Red Internacional para el Mejoramiento del Banano y … · evaluación y la diseminación de cultivar es mejorados y para la conservación y utilización de la diversidad de las Musaceas;

La misión de la Red Internacional para el Mejoramiento del Banano y el Plátano es aumentar laproductividad y la estabilidad del banano y el plátano cultivados por pequeños productores para elconsumo doméstico y mercados locales y de exportación.

INIBAP tiene cuatro objetivos principales:

• organizar y coordinar un esfuerzo global de investigación sobre banano y plátano para el desarrollo, laevaluación y la diseminación de cultivares mejorados y para la conservación y utilización de la diversidadde las Musaceas;

• promover y fortalecer los esfuerzos regionales para resolver los problemas específicos de cada región yayudar los programas nacionales a beneficiarse de y a contribuir con el esfuerzo global de investigación;

• fortalecer la capacidad de los SNIA para conducir investigaciones sobre banano y plátano;

• coordinar, facilitar y apoyar la producción, recopilación y el intercambio de información y dedocumentación sobre banano y plátano.

INIBAP es un programa del Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI), un centro FutureHarvest.

El Instituto Internacional de Recursos Fitogenéticos (IPGRI) es una organización científica, autónoma, decarácter internacional que funciona bajo los auspicios del Grupo Consultivo para la Investigación AgrícolaInternacional (GCIAI). El mandato del IPGRI es realizar avances en la conservación y utilización de losrecursos fitogenéticos para beneficiar a las generaciones presentes y futuras. Esta operando con los tresprogramas siguientes : (1) el programa de recursos fitogenéticos, (2) el programa de recursos genéticos delGCIAI, y (3) la Red internacional para el mejoramiento del banano y plátano (INIBAP).

El estatuto internacional ha sido conferido al IPGRI mediante un acuerdo de establecimiento firmado yratificado por los Gobiernos de los siguientes países: Argelia, Australia, Bélgica, Benin, Bolivia, Brasil,Burkina Faso, Camerún, Chile, China, Congo, Costa Rica, Côte d’Ivoire, Chipre, Dinamarca, Ecuador, Egipto,Grecia, Guinea, Hungría, India, Indonesia, Irán, Israel, Italia, Jordania, Kenia, Malasia, Mauritania,Marruecos, Noruega, Pakistán, Panamá, Perú, Polonia, Portugal, República Checa, República Eslovaca,Rumania, Rusia, Senegal, Sudán, Suiza, Siria, Túnez, Turquía, Ucrania y Uganda.

Cita: Panis B. y N.T. Thinh. 2001. Cryoconservación de germoplasma de Musa. Guías técnicas INIBAP 5 (J.V.Escalant y S. Sharrock, eds). Red Internacional para el Mejoramiento del Banano y el Plátano, Montpellier,Francia.

INIBAP ISBN 2-910810-46-1© International Plant Genetic Resources Institute, 2001

IPGRI Via dei Tre Denari 472/a

00057 Maccarese (Fiumicino)Roma, Italia

INIBAPParc Scientifique Agropolis II

34397 Montpellier Cedex 5Francia

2 Crioconservación de germoplasma de Musa

Ilustración de la portada: Roberto Hamm, Crayon & Cie

Agradecimientos

Los autores agradecen:

• el General Directorate of International Collaboration de Bélgica y elJapanese International Research Center for Agricultural Sciences (JIRCAS)por su apoyo financiero a las investigaciones sobre los protocolos pre-sentados en estas guías,

• la Red Internacional para el Mejoramiento del Banano y el Plátano(INIBAP) y el Grupo de trabajo sobre Mejoramiento genético de PROMUSA por el aporte de los recursos necesarios para hacer realidadla publicación de estas guías técnicas.

Desean además manifestar reconocimiento a:

• Jean-Vincent Escalant y Suzanne Sharrock por su labor como editorescientíficos,

• Florent Engelmann, especialista en crioconservación, por sus valiososconsejos y su ayuda en la traducción de estas guías hacia el francés,

• Elinor Lipman y Claudine Picq por la edición técnica.

Tabla de contenido

Prólogo 5

Introducción 7

Protocolos de crioconservación para meristemas de banano 7Detección de las bacterias endofíticas 7Pruebas de viabilidad 8

1. Crioconservación de meristemas individuales de banano 91.1 Material vegetal 91.2 Crioconservación de meristemas individuales 11

2. Crioconservación de los grupos de meristemas de banano

(estructuras parecidas a la coliflor) 132.1 Material vegetal 132.2 Método sencillo de congelación 152.3 Método de crioconservación combinado 16

3. Crioconservación de las suspensiones

de células embriogénicas de banano 17

3.1 Introducción 173.2 Material vegetal 183.3 Crioconservación de las suspensiones de células 19

4. Crioconservación de los embriones zigóticos de banano 254.1 Materiales y métodos 254.2 Discusión 27

5. Discusión y perspectivas 275.1 Crioconservación de los meristemas de banano 275.2 Suspensiones de células 30

Apendices 33Apéndice 1. Composición de medios y solución 33Apéndice 2. Equipo básico requerido 36Apéndice 3. Lista de abreviaturas 37

Bibliografía 39

Guías técnicas INIBAP 5 3

Prólogo

Los bananos y plátanos (Musa spp.) representan dos de los cultivos másimportantes en el mundo entero. Más de 400 millones de personas en los paísesen vías de desarrollo de los trópicos y subtrópicos dependen de estos cultivos,los cuales les proporcionan tanto alimento básico, como un importanteproducto para la venta, local e internacionalmente.

Los bananos y plátanos se cultivan casi exclusivamente por pequeñosagricultores y la producción se basa en una amplia gama de variedadesimportantes localmente. Sin embargo, en muchas áreas esta producción se estárestringiendo por la presión de las plagas y enfermedades. En respuesta a estehecho, varios programas de mejoramiento de bananos y plátanos alrededor delmundo están trabajando para producir variedades mejoradas, resistentes aplagas y enfermedades y de alto rendimiento.

La materia prima para el mejoramiento de los bananos son las especiessilvestres de Musa y diversas variedades que se encuentran principalmente enAsia, centro de diversidad de Musa, pero también en Africa y América Latina.Estas especies y cultivares contienen los genes necesarios para una producciónmejorada de manera sostenida de cara a los ataques de plagas y enfermedadesy condiciones ambientales cambiantes. Para asegurar la disponibilidad deestos recursos importantes para el mejoramiento y producción futuros, esesencial conservar el germoplasma de Musa de manera segura.

La Red Internacional para el Mejoramiento de Banano y Plátano (INIBAP) esresponsable por la colección mundial del germoplasma de Musa. Esta colecciónconta con más de 1100 accesiones, tanto de especies silvestres, como devariedades cultivadas, y es ubicada bajo los auspicios de la FAO. Esta colecciónse mantiene actualmente in vitro, en condiciones de baja intensidad de luz ytemperatura baja con el fin de reducir las tasas de crecimiento de los cultivos.A pesar de estas condiciones de crecimiento lento, aún es necesario hacernuevos cultivos de todas las accesiones una vez al año en promedio. El procesode recultivo es laborioso y propicio a la contaminación de las accesiones conhongos o bacterias. Además, las accesiones que se mantienen in vitro, aún bajocondiciones de crecimiento lento, están expuestas a la variación somaclonal.

