- 1 -

Receptory sprzone z biakami G

- 2 -

Spis treci:

1. Receptory GPCR ....................................................................................................................... 3 1.1. Przekazanie sygnau i aktywacja biaka G ............................................................................... 6 1.2. Mechanizmy aktywacji receptorw GPCR .............................................................................. 8 1.3. Receptory Opioidowe .............................................................................................................. 10 1.3.1. Ligandy receptorw opioidowych .......................................................................................... 15 1.4. Znane struktury krystalograficzne receptorw GPCR ......................................................... 17 1.4.1. Rodopsyna ............................................................................................................................... 18 1.4.2. Opsyna w stanie aktywnym .................................................................................................... 21 1.4.3. Receptor 1 oraz 2 adrenergiczny ......................................................................................... 24 1.4.4. Receptor 2A adenozynowy .................................................................................................... 28

Literatura ...................................................................................................................................... 30

- 3 -

1. Receptory GPCR

Receptory sprzone z biakami G (GPCRs ang. G protein coupled receptors)

stanowi najliczniejsz i bardzo zrnicowan grup biaek bonowych odpowiedzialnych

za przekazywanie sygnaw przez dwuwarstw lipidow do miejsc efektorowych

znajdujcych si we wntrzu komrki [1]. Sekwencjonowanie ludzkiego genomu ujawnio

wystpowanie ok. 800 rnych typw receptorw nalecych do rodziny GPCR (geny

kodujce receptory GPCR stanowi powyej 3% ludzkiego genomu), a ponad poowa z

nich wykazuje potencjalne znaczenie dla przemysu farmaceutycznego [2, 3].

Analiza porwnawcza sekwencji receptorw GPCR oraz badania funkcji

poszczeglnych typw receptorw doprowadziy do podziau tej rodziny biaek na klasy,

ktre oznaczono literami od A do F [4, 5]. Pierwsza, najliczniejsza klasa A (nazywana

rwnie klas podobnych do rodopsyny ang. rhodopsin like), obejmujca ponad 80%

wszystkich GPCR, to klasa receptorw rodopsyno-podobnych. Receptory wchodzce w

skad tej grupy s jednymi z najlepiej zbadanych. Zaliczamy do nich, obok rodopsyny,

midzy innymi: receptory adrenergiczne, opioidowe, adenozynowe, kanabinoidowe,

receptory chemokin, dopaminowe i histaminowe. Klas B stanowi receptory sekretyno-

podobne. Do klasy C zaliczamy receptory glutaminergiczne i feromonowe. Kolejne klasy

D i E tworz odpowiednio receptory feromonw grzybw oraz receptory cAMP. Ostatnia

klasa F to receptory frizzled/smoothened. Klasyfikacja ta pokrywa si w wikszoci z

now klasyfikacj GRAFS [6], opart na badaniach filogenetycznych. Nazwa GRAFS

pochodzi od pierwszych liter wyodrbnionych rodzin receptorw, do ktrych nale

odpowiednio: receptory Glutaminergiczne, Rodopsyno-podobne, Adhezyjne, Frizzled i

smakowe oraz Sekretyno-podobne.

Receptory sprzone z biakami G uczestnicz w kaskadach sygnalizacyjnych

poredniczc w przekazywaniu informacji przez liczne zewntrzkomrkowe czsteczki

sygnaowe: hormony, przekaniki neuronalne, mae biaka, krtkie acuchy peptydowe,

aminy, lipidy, nukleotydy czy pochodne aminokwasw i kwasw tuszczowych [3, 7]. Dla

kadej z wymienionych substancji istnieje receptor, bd te grupa receptorw mogca

wiza dan czsteczk, inicjujc jednoczenie przekazanie sygnau przez bon

komrkow. Receptory GPCR odgrywaj kluczow rol w wielu procesach

fizjologicznych regulujcych prace komrki, jej metabolizm, wzrost i obron

immunologiczn. Receptory sprzone z biakami G peni ponadto bardzo rnorodne

funkcje w organizmie czowieka. Zaliczamy do nich midzy innymi: rodopsyn [8, 9],

- 4 -

biako fotoreceptorowe aktywowane przez wiato, uczestniczce w procesie widzenia,

receptory adrenergiczne [10-12] wywierajce wpyw na cinienie ttnicze, receptory

opioidowe [13, 14] modulujce poziom odczuwanego blu, receptory muskarynowe

kontrolujce prac misni gadkich, a take receptory smakowe oraz wchowe.

Przestrze zewntrzkomrkowa

Przestrze wewntrzkomrkowa - cytoplazma

I II III IV V VI VII

EL:I EL:II EL:III

IL:I IL:III

NH2

COOH

IL:II

Bonakomrkowa

Przestrze zewntrzkomrkowa

Przestrze wewntrzkomrkowa - cytoplazma

I II III IV V VI VII

EL:I EL:II EL:III

IL:I IL:III

NH2

COOH

IL:II

Bonakomrkowa

Rys. 1. Schemat budowy receptora GPCR oraz jego lokalizacja w bonie komrkowej, IL:I do IL:III - ptle wewntrzkomrkowe, EL:I do EL:III ptle zewntrzkomrkowe, helisy transbonowe

oznaczono cyframi od I do VII. N-koniec pooony jest po stronie zewntrzkomrkowej, C-koniec

znajduje si po stronie cytoplazmatycznej bony. Rysunek wykonany na podstawie pracy [15]

Niezalenie od penionych funkcji oraz rnic w dugoci acucha biakowego

receptory GPCR posiadaj wsplne cechy strukturalne. Wszystkie zbudowane s z

pojedynczego acucha polipeptydowego siedmiokrotnie przechodzcego przez

dwuwarstw lipidow. Domen transbonow wszystkich receptorw GPCR tworzy

siedem hydrofobowych -helis (TMH:I do TMH:VII) poczonych ptlami, trzy ptle na

zewntrz komrki (EL:I do EL:III) oraz trzy wewntrz komrki (IL:I do IL:III)). Koniec

karboksylowy (C-koniec) znajduje si zawsze po stronie cytozolowej bony i zawiera

miejsca fosforylacji przez odpowiednie kinazy GRK (G protein coupled Receptor Kinase).

Majcy woln grup aminow koniec acucha biakowego (N-koniec) pooony jest

zawsze na zewntrz komrki i zwykle zawiera miejsca glikozylacji. Na znajdujcej si po

obu stronach bony komrkowej powierzchni receptora, wystpuj liczne aminokwasy o

charakterze hydrofilowym, natomiast w obszarze bony przewaaj aminokwasy o

- 5 -

waciwociach hydrofobowych co powoduje silne zakotwiczenie biaka w bonie

lipidowej. Obecne pomidzy helisami liczne wizania wodorowe dodatkowo stabilizuj

struktur receptorw GPCR.

Receptory sprzone z biakami G wykazuj due podobiestwo sekwencyjne i

strukturalne w rejonie transbonowym [11, 16-20], natomiast dugo acucha biakowego

w obszarze N- jak i C-koca oraz ptli czcych helisy podlega duemu zrnicowaniu

[21]. Znikome podobiestwo sekwencyjne tych fragmentw pozwala rwnie

przypuszcza, i posiadaj one odmienn struktur przestrzenn, szczeglnie w czci

zewntrzkomrkowej (ktra wie odmienne ligandy), podczas gdy s one zadziwiajco

podobne pod wzgldem dugoci ptli w czci cytoplazmatycznej (ktra suy do

wizania trimeru biaka G).

Miejsce wizania ligandw receptorw rodziny A zlokalizowane jest przewanie

we wnce tworzonej przez siedem -helis, jak ma to miejsce w przypadku receptora 2

adrenergicznego [10] czy rodopsyny [8]. Bezporednie otocznie miejsca aktywnego

stanowi aminokwasy pochodzce z helis transmembranowych TMH:I, TMH:III, ,TMH:V,

TMH:VI, oraz TMH:VII. W niektrych typach receptorw GPCR ligandy wi si

rwnie do duej domeny tworzonej przez dugi N-koniec receptora (receptory

feromonw, receptory GABA), [22, 23] jak i do aminokwasw zlokalizowanych w

ptlach i w obszarze transmembranowym biaka receptorowego (receptory

neuropeptydowe) [1, 7, 24, 25].

Wszystkie poznane dotychczas struktury krystaliczne receptorw GPCR (struktury

rodopsyny nieaktywnej [8], struktura rodopsyny czciowo aktywnej [26], struktury

opsyny [16], struktura receptora A2A adenozynowego [18], struktury receptora 1

adrenergicznego [11] oraz receptora 2 adrenergicznego [10]) stanowi receptory nalece

do klasy A, rodopsyno-podobnych. Pomimo faktu, i podobiestwo sekwencyjne nie jest

due dla rnych typw receptorw klasy A (20-30% dla caej dugoci acucha

biakowego), prezentowane struktury wykazuj wysok zbieno w obszarze

transbonowym (po wzajemnym naoeniu czci acucha biakowego, wsplnego dla

obszaru transmembranowego receptora 2 adrenergicznego oraz rodopsyny, rednie

odchylenie kwadratowe pooenia wsprzdnych atomw biaka (RMSD) nie przekracza

3.2 . Wysokie podobiestwo strukturalne tego obszaru sugeruje, e proces przeniesienia

sygnau przez bon komrkow inicjowany aktywacj receptora moe posiada wsplny

mechanizm dla wikszoci przedstawicieli tej rodziny.

- 6 -

1.1. Przekazanie sygnau i aktywacja biaka G

Kiedy zewntrzkomrkowa czsteczka sygnalizacyjna o waciwociach

agonistycznych wie si z receptorem nastpuje zmiana konformacyjna tego biaka.

Dzieje si tak prawdopodobnie dlatego, i wizany ligand modyfikuje oddziaywania

pomidzy helisami (wizania wodorowe, oddziaywania jonowe oraz hydrofobowe), ktre

s niezbdne dla stabilizacji receptora w jego formie nieaktywnej [27, 28]. Podczas

aktywacji, cze cytoplazmatyczna receptora modyfikuje swoj struktur, co umoliwia

bezporednie oddziaywanie z biakiem G po wewntrznej stronie bony komrkowej (w

cytoplazmie). W procesie przeniesienia sygnau prawdopodobnie kluczow rol odgrywa

trzecia ptla cytozolowa receptora (IL:III, ptla pomidzy helis TMH:V i helis

TMH:VI), ktra bierze udzia w bezporednim wizaniu i aktywacji biaka G [29-33].

Wszystkie biaka G skadaj si z trzech podjednostek: , i . Istnieje wiele

odmian biaek G jednak jest ich dziesiciokrotnie mniej ni receptorw GPCR, co pozwala

przypuszcza, i pojedyncze biako G moe by wizane i aktywowane przez rne typy

receptorw GPCR. Sugeruje to podobiestwo mechanizmu aktywacji biaka G przez

poszczeglne receptory [21] jak i na podobiestwo strukturalne samych receptorw GPCR.

W formie nieaktywnej biaka G (Rys. 2.A.), podjednostka zawiera zwizan

czsteczk GDP (difosforan guanozyny). Po zmianie konformacji receptora GPCR,

zakotwiczone w bonie biako G [34] dyfunduje w jego poblie tworzc z nim kompleks

(Rys. 2.B.). Receptor aktywujc biako G katalizuje wymian czsteczki GDP na GTP

(trifosforan guanozyny), prawdopodobnie przez chwilowe rozwarcie miejsca wizania

nukleotydu guanylowego. Nastpuje wtedy podzia na podjednostk G-GTP oraz G a

nastpnie ich oddysocjowanie. Cytoplazmatyczna powierzchnia receptora zostaje

uwolniona ( Rys. 2.C.), aby mc aktywowa dalsze molekuy biaka G. Sygna aktywacji

jest zwykle przenoszony do miejsca docelowego przez jednostk G-GTP, ale w pewnych

przypadkach obiekt docelowy uruchamiany jest przez podkompleks G .

Podjednostki biaka G pozostaj aktywne przez okres rzdu od kilku sekund do

kilku minut. Podczas jednego cyklu sygna moe zosta przekazany do wielu miejsc

docelowych. Czas ten jest jednak ograniczony przez zachowanie G-GTP. Podjednostka

posiada wbudowan zdolno hydrolizowania GTP (aktywno GTPazy). Prowadzi to

ostatecznie do zhydrolizowania zwizanego GTP do GDP. Dwie podjednostki z powrotem

cz si tworzc kompleks nieaktywn form biaka G.

- 7 -

Rys. 2. Schemat przekazania sygnau i aktywacji biaka G. A) Wizanie agonisty przez biako receptorowe, aktywacja receptora GPCR. B) Tworzenie kompleksu GPCR-biako G i aktywacja

biaka G. C) Przekazanie sygnau przez aktywne podjednostki biaka G do miejsca docelowego (biaka

efektorowego: enzymu, kanau jonowego).

