten

Exp3174 und Dimethylsulfoxid (DMSO) auf den durch Phorbol-myristat-acetat

(PMA) induzierten Anstieg reaktiver Sauerstoffradikale (ROS) in mononukleären

Leukozyten (n=6-18). Die Messung von ROS in mononukleären Leukozyten

erfolgte fluoreszenzspektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichloroflu-

orescein-diacetat (DCF-DA). Die Veränderung der Fluoreszenz nach Zugabe von

10µmol/L PMA wurde über 60 Minuten gemessen und alleiniges PMA als 100%

dargestellt. *p <0,05, ***p <0,01 und +p <0,02 (mit DMSO) im Vergleich zu PMA.

0

50

100*

Con

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PMA

Cap

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Ram

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AT

2-A

goni

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∆ R

OS

(% o

f PM

A)

29

Wie in bereits erwähnt, erfolgte eine Abnahme der durch Phorbol-myristat-acetat

(PMA) induzierten reaktiven Sauerstoffradikalenbildung (ROS) nach Zugabe des

Angiotensin AT-2-Rezeptoragonisten CGP42112, des Angiotensin AT-1 und AT-

2-Rezeptoragonisten Angiotensin ll sowie des Calciumantagonisten Verapamil.

Dies legt die Vermutung nahe, daß die Regulierung der ROS-Entstehung bzw.

Hemmung über die AT-1- und/oder AT-2-Rezeptoren erfolgt.

Daraufhin wurden Messungen mit dem Angiotensin AT-1- und AT-2-Rezeptor-

agonisten Angiotensin ll ohne Zugabe von Phorbol-myristat-acetat (PMA)

durchgeführt (n=13). Dabei wurden steigende Endkonzentrationen von 1,0 bis

10000 µmol/L des AT-1- und AT-2-Rezeptoragonisten eingesetzt. Die alleinige

Zugabe von Angiotensin ll führte zu keiner signifikanten Änderung der ROS-

Produktion in den mononukleären Leukozyten.

Da Angiotensin ll eine AT-1- und eine AT-2-rezeptoragonistische Wirkung besitzt,

wurde bei einigen Messungen der Probe außer Angiotensin ll noch PD123319,

ein Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonist, hinzugefügt, um die AT-2-

Rezeptorwirkung auszuschalten und die alleinige AT-1-Rezeptorwirkung des

Angiotensin ll zu testen (n=13). Wie in Abbildung 13 zu sehen ist, wurden hierbei

sowohl Messungen mit Stimulation der mononukleären Leukozyten durch

Phorbol-myristat-acetat (PMA) als auch ohne Zugabe von PMA durchgeführt. Bei

dieser Meßreihe konnte aber keine signifikante Änderung der Konzentration der

reaktiven Sauerstoffradikale (ROS) ermittelt werden. Es zeigte sich eine

Verminderung der ROS-Konzentration nach Zugabe von PD123319, Angiotensin

ll und PMA auf 90,8%+8,5%.

Des weiteren wurde die Wirkung von S-Nitroso-N-acetylpenicillinamin (SNAP)

auf die mononukleären Leukozyten bezüglich der reaktiven Sauerstoffradikale

(ROS) untersucht (n=7). SNAP ist ein Stickstoffmonoxid (NO) Donor. NO ist ein

relativ labiles Molekül, welches auch radikale Eigenschaften besitzt (daher kann

man das NO-Molekül nicht direkt einsetzen). In der Studie von Muriel (Muriel et

al., 2000) setzte dieser SNAP ein, um das kurzlebige NO-Molekül direkt am

gewünschten Wirkungsort zu erzeugen.

30

Die Untersuchung erfolgte zum einen mit Stimulation von Phorbol-myristat-acetat

(PMA) und zum anderen ohne Stimulation. Da SNAP nicht ausreichend in

Wasser löslich ist, wurde Dimethylsulfoxid (DMSO) als Lösungsmittel verwendet.