Para superar estos problemas y asegurar la conservación segura a largo plazode los recursos genéticos de Musa, INIBAP financia la investigación en el áreade la crioconservación, es decir, almacenamiento a temperatura ultra baja,usualmente la del nitrógeno líquido (-196 °C). Este es el método que aseguraun almacenamiento a largo plazo seguro y a costo reducido de los recursosgenéticos de las especies que tienen semillas recalcitrantes o se propaganvegetativamente, como Musa. Esta investigación se está llevando a cabo en laKatholieke Universiteit Leuven, Bélgica (KUL), y las técnicas desarrolladas se


utilizan actualmente para la crioconservación rutinaria de las accesionesmantenidas por INIBAP.

Las técnicas de crioconservación en principio son aplicables a cualquier tipo detejido vegetal con potencial de regeneración. Estas técnicas han sidodesarrolladas para más de 112 especies de plantas diferentes, cultivadas demaneras diversas, incluyendo suspensiones celulares, callos, ápices, embrionessomáticos y zigóticos (Engelmann 1997). Sin embargo, el uso habitual de lacrioconservación aún se restringe casi exclusivamente para la conservación delíneas de células en laboratorios de investigación.

A partir de bananos es posible obtener dos tipos de tejidos altamentemeristemáticos y regenerativos in vitro: (i) meristemas individuales aislados decultivos de ápices y (ii) cultivos de meristemas altamente proliferantes quecontienen grupos de meristemas parecidos al coliflor. Los métodos decrioconservación han sido desarrollados para ambos tipos de tejidos. Enadición, las suspensiones de células embriogénicas de diferentes cultivarespertenecientes a distintos grupos genómicos se almacenan actualmente ennitrógeno líquido (Panis et al. 1990, Panis 1995).

En esta publicación se describen diferentes métodos, desarrollados en la KULy JIRCAS (Centro Internacional Japonés de Investigaciones de CienciasAgropecuarias, Japanese International Research Center for Agricultural Sciences)para la crioconservación de los tejidos de Musa. Se describen las ventajas ydesventajas y se identifican las áreas donde aún se requieren investigacionespara optimizar los protocolos.

El propósito de esta publicación consiste en proporcionar información y guíascon respecto a metodologías adecuadas de crioconservación para su uso en elgermoplasma de Musa. Se espera que las descripciones detalladas de lasmetodologías descritas facilitarán su adopción y uso en diferentes laboratorios.

La disponibilidad y el tipo del material inicial, los genotipos aptos para lacrioconservación y la disponibilidad de los recursos tendrán que serconsiderados para determinar cual de estos métodos es el más apropiado parauso en otros laboratorios.


Introducción

PROTOCOLOS DE CRIOCONSERVACIÓN PARA MERISTEMAS DE BANANO

Hasta hace 10 años, los protocolos de crioconservación para los tejidosvegetales se basaban principalmente en un congelamiento lento en presenciade mezclas crioprotectoras que contenían DMSO (sulfóxido de dimetilo),azúcares, glicerol y/o prolina. El congelamiento lento resulta en unadeshidratación inducida por congelación, dejando menos agua en las célulasque pudieran formar cristales de hielo durante la exposición a temperaturasextremadamente bajas.

Sin embargo, durante la última década se han establecido varios nuevosprocedimientos para la crioconservación. Entre ellos, el protocolo devitrificación que involucra un tratamiento con soluciones crioprotectorasseguido por la deshidratación con soluciones de vitrificación de altaconcentración. Se han desarrollado técnicas de vitrificación para varioscultivos tropicales de propagación vegetativa, incluyendo los bananos (Thinhet al. 1999).

La investigación en la KUL financiada por INIBAP resultó en el desarrollo dedos protocolos de crioconservación adecuados para el almacenamiento a largoplazo de los cultivos de meristemas de banano. El primer método se basa en uncongelamiento rápido de los cultivos de meristemas altamente proliferantesprecultivados durante dos semanas en 0.4 M de sacarosa. El segundo, y hastala fecha el protocolo más exitoso, combina las tecnologías de los dos métodosanteriores, es decir, la vitrificación de los cultivos de meristemas altamenteproliferantes precultivados en sacarosa. El trabajo que se requiere paracrioconservar las accesiones, así como las tasas de regeneración después dedescongelarlas, depende del cultivar y del método utilizado. La aplicación deun protocolo de congelación sencillo y la vitrificación de los gruposproliferantes hasta la fecha dieron como resultado un almacenamiento seguroen nitrógeno líquido de las accesiones pertenecientes a diferentes gruposgenómicos dentro del género Musa.

DETECCIÓN DE LAS BACTERIAS ENDOFÍTICAS

Durante el cultivo y almacenamiento de meristemas normales bajo condicionesde crecimiento limitado, la presencia de las bacterias endógenas se observararamente. Si se encuentran, estas bacterias no interfieren con el crecimiento delos cultivos de meristemas. Sin embargo, tan pronto como los meristemas sesometen a crioconservación, las bacterias endógenas se vuelven un problema.Cuando los meristemas empiezan a crecer nuevamente después de lacrioconservación, cualesquiera bacterias endógenas presentes se desarrollan en


colonias amarillas o blancas, cuyo crecimiento sobrepasa el meristema enrecuperación. Por lo tanto, antes de someter los cultivos a la crioconservación,ellos son cribados para detectar la presencia de bacterias endofíticas en unmedio desarrollado para el crecimiento de las bacterias (medio BACT) quecontiene 23 g/l del medio nutritivo Difco® Bacto, 10 g/l de glucosa y 5 g/l delextracto de levadura (van den Houwe y Swennen 2000). Estos platos seincuban por 3 semanas a plena luz a 28 °C. Las accesiones que respondenpositivamente son descartadas.

PRUEBAS DE VIABILIDAD

Después de estar almacenadas por lo menos durante una hora en nitrógenolíquido, una pequeña cantidad de réplicas de todas las muestrascrioconservadas se descongela para evaluar la viabilidad del material. Así, enla KUL, y para cada nuevo lote de material crioconservado, se descongelan unmínimo de dos criotubos con cada uno 7 a 10 meristemas individuales ogrupos de meristemas para pruebas de viabilidad. La descongelación se realizasiguiendo los métodos descritos abajo para diferentes protocolos decrioconservación. La evaluación del porcentaje de meristemas germinados daun buen indicador de la viabilidad del material que es almacenadopermanentemente en nitrógeno líquido.


1. Crioconservación de meristemas individuales de banano

Este método se ilustra en la Figura 1 y se presentan los detalles a continuación.

1.1 MATERIAL VEGETAL

Producción de las plántulas in vitro

Los ápices individuales o múltiples de banano in vitro se establecen cultivandoápices aislados de los retoños en el campo en un medio semisólido MS(Murashige y Skoog 1962) complementado con 0.2 o 4 mg/l de BA(6-benzilaminopurina). Los ápices establecidos, cada uno de 3-4 cm de largo, secultivan por 30-45 días en el medio MS complementado con 60-90 g/l desacarosa para que formen raíces adventicias. Durante esta etapa deenraizamiento, se recomienda colocar los cultivos bajo una luz con intensidadde al menos 90 µE m-2 s-1 (lámparas fluorescentes blancas frías). Lasvitroplantas vigorosas enraizadas, con un diámetro de la base deaproximadamente 1 cm, representan una fuente apropiada para la excisión demeristemas apicales.