Opisany schemat obrazuje jeden ze sposobw przekazywania sygnau spoza

komrki do jej wntrza [35, 36]. Naley zauway, i jeden receptor moe aktywowa do

- 8 -

kilkuset czsteczek biaka G. Rwnie kada z aktywnych podjednostek biaka G, podczas

jednego cyklu, moe dotrze do duej liczby biaek efektorowych (miejsc docelowych):

enzymw, kanaw jonowych. Przekazywany sygna ulega wtedy istotnemu wzmocnieniu

(zjawisko amplifikacji sygnau).

1.2. Mechanizmy aktywacji receptorw GPCR

Podczas aktywacji w strukturze receptora dochodzi do szeregu zmian

konformacyjnych umoliwiajcych wizanie biaek G po wewntrznej stronie bony

komrkowej oraz dalsze przekazanie sygnau. Receptory te nie dziaaj jednak jak

bimodalne przeczniki przyjmujce jedynie dwa stany: nieaktywny (podstawowy) lub

aktywny [27]. Wikszo receptorw GPCR to receptory wykazujce pewn aktywno

podstawow (ang. basal activity), czyli moliwo samoczynnego przejcia do formy

aktywnej pod nieobecno wizanego liganda. Czsteczki sygnaowe modulujce

aktywno receptora moemy podzieli na grupy w zalenoci od ich wpywu na

funkcjonalno biaka receptorowego. Peni agonici (ang. full agonists) wywouj stan

cakowicie aktywny, agonici (ang. agonists) prowadz do wikszej aktywnoci receptora

ni jego aktywno podstawowa, antagonici (ang. antagonists) blokuj jedynie miejsce

wice biaka receptorowego nie zmieniajc jego aktywnoci podstawowej, natomiast

agonici inwersyjni (ang. inverse agonists) wywouj stan receptora charakteryzujcy si

nisz aktywnoci od jego aktywnoci podstawowej [37]. Wykazano, i wizanie rnych

ligandw moe prowadzi do form receptora wykazujcych odmienny poziom aktywnoci,

a take charakteryzujcych si odmienn konformacj biaka [38-41] wpywajc na

sposb przeniesienia sygnau.

W strukturze receptora w formie nieaktywnej wystpuje szereg oddziaywa

stabilizujcych jego konformacj [8, 10, 11, 16-20, 26]. Nale do nich midzy innymi

wizania wodorowe, oddziaywania hydrofobowe oraz jonowe, obecne pomidzy helisami

[7]. Czsteczki wody, znajdujce si w strukturze receptorw, mog dodatkowo

stabilizowa ich konformacj poredniczc w sieci wiza wodorowych we wntrzu

biaka. W strukturze receptorw GPCR nalecych do rodziny A, wystpuj dobrze

zachowane motywy sekwencyjne okrelane mianem przecznikw molekularnych (ang.

molecular switches) [42], ktre peni kluczow rol w stabilizacji stanu podstawowego

tych biaek. Nale do nich midzy innymi: motyw E(D)RY na TMH:III, nazywany

zamkiem jonowym (ang. ionic lock) [43, 44], sekwencja CWxPxF(H) zlokalizowana

- 9 -

na TMH:VI (ang. rotamer toggle switch) [45, 46], tak zwany zamek 3-7 (ang. 3-7

lock) czcy TMH:III i TMH:VII [47, 48], obecny w strukturze rodopsyny oraz

sekwencja NPxxY czca TMH:VII z helis sm [49].

Receptory GPCR, podobnie jak wszystkie biaka, nie s sztywnymi strukturami i

podlegaj nieustannym ruchom termicznym [50]. Przejcie ze stanu podstawowego do

formy aktywnej wymaga zerwania oddziaywa wewntrzczsteczkowych stabilizujcych

konformacj nieaktywn. Prawdopodobiestwo takiego przejcia jest odpowiednio

wiksze dla receptorw wykazujcych du aktywno podstawow takich, jak receptor

kanabinoidowy CB1 [51]. Natomiast w receptorach posiadajcych znikom aktywno

podstawow jak rodopsyna czy receptor FSH (ang. follicle stimulating hormone receptor)

[52], przejcie takie zachodzi niezwykle rzadko.

STAN NIEAKTYWNY STAN AKTYWNYSTAN NIEAKTYWNY STAN AKTYWNY

Rys. 3. Schematy aktywacji receptorw GPCR wywoanej wizaniem agonisty. Kolorem tym

oznaczono wizany ligand agonist. a) Agonista blokuje oddziaywania obecne midzy helisami

stabilizujce stan podstawowy receptora, co umoliwia przejcie biaka w stan aktywny. b) Stan

aktywny receptora stabilizowany jest przez nowo utworzone bezporednie oddziaywania

ligand-receptor. Rysunek pochodzi z pracy [27].

Badania z zastosowaniem mutacji kierunkowych pozwoliy na identyfikacj

pojedynczych aminokwasw odpowiedzialnych za stabilizacj stanu nieaktywnego

niektrych receptorw z rodziny A [47, 53]. Zamiana pojedynczego aminokwasu na reszt

o odmiennych waciwociach fizykochemicznych, powoduje niekiedy znaczny wzrost

aktywnoci podstawowej mutanta albo prowadzi nawet do otrzymania stabilnej formy

aktywnej danego receptora (ang. CAM - constitutively active mutant) [7, 54-59].

- 10 -

Wizanie agonisty prowadzi do zmian konformacyjnych w receptorze

pozwalajcych na przejcie biaka w stan aktywny [43, 60]. Mechanizm aktywacji

receptora wywoany wizaniem liganda prawdopodobnie moe przebiega w dwojaki

sposb [27]. Wizany ligand moe powodowa zerwanie lub blokad obecnych

oddziaywa wewntrzczsteczkowych stabilizujcych stan podstawowy receptora, co

inicjuje sekwencje zmian konformacyjnych prowadzcych do stanu aktywnego biaka. W

drugim przypadku, stan aktywny receptora moe by stabilizowany przez nowo utworzone

bezporednie oddziaywania ligand-receptor (Rys. 3.).

Receptory GPCR nalece do rodziny A, pomimo podobiestwa strukturalnego w

rejonie transmembranowym, mog wiza ligandy do rnych mikrodomen obecnych w

strukturach tych receptorw. Pooenie zwizanego liganda ZM241385 w strukturze

krystalicznej receptora A2A adenozynowego [18] znacznie odbiega od miejsca wizania

retinalu w rodopsynie czy ligandw obecnych w dostpnych strukturach krystalicznych

receptorw adrenergicznych [10, 11, 19, 20]. Ponadto, ligandy tego samego receptora

2AR: katechol i ICI11855 posiadaj odmienne miejsca wizania [38], a co wicej

aktywuj ten receptor wedug odmiennych mechanizmw, powodujc zmian odmiennych

przecznikw molekularnych [38].

1.3. Receptory Opioidowe

Substancje umierzajce bl byy uywane przez ludzko od zamierzchych

czasw. Stosowanie opium, substancji otrzymywanej w procesie suszenia gstego soku z

niedojrzaych owocw maku lekarskiego (mak lekarski ac. Papaver Somniferum), datuje

si ju na 3400 rok p.n.e. [61]. Pocztkowo wycig z maku lekarskiego by stosowany jako

element kultu religijnego ze wzgldu na silne dziaanie na ukad nerwowy. Przyjmowanie

mikstury wywoywao uczucie euforii, prowadzio do stanu otpienia i odurzenia. Pierwsze

przekazy opisujce stosowanie opium na terenie Europy w celach medycznych

(przeciwblowych, uspokajajcych czy nasennych) pochodz z roku 1500 n.e. W roku

1806 po raz pierwszy z opium wyodrbniono jeden z czynnych skadnikw morfin,

nazwan tak na cze boga snu Morfeusza. Od koca dziewitnastego wieku morfin

zaczto stosowa w medycynie do celw terapeutycznych.

Wycig z maku lekarskiego zawiera liczne substancje psychoaktywne. W skad

opium wchodzi mieszanina ponad 40 alkaloidw, ktre moemy podzieli na dwie

podstawowe grupy: pochodne fenantrenu (morfina, kodeina, tebaina) oraz pochodne

- 11 -

izochinoliny (papaweryna, emetyna). Pierwsza grupa zwizkw, zwana opiatami, wywiera

istotny wpyw na ukad nerwowy czowieka. W roku 1973 wykazano, i niektre

substancje zawarte w wycigu z opium oddziaywaj na specyficzne receptory

zlokalizowane w centralnym ukadzie nerwowym [62-64], nazwane pniej receptorami

opioidowymi. W latach 1977-90 potwierdzono wystpowanie trzech typw receptorw

opioidowych: MOR, DOR oraz KOR, wykazujcych selektywno w wizaniu ligandw

[65, 66]. Ostatecznie w 1992 roku zidentyfikowano oraz poddano ekspresji geny kodujce

wszystkie trzy typy receptorw opioidowych [67-73], co w znacznym stopniu przyczynio

si do szybkiego rozwoju bada nad tymi biakami.

Receptory opioidowe wystpuj gwnie w centralnym ukadzie nerwowym, w

bonie komrkowej neuronw. Moemy je rwnie odnale w niektrych typach mini

gadkich. Ich obecno stwierdzono take m.in. w przewodzie pokarmowym, komrkach

ukadu immunologicznego, w macicy, sercu oraz pucach. Skutki oddziaywania substancji

opioidowych (zdolnych do modulacji aktywnoci podstawowej receptorw opioidowych)

na organizm czowieka s liczne i bardzo zrnicowane. Zaliczamy do nich: osabienie

reakcji na bodce pochodzce z otoczenia, takie jak dotyk, dwik czy wiato; otpienie,

stany euforyczne jak i depresyjne. Substancje te wywieraj wpyw na cinienie ttnicze,

czsto skurczw minia sercowego, reguluj take funkcje oddechowe. Receptory

opioidowe odgrywaj take kluczow rol w kaskadach sygnalizacyjnych

odpowiedzialnych za odczuwanie blu, regulacje funkcji motorycznych, psychofizycznych

jak i kontrol nastroju [74].

Receptory opioidowe, w odpowiedzi na zwizanie zewntrzkomrkowej czsteczki

sygnaowej, aktywuj biaka Gi oraz Go po wewntrznej stronie bony komrkowej.

Nastpnie, podjednostka G-GTP oraz podkompleks G docieraj do miejsc docelowych,

biaek efektorowych, ktrymi s midzy innymi kanay jonowe (wapniowe i potasowe)

oraz enzymy bonowe (np. cyklaza adenylowa). Jednorazowe dziaanie agonistw

receptorw opioidowych skutkuje zahamowaniem aktywnoci cyklazy adenylowej co

prowadzi do obnienia poziomu cAMP, penicego rol przekanika drugiego rodzaju

(ang. second messenger). Przy dugotrwaym dziaaniu agonistw obserwujemy natomiast

kompensacyjn up-regulacj tego enzymu i wzrost poziomu cAMP, co moe by

przyczyn zwikszonej pobudliwoci neuronw. Obecno cAMP wywiera take wpyw

na proces regulacji genw, przez fosforylacj czynnikw transkrypcyjnych, ktre z kolei

wi si z elementami regulatorowymi odpowiednich genw. Wiadomo, i receptory

- 12 -

opioidowe peni wan funkcj w procesie uwalniania przekanikw neuronalnych,

kontrolujc stan bramkowanych napiciem kanaw wapniowych, zlokalizowanych w

bonie presynaptycznych zakocze nerwowych. Rwnie, poprzez regulacj

przepustowoci kanaw potasowych [75] receptory te mog spowalnia przekazywanie

impulsw nerwowych poprzez neurony [76-78]. Dugotrwae stosowanie substancji

opioidowych moe prowadzi do uzalenienia [79]. Receptory opioidowe wywieraj

wpyw na wydzielanie dopaminy - neuroprzekanika syntezowanego i uwalnianego przez

neurony orodkowego ukadu nerwowego [80]. Ukad dopaminowy stoi u podstawy

zjawiska wzmocnienia pozytywnego, ktre jest zwizane z dziaaniem lekw

uzaleniajcych. Dugotrwale przyjmowanie opioidw prowadzi do nasilenia wydzielania

dopaminy odpowiedzialnej za intensywno w ukadzie nagrody oraz stan okrelany w

uproszczeniu jako euforia, a take za zjawiska motywacyjne.

Ze wzgldu na swoje waciwoci farmakologiczne, receptory opioidowe stay si

przedmiotem licznych bada niezwykle istotnych dla przemysu farmaceutycznego.

Znalezienie substancji wykazujcych wysok selektywno oraz powinowactwo wzgldem

jednego z trzech podtypw receptorw opioidowych: MOR, DOR i KOR, pomogoby w

zaprojektowaniu skutecznych lekw przeciwblowych, antydepresyjnych, lekw

stosowanych w leczeniu uzalenie, powodujcych mniej efektw ubocznych. Niestety

nadal stan wiedzy dotyczcy struktur tych biaek receptorowych oraz mechanizmw ich

aktywacji jak i dezaktywacji jest bardzo ograniczony.