Dabei zeigte sich bei beiden Meßreihen eine signifikante Erhöhung der ROS-

Freisetzung gegenüber dem Kontrollwert.

Bei der ersten Meßreihe (ohne Zugabe von PMA) stieg die ROS-Konzentration

auf 102,7%±15,2% gegenüber 50,46%±11% nur mit dem Lösungsmittel DMSO.

Die zweite Meßreihe (mit Zugabe von PMA) ergab eine Erhöhung der ROS-

Konzentration auf 176,4%±33,9% gegenüber 67,6%±8,9% nur mit dem

Lösungsmittel DMSO.

Die angegebenen Werte sind in Abbildung 13 graphisch dargestellt.

31

Abbildung 13: Die Wirkung des Angiotensin AT-1-und AT-2-Rezeptoragonisten

Angiotensin ll in Gegenwart des Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonisten

PD123319 (n=13) und des Stickstoff(2)oxid Donors S-Nitroso-N-acetylpenicillin-

amin (SNAP, n=7) auf die Konzentration reaktiver Sauerstoffradikale (ROS) in

mononukleären Leukozyten ohne und mit Induktion durch Phorbol-myristat-

acetat (PMA). Die Messung von ROS in den mononukleären Leukozyten wurde

fluoreszenzspektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluoroscein-

diacetat (DCF-DA) bestimmt. Die Veränderung der Fluoreszenz nach Zugabe

von 10µmol/L PMA wurde über 60 Minuten gemessen und alleiniges PMA als

100% dargestellt.

** p < 0,01 im Vergleich zum Kontrollwert.

cont

rol

PMA

PD+A

ng

PD+A

ng+P

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SO

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SO

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150

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**

**

∆ R

OS

% o

f PM

A

32

3.4. Calciummessung und reaktive Sauerstoffradikalenmessung unter

Zugabe verschiedener Sauerstoffradikalenstimulatoren (PMA und

Thapsigargin)

Bei dieser Meßreihe wurde die reaktive Sauerstoffradikalenbildung durch zwei

verschiedene Stimulatoren ausgelöst. Zum einen durch das bis jetzt verwendete

Phorbol-myristat-acetat (PMA) zum anderen durch Thapsigargin. Hierbei sollte

geprüft werden, ob unterschiedliche Konzentrationen reaktiver Sauerstoffradikale

(ROS) entstehen. Außerdem wurde die Calciumionenkonzentration nach Zugabe

der verschiedenen Sauerstoffradikalenbildner gemessen.

Die Messung mit Thapsigargin erfolgte nach derselben Vorschrift wie die

Messung mit Phorbol-myristat-acetat (PMA). Auch hierbei wurden die ACE-

Hemmer Captopril und Ramiprilat, der Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist

EXP3174 und Dimethylsulfoxid (DMSO) jeweils mit einer Endkonzentration von

10µmol/L eingesetzt. Wie bereits in Abbildung 11 beschrieben zeigte sich eine

signifikante Verminderung der PMA induzierten reaktiven Sauerstoffradikalen

(ROS)-Konzentration bei den ACE-Hemmern wie auch bei dem Angiotensin AT-

1-Rezeptorantagonisten. Bei den Messungen mit dem Sauerstoffradikalen-

stimulator Thapsigargin konnte, wie in Abbildung 14 (n=6) zu sehen ist, nur eine

signifikante Verminderung der ROS-Bildung nach Zugabe des Angiotensin AT-1-

Rezeptorantagonisten Exp3174 auf 50,3%±7,4% nachgewiesen werden. Bei den

anderen Messungen zeigten sich keine signifikanten Veränderungen in der ROS-

Konzentration.