Enraizamiento

0° C25° C 0.7 ml

Selecciónde

meristemas

Envolvimientode

meristemas

Pretratamientode

meristemas

Deshidratación Meristemaen

criotubos

Enraizamiento Escurrimientode meristemas

Post-tratamientos

de meristemas

Descongelación Almacenamientoen

nitrógenolíquido

Figura 1. Crioconservación de meristemas individuales.

Disección y selección de meristemas apicales

Como en muchas otras monocotiledóneas, los meristemas apicales de bananoestán estrechamente cubiertos con varias capas de hojas inmaduras, de formatubular y de color blancuzco. Utilizando un microscopio binocular yherramientas de disección finas, las hojas pueden ser removidas cuidadosa ypacientemente una por una, hasta que se puede observar claramente el domoapical del meristema. Luego, el meristema es aislado del brote principalmediante cortes afilados en su base (Figura 2). Los meristemas, ideales para lacrioconservación, son aquellos donde el domo apical está sólo parcialmentecubierto por las bases del primer primordio foliar externo, es decir, meristemaPC, como se muestra en la Figura 3. Estos meristemas generalmente midenalrededor de 0.8-1 mm de longitud.


Figura 2. Ilustración del aislamiento del meristema en banano.

Figura 3. De izquierda a derecha, meristemasapicales recién aislados abiertos (O), cubiertosparcialmente (PC) y cubiertos totalmente (FC)del cv. ‘Cavendish’.

Plantas enraizadas en condiciones in vitro

Cortes agudosaislados

Meristema apical

1er, 3° y 5°... cortes 2do, 4° y 6°...

cortes

O PC FC

Para prevenir su desecamiento, los meristemas recién cortados se colocaninmediatamente en la superficie del medio MS con 0.1 M de sacarosa en unacaja de Petri. Todos los meristemas posiblemente dañados (debido a errores demanipulación) deben ser descartados. Un técnico experimentado puede aislar6-8 meristemas por hora (aproximadamente, 7-10 minutos por meristemaaislado).

1.2 CRIOCONSERVACIÓN DE MERISTEMAS INDIVIDUALES

Pretratamiento (Loading)

Aunque el mecanismo preciso de pretratamiento (loading) todavía no está clarocompletamente, se comprobó para diferentes especies vegetales que puedemejorar en forma muy importante la tolerancia de los meristemas aislados a ladeshidratación, mediante la solución vitrificante (Matsumoto et al. 1994, Takagiet al. 1997).

EL pretratamiento de los meristemas de banano se realiza de la manerasiguiente:

• Un pedazo de papel tisú (1.5-2 x 1.5-2 cm) se coloca en una caja de Petri y sehumedece con unas gotas de solución de pretratamiento L1 (ver Apéndice 1).

• 7-10 meristemas se envuelven en este papel tisú y se sumergeninmediatamente por 20 minutos a temperatura ambiente (22-25 °C) en 6 ml desolución L1 en una pequeña caja de Petri (∆=6 cm).

• El papel tisú doblado que contiene meristemas pretratados es colocado poraproximadamente 1 minuto en un papel de filtración esterilizado para escurrirel exceso de la solución L1.

Deshidratación

Para deshidratar los meristemas, se sumergen en un pequeño tubo de ensayode Pyrex (con tapa enroscable) con 10 ml de solución PVS2 enfriada (verApéndice 1 para la preparación de la solución). Luego, los tubos se colocan enun baño helado por 20 minutos.

Congelación rápida

Después de 20 minutos en el baño helado, los meristemas se colocan en unospequeños (vol. 0.7 ml) criotubos de plástico llenados con una solución PVS2fresca y helada. Después de enroscar la tapa del tubo, se aplica una capa decinta de Teflón para sellar el borde entre la tapa del criotubo y el cuerpo.Dentro de unos pocos segundos, el criotubo se sumerge rápidamente en elnitrógeno líquido (LN) en un pequeño frasco Dewar.


Almacenamiento

Después de 30 minutos de almacenamiento en nitrógeno líquido, los criotuboscon meristemas se transfieren del frasco Dewar a un tanque permanente denitrógeno líquido. Para asegurar una transferencia rápida (unos pocossegundos) del frasco Dewar al tanque de almacenamiento a largo plazo, losdos recipientes deben ser colocados lo más cerca posible uno del otro.

Ya que el nitrógeno líquido se evapora continuamente, es necesario asegurarun abastecimiento regular de nuevo LN al tanque para asegurar que loscriotubos están expuestos continuamente a la fase líquida de LN.

Descongelación

Después de estar almacenadas al menos por una hora en nitrógeno líquido, lasmuestras (criotubos con meristemas) son descongeladas para evaluar laviabilidad del material crioconservado.

Después del almacenamiento, los criotubos se transfieren rápidamente a unfrasco Dewar con LN y se colocan en una banca limpia para realizar el paso decalentamiento:

Los criotubos congelados se transfieren rápidamente (dentro de un segundo)de LN a un baño de agua a 40 °C y se agitan vigorosamente por 90 s.

Luego, el sobre que contiene los meristemas es removido de los tubos ycolocado por 30 s. sobre una superficie cubierta con un papel de filtroesterilizado para escurrir parcialmente el exceso de la solución PVS2.

Post-tratamiento (unloading)

Luego, el sobre se transfiere a una caja de Petri de 6 cm de diámetro quecontiene medio líquido MS complementado con 1.2 M de sacarosa. Cada 5minutos esta solución se renueva por un período total de 10 minutos.

El sobre se abre y los meristemas que se mantienen en suspensión en lasolución de sacarosa por otros 5 minutos.

Recuperación

Con la ayuda de un microscopio binocular, los meristemas se recogen de lasolución de sacarosa y se colocan en un papel de filtro esterilizado ubicadosobre una superficie de un medio semisólido MS fresco complementado con0.3 M de sacarosa en una caja de Petri.

Después de una noche, los meristemas se transfieren en el medio MSsemisólido complementado con 0.1 M de sacarosa y 0.5 mg/l de BA(6-benzilaminopurina).

Durante los primeros 10-15 días, los cultivos se incuban en la oscuridad o bajouna luz tenue, luego se colocan bajo un régimen de luz regular de al menos90 µE m-2 s-1 (lámparas fluorescentes blancas frías). Los meristemas


crioconservados con éxito formaran pequeños brotes dentro de 40-60 días(Figuras 4, 5 y 6; ver página 21).

2. Crioconservación de los grupos de meristemas de banano(estructuras parecidas a la coliflor)

Un segundo tipo de tejido meristemático con alto potencial de regeneración enbanano, el cual ha sido crioconservado exitosamente, es el grupomeristemático altamente proliferante (algunas veces llamado ‘parecido a lacoliflor’). Este tipo de tejido fue al origen producido como material inicial paraempezar cultivos de suspensiones de células embriogénicas en material debanano (Dhed’a et al. 1991, Schoofs 1997).

Dos técnicas de crioconservación aplicadas a los cultivos de meristemasaltamente proliferantes ‘parecidos a la coliflor’ se describen a continuación:

• Método sencillo de congelamiento (que incluye un precultivo con sacarosa)(Panis et al. 1996),

• Método combinado de crioconservación (combinando el precultivo convitrificación) (Panis et al. 2000b).