Obecny stan wiedzy potwierdza wystpowanie trzech gwnych typw receptorw

opioidowych: MOR, KOR i DOR [81] oraz receptora nocyceptyny, podobnego do

receptorw opioidowych (ORL 1 ang. opioid receptor like-1) [82-84]. Badania

farmakologiczne sugeruj rwnie wystpowanie wikszej liczby podtypw tych

receptorw (np. dwa receptory DOR i po trzy KOR i MOR) [14]. Moe to wynika z faktu,

i receptory te wystpuj w formie homo- jak i hetero-dimerw oraz merw wyszych

rzdw [85, 86], ktre take mog by funkcjonalne. Wiadomo rwnie, i niektre

opioidy o waciwociach agonistycznych wykazuj selektywno wzgldem cile

okrelonego dimeru lub monomeru [87] tych receptorw.

Receptory opioidowe nale do rodziny A receptorw GPCR (zwanej take rodzin

podobnych do rodopsyny; ang. rhodopsin like). acuchy peptydowe receptorw

opioidowych skadaj si odpowiednio z 372 AA - DOR, 380 AA - KOR oraz 398 AA -

MOR. Pomimo braku struktury krystalicznej tych biaek przyjmuje si, e s one

- 13 -

zbudowane z siedmiu -helis przechodzcych przez dwuwarstw lipidow, poczonych

ze sob krtkimi ptlami. Helisa sma jest pooona prostopadle do bony po stronie

wewntrzkomrkowej. Podobiestwo sekwencyjne trzech receptorw opioidowych jest

wysokie, procent identycznych aminokwasw dla poszczeglnych par rwny jest

odpowiednio: 57% dla MOR i KOR, 61% dla DOR i KOR oraz 62% dla DOR i MOR

[88]. Natomiast ponad 93% aminokwasw jest ewolucyjnie zachowanych dla danego typu

receptora obecnego u przedstawicieli rnych gatunkw.

Uliniowienie sekwencji trzech receptorw opioidowych oraz sekwencji rodopsyny

(Rys. 4.) pokazuje, i w sekwencji receptorw opioidowych wystpuj dobrze zachowane

motywy, charakterystyczne dla innych przedstawicieli rodziny A, receptorw GPCR. Na

helisie II obecny jest motyw LxxxD, na helisie III motyw E(D)RY, motyw CWxPxF(H)

wystpuje na helisie VI, oraz motyw NPxxY na helisie VII (gdzie x oznacza dowolny

aminokwas). W kadym z receptorw opioidowych obecne jest wizanie disulfidowe

pomidzy cystein z helisy III oraz cystein zlokalizowan w drugiej ptli

zewntrzkomrkowej. Jest to cecha wsplna dla wszystkich GPCR-w z rodziny A.

Najwiksze podobiestwo sekwencyjne wystpuje na odcinku transmembranowym,

natomiast znikome podobiestwo widoczne jest w rejonie ptli zewntrzkomrkowych

oraz C- i N-koca.

Dane eksperymentalne opisujce wpyw pojedynczych mutacji kierunkowych (ang.

point mutations), oraz badania z zastosowaniem receptorw o zmienionej czci acucha

peptydowego (ang. receptor chimeras), pozwoliy na okrelenie prawdopodobnego

miejsca wizania typowych ligandw receptorw opioidowych [88-90]. Miejsce wizania

zlokalizowane jest we wnce pomidzy helisami od TMH:II do TMH:VII, ktr

przykrywaj trzy ptle zewntrzkomrkowe. Aminokwasy odpowiedzialne za wizanie

ligandw s w wikszoci dobrze zachowane w trzech typach receptorw opioidowych:

Asp:3.32, Tyr:3.33, Lys:5.39, Phe:5.47, Trp:6.48, Ile:6.51, His:6.52, Ile:6.53, Ile:7.39, and

Tyr:7.43 [91-100] (numeracja wedug konwencji Ballesterosa-Weinsteina [101], gdzie

pierwsza liczba oznacza numer helisy transbonowej, druga to pozycja reszty liczona

wzgldem najbardziej zachowanego w ewolucji aminokwasu na tej helisie, oznaczonego

numerem 50).

- 14 -

Rho : -------------------MNGTEGPNFYVPFSNKTGVVRSPFEAPQYYLAEPW------

: -----------------------MEPAPSAGAELQPPLFANASDAYPSACPSAG-ANASG

: --------------MESPIQIFRGEPGPTCAPSACLPPNSSAWFPGWAEPDSNGSAGSED

: -MDSSAAPTNASNCTDALAYSSCSPAPSPGSWVNLSHLDGNLSDPCGPNRTDLG-GRDS-

Rho : -----------QFSMLAAYMFLLIMLGFPINFLTLYVTVQHKKLRTPLNYILLNLAVADL

: PPGARSASSLALAIAITALYSAVCAVGLLGNVLVMFGIVRYTKMKTATNIYIFNLALADA

: AQLEPAHISPAIPVIITAVYSVVFVVGLVGNSLVMFVIIRYTKMKTATNIYIFNLALADA

: LCPPTGSPSMITAITIMALYSIVCVVGLFGNFLVMYVIVRYTKMKTATNIYIFNLALADA

Rho : FMVFGGFTTTLYTSLHGYFVFGPTGCNLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIERYVVVCKPMS

: LATS-TLPFQSAKYLMETWPFGELLCKAVLSIDYYNMFTSIFTLTMMSVDRYIAVCHPVK

: LVTT-TMPFQSTVYLMNSWPFGDVLCKIVISIDYYNMFTSIFTLTMMSVDRYIAVCHPVK

: LATS-TLPFQSVNYLMGTWPFGTILCKIVISIDYYNMFTSIFTLCTMSVDRYIAVCHPVK

Rho : NFRFG-ENHAIMGVAFTWVMALACAAPPLV-GWSRYIPEGMQCSCGIDYYTPHEETNNES

: ALDFRTPAKAKLINICIWVLASGVGVPIMVMAVTRPRDGA--VVCMLQFPSP-SWYWDTV

: ALDFRTPLKAKIINICIWLLSSSVGISAIVLGGTKVREDVDVIECSLQFPDDDYSWWDLF

: ALDFRTPRNAKIINVCNWILSSAIGLPVMFMATTKYRQGS--IDCTLTFSHP-TWYWENL

Rho : FVIYMFVVHFIIPLIVIFFCYGQLVFTVKEAAAQQQESATTQKAEKEVTRMVIIMVIAFL

: TKICVFLFAFVVPILIITVCYGLMLLRLRSVRLLSG-SKEKDRSLRRITRMVLVVVGAFV

: MKICVFIFAFVIPVLIIIVCYTLMILRLKSVRLLSG-SREKDRNLRRITRLVLVVVAVFV

: LKICVFIFAFIMPVLIITVCYGLMILRLKSVRMLSG-SKEKDRNLRRITRMVLVVVAVFI

Rho : ICWLPYAGVAFYIFTHQGS---DFGPIFMTIPAFFAKTSAVYNPVIYIMMNKQFRNCMVT

: VCWAPIHIFVIVWTLVDIDRRDPLVVAALHLCIALGYANSSLNPVLYAFLDENFKRCFR-

: VCWTPIHIFILVEALGSTS-HSTAALSSYYFCIALGYTNSSLNPILYAFLDENFKRCFR-

: VCWTPIHIYVIIKALVTIPE-TTFQTVSWHFCIALGYTNSCLNPVLYAFLDENFKRCFR-

Rho : TLCCGKNPLGDDE-ASTTVSKTETSQVAPA

: QLCRKPCGRPDPSSFSRAREATARERVTACTPSDGPGGGAAA

: DFCFPLKMRMERQSTSRVRNTVQDPAYLRDIDGMNKPV

: EFCIPTSSNIEQQNSTRIRQNTRDHPSTANTVDRTNHQLENLEAETAPLP

TM1 1.50 TM2

TM2

2.50

TM3 3.50

TM4 4.50

TM5 5.50

H8TM6 TM76.50 7.50

TM6

1 2

3 4

OR

OROR

OR

OROR

OR

OR

OR

OR

OROR

OROR

OR

OROR

OR

OR

OR

OR

Rho : -------------------MNGTEGPNFYVPFSNKTGVVRSPFEAPQYYLAEPW------

: -----------------------MEPAPSAGAELQPPLFANASDAYPSACPSAG-ANASG

: --------------MESPIQIFRGEPGPTCAPSACLPPNSSAWFPGWAEPDSNGSAGSED

: -MDSSAAPTNASNCTDALAYSSCSPAPSPGSWVNLSHLDGNLSDPCGPNRTDLG-GRDS-

Rho : -----------QFSMLAAYMFLLIMLGFPINFLTLYVTVQHKKLRTPLNYILLNLAVADL

: PPGARSASSLALAIAITALYSAVCAVGLLGNVLVMFGIVRYTKMKTATNIYIFNLALADA

: AQLEPAHISPAIPVIITAVYSVVFVVGLVGNSLVMFVIIRYTKMKTATNIYIFNLALADA

: LCPPTGSPSMITAITIMALYSIVCVVGLFGNFLVMYVIVRYTKMKTATNIYIFNLALADA

Rho : FMVFGGFTTTLYTSLHGYFVFGPTGCNLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIERYVVVCKPMS

: LATS-TLPFQSAKYLMETWPFGELLCKAVLSIDYYNMFTSIFTLTMMSVDRYIAVCHPVK

: LVTT-TMPFQSTVYLMNSWPFGDVLCKIVISIDYYNMFTSIFTLTMMSVDRYIAVCHPVK

: LATS-TLPFQSVNYLMGTWPFGTILCKIVISIDYYNMFTSIFTLCTMSVDRYIAVCHPVK

Rho : NFRFG-ENHAIMGVAFTWVMALACAAPPLV-GWSRYIPEGMQCSCGIDYYTPHEETNNES

: ALDFRTPAKAKLINICIWVLASGVGVPIMVMAVTRPRDGA--VVCMLQFPSP-SWYWDTV

: ALDFRTPLKAKIINICIWLLSSSVGISAIVLGGTKVREDVDVIECSLQFPDDDYSWWDLF

: ALDFRTPRNAKIINVCNWILSSAIGLPVMFMATTKYRQGS--IDCTLTFSHP-TWYWENL

Rho : FVIYMFVVHFIIPLIVIFFCYGQLVFTVKEAAAQQQESATTQKAEKEVTRMVIIMVIAFL

: TKICVFLFAFVVPILIITVCYGLMLLRLRSVRLLSG-SKEKDRSLRRITRMVLVVVGAFV

: MKICVFIFAFVIPVLIIIVCYTLMILRLKSVRLLSG-SREKDRNLRRITRLVLVVVAVFV

: LKICVFIFAFIMPVLIITVCYGLMILRLKSVRMLSG-SKEKDRNLRRITRMVLVVVAVFI

Rho : ICWLPYAGVAFYIFTHQGS---DFGPIFMTIPAFFAKTSAVYNPVIYIMMNKQFRNCMVT

: VCWAPIHIFVIVWTLVDIDRRDPLVVAALHLCIALGYANSSLNPVLYAFLDENFKRCFR-

: VCWTPIHIFILVEALGSTS-HSTAALSSYYFCIALGYTNSSLNPILYAFLDENFKRCFR-

: VCWTPIHIYVIIKALVTIPE-TTFQTVSWHFCIALGYTNSCLNPVLYAFLDENFKRCFR-

Rho : TLCCGKNPLGDDE-ASTTVSKTETSQVAPA

: QLCRKPCGRPDPSSFSRAREATARERVTACTPSDGPGGGAAA

: DFCFPLKMRMERQSTSRVRNTVQDPAYLRDIDGMNKPV

: EFCIPTSSNIEQQNSTRIRQNTRDHPSTANTVDRTNHQLENLEAETAPLP

TM1 1.50 TM2

TM2

2.50

TM3 3.50

TM4 4.50

TM5 5.50

H8TM6 TM76.50 7.50

TM6

1 2

3 4

OR

OROR

OR

OROR

OR

OR

OR

OR

OROR

OROR

OR

OROR

OR

OR

OR

OR

Rys. 4. Uliniowienie sekwencji trzech receptorw opioidowych DOR, KOR i MOR oraz sekwencji

rodopsyny. Kolorem niebieskim zaznaczono najlepiej zachowane w ewolucji reszty obecne w helisach

I-VII, kolorem czerwonym motywy charakterystyczne dla rodziny A receptorw GPCR, kolorem

zielonym zaznaczono: dwie cysteiny tworzce wizanie disulfidowe (pomidzy helis TMH:III oraz

drug ptl zewntrzkomrkow) oraz palmitylowan cystein z helisy VIII. Linie niebieskie

wyznaczaj pooenie -helis transbonowych w uliniowionych sekwencjach receptorw. Linie zielone

oznaczaj lokalizacje -kartek w sekwencji rodopsyny. Kolorem tym oznaczono przerw w

sekwencji receptorw opioidowych w helisie II. Uliniowienie sekwencji wykonane na podstawie pracy

[102].