Die intrazelluläre Calciumionenkonzentrationsmessung wurde auch mit den

obengenannten Substanzen in gleicher Konzentration durchgeführt. Dabei

änderte sich die Calciumionenkonzentration signifikant nach Zugabe des

Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 sowohl bei den durch PMA als

auch bei den durch Thapsigargin stimulierten mononukleären Leukozyten. Bei

der Messung mit PMA stieg die Calciumionenkonzentration auf 120,6%±49,4%

an und bei der Messung mit Thapsigargin fiel die Calciumionenkonzentration auf

34,6%±3,6% ab.

33

Abbildung 14: Die Wirkung der ACE-Hemmer Captopril und Ramiprilat sowie des

Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 und von Dimethylsulfoxid

(DMSO) auf den durch Phorbol-myristat-acetat (PMA) bzw. durch Thapsigargin

induzierten Anstieg reaktiver Sauerstoffradikale (ROS), Abbildungen oben,

(n=6-18) und von der Änderung der Calciumionenkonzentration in

mononukleären Leukozyten, Abbildungen unten, (n=6).

Die Messung von ROS in den mononukleären Leukozyten erfolgte fluoreszenz-

spektrophotometrisch mit Hilfe des Farbstoffes Dichlorofluoroscein-diacetat

(DCF-DA), die Messung der Calciumionenkonzentration erfolgte mit Hilfe des

Farbstoffes Fura 2.

Die Veränderungen der Fluoreszenz nach Zugabe von 10µmol/L PMA bzw. von

10µmol/L Thapsigargin wurde über 60 Minuten gemessen und alleiniges

PMA/Thapsigargin (Control) als 100% dargestellt.

***p < 0,01 im Vergleich zu PMA/ Thapsigargin und +p < 0,05 im Vergleich zu

DMSO.

0

50

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DM

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trol

Cap

topr

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Ram

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p317

4

DM

SO

34

4. Diskussion

In dieser Arbeit wurde die Bildung reaktiver Sauerstoffradikale (ROS) in

mononukleären Leukozyten bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-

Syndrom (OSAS) und im Vergleich dazu bei einer gesunden Kontrollgruppe

untersucht. Ferner wurden in dieser Arbeit mögliche Reaktionsmechanismen und

-wege der reaktiven Sauerstoffradikalen-(ROS)-bildung sowie -hemmung im

menschlichen Körper diskutiert. Besondere Aufmerksamkeit galt dabei dem

Angiotensin Subtyp AT-1- und AT-2-Rezeptor. Desweiteren wurde auch eine

mögliche Veränderung der Calciumkonzentration in den mononukleären

Leukozyten untersucht.

In geringer Konzentration sind reaktive Sauerstoffradikale (ROS) Nebenprodukte

von physiologischen metabolischen Prozessen in den Zellen, Orie (Orie et al.,

1999). Auch spielen sie bei der intrazellulären Signaltransduktion eine Rolle. Bei

höheren Konzentrationen werden die ROS jedoch für die Entstehung einer Reihe

von Erkrankung mitverantwortlich gemacht.

Bereits 1999 wurde in einer Untersuchung von Orie (Orie et al., 1999) die ROS-

Bildung bei Patienten mit arterieller Hypertonie sowie mit Diabetes mellitus

untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, daß bei Patienten mit Diabetes

mellitus (Typ 2) sowohl die spontane ROS-Entwicklung als auch die durch

Phorbol-myristat-acetat (PMA) stimulierten Werte gegenüber einer gesunden

Kontrollgruppe signifikant erhöht waren. Dies gilt auch für Patienten mit einer

Niereninsuffizienz, wie in einer Untersuchung von Tepel (Tepel et al., 2000)

gezeigt werden konnte. In der jetzigen Arbeit wurden dann Patienten mit

obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) untersucht. Bei Patienten mit

OSAS ist eine erhöhte Inzidenz an Herz-Kreislauferkrankungen bekannt. Dies

konnte auch in dieser Studie im Verhältnis zu den gesunden Kontrollpersonen

gezeigt werden. Dabei fiel eine erhöhte Inzidenz bei der Hypertonie und bei der

koronaren Herzkrankheit (KHK) / Infarkten auf. Besonders deutlich ist der

Bodymass-Index (BMI) bei den Patienten mit OSAS mit durchschnittlich

33,2±5,0kg/m² gegenüber der gesunden Kontrollgruppe mit durchschnittlich

23,2±3,7kg/m² erhöht.