Producción de los agregados de meristemas ‘parecidos a la coliflor’

Los experimentos preliminares revelaron que el reinicio del crecimiento de losgrupos meristemáticos después de la crioconservación puede tener éxito sólo


Figura 4. Meristema apical enplena recuperación después de laexposición a LN, 5 días despuésdel calentamiento (D = domo apical, LP = primordio foliar encrecimiento).

utilizando los agregados ‘parecidos a la coliflor’. Para producir este tipo dematerial en todas las accesiones de Musa, los cultivos de meristemas setransfieren a un medio que contiene una alta concentración de BA (medio P4,ver Apéndice 1). Cada 1 a 2 meses, el material es subcultivado y los pequeñosagregados de meristemas ‘parecidos a la coliflor’ son seleccionados ytransferidos a un medio fresco. La alta concentración de BA en el medio P4inhibe el crecimiento excesivo de los meristemas, favoreciendo de este modo laformación de numerosos domos apicales de color blanco (Figura 7; verpágina 22).

Precultivo de agregados de meristemas

Luego de la aparición de los agregados ‘parecidos a la coliflor’ y seissemanas después del último subcultivo, se recortan los agregados blancosmeristemáticos de unos 4 mm de diámetro, cada uno conteniendo al menoscuatro domos apicales, y se transfieren a un medio de precultivo (P5 + 0.4 Mde sacarosa) por 2 semanas. Estos agregados meristemáticos se cultivan a 25 °C ± 2 °C bajo iluminación continua (50 µE m-2 s-1) proporcionada portubos fluorescentes blancos fríos.

2.2 MÉTODO SENCILLO DE CONGELACIÓN

Este método se ilustra en la Figura 8.

Crioconservación

Pequeños agregados meristemáticos de color blanco de 5-15 mg, quecontienen de 3 a 6 domos meristemáticos, se recortan de los brotesprecultivados. Se remueven los tejidos de color marrón y sólo se retienen losmás sanos, como lo indica el color blanco amarillento. Los agregados setransfieren a criotubos estériles (2 ml) sin ninguna solución líquida, se sellancon una capa de cinta de Teflón y se sumergen directamente en un frascoDewar que contiene nitrógeno líquido. Cada criotubo contiene de 7 a10 agregados. En esta etapa, las muestras pueden ser almacenadas por untérmino largo transfiriendo los criotubos al tanque con nitrógeno líquido,asegurando que su transferencia de un contenedor a otro transcurra con lamayor rapidez (dentro de unos pocos segundos), previniendo de esta manerala descongelación letal de las muestras.

Descongelación y recuperación

Después del almacenamiento, la descongelación rápida se realiza revolviendoel criotubo congelado en un baño María a 40 °C por 90 segundos.


La regeneración de los meristemas congelados puede ser efectuada de dosmaneras diferentes:

• Los meristemas se transfieren a cajas de Petri de 9 cm que contienen el mediode regeneración semisólido (P6) y sellados con Parafilm.

• Alternativamente, la regeneración puede ser realizada en un medio líquido.Los meristemas descongelados se transfieren a frascos Erlenmeyer de 100 mlque contienen 30 ml de medio de regeneración líquido (P6 sin agentessolidificantes) y se colocan en un agitador rotativo a 70 rpm.

Después de 1 semana de cultivo en condiciones de oscuridad, las cajas de Petriy los frascos se transfieren a una luz continua a 50 µE m-2 s-1. Los cultivos semantienen todo el tiempo a 25 ± 2 °C.

Tres semanas después de la transferencia al medio de regeneración, el nuevocrecimiento de los meristemas congelados se determina bajo un microscopiobinocular. Se distinguen dos tipos de tejidos sobrevivientes, es decir, brotes ycallos no regenerados. Los brotes recuperados (Figura 9) se transfieren a lostubos de ensayo con el medio de regeneración para promover el consiguientedesarrollo de plantas enteras. Tan pronto las plantas enraizadas alcanzan untamaño suficiente, se siembran en el suelo.


p54 semanas

p45 a 12

subcultivosde 4 a 5 semanas

p5 + 0,4 M sacarosa2 semanas

Nitrógenolíquido

(-196 °C)>1h

65 rpm

H2O (+40 °C)90 s.p6

4 a 5 semanaslíquido p6

4 a 5 semanas

Figure 8. congelación sencilla.

2.3 MÉTODO DE CRIOCONSERVACIÓN COMBINADO

Este método se describe en la Figura 10.

Pretratamiento (Loading)

Los agregados de meristemas se transfieren a 5 ml de una solución depretratamiento (Apéndice 1), en un recipiente plástico de 20 ml donde semantienen por 20 minutos a temperatura ambiente.

Tratamiento con la solución de vitrificación (deshidratación) y congelación

La solución de pretratamiento es reemplazada por 5 ml de solución PVS2 fríay los recipientes plásticos que contienen los meristemas se colocan sobre hielo.Los meristemas se someten a la solución PVS2 por 60 a 180 minutos a 0 °C.

Durante el tratamiento con la solución PVS2, los meristemas se transfieren delos recipientes plásticos a criotubos estériles enfriados de 2 ml de capacidad,que contienen 1 ml de solución fresca PVS2 bien fría.

Los criotubos se sellan con una capa de la cinta de Teflón y se sumergendirectamente en un frasco Dewar que contiene nitrógeno líquido.

Descongelación y dilución de la solución PSV2 (Unloading)

Después del almacenamiento, los criotubos son descongelados rápidamenterevolviéndolos en un baño María a 40 °C por 90 segundos. Inmediatamente


p54 semanas

p45 a 12

subcultivosde 4 a 5 semanas

p5 + 0,4 M sacarosa

2 semanasLS

(+25 °C)

Nitrógenolíquido

(-196 °C)>1h

H2O (+40 °C)80 s.

MS + 0.3Msacarosa

2 días

US(25 °C)

MS + 2.22 µMBA

4 a 6 semanasp64 a

5 semanas

PVS2(0 °C)

1h

Figura 10. Vitrificación de meristemas proliferantes.

después de la descongelación, la solución PVS2 tóxica es removida de loscriotubos y reemplazada por una solución de dilución (ver Apéndice 1). Losmeristemas son mantenidos por 15 minutos a temperatura ambiente.

Regeneración

Los meristemas descongelados se remueven de la solución de dilución y secolocan en platos Petri de 9 cm sobre dos capas de papel filtro esterilizadoencima de unos 25 ml de medio MS semisólido libre de hormonas que contiene0.3 M de sacarosa.

Después de dos días, el papel filtro se remueve y los meristemas se transfierena cajas de Petri con un medio MS complementado con 2.22 µM de BA. Laprimera semana de cultivo siempre tiene lugar en la oscuridad. Después de unmáximo de 6 semanas, los meristemas se transfieren a los tubos de ensayo conel medio P6 para el posterior desarrollo de plantas enteras (Figura 11; verpágina 23).