Badania dotyczce wizania jonw Zn2+

do zmodyfikowanej struktury receptorw

opioidowych (ang. engineered zinc-binding sites) [102] sugeruj, i w przeciwiestwie do

- 15 -

struktury rodopsyny, w miejscu znajdowania si reszty Gly w TMH:II na pozycji 2.56 nie

wystpuje odpowiadajcy jej aminokwas w sekwencji trzech receptorw opioidowych.

Brak reszty na wyej wymienionej pozycji sprawia, i ten fragment biaka

prawdopodobnie przyjmuje struktur regularnej -helisy (przerwa zaznaczona kolorem

tym, (Rys. 4.)).

1.3.1. Ligandy receptorw opioidowych

Mianem opiatw okrelamy wszystkie naturalne zwizki egzogenne modulujce

aktywno podstawow (ang. basal activity) receptorw opioidowych. Zaliczamy do nich

wszystkie alkaloidy obecne w opium, takie jak: morfina, heroina, czy kodeina, oraz ich

pochodne [103]. Substancje te wpywaj silnie na ukad nerwowy czowieka, prowadz do

stanw euforycznych jak i depresyjnych, wykazuj silne dziaanie przeciwblowe [13, 74].

Przyjmowanie opiatw moe prowadzi do szybkiego uzalenienia [79]. Szerszym

pojciem okrelajcym wszystkie zwizki wykazujce powinowactwo w stosunku do

receptorw opioidowych s opioidy. Zaliczamy do nich zarwno opiaty, ich pochodne

syntetyczne, jak i rwnie endogenne ligandy peptydowe, takie jak endorfiny, enkefaliny,

endomorfiny czy dynorfiny [104, 105].

Tabela 1. Endogenne ligandy peptydowe receptorw opioidowych.

Peptyd Selektywno Sekwencja aminokwasw

Enkefalina DOR Tyr-Gly-Gly-Phe-X, X=Leu lub Met

Dynorfina A

KOR

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-

Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln

Endomorfina MOR Tyr-Pro-X-Phe-NH2, X=Trp lub Phe

Endomorfiny, enkefaliny oraz dynorfiny, naturalne ligandy peptydowe receptorw

opioidowych (Tabela 1.) s czsteczkami zbudowanymi z kilku do kilkudziesiciu

aminokwasw. Ligandy te wykazuj selektywno wzgldem receptorw MOR, DOR oraz

KOR. Peptydy te charakteryzuje wsplny motyw obecny od strony N-koca acucha

peptydowego, sekwencja Tyr-Gly-Gly-Phe (lub Tyr-Pro-Phe/Trp-Phe) [105-108]. Wedug

postulowanego modelu wizania si ligandw, nazywanego potocznie: wiadomo-adres

(ang. message-address) [109], wsplna dla peptydowych ligandw opioidowych

sekwencja czterech aminokwasw jest odpowiedzialna za przekazanie sygnau

- 16 -

wiadomoci. Pozostaa cz acucha polipeptydowego, specyficzna dla kadego liganda,

odpowiada za selektywno wzgldem danego typu receptora opioidowego adres [110]

(Rys. 5). Proponowany model oddziaywa zakada, i okrelony receptor posiada domen

odpowiedzialn za rozpoznawanie wsplnego dla ligandw opioidowych farmakoforu

(modelu opisujcego relacje przestrzenne midzy elementami wsplnymi dla ligandw

oddziaujcych z danym receptorem) oraz ssiednie miejsce specyficzne dla danego typu

receptora, odpowiadajce za jego selektywno.

NN

NN

NH2

O

H O

H

H O

H

R

OH

O

COOH

N

OH

O

H

N

OH

ENKEFALINA

NTI

a)

b)

cznik

cznik

wiadomo

wiadomo

adres

NN

NN

NH2

O

H O

H

H O

H

R

OH

O

COOH

N

OH

O

H

N

OH

ENKEFALINA

NTI

a)

b)

cznik

cznik

wiadomo

wiadomo

adres

Rys. 5. Porwnanie struktury dwch ligandw opioidowych, selektywnych wzgldem receptora DOR:

a) struktura naturalnego liganda peptydowego enkefaliny, b) struktura zaprojektowanego liganda

naltrindolu (NTI) [111]. Zaznaczono fragmenty czsteczek odpowiadajce za: wiadomo, cznik oraz

adres. Kolorem czerwonym oznaczono wsplny element strukturalny tyramin.

W oparciu o powyszy model wizania peptydowych ligandw opioidowych

podjto prby zaprojektowania nowych zwizkw wykazujcych selektywno wzgldem

danego typu receptora MOR, DOR lub KOR [111-113]. Zwizki te skaday si z trzech

czci: fragmentu odpowiedzialnego za wiadomo, ktr bya czsteczka tyraminy

(obecna zarwno w typowych alkaloidach jak morfina czy kodeina oraz w endogennych

ligandach peptydowych), cznika (np. szkieletu naladujcego sekwencje -Gly-Gly- ),

- 17 -

oraz czci odpowiedzialnej za adres, posiadajcej podobne cechy do czci adresowej

endogennych ligandw peptydowych [111-113, 114 ] (Rys. 5).

Otrzymane ligandy wykazujce selektywno wzgldem kadego z trzech typw

receptorw opioidowych przyczyniy si do znacznego rozwoju bada nad mechanizmami

wizania si opioidw. Eksperymenty z zastosowaniem mutacji kierunkowych pozwoliy

rwnie na okrelenie miejsca wizania tych ligandw oraz niektrych aminokwasw

odpowiedzialnych za bezporednie oddziaywanie ligand-receptor, a take umoliwiy

budow nowych syntetycznych zwizkw opioidowych [92, 94-99, 111, 113]. Obecnie

znana jest dua liczba ligandw niepeptydowych wykazujcych powinowactwo do trzech

typw receptorw opioidowych: MOR, KOR oraz DOR (Tabela 2.).

Tabela 2. Niepeptydowe ligandy receptorw opioidowych.

Nazwa Waciwoci Efekt dziaania

Naltrekson antagonista MOR, KOR, DOR blokada receptora, senno

Morfina agonista MOR, DOR silny analgetyk

GNTI antagonista KOR blokada receptora

Tramadol czciowy agonista MOR analgetyk

nor-BNI antagonista KOR blokada receptora

NTI antagonista DOR blokada receptora, senno

-FNA antagonista MOR blokada receptora

Butorfanol agonista KOR, czciowy antagonista receptora MOR

analgetyk

1.4. Znane struktury krystalograficzne receptorw GPCR

Otrzymywanie metodami krystalografii rentgenowskiej struktur przestrzennych

biaek bonowych, w tym receptorw GPCR, jest bardzo trudne. Dzieje si tak poniewa,

w przeciwiestwie do globularnych biaek cytoplazmatycznych, biaka bonowe posiadaj

du powierzchnie hydrofobow uniemoliwiajc prawidow krystalizacj w roztworach

wodnych [115]. Otrzymanie krysztaw nadajcych si do pomiarw wymaga rwnie

uwzgldnienia otaczajcej bony lipidowej oraz zastosowania specyficznych warunkw

krystalizacji (temperatura, roztwr, cinienie, detergenty) [116]. Ponadto, cech

charakterystyczn wikszoci receptorw GPCR jest niezerowa aktywno podstawowa,

powodujca samoczynne przejcie receptora do stanu penej aktywacji. Dodatkowo, dua

niestabilno konformacyjna receptorw GPCR utrudnia otrzymanie krysztaw

nadajcych si do pomiarw rentgenostrukturalnych [117]. Do dzisiaj znamy struktury

- 18 -

krystaliczne jedynie czterech receptorw GPCR (rodopsyny, receptora A2A

adenozynowego oraz receptorw 1 i 2 adrenergicznych) [8, 10, 11, 16, 18, 26], z ktrych

najlepiej zbadanym (struktury: PDB: ID: 1F88, 1HZX, 1L9H, 1GZM, 1U19, 2J4Y, 2I37,

3CAP, 3DQB, 2Z73, 2ZIY) [8, 16, 17, 26, 105, 118-123] jest biako fotoreceptorowe

rodopsyna, dlatego jej struktura i modyfikacje zostan przedstawione najdokadniej. [9, 21,

49, 124-131]

1.4.1. Rodopsyna

Rodopsyna jest biakiem fotoreceptorowym zlokalizowanym w komrkach

prcikowych siatkwki oka. Receptor ten bierze udzia w kaskadach sygnalizacyjnych

umoliwiajcych przeksztacenie sygnau wietlnego w impuls nerwowy [9]. Absorpcja

pojedynczego fotonu jest wystarczajca do przejcia receptora w stan aktywny, co

umoliwia zwizanie i aktywacj biaka G (transducyny) po wewntrznej stronie bony

komrkowej [125]. Aktywna podjednostka G aktywuje fosfodiesteraz [132, 133],

enzym hydrolizujcy cykliczny GMP (cGMP) do GMP, co zmniejsza stenie cGMP.

Zmiana stenia cGMP skutkuje czasowym zamkniciem kanaw potasowych powodujc

depolaryzacj bony i przepyw prdu do synapsy i dalej do mzgu. Przekazany sygna

ulega istotnemu wzmocnieniu. Dziej si tak gdy pojedyncza molekua rodopsyny moe

aktywowa ok. 500 czsteczek biaka G.

Rodopsyna zbudowana jest z czci biakowej opsyny oraz grupy prostetycznej

11-cis-retinalu (pochodnej witaminy A) (Rys. 6.). Kowalencyjnie zwizany ligand znajduje

si w kieszeni hydrofobowej, otoczonej przez helisy (TMH:II do TMH:VII), ktr

przykrywa druga ptla cytoplazmatyczna (EL:II). Poczenie pomidzy grup aldehydow

11-cis-retinalu oraz acuchem bocznym Lys:7.43 tworzy uprotonowana zasada Schiffa

[134]. Absorpcja kwantu wiata przez 11-cis-retinal skutkuje jego izomeracj i przejciem

w cakowicie-trans-retinal [9]. Zmiana w strukturze przestrzennej tego liganda prowadzi

do zmian konformacyjnych caego receptora oraz jego aktywacji [135].

Rodopsyna jest biakiem o masie 40 kDa (kilodaltonw), skadajcym si z 348

aminokwasw (AA). Rodopsyna, podobnie jak inne receptory GPCR, posiada

charakterystyczny motyw siedmiu -helis przechodzcych przez dwuwarstw lipidow.

Ich dugo wynosi odpowiednio od 19 AA do 34 AA. Najkrtsza helisa VIII pooona jest

rwnolegle do dwuwarstwy lipidowej, po stronie cytoplazmatycznej [8].

- 19 -

TMH:I

TMH:II

TMH:IIITMH:VIITMH:VI

TMH:V

TMH:IV

A) B)

11-cis-retinal

Lys:7.43

Glu:3.28

NH2

COOH

TMH:I

TMH:II

TMH:IIITMH:VIITMH:VI

TMH:V

TMH:IV

A) B)

11-cis-retinal

Lys:7.43

Glu:3.28

NH2

COOH

Rys. 6. A) Struktura krystaliczna rodopsyny (PDB ID: 1U19). Helisy transmembranowe od TMH:I do

TMH:VII zostay oznaczone kolorami odpowiednio od niebieskiego do czerwonego. B) Widok od

strony zewntrzkomrkowej na miejsce wice retinal. Czerwony, przerywany okrg wskazuje na

miejsce wizania retinalu (wizanie kowalencyjne za pomoc zasady Schiffa do lizyny Lys7.43) oraz na

kwas glutaminowy, Glu3.28, bedcy przeciwjonem dla protonowanej zasady Schiffa.