35

Bei der spontanen ROS-Bildung und unter Stimulation mit Phorbol-myristat-

acetat (PMA) konnte kein signifikanter Unterschied im Vergleich zwischen den

Patienten mit OSAS und der gesunden Kontrollgruppe nachgewiesen werden.

Nach Zugabe einiger Medikamente, den ACE-Hemmern Captopril bzw.

Ramiprilat und dem Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174

(Losartan), zu den mit Phorbol-myristat-acetat (PMA) stimulierten mononukleären

Leukozyten konnte in Bezug auf den PMA induzierten Kontrollwert eine

signifikante Verminderung der ROS-Bildung nachgewiesen werden. Es konnten

jedoch keine Unterschiede zwischen den beiden Untersuchungsgruppen

festgestellt werden.

In einer Veröffentlichung von Inagami (Inagami et al., 1998) wurden Nierenzellen

unter anderem auf Subtypen des Angiotensinrezeptors untersucht. Dabei wurden

2 Subtypen, der AT-1-Rezeptor und der AT-2-Rezeptor, unterschieden, die eine

antagonistische Wirkung zueinander zeigten. Es konnte bewiesen werden, daß

die Stimulation von AT-1-Rezeptoren und AT-2-Rezeptoren unterschiedliche

Wirkung auf den Blutdruck von Mäusen haben (über AT-1-Rezeptoren wird der

Blutdruck gesteigert und über AT-2-Rezeptoren wird der Blutdruck gesenkt),

sowie auf die Diurese und Natriurese in Rattennieren (der Angiotensin AT-2-

Rezeptoragonist CGP42112 führt zu einer Supression, der Angiotensin AT-2-

Rezeptorantagonist PD123319 führt zu einer Stimulation und der Angiotensin

AT-1-Rezeptorantagonist Losartan (Exp 3174) führt nur zu einer gesteigerten

Natriurese).

In der vorliegenden Arbeit konnte bereits eine Hemmung der durch Phorbol-

myristat-acetat (PMA) induzierten reaktiven Sauerstoffradikalenbildung (ROS)

durch einen Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten, Exp3174 (Losartan), sowie

durch zwei verschiedene ACE-Hemmer, Captopril und Ramiprilat, (die die

Bildung von Angiotensin ll verhindern) gezeigt werden. Daraufhin aufbauend

sollte untersucht werden, ob eine unterschiedliche ROS-Bildung durch

Stimulierung oder Blockierung der AT-1- und/oder der AT-2-Rezeptoren

stattfindet. Es wurden zusätzlich mehrere andere angiotensinrezeptorwirksame

Substanzen, ein weiterer ACE-Hemmer und ein Calciumantagonist auf ihre

Wirkung in Bezug zur ROS-Konzentration in den mononukleären Leukozyten

36

getestet. Dabei zeigte sich nach allen Untersuchungen eine signifikante

Verminderung der PMA induzierten ROS-Bildung bei den ACE-Hemmern

Captopril und Ramiprilat, bei dem Calciumantagonisten Verapamil, bei dem

Angiotensin AT-2-Rezeptoragonisten CGP42112, bei dem Angiotensin AT-1- und

AT-2-Rezeptoragonisten Angiotensin ll und bei dem Angiotensin AT-1-

Rezeptorantagonisten EXP 3174 sowie eine vermehrte ROS-Bildung bei dem

Angiotensin AT-1-Rezeptoragonisten Angiotensin l.