3. Crioconservación de las suspensiones de células embriogénicasde banano

3.1 INTRODUCCIÓN

Ya que la mayoría de las variedades cultivadas de banano son altamenteestériles, los programas clásicos de mejoramiento son muy lentos y laboriosos.Además, no se dispone de las fuentes de resistencia en el acervo genético debananos contra algunos de los patógenos, como lo son los virus. Por lo tanto,la ingeniería genética ofrece una alternativa acogida para el mejoramiento delos bananos. En monocotiledóneas, las suspensiones de células embriogénicasrepresentan a menudo el material de elección para la transformación,particularmente, en los cultivos estériles como el banano, donde los embrioneszigóticos no se encuentran disponibles. Las suspensiones de célulasembriogénicas actualmente representan la única fuente de protoplastosregenerativos en banano (Panis et al. 1993). Al someterlos a electroporación, losprotoplastos derivados de las suspensiones de células embriogénicas originanuna alta frecuencia de expresión transitoria de los genes marcadoresintroducidos (Sagi et al. 1994). Las suspensiones de células con paredes puedenser exitosamente transformadas mediante bombardeo con partículas (Sagi et al.1995) y Agrobacterium (Hernandez et al. 1998). De esta manera, se introdujo enlos bananos la codificación de genes para obtener nuevos tipos de proteínasantifungosas, así como la resistencia a los virus.

El principal cuello de botella para la transformación sigue siendo la iniciaciónde las suspensiones celulares de buena calidad, es decir, suspensioneshomogéneas de células embriogénicas con una alta frecuencia de regeneración.


La iniciación de estos cultivos de suspensiones es difícil y consume muchotiempo, independientemente del material de iniciación utilizado (floresmasculinas inmaduras, embriones zigóticos inmaduros o meristemasproliferantes in vitro). Una vez establecidas, estas valiosas suspensionescelulares están sujetas a variación somaclonal y contaminación microbiana.Además, un prolongado período de cultivo puede dar como resultado unadisminución y eventualmente una pérdida total de la capacidad morfogénica.

En 1990, se desarrolló una técnica de crioconservación para suspensionescelulares ‘ideales’ que involucra una crioprotección con 7.5% de DMSO(sulfoxido de dimetil) por 1 hora a 0 °C, seguida por una congelación lenta a1 °C/minuto hasta -40 °C e inmersión en nitrógeno líquido. Una suspensión‘ideal’ de células embriogénicas contiene una alta proporción de célulasisodiamétricas caracterizadas por un núcleo relativamente grande, vacúolospequeños y pequeños granos de almidón y proteínas (Figura 12; verpágina 23). Posteriormente, este protocolo de crioconservación fue optimizadocon el fin de aplicarlo a las células de banano menos ‘ideales’ pero tambiénaltamente regenerativas (Panis et al. 2000a). Las suspensiones menos ‘ideales’son más heterogéneas y pueden contener, además de los agregados de célulasembriogénicas, células con vacúolos grandes y elongados, células con uncitoplasma muy denso, pero granular, y células con grandes granos de almidóny glóbulos organizados.

Recientemente, fueron recuperadas suspensiones celulares de banano despuésde 5 años de almacenamiento en nitrógeno líquido. La habilidad de producirembriones somáticos permanece intacta. También se pudo iniciar suspensionesde células embriogénicas a partir del material congelado.


Material inicial

Los estudios más recientes publicados sobre la crioconservación de lassuspensiones de las células de banano, muestran algunas diferencias en losprocedimientos dependiendo del tejido utilizado como material inicial paraempezar las suspensiones celulares. En estas guías se considerarán dosdiferentes tipos de suspensiones: (i) suspensiones derivadas de las floresmasculinas (Côte et al. 1996) y (ii) suspensiones derivadas de los cultivos demeristemas proliferantes (Schoofs 1997).

Suspensiones de células derivadas de los cultivos de células proliferantes

Las suspensiones celulares se mantienen en un medio líquido ZZ (Apéndice 1)en un vibrador rotativo a unas 70 rpm y a 25 ± 2 °C bajo condiciones de luz de25 µE m-2 s-1 de PAR (Radiación fotosintética activa, photosynthetic activeradiation).


Suspensiones de células derivadas de las flores masculinas

Las suspensiones celulares se mantienen en un medio líquido MA2(Apéndice 1).

3.3 CRIOCONSERVACIÓN DE LAS SUSPENSIONES DE CÉLULAS

Precultivo

Esta etapa se recomienda solamente para las suspensiones de células derivadasde flores masculinas. Las células se cultivan 24 horas en medio MA2 liquido complementado con180 g/l de sacarosa.

Crioprotección

Las suspensiones de células se crioconservan siempre y cuando se encuentranen su fase de crecimiento exponencial. El crecimiento celular exponencialusualmente tiene lugar de 7 a 10 días después del último subcultivo.Se dejan las células sedimentar en un tubo graduado de centrífuga y seremueve el medio viejo.Se añade el nuevo medio líquido1 ZZ con 180 g/l de sacarosa hasta obtener unvolumen final de células establecidas de 30%.Un volumen igual del medio estéril ZZ1 +180 g/l de sacarosa que contiene 15%de dimetilsulfóxido (DMSO) se transfiere gradualmente a la suspensiónconcentrada de células durante un período de una hora a temperaturaambiente.Como tal, la solución crioprotectora final, en soluciones derivadas tanto de lasflores masculinas como de los cultivos meristemáticos, contiene 7.5% deDMSO y 180 g/l de sacarosa.

Congelación y almacenamiento

Congelación lenta en el baño de metanol

Muestras de 1.5 ml de suspensiones de células crioprotegidas se transfieren acriotubos de 2 ml, se sellan con una cinta de Teflón y se colocan en un baño demetanol agitado (Cryocool CC-60, Exatrol y agitador de Neslab, Portsmouth,New Hampshire, EEUU). Este baño de metanol se refresca a una tasa de1 °C/minuto.Tan pronto se obtiene la temperatura de -7.5 °C, los criotubos se sumergen por3 segundos en nitrógeno líquido para iniciar la cristalización del mediocrioprotector. Luego los criotubos se enfrían hasta -40 °C. Después de30 minutos a -40 °C, los criotubos se sumergen en nitrógeno líquido (-196 °C)para el almacenamiento posterior.


1 El medio ZZ es reemplazado por el medio MA2 cuando se utilizan células procedentes de flores masculinas.

Congelación lenta utilizando el contenedor para congelación Nalgene™ cryo 1 °C

Los criotubos que contienen 2 ml de suspensiones de células crioprotegidas secolocan en un contenedor de congelación NalgeneTM cryo 1 °C. Este sencillodispositivo para congelación consiste de un contenedor plástico que contiene250 ml de isopropanol. Su transferencia a un congelador (–80 °C) permite unatasa de enfriamiento de alrededor de 1 °C/minuto.

En ambos casos, la disminución de la temperatura dentro de los criotubos esmedida utilizando una sonda de temperatura que se coloca en un criotuborepresentativo.


Después del almacenamiento, los criotubos se descongelan rápidamente en unvaso con agua esterilizada a 40 °C por unos 1.5 a 2 minutos hasta derretirse lamayor parte de hielo.

Suspensiones de células derivadas de los cultivos de meristemas proliferantes

Las células descongeladas se colocan sobre un medio semisólido ZZ o RD1(Apéndice 1) en platos Petri de 90 mm. El medio RD1 se aplica cuando serequiere obtener plántulas regeneradas a partir del material crioconservado. Elmedio semisólido ZZ se utiliza cuando se debe restablecer un cultivo desuspensiones de células embriogénicas. Durante la primera semana despuésde la crioconservación, las cajas de Petri siempre se colocan en un lugar oscuro(Figuras 13a, b, c; ver página 24).

Suspensiones de células derivadas de las flores masculinas

Las células descongeladas se colocan sobre un medio semisólido MA2 por24 horas en los platos Petri de 90 mm. Después de 24 horas, las células setransfieren a un medio MA3 para el consiguiente desarrollo de los embrionessomáticos regenerados a partir de la suspensión de células, o a un medio MA2cuando se debe restablecer un cultivo de suspensiones de célulasembriogénicas.