N-koniec rodopsyny zbudowany jest z 33 AA i jest dosy sztywny bowiem jego

konformacj stabilizuje -kartka utworzona przez reszty Thr:4-Glu:5 oraz Tyr:10-Val:11

[128]. Dwie reszty asparaginowe zlokalizowane na pozycji 2 oraz 15 (Asn:2 oraz Asn:15)

s miejscami glikozylacji receptora. Helisy transbonowe rodopsyny posiadaj

nieregularn budow oraz s odchylone od pionowej osi biaka [8]. Zgicia helis powstaj

gwnie na skutek wystpujcych w sekwencji reszt: prolin oraz glicyn. Najwiksze

zgicia w TMH:VI oraz TMH:VII spowodowane s przez obecno dobrze zachowanych

w sekwencji reszt Pro:6.50 oraz Pro:7.50. W helisach TMH:II oraz TMH:V wystpuj

odstpstwa od -helikalnej struktury drugorzdowej na skutek obecnoci dodatkowych

aminokwasw, odpowiednio: Gly:2.56 oraz Phe:5:47, tworzcych w miejscu

wystpowania fragmenty -helisy. Rwnie w rejonie zgicia TMH:VII, fragment

- 20 -

acucha biakowego przyjmuje nietypow konformacj helisy 310. Ptle czce helisy s

relatywnie krtkie z wyjtkiem EL:II oraz IL:II. Najdusza ptla rodopsyny (EL:II),

zlokalizowana pomidzy helisami TMH:IV oraz TMH:V, szczelnie przykrywa miejsce

wizania retinalu zapobiegajc prawdopodobnie samoistnej aktywacji rodopsyny, co jest

niezwykle istotne dla procesu widzenia [136]. Fragmenty ptli czcej TMH:IV oraz

TMH:V: Ile:179 do Glu:181 oraz Ser:186 do Ile:189, tworz struktur -kartki [128]. Za

stabilizacj ptli EL:II odpowiada dodatkowo wizanie disulfidowe tworzone pomidzy

Cys:3.25 z helisy TMH:III oraz Cys:187 z ptli EL:II. Najdusz ptl znajdujc si po

stronie wewntrzkomrkowej jest IL:II, czca TMH:IV oraz TMH:V. Porwnanie

wszystkich dostpnych struktur krystalicznych rodopsyny, zdeponowanych w bazie PDB,

pozwala przypuszcza, i fragment ten nie przyjmuje jednoznacznie okrelonej, stabilnej

konformacji. Due wartoci czynnika temperaturowego dla tego odcinka acucha

peptydowego rwnie sugeruj jego wysok mobilno. Domena tworzca C-koniec

receptora, od Asn:310 do Ala:348, nie jest dobrze upakowana. Midzy obecnymi tam

aminokwasami nie wystpuj adne oddziaywania usztywniajce ten fragment acucha

biakowego. Krtka helisa H:VIII, znajdujca si na powierzchni bony, jest stabilizowana

dziki palmitylacji Cys:323 i Cys324 [122]. Dugie palmitylowe acuchy, obecne na

kocu tej helisy, s trwale zakotwiczone w bonie komrkowej.

W sekwencji rodopsyny wystpuj charakterystyczne motywy dobrze zachowane w

procesie ewolucji take w innych typach receptorw GPCR z rodziny A (Rys. 7.) [9, 49,

137]. Po stronie cytoplazmatycznej helisy TMH:III, znajduje si mikrodomena D(E)RY (a

szczeglnie rodkowa, najbardziej zachowana w ewolucji reszta Arg:3.50), ktra tworzy

poczenie pomidzy helisami TMH:III i TMH:VI [137] poprzez utworzenie mostka

solnego pomidzy resztami Arg:3.50 oraz Glu:6.30. Podczas aktywacji receptora mostek

ten ulega zerwaniu a cz cytoplazmatyczna helisy TMH:VI ulega przemieszczeniu,

tworzc w ten sposb miejsce na zwizanie biaka G. Innym motywem o istotnym

znaczeniu jest mikrodomena NPxxY obecna na helisie VII, ktra czy helisy TMH:VII i

H:VIII. Ten fragment acucha biakowego, rwnie bierze udzia w procesie aktywacji

receptora prowadzcej do tworzenia kompleksu z biakiem G [49, 125]. Wzajemne

pooenie siedmiu helis transbonowych rodopsyny stabilizowane jest dodatkowo przez

oddziaywania hydrofobowe, jonowe, a take liczne wizania wodorowe [9]. Badania

krystalograficzne ujawniy take obecno czsteczek wody w strukturze rodopsyny, ktre

- 21 -

take uczestnicz w sieci wiza wodorowych we wntrzu receptora [121] i porednicz w

procesie aktywacji.

ERY

NPxxY

Grupy

oligosacharydowe

Mostek S-S

Grupy palmitynylowe

Retinal

Strona zewntrzkomrkowa

Strona cytoplazmatyczna

ERY

NPxxY

Grupy

oligosacharydowe

Mostek S-S

Grupy palmitynylowe

Retinal

Strona zewntrzkomrkowa

Strona cytoplazmatyczna

Rys. 7. Mikrodomeny obecne w krystalicznej strukturze rodopsyny (PDB ID: 1U19) [122]. Helisy

transmembranowe od TNH:I do TMH:VII (oraz H:VIII) zostay oznaczone kolorami od niebieskiego

do czerwonego. Przerywane linie obrazuj pooenie granic bony komrkowej.

1.4.2. Opsyna w stanie aktywnym

Dziki postpom w metodach krystalograficznych, a w szczeglnoci technice

mikroogniskowania, w 2008 roku udao si skrystalizowa opsyn (rodopsyna bez

retinalu) [16] oraz uzyska struktur kompleksu opsyny z C-kocow czci podjednostki

biaka G (GCT) [17]. Cz podjednostki biaka G wnika w gb rodopsyny i

uczestniczy bezporednio w przeniesieniu sygnau z aktywnego receptora na biako G.

Absorpcja kwantu wiata, powodujca izomeryzac retinalu, prowadzi do zmian

konformacyjnych w strukturze rodopsyny. Receptor przechodzi przez szereg stanw

- 22 -

porednich (czciowo aktywnych), osigajc ostatecznie form cakowicie aktywn

(zwan metarodopsyn II) [138], zdoln do wizania biaka G. Podczas tego procesu,

zasada Schiffa ulega hydrolizie, co umoliwia oddysocjowanie cakowicie-trans-retinalu z

miejsca wizania w rodopsynie. Nastpnie, z udziaem izomerazy, uwolniony ligand

zostaje przeksztacony z powrotem do formy 11-cis. Czsteczka opsyny wie si z 11-cis-

retinalem, co inicjuje kolejny cykl aktywacyjny [139]. Aby jednak aktywna rodopsyna lub

opsyna nie powodowaa staej aktywacji biaek G, a w konsekwencji caej komrki

prcikowej, istnieje mechanizm wygaszania receptora. W pierwszej kolejnoci aktywna

rodopsyna jest fosforylowana przez kinaz rodopsynow, a nastpnie do takiej rodopsyny

przycza si arestyna. Poniewa rodopsyna ulega oligomeryzacji sdzi si, e arestyna

tworzy kompleks z dimerem rodopsyny [140, 141].

Opsyna jest niestabilna konformacyjnie i moe istnie zarwno w formie aktywnej

jak i nieaktywnej (tzw. stan podstawowy). Wykazano, i niska warto pH oraz obecno

GCT (krtkich acuchw peptydowych, identycznych z C-kocow czci

podjednostki biaka G), dodatkowo stabilizuj stan aktywny opsyny [142].

a) b)a) b)

Rys. 8. a) Naoenie struktury rodopsyny w stanie podstawowym (kolor zielony, PDB ID: 1U19) [122]

oraz opsyny w stanie aktywnym (kolor pomaraczowy, PDB ID: 3DQB) [17]. Kolorem niebieskim

oznaczono GCT (peptyd identyczny z C-kocow czci podjednostki biaka G). Cyfry od 1 do 7

oznaczaj TMH:I do TMH:VII. b) Schemat przedstawiajcy rnice w strukturze rodopsyny oraz w

strukturze opsyny w kompleksie z GCT, widok od strony cytoplazmatycznej. Rysunek wykonany na

podstawie pracy [17].

Porwnujc dwie struktury charakterystyczne dla stanu podstawowego rodopsyny

(PDB ID: 1U19) [122] oraz formy aktywnej biaka (PDB ID: 3DQB) [17], zaobserwowa

- 23 -

mona due zmiany w pooeniu helis: TMH:V do TMH:VII. Natomiast struktura rdzenia

biaka, tworzona przez helisy: TMH:I do TMH:IV oraz pooenie ptli

zewntrzkomrkowych EL:I do EL:III wraz z domen N-kocow, s prawie

niezmieniona (Rys. 8.).

W strukturze opsyny cz cytoplazmatyczna TMH:VI jest odchylona o 7 na

zewntrz biaka [17]. Miejscem zgicia helisy jest reszta TRP:6.48, ktrej pooenie w

nieaktywnej strukturze rodopsyny jest stabilizowane przez zwizany 11-cis-retinal. W

strukturze opsyny widocznym zmianom podlega rwnie helisa TMH:V. Jest ona

przesunita w kierunku TMH:VI oraz wyduona o trzy skrty helisy. Skutkuje to

znacznym skrceniem ptli IL:III po stronie cytoplazmatycznej bony. Rwnie poowa

TMH:VII, zlokalizowana po wewntrzkomrkowej stronie bony, jest przesunita do

rodka receptora, co zmienia konformacj czci acucha czcego j z helis VIII

pooon prostopadle do bony. Rnice w lokalizacji poszczeglnych helis wpywaj na

struktur trzech ptli: IL:I do IL:III. Prowadzi to do zmiany ksztatu powierzchni

cytoplazmatycznej receptora w formie aktywnej, ktra jest interfejsem biorcym udzia w

wizaniu biaka G (transducyny).

Przeprowadzenie rodopsyny ze stanu nieaktywnego do formy aktywnej

(metarodopsyny II) wymaga zerwania oddziaywa wewntrzczsteczkowych

odpowiedzialnych za stabilizacj stanu podstawowego receptora. Kluczowe zmiany

zachodz wwczas w miejscu wystpowania dobrze zachowanych ewolucyjnie u

wszystkich receptorw GPCR z rodziny A, motyww: E(D)RY, NPxxY (Rys. 9.), w

miejscu wizania retinalu, jak i rwnie w pooeniu czci cytoplazmatycznej helis:

TMH:IV do TMH:VII [49, 135, 138, 143, 144].

Sie oddziaywa jonowych (tzw. ang. ionic lock) tworzona przez Arg:3.50 i

Glu:3.49 z motywu E(D)RY (obecnego na TMH:III) oraz oddziaujce z nimi Glu:6.30 i

Thr:6.34 z TMH:VI, stabilizuje wzajemne pooenie dwch helis [122]. Poczenie to

zostaje jednak zerwane podczas aktywacji receptora na skutek ruchu TMH:VI. Zmiana

pooenia czci cytoplazmatycznej TMH:V w stron TMH:VII prowadzi do powstania

wnki po stronie wewntrzkomrkowej opsyny, pozwalajcej na wizanie GCT. acuch

boczny Arg:3.50 tworzc wizanie wodorowe z Tyr:5.58, zmienia swoj orientacj w

kierunku wntrza receptora. Pozwala to na bezporednie oddziaywanie naadowanego

acucha bocznego Arg:3.50, z grup karbonylow cysteiny obecnej na C-kocu wizanej

podjednostki GCT. Dodatkowo, za stabilizacj formy aktywnej receptora, jak i rwnie

- 24 -

powstaej wnki, odpowiada Tyr:7.53 obecna w motywie NPxxY [17]. Piercie Tyr:7.53

(ktra w stanie nieaktywnym oddziauje z Phe:313 z helisy smej) skierowany do rodka

receptora, zapobiega zmianie pooenia TMH:VI (Rys. 9.).

TMH:VITMH:VI TMH:VITMH:VITMH:VTMH:V TMH:VTMH:V

TMH:IIITMH:III TMH:IIITMH:III

TMH:IVTMH:IV

H:VIIIH:VIII

GGCTCT

ARG:3.50ARG:3.50

ARG:3.50ARG:3.50

GLU:3.49GLU:3.49

TYR:5.58TYR:5.58

TYR:5.58TYR:5.58

GLU:6:30GLU:6:30

GLU:6:30GLU:6:30

THR:6.34THR:6.34

THR:6.34THR:6.34

GLU:3.49GLU:3.49

STAN NIEAKTYWNY STAN AKTYWNY

A) Sekwencja E(D)RY, tzw. ionic lock

B) Sekwencja NPxxY

TYR:7.53TYR:7.53

TYR:7.53TYR:7.53

GGCTCT

PHE:313PHE:313PHE:313PHE:313

TMH:VIITMH:VII

H:VIIIH:VIII

TMH:ITMH:I

TMH:VITMH:VI TMH:VITMH:VI

TMH:VIITMH:VII

TMH:ITMH:I

TMH:VITMH:VI TMH:VITMH:VITMH:VTMH:V TMH:VTMH:V

TMH:IIITMH:III TMH:IIITMH:III

TMH:IVTMH:IV

H:VIIIH:VIII

GGCTCT

ARG:3.50ARG:3.50

ARG:3.50ARG:3.50

GLU:3.49GLU:3.49

TYR:5.58TYR:5.58

TYR:5.58TYR:5.58

GLU:6:30GLU:6:30

GLU:6:30GLU:6:30

THR:6.34THR:6.34

THR:6.34THR:6.34

GLU:3.49GLU:3.49

STAN NIEAKTYWNY STAN AKTYWNY

A) Sekwencja E(D)RY, tzw. ionic lock

B) Sekwencja NPxxY

TYR:7.53TYR:7.53

TYR:7.53TYR:7.53

GGCTCT

PHE:313PHE:313PHE:313PHE:313

TMH:VIITMH:VII

H:VIIIH:VIII

TMH:ITMH:I

TMH:VITMH:VI TMH:VITMH:VI

TMH:VIITMH:VII

TMH:ITMH:I

Rys. 9. Rnice w ustawieniu dwu przecznikw molekularnych w czsteczce rodopsyny w stanie

nieaktywnym (PDB ID: 1U19) [122] i w stanie aktywnym (PDB ID: 3DQB) [17]. A) Zmiana pooenia

Glu:3.49, ARG:3.50 z motywu E(D)RY, czerwona przerywana linia symbolizuje wizania wodorowe.