Eine alleinige Gabe von Angiotensin ll (AT-1-und AT-2-Rezeptoragonist), ohne

PMA Stimulation, in ansteigender Konzentration sowie mit dem Angiotensin AT-

2-Rezeptorantagonisten PD 123319 in Kombination (alleinige AT-1-

Rezeptorwirkung) brachte dagegen keine signifikante Änderung der ROS-

Konzentration gegenüber dem Kontrollwert.

In einer weiteren Meßreihe erfolgte eine reaktive Sauerstoffradikalenmessung

(ROS) in den mononukleären Leukozyten mit dem Radikalenstimulator

Thapsigargin im Vergleich zu Phorbol-myristat-acetat (PMA) sowie eine Messung

der intrazelluläre Calciumionenkonzentration (je eine Meßreihe mit PMA und eine

mit Thapsigargin). In einem Artikel von Tepel (Tepel et al, 1999) wurde die

Aktivität des Na+/H+-Gegentransportsystems bei Patienten mit obstruktivem

Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) im Vergleich zu einer gesunden Kontrollgruppe

und der nächtliche Verlauf (bei den Patienten) gemessen. Bei den Patienten mit

OSAS kommt es zu Hypoxiezuständen mit Hypercapnie während der

Atempausen. In den Zellen kommt es zu einer anaeroben Stoffwechsellage

wobei Milchsäure entsteht. So fallen laufend Protonen in den Zellen an. Dadurch

wird der intrazelluläre pH-Wert verändert und bestimmte intracelluläre und

extracelluläre Puffersysteme beeinflußt. Durch das Na+/H+-Gegentransport-

system werden H+-Ionen aus der Zelle transportiert und somit der pH-Wert

reguliert.

Bei Patienten mit OSAS zeigte sich eine signifikant höhere Aktivität des Na+/H+-

Gegentransportsystems. Während der ganzen Nacht war die Aktivität

gleichermaßen hoch. Daher stellt sich die Frage, ob dadurch das Gleich-

gewichtssystem anderer Ionen, z.B. der Calciumionen, bei Patienten mit OSAS

verschoben ist.

37

In anderen Studien wurde bereits gezeigt, daß reaktive Sauerstoffmetabolite den

durch Calcium übertragenen Zellmetabolismus und spezifische membran-

gebundene Regulationsschritte in der Calciumsignalkaskade beeinträchtigen.

Thapsigargin erhöht die cytoplasmatische Calciumionenkonzentration laut

Thastrup (Tharsup et al., 1999) indem es die Wiederaufnahme der Calciumionen

in die zellulären Speicher hemmt. Des weiteren beschreiben Nofer (Nofer et al.,

1999) in einer Studie, daß das Na+/Ca²+-Gegentransportsystem in menschlichen

Lymphozyten durch Thapsigargin induziert wird. Dieses System spielt eine große

Rolle in der Regulation des Gleichgewichtssystems der Elektrolyte in den Zellen.

Takeyama (Takeyama et al., 1993) zeigen in einer Arbeit, daß die oxidative

Schädigung in Mitochondrien mit der Öffnung von nicht-spezifischen

Calciumkanälen zusammenhängt.

Auch in dieser Meßreihe wurden den Proben verschiedene Medikamente, die

ACE-Hemmer Captopril und Ramiprilat und der Angiotensin AT-1-Rezeptor-

antagonist Exp3174, hinzugesetzt. Bei der thapsigargininduzierten ROS-Bildung

konnte eine signifikante Minderung der ROS-Konzentration nach Zugabe des

Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 festgestellt werden. Bei der

Messung der intrazellulären Calciumionenkonzentration zeigte sich auch bei dem

Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonisten Exp3174 eine signifikante Änderung

nach Stimulation mit PMA sowie mit Thapsigargin.

Im Rahmen der hier durchgeführten Untersuchung konnte mit Hilfe der

fluoreszenzspektrophotometrischen Messungen gezeigt werden, daß die

Konzentration der reaktiven Sauerstoffradikale (ROS) in mononukleären

Leukozyten durch Zugabe verschiedener Medikamente signifikant gemindert

werden kann.