Prueba de viabilidad de las suspensiones de células

La viabilidad de las células se determina mediante una prueba de diacetatofluorescente (FDA) (Widholm 1972), ya que las células sobrevivientesmuestran un gran brillo fluorescente bajo la iluminación ultravioleta(Figura 14; ver página 24).

Si no se dispone de un microscopio con fluorescencia, se puede aplicar laprueba de reducción de cloruro 2,3,4-trifenilo de tetrazolio (TTC) (Dixon 1985).Las células supervivientes convierten el TTC incoloro en cristales deformazano rojos que pueden ser observados bajo un microscopio ordinario.



Figura 5. Desarrollo demeristemas apicalescrioconservados del cv.‘Chuoi Huong’ 30 díasdespués de la descon-gelación.

Figura 6. Brotes formados de los meristemas apicales crioconservados del cv. ’Sanjaku’ 60 díasdespués de la descongelación.


Figura 7. Reacción de los cultivos de meristemas proliferantes de Nakitengwa (banano de altiplanosAAA), Williams (grupo AAA) y Bluggoe (grupo ABB) en un medio p5 conteniendo 10µM de BA(izquierda) y 100µM de BA (derecha) (barra = 1 cm).

Figura 9. Caja de Petri que contieneagregados meristemáticos testigo(izquierda) y congelados (derecha)del cv. Bluggoe (grupo ABB), 8semanas después de la crioconser-vación (barra = 1 cm).

Nakitengwa Williams Bluggoe

p5 medium (10 µM BA)

Nakitengwa Williams Bluggoe

p4 medium (100 µM BA)


Figura 11. Brotes en regeneración de 1 testigo y 3 brotes proliferantes congelados de los cultivares‘Kisubi’ (AB group) y ‘Dominico Harton’ (plátano AAB), 3 meses después de crioconservación.

Figura 12. Suspensionesde celulas embriogénicasdel cultivar Three HandPlanty (Plátano AAB).

Testigo ________ Congelados ________

Kisubi (AB group)

Testigo ________ Congelados ________

Dominico Harton (AAB plantain)


Figura 13. (A) Nuevo crecimientodespués de 4 semanas en un mediosemisólido de las suspensiones decélulas embriogénicas no congeladas (izquierda) y congeladas(derecha) del cv. Bluggoe (grupoABB). (B) Masa de embriones somáticos que se originan a partirde un cultivo de células congeladas.(C) Plantas de invernadero deriva-das a partir de una suspensión decélulas congeladas.

Figura 14. Suspensión de célulasembriogénicas del cv. Bluggoe

(grupo ABB), crioprotegida con el5% de DMSO, congelada en

nitrógeno líquido, teñida con FDA yobservada bajo una luz ultravioleta.Las pequeñas células embriogénicas

muestran un gran brillo fluorescente,mientras que las estructuras más

grandes muestran una fluorescenciamás difusa (barra = 100 µm).

C

B

A

4. Crioconservación de los embriones zigóticos de banano

4.1 MATERIALES Y MÉTODOS

Este método de crioconservación requiere de embriones zigóticosdesarrollados completamente extraídos de las semillas maduras de Musa. Lafruta es cepillada y lavada con agua del tubo y jabón líquido. A continuación,la fruta se esteriliza con un blanqueador comercial de 20% por 5 minutos y seenjuaga tres veces con agua esterilizada.

El banano se pela bajo condiciones asépticas utilizando un gabinete de flujolaminar. Después de extraer las semillas, se aísla el embrión zigótico utilizandoun microscopio estereoscópico. Debido a que el embrión zigótico se localizajustamente por debajo del ‘micropilo’, es importante utilizar el escalpelo yhacer un corte longitudinal muy preciso alrededor del ‘tapón de micropilo’(Figura 15).

Precultivo

Los embriones se transfieren por 5 horas en el medio descrito por Escalant yTeisson (1987) que consiste de nutrientes minerales de Murashige y Skoog con


Tapón delmicropilo

Micropilo

Embryozigótico

Endospermo

Chalaza

Tegumentoexterno

Dirección del corte longitudinal

Figura 15. Representación gráfica del corte longitudinal de una semilla de banano.

macroelementos reducidos a la mitad, vitaminas de Morel, 60 g/l desacarosa, y 2 mg/l de gelrite. El pH se ajusta a 5.8 previo a someterlo alautoclave.

Deshidratación

Luego, los embriones se deshidratan bajo el aire esterilizado de un gabinete deflujo laminar (Abdelnour-Esquivel et al. 1992). No obstante, dependiendo tantode las condiciones de laboratorio como de la especie de banano, el período dedesecamiento puede requerir algunos ajustes (ver Tabla 1). Por lo tanto serecomienda tener un estimado del tiempo requerido para obtener uncontenido de agua de alrededor de 14% (% de peso fresco) en los embriones,ya que se comprobó que este contenido de agua es óptimo y proporciona latasa más alta de recuperación después de la descongelación. Para Musaacuminata y Musa balbisiana, este contenido de agua se logra después de 1.5 y2 horas de deshidratación, respectivamente.

Tabla 1. Evolución del contenido de agua de embriones aislados de Musa acuminata y M. balbisiana teniendo en cuenta la duración de la deshidratación

Contenido de agua (% de peso fresco)*

Tiempo (horas) M. acuminata M. balbisiana

0 64 79

0,5 26 37

1,0 20 28

1,5 15 19

2,0 11 14

2,5 8 11

3,0 6 9

(*) Promedio de 3 experimentos con 3 réplicas de 12 embriones cada una.

Congelación

La congelación de los embriones se realiza en criotubos de 2 ml mediante lainmersión directa en nitrógeno líquido.


Los embriones se descongelan rápidamente calentando los frascos conmuestras en baño de agua a 40 °C por unos 2 minutos. Para la regeneración, losembriones se colocan en el medio descrito anteriormente complementado con0.5 mg/l de BA. Los cultivos se mantienen en oscuridad por un período deaproximadamente 4 semanas. Luego, los embriones germinados se transfierenal medio de enraizamiento y desarrollo (medio MS sin hormonas).


4.2 DISCUSIÓN

La eficacia y simplicidad de la técnica de crioconservación para los embrionesde M. acuminata y M. balbisiana muestra que podría ser útil en elalmacenamiento del germoplasma de los diploides fértiles de Musa.

5. Discusión y perspectivas

5.1 CRIOCONSERVACIÓN DE LOS MERISTEMAS DE BANANO

Crioconservación de meristemas individuales

Varios genotipos diferentes de Musa han sido crioconservados utilizando esteprotocolo (Thinh et al. 1999). La observación bajo un microscopio de larecuperación de los meristemas crioconservados ha revelado que: (i) todo eldomo del meristema aislado sobrevive a la exposición al nitrógeno líquido, y(ii) no se forman callos después de la crioconservación. Por lo tanto, es pocoprobable que ocurra la variación somaclonal.

Las principales limitaciones de este procedimiento son las siguientes:

• Las tasas de viabilidad o regeneración después de la crioconservación varíande acuerdo al operador (por lo menos se observó una variación considerableentre JIRCAS y KUL).

• Se requiere una experiencia considerable en la disección de los pequeños yfrágiles meristemas apicales de banano antes de aplicar este protocolo decrioconservación.