B) Zmiana pooenia Tyr:7.53 z motywu NPxxY.

1.4.3. Receptor 1 oraz 2 adrenergiczny

Receptory adrenergiczne, podobnie jak rodopsyna, nale do rodziny A receptorw

GPCR. Receptory te zlokalizowane s w duej liczbie tkanek i narzdw czowieka,

midzy innymi w centralnym ukadzie nerwowym, wtrobie, trzustce, nerkach, pytkach

krwi i w oku [145]. Typowymi endogennymi ligandami tych biaek s hormony, takie jak

adrenalina (epinefryna) oraz noradrenalina (norepinefryna). Receptory adrenergiczne bior

udzia w kaskadach sygnalizacyjnych: regulujcych poziom cinienia ttniczego,

- 25 -

odpowiadajcych za czsto skurczw serca, wpywajcych na funkcje oddechowe oraz

mobilizacj organizmu do obrony [145]. Receptory adrenergiczne dzielimy na dwa typy

i . Ponadto w kadej z rodzin, wystpuje kilka podtypw danego receptora, ktre rni

si midzy sob lokalizacj w organizmie, selektywnoci w wizaniu ligandw, a take

sposobem przekazywania sygnau przez biaka G [146].

Obecnie znamy struktury krystaliczne dwch receptorw adrenergicznych: 1AR

(ang. 1 adrenergic receptor, PDB ID: 2VT4) [11] oraz 2AR (ang. 2 adrenergic

receptor, PDB ID: 2RH1, 2R4R i 2R4S) [10, 19, 20]. Ze wzgldu na trudnoci zwizane z

krystalizacj biaek bonowych [117] zastosowano rne metody do otrzymania krysztaw

wspomnianych receptorw. W celu otrzymania struktury 1AR (PDB ID: 2VT4) [11]

wprowadzono odpowiednie mutacje kierunkowe w acuchu polipeptydowym

zwikszajce stabilno receptora w detergencie [147]. Do konstrukcji krysztaw 2AR

zastosowano metod polegajc na stworzeniu hybrydy receptora z innymi biakami. W

pierwszym przypadku bya to hybryda receptora z fragmentem FAB (2AR-Fab5)

przeciwciaa monoklonalnego Mab5 [20], a w drugim hybryda z lizozymem T4 (2AR-

T4L) [10]. W obydwu przypadkach miejscem doczenia biaka stabilizujcego struktur

receptora bya pozostao po odcitej, bardzo dugiej, ptli cytoplazmatycznej IL:III.

Druga metoda pozwolia na okrelenie peniejszej struktury 2AR z lepsz rozdzielczoci,

rwn 2.4 PDB ID: 2RH1) [10]. Niestety, w obu strukturach krystalicznych N- i

C-koniec biaka s niewidoczne.

Struktury obu receptorw 1AR oraz 2AR s do siebie podobne. Pooenie helis

transmembranowych oraz ptli jest niemal identyczne. Jedyna znaczca rnica widoczna

jest w uoeniu IL:II (Rys. 10.). W strukturze 1AR ptla ta tworzy krtk helis

zorientowan prostopadle w stosunku do paszczyzny bony. Prawdopodobnie ptla ta jest

istotnym elementem biorcym udzia w procesie aktywacji receptorw adrenergicznych,

poniewa obecna tam reszta Tyr:149 tworzy wizanie wodorowe z reszt Asp:3.49,

pochodzc z motywu E(D)RY [11]. Natomiast reszta tyrozyny (Tyr:141) na

odpowiadajcej pozycji w strukturze receptora 2AR, oddziauje z Glu:6.30 (Rys. 10.). W

obu przypadkach mostek solny pomidzy helisami III i VI (ang. ionic lock) jest

przerwany, ale nie powoduje to jednak powstania w peni aktywnej struktury receptora.

Dwa podtypy receptorw adrenergicznych skrystalizowano w kompleksach z

antagonist (cyjanopindolol w 1AR) i agonist inwersyjnym (karazolol w 2AR), tak wic

struktura receptora nie powinna wykazywa ladw aktywacji. Tym niemniej ang. ionic

- 26 -

lock jest w stanie otwartym, co moe sugerowa i receptory te mog by w stanie

czciowo aktywnym, a same otwarcie zamka jonowego moe nie by wystarczajcym

warunkiem do przejcia receptora w stan cakowicie aktywny [19]. Istnieje te druga

hipoteza, e taka struktura z otwartym zamkiem jonowym moe suy do

przekazywania sygnau nie przez biako G, ale przez arestyn [148], bowiem reszta

tyrozyny z ptli IL:II, wic si do helis TMH:III lub TMH:VI, blokuje miejsce wizania

biaka G.

A) B)A) B)EL:IIEL:II

IL:IIIL:II

H8H8 H8H8

TMH:ITMH:I

TMH:IITMH:II

TMH:VITMH:VI

TMH:VIITMH:VII

TMH:VTMH:V

TMH:IIITMH:III

TMH:IVTMH:IV

TMH:VIITMH:VII

TMH:VITMH:VI

TMH:IIITMH:III

TMH:IVTMH:IV

TMH:ITMH:ITMH:IITMH:II

TMH:VTMH:V

TYR:141TYR:141

TYR:149TYR:149AASPSP:3.49:3.49

GLU:6.30

A) B)A) B)EL:IIEL:II

IL:IIIL:II

H8H8 H8H8

TMH:ITMH:I

TMH:IITMH:II

TMH:VITMH:VI

TMH:VIITMH:VII

TMH:VTMH:V

TMH:IIITMH:III

TMH:IVTMH:IV

TMH:VIITMH:VII

TMH:VITMH:VI

TMH:IIITMH:III

TMH:IVTMH:IV

TMH:ITMH:ITMH:IITMH:II

TMH:VTMH:V

TYR:141TYR:141

TYR:149TYR:149AASPSP:3.49:3.49

GLU:6.30

Rys. 10. A) Naoenie struktur krystalicznych receptorw: 1AR (PDB ID: 2VT4, kolor czerwony) oraz

2AR (PDB ID: 2RH1, kolor niebieski). B) Porwnanie uoenia drugiej ptli wewntrzkomrkowej

(IL:II), miejsce wystpowania ptli oznaczono zielon przerywan lini. Czerwone przerywane linie

symbolizuj wizania wodorowe.

Pomimo tego, i receptory adrenergiczne i rodopsyna nale do tej samej rodziny

A, wystpuj w nich pewne rnice strukturalne. W receptorach adrenergicznych helisa

TMH:I jest prosta, co skutkuje jej odchyleniem od reszty receptora po stronie

zewntrzkomrkowej. Spowodowane jest to brakiem reszty Pro:1.48 obecnej w strukturze

rodopsyny. TMH:IV jest odsunita od miejsca wizania liganda, natomiast TMH:V, po

stronie zewntrzkomrkowej, jest nieznacznie przemieszczona do rodka receptora. W

strukturach krystalicznych receptorw adrenergicznych cz cytozolowa TMH:VI jest

- 27 -

rwnie nieznacznie odchylona na zewntrz receptora w porwnaniu do struktury

rodopsyny, natomiast cz cytozolowa TMH:V przesunita jest w kierunku TMH:VI.

A)A) B)B)

C)C) D)D)

TMH:IVTMH:IVTMH:VTMH:V

TMH:IVTMH:IV

TMH:VTMH:V

TMH:IVTMH:IV

TMH:VTMH:V

TMH:IVTMH:IV

TMH:VTMH:V

TMH:ITMH:ITMH:ITMH:I

TMH:ITMH:ITMH:ITMH:I

TMH:IIITMH:III

TMH:IIITMH:III

TMH:IIITMH:III

TMH:IIITMH:III

TMH:IITMH:II

TMH:IITMH:II

TMH:IITMH:II

TMH:IITMH:II

TMH:VITMH:VI

TMH:VITMH:VI

TMH:VITMH:VI

TMH:VITMH:VI

TMH:VIITMH:VII

TMH:VIITMH:VIITMH:VIITMH:VII

TMH:VIITMH:VII

A)A) B)B)

C)C) D)D)

TMH:IVTMH:IVTMH:VTMH:V

TMH:IVTMH:IV

TMH:VTMH:V

TMH:IVTMH:IV

TMH:VTMH:V

TMH:IVTMH:IV

TMH:VTMH:V

TMH:ITMH:ITMH:ITMH:I

TMH:ITMH:ITMH:ITMH:I

TMH:IIITMH:III

TMH:IIITMH:III

TMH:IIITMH:III

TMH:IIITMH:III

TMH:IITMH:II

TMH:IITMH:II

TMH:IITMH:II

TMH:IITMH:II

TMH:VITMH:VI

TMH:VITMH:VI

TMH:VITMH:VI

TMH:VITMH:VI

TMH:VIITMH:VII

TMH:VIITMH:VIITMH:VIITMH:VII

TMH:VIITMH:VII

Rys. 11. Lokalizacja oraz ksztat drugiej ptli cytoplazmatycznej (EL:II) czcej helisy czwart i pit

(kolor czerwony) w strukturach krystalicznych receptorw: A) rodopsyny, B) 1AR, C)2AR oraz D)

receptora A2A adenozynowego. Kolor zielony oznacza lokalizacj wizanych ligandw w

prezentowanych receptorach. Wizania disulfidowe oznaczono kolorem tym. Widok od strony

zewntrzkomrkowej.

Znaczce rnice mona rwnie zaobserwowa w uoeniu ptli po obu stronach

receptorw 1AR, 2AR i rodopsyny. W receptorach adrenergicznych najdusza ptla

EL:II, przykrywajca miejsce wizania, przyjmuje struktur -helikaln, w odrnieniu od

-kartki obecnej w strukturze rodopsyny (Rys. 11.). Oprcz analogicznego wizania

- 28 -

disulfidowego wystpujcego w rodopsynie pomidzy Cys:3.25 z TMH:III oraz Cys:187,

za stabilizacj krtkiej -helisy odpowiedzialny jest dodatkowy mostek disulfidowy

obecny midzy resztami cystein na pozycjach 192 i 198 w 1AR, oraz na pozycjach 184 i

190 w 2AR (Rys. 11.).

Ligandy widoczne w strukturach receptorw 1AR, 2AR, zajmuj niemale

identyczn pozycj we wnce otoczonej przez TMH:II do TMH:VII. Pooenie dugiej

ptli EL:II powyej helisy TMH:III umoliwia atwy dostp ligandw dyfuzyjnych do

miejsca wicego w strukturach dwch receptorw adrenergicznych.

1.4.4. Receptor 2A adenozynowy

Receptory adenozynowe, podobnie jak receptory adrenergiczne oraz rodopsyna,

nale do najliczniejszej rodziny A receptorw GPCR. Istniej cztery typy receptorw

adenozynowych: A1, A2A, A2B oraz A3 [149, 150]. Kady z tych czterech receptorw

zlokalizowany jest w centralnym ukadzie nerwowym [151, 152]. W odpowiedzi na

zwizanie adenozyny receptory te kontroluj odczuwanie blu [153], reguluj przepyw

krwi przez mzg [154], wpywaj na sen [155], a take na funkcje oddechowe [156].

W roku 2008 skrystalizowano receptor A2A adenozynowy i wyznaczono jego

struktur (PDB ID: 3EML) w rozdzielczoci 2.6 [18]. W procesie krystalizacji biaka

wykorzystano metod, zastosowan ju wczeniej do otrzymania struktury receptora 2AR

[10], polegajc na stworzeniu hybrydy receptora z lizozymem T4 [157]. Przedstawiona

struktura zawieraa receptor ze zwizanym antagonist ZM241385 [158].

Uoenie przestrzenne helis transbonowych receptora A2 adenozynowego jest

bardzo podobne do wczeniej opisanych struktur receptorw GPCR. W porwnaniu do

struktury rodopsyny i struktur receptorw 1AR oraz 2AR, helisa TMH:VI jest

nieznacznie odchylona na zewntrz receptora w jej czci cytoplazmatycznej (Rys. 12.).

Receptor A2A adenozynowy posiada trzy cechy znacznie odrniajce go od

pozostaych struktur receptorw [18]. Po pierwsze, organizacja trzech ptli

zewntrzkomrkowych, od EL:I do EL:III, znacznie odbiega od tych widzianych w

strukturach receptorw adrenergicznych oraz w strukturze rodopsyny. Zwaszcza ptla

EL:II nie przyjmuje wyranie zdefiniowanej struktury drugorzdowej -helisy czy -kartki

(Rys. 11.). Jej konformacja jest stabilizowana przez trzy wizania disulfidowe, obecne

pomidzy parami cystein: Cys:77 i Cys:166, Cys:77 i Cys:159 oraz Cys:74 i Cys:146 (Rys.

11.). Dodatkowe, czwarte wizanie disulfidowe jest obecne w trzeciej ptli

- 29 -

zewntrzkomrkowej, pomidzy Cys:259 a Cys:262, co powoduje widoczne zakrzywienie

acucha biakowego w tym obszarze.