Andererseits konnte eine unterschiedliche Konzentration der ROS-Bildung weder

spontan noch nach Stimulation mit Phorbol-myristat-acetat (PMA) bei Patienten

mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) gegenüber einer gesunden

Kontrollgruppe nachgewiesen werden.

38

Zusammenfassend, mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen und Befunden

in der Literatur, läßt sich für einige Erkrankungen, z.B. Diabetes mellitus und

Niereninsuffizienz, eine Erhöhung der reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) in den

mononukleären Leukozyten feststellen. Jedoch gilt dies nicht für Patienten mit

obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom.



gegenüber einer gesunden Kontrollgruppe aufweisen. Weiterhin wurden

Hinweise dafür gefunden, daß eine Regulation der Bildung von intrazellulären

reaktiven Sauerstoffradikalen über den Angiotensin Subtyp AT-2-Rezeptor

erfolgt.

39

5. Zusammenfassung

Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-

Syndrom und Regulation der Radikalenbildung durch Angiotensin

Rezeptoren

Reaktive Sauerstoffradikale (ROS) spielen eine wesentliche Rolle bei der

intrazellulären Signaltransduktion. Hohe ROS-Konzentrationen führen dagegen

zu einer Schädigung von intrazellulären Proteinen, Enzymen oder

Transkriptionsfaktoren und damit zu einer Störung der regulären Zellfunktion bei

einer Reihe von Erkrankungen wie Entzündungen, Arteriosklerose, arterieller

Hypertonie, kardialen und vaskulären Erkrankungen oder Neoplasien. Patienten

mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom (OSAS) haben häufig eine arterielle

Hypertonie und eine erhöhte kardiovaskuläre Mortalität. In der vorliegenden

Untersuchung sollte daher geprüft werden, ob Veränderungen von intrazellulären

ROS bei Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom vorliegen und

welchen Einfluß Angiotensin AT-2-Rezeptoren bei der Bildung der

Sauerstoffradikale haben.

Die ROS-Konzentration in den mononukleären Leukozyten wurde bei 13

Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom und bei 18 altersgleichen

gesunden Kontrollpersonen fluoreszenzspektrophotometrisch mit Hilfe des

intrazellulären Farbstoffs 2',7'-Dichlorofluorescein-diacetat (DCF-DA) bestimmt.

Die Messungen erfolgten bei 534nm mit einer Exzitationswellenlänge von

488nm. Innerhalb von 30 Minuten kam es zu einem spontanen Anstieg von

intrazellulären ROS in mononukleären Leukozyten von Patienten mit

obstruktivem Schlaf-Apnoe-Syndrom um 2.8±0.4 (MW ± SEM, n=13) und von

gesunden Kontrollpersonen um 3.9±0.6 (n=18). Die Stimulation der Zellen mit

Phorbol-myristat-acetat (PMA) führte zu einem Anstieg von intrazellulären ROS

in mononukleären Leukozyten von Patienten mit obstruktivem Schlaf-Apnoe-

Syndrom um 10.4±1.6 und von gesunden Kontrollpersonen um 13.8±1.5. Sowohl

der spontane Anstieg von ROS als auch die Stimulation der Zellen mit PMA

zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen.