• Sólo un cierto tipo de meristemas (tipo PC, Figura 3) puede ser utilizadocomo explantes. Algunas plántulas in vitro (20%) no contienen meristemas detipo PC.

• Muchos meristemas sobreviven pero se tornan negros y no son capaces deformar brotes regenerativos. Por lo tanto, es necesario optimizar lascondiciones de regeneración.

Crioconservación de grupos de meristemas

La parte más laboriosa de la crioconservación de este tipo de material es laproducción de los cultivos altamente proliferantes. Corrientemente, estoscultivos no pueden ser obtenidos sino utilizando BA a concentracionesextremadamente altas (100 µM), próximas de la toxicidad. Un cultivoprolongado en tal medio conlleva amenudo una disminución de la calidad delos cultivos debido a la pérdida de su estructura parecida a la coliflor. Además,la reacción a este medio depende en gran medida del cultivar. Por lo tanto, seconsidera que es necesario examinar las citoquininas o los reguladores delcrecimiento de las plantas semejantes a las citoquininas, con el fin de


determinar su potencial para inducir cultivos de meristemas altamenteproliferantes.

Método sencillo de congelación

Los mejores resultados (hasta 70% de crecimiento después de ladescongelación) han sido obtenidos con los cultivares ABB como Bluggoe,Cachaco y Monthan. Los resultados intermedios (alrededor de 25% decrecimiento) fueron alcanzados con los bananos de postre AAA y AAB. Losplátanos AAB y los diploides generalmente respondieron pobremente. Paratodos los cultivares investigados pertenecientes a estos grupos genómicos, lasplantas fueron regeneradas y cultivadas en el invernadero. Sin embargo,ninguno de los bananos de altiplanos AAA fue capaz de sobrevivir unacongelación sencilla.

A menudo, la falta de reproductibilidad del método es un factor que limita laaplicación habitual de crioconservación (Benson et al. 1996). Sin embargo, losinvestigadores de INIFAT (Instituto Nacional de Investigación Fundamental enAgricultura Tropical, Cuba) y FONAIAP (Fondo Nacional de InvestigacionesAgropecuarias, Venezuela) (Surga et al. 1999), han aplicado con éxito el métodode congelación sencilla. En INIFAT, se obtuvo la tasa de sobrevivencia de 34%después de la descongelación para el cultivar local Burro Criollo (IPGRI 1996).

Método de crioconservación combinado

Se descubrió, que las tasas de crecimiento después de la descongelación de losmeristemas precultivados con sacarosa son superiores en comparación conaquellos cultivados en un medio P4 normal. Un precultivo con sacarosa pareceincrementar la tolerancia de los meristemas, no sólo a la solución PVS2, sinotambién a la congelación. Sin embargo, la frecuencia de crecimiento de calloses aún alta. Al comparar los resultados del método combinado decrioconservación con aquellos obtenidos con el método sencillo decongelación, se observó un aumento en las tasas de viabilidad después de ladescongelación casi para todos los cultivares.

El aumento en la regeneración después de la descongelación para los bananosABB es limitado. La recuperación después de la descongelación permaneceentre 50 y 70%. Para los bananos de postre AAA y AAB, las tasas deregeneración están en alrededor de 30-50%, mientras que para los plátanos selogra 20-30%. Los bananos de altiplanos AAA que resultaron ser recalcitrantesen cuanto a la crioconservación utilizando la congelación sencilla, dieron 5-15% de sobrevivencia utilizando el método de crioconservación combinada.

Optimización de protocolos

Con respecto al método sencillo de congelación, a menudo se observa unoscurecimiento debido a la oxidación de polifenoles cuando los meristemas


descongeladas se colocan en un medio semisólido. Esto puede causar efectoscitotóxicos y también puede resultar en que los grupos en recuperación serodeen por una capa impermeable que previene la absorción de nutrientespara su crecimiento posterior. Uno de los métodos para superar este problemaconsiste en la utilización de un medio de regeneración líquido con el fin dediluir los polifenoles liberados.

Para la mayoría de las especies de plantas, la deshidratación óptima de lostejidos meristemáticos con el PVS2 se obtiene después de 10 a 30 minutos(Takagi 2000). Entre las excepciones se encuentran los brotes apicales de lapatata dulce y de la piña, que deben ser tratados con el PVS2 por 100 minutosy 7 horas respectivamente (Plessis y Steponkus 1996, Gonzalez-Arnao et al. 1998).La duración de este tratamiento debe ser optimizada caso por caso, ya quedebe producirse deshidratación suficiente para evitar la formación de loscristales de hielo letales durante la congelación. Al mismo tiempo es necesariotomar cuidados para prevenir el tratamiento con la solución potencialmentetóxica que daña irreversiblemente el tejido. En el caso de los cultivares debanano proliferantes precultivados en sacarosa, se observó recientemente quelas tasas óptimas de regeneración después de la descongelación se obtienengeneralmente después de 2 a 2.5 horas de tratamiento con el PVS2. Las tasas desupervivencia después de 3 horas para la mayoría de los cultivares fueronconsiderablemente bajas, debido probablemente a la toxicidad de esta soluciónaltamente concentrada.

Es esencial realizar una fase de precultivo en medios que contienenconcentraciones elevadas de sacarosa, para que los cultivos de meristemas debanano se vuelvan tolerantes para poder aplicar el método de congelaciónsencilla. También la vitrificación de los meristemas proliferantes resulta másexitosa después de un precultivo en sacarosa. Existen numerosas prácticasaceptables de precultivo con sacarosa para el mejoramiento de la resistencia ala congelación. El precultivo con sacarosa resulta en una reducción lenta delcontenido de humedad (Uragami 1991, Engelmann y Duval 1986) debido a suefecto osmótico y absorción de sacarosa, bajando de este modo el punto decongelación y la cantidad de agua a congelar. Los estudios histocitológicosrevelan la acumulación o la síntesis de un compuesto parecido al azúcar dentrodel citoplasma después del precultivo (Panis et al. 1996). Esto se confirma porun detallado análisis de azúcares. Sin embargo, no se encontró una correlacióndirecta entre el contenido de azúcar y la supervivencia después de ladescongelación (Panis et al. 1998). Los azúcares también mantienen el estadocristalino líquido de las capas dobles de membranas y estabilizan las proteínasbajo condiciones de congelación (Kendall et al. 1993). Un efecto indirecto de lasacarosa, que provoca un ligero estrés osmótico en el tejido, podría provenir dela acumulación de los compuestos que protegen contra el estrés hídrico, como


la prolina (Delvallée et al. 1989). Recientemente, se descubrió que el precultivoen sacarosa también puede resultar en un aumento del contenido total deproteínas y cambios en el lípido de la membrana (Panis et al. 1998),composición de poliamina y esteroles (resultados sin publicar). Si se pudieradeterminar el método exacto de proceder del precultivo con sacarosa conrespecto a la crioprotección, los diversos protocolos de crioconservaciónpodrían ser optimizados con mayor eficacia.

Actualmente, 39 accesiones de banano diferentes pertenecientes a 7 diferentesgrupos genómicos han sido puestos en almacenamiento a largo plazo ennitrógeno líquido en el Centro de Tránsito de INIBAP (ITC), Lovaina, Bélgica.Las tasas de regeneración varían entre 10 y 80% dependiendo del cultivar y delprotocolo de crioconservación que se aplica. Los cultivares ABB generalmenteson almacenados utilizando el método de congelación sencillo, mientras que elprotocolo de crioconservación combinado es aplicado a otros genotipos.