A) B)A) B)

TMH:VITMH:VI

TMH:VIITMH:VII

A) B)A) B)

TMH:VITMH:VI

TMH:VIITMH:VII

Rys. 12. a) Naoenie struktury receptora A2A adenozynowego (kolor czerwony) oraz struktur

receptorw 1AR i 2AR oraz rodopsyny (kolor niebieski). ta strzaka wskazuje na przesunity na

zewntrz biaka fragment TMH:VI receptora A2A adenozynowego po jego stronie cytozolowej. B)

Pooenie ligandw w miejscu wicym receptorw. Kolor pomaraczowy oznacza pooenie

ligandw receptorw 1AR (cyjanopindololu), 2AR (karazololu) oraz rodopsyny (retinalu). Kolor

zielony odpowiada pooeniu zwizanego liganda receptora A2A adenozynowego (ZM241385).

Po drugie, wizany antagonista (ZM241385) jest inaczej ulokowany w miejscu

wicym w porwnaniu do miejsc wizania ligandw w strukturach receptorw

adrenergicznych i w strukturze rodopsyny, bowiem ligand ten zorientowany jest

prostopadle w stosunku do paszczyzny bony. Antagonista pooony jest wzdu helisy

TMH:VII, oddziaujc jednoczenie z fragmentami EL:II oraz EL:III (Rys. 12.).

Trzeci cech charakterystyczn tylko dla receptora A2A adenozynowego jest

lokalizacja wnki wystpujcej pomidzy helisami transbonowymi, ktra na skutek

zmian w pooeniu helis (a szczeglnie TMH:III) jest przesunita w stron TMH:VI i

TMH:VII. W wyniku tego wizany ligand ma ograniczony dostp do TMH:III oraz

TMH:V (Rys. 11.).

- 30 -

W strukturze receptora A2A adenozynowego druga ptla cytoplazmatyczna

przyjmuje struktur drugorzdow -helikaln [18], wykazujc due podobiestwo do

struktury receptora 1AR. Tyr:112 obecna w ptli IL:II tworzy wizanie wodorowe z

asparagin (Asp:3.49), bdc czci dobrze zachowanego motywu E(D)RY.

Formowanie -helisy w obszarze drugiej ptli cytoplazmatycznej w strukturach

receptorw A2A adenozynowego oraz 1 adrenergicznego moe wiadczy o istotnej roli

tego motywu strukturalnego w procesie aktywacji. Obydwa receptory posiadaj wysok

aktywno podstawow, tj. moliwo przejcia do formy aktywnej bez obecnoci

zwizanego agonisty. W odrnieniu od nich, rodopsyna, nie wykazujca aktywnoci

podstawowej, oraz receptor 2 adrenergiczy, posiadajcy relatywnie nisk aktywno

podstawow, nie tworz struktury -helikalnej w obszarze drugiej ptli cytoplazmatycznej

Literatura

1. Pierce, K.L., R.T. Premont, and R.J. Lefkowitz, Seven-transmembrane receptors.

Nat Rev Mol Cell Biol, 2002. 3(9): p. 639-50.

2. George, S.R., B.F. O'Dowd, and S.P. Lee, G-protein-coupled receptor

oligomerization and its potential for drug discovery. Nat Rev Drug Discov, 2002.

1(10): p. 808-20.

3. Horn, F., et al., GPCRDB information system for G protein-coupled receptors.

Nucleic Acids Res, 2003. 31(1): p. 294-7.

4. Foord, S.M., et al., International Union of Pharmacology. XLVI. G protein-coupled

receptor list. Pharmacol Rev, 2005. 57(2): p. 279-88.

5. Attwood, T.K. and J.B. Findlay, Fingerprinting G-protein-coupled receptors.

Protein Eng, 1994. 7(2): p. 195-203.

6. Schioth, H.B. and R. Fredriksson, The GRAFS classification system of G-protein

coupled receptors in comparative perspective. Gen Comp Endocrinol, 2005. 142(1-

2): p. 94-101.

7. Kristiansen, K., Molecular mechanisms of ligand binding, signaling, and regulation

within the superfamily of G-protein-coupled receptors: molecular modeling and

mutagenesis approaches to receptor structure and function. Pharmacol Ther, 2004.

103(1): p. 21-80.

8. Palczewski, K., et al., Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled

receptor. Science, 2000. 289(5480): p. 739-45.

9. Filipek, S., et al., G protein-coupled receptor rhodopsin: a prospectus. Annu Rev

Physiol, 2003. 65: p. 851-79.

10. Cherezov, V., et al., High-resolution crystal structure of an engineered human

beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science, 2007. 318(5854): p. 1258-

65.

11. Warne, T., et al., Structure of a beta(1)-adrenergic G-protein-coupled receptor.

Nature, 2008.

- 31 -

12. Taira, C.A., et al., Therapeutic implications of beta-adrenergic receptor

pharmacodynamic properties. Curr Clin Pharmacol, 2008. 3(3): p. 174-84.

13. Trescot, A.M., et al., Opioid pharmacology. Pain Physician, 2008. 11(2 Suppl): p.

S133-53.

14. Corbett, A.D., et al., 75 years of opioid research: the exciting but vain quest for the

Holy Grail. Br J Pharmacol, 2006. 147 Suppl 1: p. S153-62.

15. Davis, M.P., S.B. LeGrand, and R. Lagman, Look before leaping: combined

opioids may not be the rave. Support Care Cancer, 2005. 13(10): p. 769-74.

16. Park, J.H., et al., Crystal structure of the ligand-free G-protein-coupled receptor

opsin. Nature, 2008. 454(7201): p. 183-7.

17. Scheerer, P., et al., Crystal structure of opsin in its G-protein-interacting

conformation. Nature, 2008. 455(7212): p. 497-502.

18. Jaakola, V.P., et al., The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine

receptor bound to an antagonist. Science, 2008. 322(5905): p. 1211-7.

19. Rosenbaum, D.M., et al., GPCR engineering yields high-resolution structural

insights into beta2-adrenergic receptor function. Science, 2007. 318(5854): p.

1266-73.

20. Rasmussen, S.G., et al., Crystal structure of the human beta2 adrenergic G-

protein-coupled receptor. Nature, 2007. 450(7168): p. 383-7.

21. Mirzadegan, T., et al., Sequence analyses of G-protein-coupled receptors:

similarities to rhodopsin. Biochemistry, 2003. 42(10): p. 2759-2767.

22. Pin, J.P., T. Galvez, and L. Prezeau, Evolution, structure, and activation

mechanism of family 3/C G-protein-coupled receptors. Pharmacol Ther, 2003.

98(3): p. 325-54.

23. Felder, C.B., et al., The Venus flytrap of periplasmic binding proteins: an ancient

protein module present in multiple drug receptors. AAPS PharmSci, 1999. 1(2): p.

E2.

24. Gether, U., Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-

coupled receptors. Endocr Rev, 2000. 21(1): p. 90-113.

25. Bohn, L.M., et al., Mu-opioid receptor desensitization by beta-arrestin-2

determines morphine tolerance but not dependence. Nature, 2000. 408(6813): p.

720-3.

26. Salom, D., et al., Crystal structure of a photoactivated deprotonated intermediate

of rhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(44): p. 16123-8.

27. Kobilka, B.K. and X. Deupi, Conformational complexity of G-protein-coupled

receptors. Trends Pharmacol Sci, 2007. 28(8): p. 397-406.

28. Spijker, P., et al., Dynamic behavior of fully solvated beta2-adrenergic receptor,

embedded in the membrane with bound agonist or antagonist. Proc Natl Acad Sci

U S A, 2006. 103(13): p. 4882-7.

29. Watanabe, Y.S., Y. Fukunishi, and H. Nakamura, Modelling of third cytoplasmic

loop of bovine rhodopsin by multicanonical molecular dynamics. J Mol Graph

Model, 2004. 23(1): p. 59-68.

30. Savarese, T.M. and C.M. Fraser, In vitro mutagenesis and the search for structure-

function relationships among G protein-coupled receptors. Biochem J, 1992. 283 (

Pt 1): p. 1-19.

31. Hedin, K.E., K. Duerson, and D.E. Clapham, Specificity of receptor-G protein

interactions: searching for the structure behind the signal. Cell Signal, 1993. 5(5):

p. 505-18.

32. Strader, C.D., et al., Structure and function of G protein-coupled receptors. Annu

Rev Biochem, 1994. 63: p. 101-32.

- 32 -

33. Wess, J., G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor

activation and selectivity of G-protein recognition. Faseb J, 1997. 11(5): p. 346-54.

34. Zhang, Z., et al., How a G protein binds a membrane. J Biol Chem, 2004. 279(32):

p. 33937-45.

35. Oldham, W.M. and H.E. Hamm, Heterotrimeric G protein activation by G-protein-

coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008. 9(1): p. 60-71.

36. Oldham, W.M. and H.E. Hamm, How do receptors activate G proteins? Adv

Protein Chem, 2007. 74: p. 67-93.

37. Kenakin, T., Efficacy at G-protein-coupled receptors. Nat Rev Drug Discov, 2002.

1(2): p. 103-10.

38. Swaminath, G., et al., Probing the beta2 adrenoceptor binding site with catechol

reveals differences in binding and activation by agonists and partial agonists. J

Biol Chem, 2005. 280(23): p. 22165-71.

39. Swaminath, G., et al., Sequential binding of agonists to the beta2 adrenoceptor.

Kinetic evidence for intermediate conformational states. J Biol Chem, 2004.

279(1): p. 686-91.

40. Kobilka, B., Agonist binding: a multistep process. Mol Pharmacol, 2004. 65(5): p.

1060-2.

41. Ghanouni, P., et al., Functionally different agonists induce distinct conformations

in the G protein coupling domain of the beta 2 adrenergic receptor. J Biol Chem,

2001. 276(27): p. 24433-6.

42. Mahalingam, M., et al., Two protonation switches control rhodopsin activation in

membranes. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(46): p. 17795-800.

43. Bhattacharya, S., S.E. Hall, and N. Vaidehi, Agonist-induced conformational

changes in bovine rhodopsin: insight into activation of G-protein-coupled

receptors. J Mol Biol, 2008. 382(2): p. 539-55.

44. Bhattacharya, S., et al., Ligand-stabilized conformational states of human beta(2)

adrenergic receptor: insight into G-protein-coupled receptor activation. Biophys J,

2008. 94(6): p. 2027-42.

45. Singh, R., et al., Activation of the cannabinoid CB1 receptor may involve a W6

48/F3 36 rotamer toggle switch. J Pept Res, 2002. 60(6): p. 357-70.

46. Shi, L., et al., Beta2 adrenergic receptor activation. Modulation of the proline kink

in transmembrane 6 by a rotamer toggle switch. J Biol Chem, 2002. 277(43): p.

40989-96.

47. Kim, J.M., et al., Structural origins of constitutive activation in rhodopsin: Role of

the K296/E113 salt bridge. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(34): p. 12508-13.

48. Porter, J.E., J. Hwa, and D.M. Perez, Activation of the alpha1b-adrenergic receptor

is initiated by disruption of an interhelical salt bridge constraint. J Biol Chem,

1996. 271(45): p. 28318-23.

49. Fritze, O., et al., Role of the conserved NPxxY(x)5,6F motif in the rhodopsin ground

state and during activation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(5): p. 2290-5.

50. Frauenfelder, H., S.G. Sligar, and P.G. Wolynes, The energy landscapes and

motions of proteins. Science, 1991. 254(5038): p. 1598-603.

51. Nie, J. and D.L. Lewis, Structural domains of the CB1 cannabinoid receptor that

contribute to constitutive activity and G-protein sequestration. J Neurosci, 2001.

21(22): p. 8758-64.

52. Kudo, M., et al., Transmembrane regions V and VI of the human luteinizing

hormone receptor are required for constitutive activation by a mutation in the third

intracellular loop. J Biol Chem, 1996. 271(37): p. 22470-8.

- 33 -

53. Nikiforovich, G.V., et al., Molecular mechanisms of constitutive activity: mutations

at position 111 of the angiotensin AT1 receptor. J Pept Res, 2005. 66(5): p. 236-48.

54. Han, M., S.O. Smith, and T.P. Sakmar, Constitutive activation of opsin by mutation

of methionine 257 on transmembrane helix 6. Biochemistry, 1998. 37(22): p. 8253-

61.

55. Egan, C., K. Herrick-Davis, and M. Teitler, Creation of a constitutively activated

state of the 5-HT2A receptor by site-directed mutagenesis: revelation of inverse

agonist activity of antagonists. Ann N Y Acad Sci, 1998. 861: p. 136-9.

56. Alewijnse, A.E., et al., The effect of mutations in the DRY motif on the constitutive

activity and structural instability of the histamine H(2) receptor. Mol Pharmacol,

2000. 57(5): p. 890-8.

57. Huang, P., et al., Functional role of a conserved motif in TM6 of the rat mu opioid

receptor: constitutively active and inactive receptors result from substitutions of

Thr6.34(279) with Lys and Asp. Biochemistry, 2001. 40(45): p. 13501-9.