40

Der Zusatz des Singlet-oxygen-scavengers Natriumazid bzw. des Peroxynitrite-

scavengers Ebselen ergaben eine signifikante Verminderung der PMA-

stimulierten intrazellulären ROS-Bildung auf 29%±3% und auf 52%±4% des

Kontrollwertes (jeweils p<0.01). Die Vorgabe des Angiotensin Converting Enzym

Inhibitors Captopril führte zu einer signifikanten Verminderung der PMA-

stimulierten intrazellulären ROS-Bildung auf 65%±5% des Kontrollwertes

(p<0.01). Der Angiotensin AT-1- und AT-2-Rezeptoragonist Angiotensin II, der

spezifische Angiotensin AT-1-Rezeptorantagonist Exp3174 und der Angiotensin

AT-2-Rezeptoragonist CGP42112 verursachten ebenfalls eine signifikante

Verminderung der PMA-stimulierten intrazellulären ROS-Bildung (jeweils

p<0.05). Dagegen hatten der Angiotensin AT-1-Rezeptoragonist Angiotensin 1-7

und der spezifische Angiotensin AT-2-Rezeptorantagonist PD123319 keine

Wirkung auf die PMA-stimulierte ROS-Bildung. Dies deutet darauf hin, daß die

intrazelluläre ROS-Bildung durch eine AT-2-Rezeptor Aktivierung blockiert

werden kann.



gegenüber einer gesunden Kontrollgruppe aufweisen. Weiterhin wurden

Hinweise dafür gefunden, daß eine Regulation der Bildung von intrazellulären

reaktiven Sauerstoffradikalen über den Angiotensin Subtyp AT-2-Rezeptor

erfolgt.

41

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48

7. Danksagung

Der experimentelle Teil dieser Arbeit fand im Zeitraum von August 1998 bis April

2000 im nephrologischen Labor der medizinischen Klinik 1 der Universitätsklinik

Marienhospital in Herne statt. Ich danke Herrn Professor Dr. med. W. Zidek für

die Möglichkeit, dieses Thema im nephrologischen Labor zu bearbeiten.

Besonderer Dank gilt meinem Doktorvater, Herrn PD Dr. med. M.Tepel, der stets

für mich ansprechbar war und mir mit fachlicher Kompetenz zu Rate stand.

Ebenso möchte ich mich bei der Station 6b bedanken, die mir bei der Auswahl

der richtigen Patienten half, bei allen gesunden Freiwilligen, sowie bei allen Mit-

Doktoranden, daß die Koordination im Labor so gut funktioniert hat und die

Hilfsbereitschaft sehr groß war.

Auch meiner Familie, meinen Eltern und Geschwistern, sowie meinem Freund

möchte ich danken, daß sie mir beim Schreiben dieser Arbeit mit Rat und Tat zur

Seite standen.

Außerdem möchte ich mich bei allen bedanken, die mich durch ihre Hilfsbereit-

schaft unterstützt haben.

49

8. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name : Susanne Stemmler Geburtsdatum /-ort : 07.06.1972 in Würzburg Familienstand : Ledig Anschrift : Buschweg 21 51519 Odenthal Schulbildung

1978 - 1982 katholische Grundschule in Voiswinkel 1982 - 1988 Städtische-Realschule Bergisch-Gladbach mit

Fachoberschulreife 1991 - 1994 Dietrich-Bonhoeffer-Gymnasium Bergisch-Gladbach

mit allgemeiner Hochschulreife Berufsausbildung :

1988-1991 Ausbildung bei der Bayer AG Leverkusen zur Chemielaborantin

Studium :

1994 - 2000 1996 1997 1999 2000 1999 - 2000

Medizinstudium an der Ruhr-Universität Bochum Physikum 1.Staatsexamen 2.Staatsexamen 3.Staatsexamen Praktisches Jahr im Marienhospital in Herne Wahlfach: Gynäkologie

1998 - 2001 Doktorarbeit: Im nephrologischen Labor des Marienhospitals in Herne unter der Leitung von PD Dr. med. M.Tepel.

Nebentätigkeiten :

1996 - 2000 Aushilfe im Pflegedienst im Klinikum Leverkusen Beruf : 2000 - z.Zt.

AiP im Bereich Gynäkologie und Geburtshilfe im Marienhospital in Herne

Documents

Reaktive Sauerstoffradikale bei Patienten mit obstruktivem ... · Prinzip der Fluoreszenz und Durchführung der Messung 5 1.4. Fragestellung der Arbeit 8 2. Materialen und Methoden