58. Gao, Y., et al., Generation of a constitutively active mutant of human

GPR48/LGR4, a G-protein-coupled receptor. Hokkaido Igaku Zasshi, 2006. 81(2):

p. 101-5, 107, 109.

59. Mukherjee, R.S., et al., Point mutations in either subunit of the GABAB receptor

confer constitutive activity to the heterodimer. Mol Pharmacol, 2006. 70(4): p.

1406-13.

60. Ghanouni, P., et al., Agonist-induced conformational changes in the G-protein-

coupling domain of the beta 2 adrenergic receptor. Proc Natl Acad Sci U S A,

2001. 98(11): p. 5997-6002.

61. Brownstein, M.J., A brief history of opiates, opioid peptides, and opioid receptors.

Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(12): p. 5391-3.

62. Pert, C.B. and S.H. Snyder, Opiate receptor: demonstration in nervous tissue.

Science, 1973. 179(77): p. 1011-4.

63. Simon, E.J., J.M. Hiller, and I. Edelman, Stereospecific binding of the potent

narcotic analgesic (3H) Etorphine to rat-brain homogenate. Proc Natl Acad Sci U

S A, 1973. 70(7): p. 1947-9.

64. Terenius, L., Stereospecific interaction between narcotic analgesics and a synaptic

plasm a membrane fraction of rat cerebral cortex. Acta Pharmacol Toxicol

(Copenh), 1973. 32(3): p. 317-20.

65. Lord, J.A., et al., Endogenous opioid peptides: multiple agonists and receptors.

Nature, 1977. 267(5611): p. 495-9.

66. Kosterlitz, H.W., S.J. Paterson, and L.E. Robson, Characterization of the kappa-

subtype of the opiate receptor in the guinea-pig brain. Br J Pharmacol, 1981. 73(4):

p. 939-49.

67. Yasuda, K., et al., Cloning and functional comparison of kappa and delta opioid

receptors from mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(14): p. 6736-40.

68. Raynor, K., et al., Characterization of the cloned human mu opioid receptor. J

Pharmacol Exp Ther, 1995. 272(1): p. 423-8.

69. Raynor, K., et al., Pharmacological characterization of the cloned kappa-, delta-,

and mu-opioid receptors. Mol Pharmacol, 1994. 45(2): p. 330-4.

70. Lai, J., et al., Pharmacological characterization of the cloned kappa opioid

receptor as a kappa 1b subtype. Neuroreport, 1994. 5(16): p. 2161-4.

71. Ammer, H. and R. Schulz, Stable expression and functional characterization of the

cloned rat mu-opioid receptor in human epidermoid carcinoma (A431) cells.

Zentralbl Veterinarmed A, 1996. 43(4): p. 193-200.

- 34 -

72. Evans, C.J., et al., Cloning of a delta opioid receptor by functional expression.

Science, 1992. 258(5090): p. 1952-5.

73. Kieffer, B.L., et al., The delta-opioid receptor: isolation of a cDNA by expression

cloning and pharmacological characterization. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992.

89(24): p. 12048-52.

74. Przewlocki, R. and B. Przewlocka, Opioids in chronic pain. Eur J Pharmacol, 2001.

429(1-3): p. 79-91.

75. Chen, X., et al., Altered gating of opiate receptor-modulated K+ channels on

amygdala neurons of morphine-dependent rats. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000.

97(26): p. 14692-6.

76. Mihara, S. and R.A. North, Opioids increase potassium conductance in submucous

neurones of guinea-pig caecum by activating delta-receptors. Br J Pharmacol,

1986. 88(2): p. 315-22.

77. Muller, W., S. Hallermann, and D. Swandulla, Opioidergic modulation of voltage-

activated K+ currents in magnocellular neurons of the supraoptic nucleus in rat. J

Neurophysiol, 1999. 81(4): p. 1617-25.

78. Margolis, E.B., et al., Kappa-opioid agonists directly inhibit midbrain

dopaminergic neurons. J Neurosci, 2003. 23(31): p. 9981-6.

79. Raith, K. and G. Hochhaus, Drugs used in the treatment of opioid tolerance and

physical dependence: a review. Int J Clin Pharmacol Ther, 2004. 42(4): p. 191-203.

80. Zhang, Y., et al., Effect of the endogenous kappa opioid agonist dynorphin A(1-17)

on cocaine-evoked increases in striatal dopamine levels and cocaine-induced place

preference in C57BL/6J mice. Psychopharmacology (Berl), 2004. 172(4): p. 422-9.

81. Dhawan, B.N., et al., International Union of Pharmacology. XII. Classification of

opioid receptors. Pharmacol Rev, 1996. 48(4): p. 567-92.

82. Meunier, J.C., et al., Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid

receptor-like ORL1 receptor. Nature, 1995. 377(6549): p. 532-5.

83. Henderson, G. and A.T. McKnight, The orphan opioid receptor and its endogenous

ligand--nociceptin/orphanin FQ. Trends Pharmacol Sci, 1997. 18(8): p. 293-300.

84. Reinscheid, R.K., et al., Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike

G protein-coupled receptor. Science, 1995. 270(5237): p. 792-4.

85. Gupta, A., F.M. Decaillot, and L.A. Devi, Targeting opioid receptor heterodimers:

Strategies for screening and drug development. AAPS Journal, 2006. 8(1): p.

E153-E159.

86. Jordan, B.A. and L.A. Devi, G-protein-coupled receptor heterodimerization

modulates receptor function. Nature, 1999. 399(6737): p. 697-700.

87. Lunzer, M.M. and P.S. Portoghese, Selectivity of delta- and kappa-opioid ligands

depends on the route of central administration in mice. J Pharmacol Exp Ther,

2007. 322(1): p. 166-71.

88. Chaturvedi, K., et al., Structure and regulation of opioid receptors. Biopolymers,

2000. 55(4): p. 334-46.

89. Law, P.Y. and H.H. Loh, Regulation of opioid receptor activities. J Pharmacol Exp

Ther, 1999. 289(2): p. 607-24.

90. Chavkin, C., J.P. McLaughlin, and J.P. Celver, Regulation of opioid receptor

function by chronic agonist exposure: constitutive activity and desensitization. Mol

Pharmacol, 2001. 60(1): p. 20-5.

91. Li, J.G., et al., ASP147 in the third transmembrane helix of the rat mu opioid

receptor forms ion-pairing with morphine and naltrexone. Life Sci, 1999. 65(2): p.

175-85.

- 35 -

92. Befort, K., et al., Constitutive activation of the delta opioid receptor by mutations

in transmembrane domains III and VII. J Biol Chem, 1999. 274(26): p. 18574-81.

93. Meng, F., et al., Creating a functional opioid alkaloid binding site in the orphanin

FQ receptor through site-directed mutagenesis. Mol Pharmacol, 1998. 53(4): p.

772-7.

94. Bot, G., et al., Mutagenesis of a single amino acid in the rat mu-opioid receptor

discriminates ligand binding. J Neurochem, 1998. 70(1): p. 358-65.

95. Bot, G., et al., Mutagenesis of the mouse delta opioid receptor converts (-)-

buprenorphine from a partial agonist to an antagonist. J Pharmacol Exp Ther,

1998. 284(1): p. 283-90.

96. Spivak, C.E., et al., Naloxone activation of mu-opioid receptors mutated at a

histidine residue lining the opioid binding cavity. Mol Pharmacol, 1997. 52(6): p.

983-92.

97. Mansour, A., et al., Key residues defining the mu-opioid receptor binding pocket: a

site-directed mutagenesis study. J Neurochem, 1997. 68(1): p. 344-53.

98. Befort, K., et al., Role of aromatic transmembrane residues of the delta-opioid

receptor in ligand recognition. J Biol Chem, 1996. 271(17): p. 10161-8.

99. Befort, K., et al., The conserved aspartate residue in the third putative

transmembrane domain of the delta-opioid receptor is not the anionic counterpart

for cationic opiate binding but is a constituent of the receptor binding site. Mol

Pharmacol, 1996. 49(2): p. 216-23.

100. Surratt, C.K., et al., -mu opiate receptor. Charged transmembrane domain amino

acids are critical for agonist recognition and intrinsic activity. J Biol Chem, 1994.

269(32): p. 20548-53.

101. Ballesteros JA and W. H, Integrated methods for the construction of three-

dimensional models and computational probing of structure-function relations in G

protein-coupled receptors. Methods Neurosci, 1995. 25: p. 366-428.

102. Fowler, C.B., et al., Refinement of a homology model of the mu-opioid receptor

using distance constraints from intrinsic and engineered zinc-binding sites.

Biochemistry, 2004. 43(27): p. 8700-10.

103. Childers, S.R., et al., Opiate receptor binding affected differentially by opiates and

opioid peptides. Eur J Pharmacol, 1979. 55(1): p. 11-8.

104. Cox, B.M., Endogenous opioid peptides: a guide to structures and terminology.

Life Sci, 1982. 31(16-17): p. 1645-58.

105. Okada, Y., et al., Endomorphins and related opioid peptides. Vitam Horm, 2002.

65: p. 257-79.

106. Ling, N., R. Burgus, and R. Guillemin, Isolation, primary structure, and synthesis

of alpha-endorphin and gamma-endorphin, two peptides of hypothalamic-

hypophysial origin with morphinomimetic activity. Proc Natl Acad Sci U S A,

1976. 73(11): p. 3942-6.

107. Chang, A.C., M. Cochet, and S.N. Cohen, Structural organization of human

genomic DNA encoding the pro-opiomelanocortin peptide. Proc Natl Acad Sci U S

A, 1980. 77(8): p. 4890-4.

108. Noda, M., et al., Isolation and structural organization of the human

preproenkephalin gene. Nature, 1982. 297(5865): p. 431-4.

109. Schwyzer, R., ACTH: a short introductory review. Ann N Y Acad Sci, 1977. 297:

p. 3-26.

110. Chavkin, C. and A. Goldstein, Specific receptor for the opioid peptide dynorphin:

structure--activity relationships. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981. 78(10): p. 6543-

7.

- 36 -

111. Takemori, A.E. and P.S. Portoghese, Selective naltrexone-derived opioid receptor

antagonists. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1992. 32: p. 239-69.

112. Portoghese, P.S., et al., A highly selective delta 1-opioid receptor antagonist: 7-

benzylidenenaltrexone. Eur J Pharmacol, 1992. 218(1): p. 195-6.

113. Takemori, A.E., et al., Agonist and antagonist activities of ligands derived from

naltrexone and oxymorphone. Life Sci, 1992. 50(20): p. 1491-5.

114. Portoghese, P.S., M. Sultana, and A.E. Takemori, Design of peptidomimetic delta

opioid receptor antagonists using the message-address concept. J Med Chem,

1990. 33(6): p. 1714-20.

115. Caffrey, M., Membrane protein crystallization. J Struct Biol, 2003. 142(1): p. 108-

32.

116. Hunte, C. and H. Michel, Crystallisation of membrane proteins mediated by

antibody fragments. Curr Opin Struct Biol, 2002. 12(4): p. 503-8.

117. Gether, U., et al., Structural instability of a constitutively active G protein-coupled

receptor. Agonist-independent activation due to conformational flexibility. J Biol

Chem, 1997. 272(5): p. 2587-90.

118. Standfuss, J., et al., Crystal structure of a thermally stable rhodopsin mutant. J Mol

Biol, 2007. 372(5): p. 1179-88.

119. Murakami, M. and T. Kouyama, Crystal structure of squid rhodopsin. Nature,

2008. 453(7193): p. 363-7.

120. Shimamura, T., et al., Crystal structure of squid rhodopsin with intracellularly

extended cytoplasmic region. J Biol Chem, 2008. 283(26): p. 17753-6.

121. Okada, T., et al., Functional role of internal water molecules in rhodopsin revealed

by X-ray crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(9): p. 5982-7.

122. Okada, T., et al., The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light

of a new 2.2 A crystal structure. J Mol Biol, 2004. 342(2): p. 571-83.

123. Li, J., et al., Structure of bovine rhodopsin in a trigonal crystal form. J Mol Biol,

2004. 343(5): p. 1409-38.

124. Fotiadis, D., et al., Atomic-force microscopy: Rhodopsin dimers in native disc

membranes. Nature, 2003. 421(6919): p. 127-8.

125. Filipek, S., et al., A concept for G protein activation by G protein-coupled receptor

dimers: the transducin/rhodopsin interface. Photochem Photobiol Sci, 2004. 3(6):

p. 628-38.

126. Fotiadis, D., et al., The G protein-coupled receptor rhodopsin in the native

membrane. FEBS Lett, 2004. 564(3): p. 281-8.

127. Suda, K., et al., The supramolecular structure of the GPCR rhodopsin in solution

and native disc membranes. Mol Membr Biol, 2004. 21(6): p. 435-46.

128. Filipek, S., et al., The crystallographic model of rhodopsin and its use in studies of

other G protein-coupled