5.2 SUSPENSIONES DE CÉLULAS

Pretratamiento

A menudo en los protocolos de crioconservación se incluye una fase decrecimiento previo para aumentar la tolerancia de los cultivos de tejidos a lacongelación. Compuestos activos osmóticamente como sorbitol o mannitol seañaden para reducir el agua celular antes de la congelación, reduciendo así lacantidad de agua disponible para la formación de hielo letal (Withers y Street1977). En el caso de las células de banano, se descubrió que la deshidrataciónosmótica con mannitol al 6% por 2 o 7 días no afecta la viabilidad después dela crioconservación. Sin embargo, para una suspensión de células derivadas debrotes masculinos de Musa acuminata, el precultivo con 180 g/l durante24 horas mostró ser beneficioso (Côte et al. 2000).

Crioprotección

Se examinaron diferentes soluciones crioprotectoras, incluyendo el DMSO (a2.5, 5, 7.5, 10 y 15%), glicerol (a 5, 10 y 15%), prolina (a 10%), y una mezclacrioprotectora (que contiene 0.5 M de glicerol, 0.5 M de DMSO y 1 M desacarosa). Aunque todos los tratamientos dieron como resultado, de acuerdo ala prueba de viabilidad de FDA, la supervivencia de las células congeladas,sólo el DMSO a 5, 7.5 y 10% dio un crecimiento satisfactorio después de ladescongelación. La adición de niveles de sacarosa más altos (180 g/l) a lasolución crioprotectora tiene, para la mayoría de las suspensiones, un efectopositivo sobre las tasas de viabilidad de FDA y, lo que es más importante, sobreel crecimiento después de la descongelación. Este hecho también se observó enlos callos embriogénicos de la caña de azúcar (Martinez-Montero et al. 1998).


Congelación

Un crecimiento comparable después de la descongelación se obtiene utilizandoel baño de metanol y las cajas de Nalgene, con tal de que los criotubos setransfieran al nitrógeno líquido tan pronto se obtenga la temperatura de–40 °C. Si las cajas de Nalgene se dejan durante la noche en un congelador contemperatura de–80 °C, no se observa la recuperación después de ladescongelación. Una posible razón para esta falta de crecimiento consiste enque las células son severamente deshidratadas debido a la deshidratación quecontinúa hasta alcanzar -70 °C en vez de -40 °C así como durante elmantenimiento de estas células a esta temperatura antes de estar sumergidasen el nitrógeno líquido. El uso de las cajas de Nalgene resultó también muyeficaz para la congelación de suspensiones embriogénicas de banano iniciadasa partir de flores masculinas (Côte et al. 2000). La principal ventaja de lautilización de las cajas de Nalgene consiste en que no se necesita un equipocostoso para controlar el congelamiento lento.

Postratamientos

La remoción de la solución crioprotectora potencialmente tóxicainmediatamente después de la descongelación y su reemplazo por un mediolíquido sin crioprotectores, antes de transferir los cultivos a un mediosemisólido, da como resultado una pérdida completa de la capacidad de nuevocrecimiento y las células se tornan blancas. La transferencia directa de lascélulas a un medio líquido que somete a las células a estrés similar al de lavadodespués de descongelación, igualmente resulta en fallo de crecimiento. Elnuevo crecimiento sólo puede ser logrado cuando las células, rodeadas aúnpor las soluciones crioprotectoras, se transfieren directamente a un mediosemisólido.

Utilizando el protocolo optimizado para crioconservación descritoanteriormente, KUL actualmente está almacenando en nitrógeno líquido50 líneas de suspensiones de células embriogénicas pertenecientes a9 cultivares de banano diferentes. Recientemente, se recuperaron lassuspensiones celulares de banano después de 5 años de almacenamiento. Lahabilidad de producir embriones somáticos permanece intacta y se podríaestablecer nuevas suspensiones de células embriogénicas a partir del materialcongelado.

El hecho de que algunas suspensiones celulares de banano no son capaces deresistir la crioconservación podría ser considerado como una razón para unafutura optimización del protocolo de crioconservación. En adición alprocedimiento más convencional, que involucra congelación lenta en presenciade una solución crioprotectora que a menudo contiene el DMSO, también seinformó sobre la obtención de una crioconservación exitosa después de la


Apéndice 1. Composición de medios y solución

MEDIO MS (Murashige y Skoog 1962)

Componentes del MS Concentración (mg/l)

Sales inorgánicas

Cloruro de calcio (CaCl2) 332.02

Nitrato de amoníaco (NH4NO3) 1650

Sulfato de magnesio (MgSO4) 80.70

Acido bórico (H3BO3) 6.2

Cloruro de cobalto (CoCl2 · 6H2O) 0.025

Sulfato cúprico (CuSO4 · 6H2O) 0.025

Sulfato de manganeso (MnSO4 · H2O) 16.90

Yoduro de potasio (KI) 0.83

Nitrato de potasio (KNO3) 1900

Fosfato de potasio (KH2PO4) 170

Molibdato de sodio (Na2MoO4 · 2H2O) 0.25

Sulfato de zinc (ZnSO4 · 7H2O) 8.60

Fuente de hierro

Sodio EDTA (Na2 · EDTA) 37.26

Sulfato férrico (FeSO4 · 7H2O) 27.80

Vitaminas

Mio-inositol 100

Acido nicotínico 0.5

Piridoxina HCL 0.5

Tiamina HCl 0.5

Glicina (base libre) 2.00

VITAMINAS DE MOREL

(Morel 1950)Pantotenato de calcio 1

Mio-inositol 100

Acido nicotínico 1

Piridoxina HCL 1

Tiamina HCl 1

Biotina 0.01


MEDIO P5

Medio MS complementado con sacarosa de 30g/l , 10 µM de BA, 1 µM de IAA,2 g/l de gelrite o 5 g/l de agar (Banerjee y De Langhe 1985). (pH:5.8).

MEDIO P4

Medio P5 con una concentración de BA , 10 veces más alta (100 µM).

MEDIO DE PRECULTIVO (PCM)

Este medio contiene todos los elementos del P5 pero los niveles de sacarosa sonaumentados hasta una concentración final de 0.4 M.

MEDIO DE REGENERACIÓN P6

Medio P5 con una concentración de BA 10 veces más baja (1 µM).

SOLUCIÓN DE PRETRATAMIENTO L1

Componentes del medio MS diluidos en agua complementada con 2 M deglicerol y 0.4 M de sacarosa, el pH es ajustado a 5.8. La solución es esterilizadaa través de un filtro (0.22 µ).

SOLUCIÓN PVS2

Consiste de glicerol a 30% (3.26 M), etileno glicol a 15% (2.42 M) (EG), DMSOa 15% (1.9 M) y 0.4 M de sacarosa (Sakai et al. 1990). Todos estos componentesse disuelven en el medio MS, el pH es ajustado a 5.8 seguido por unaesterilización con filtro (0.22 µ).

SOLUCIÓN DE DESCARGA

El filtro es esterilizado (0.22µ), la solución de descarga consiste de 1.2 M desacarosa disuelta en el medio MS. (pH:5.8).

MEDIO ZZ

Macro elementos y hierro de MS a mitad de su poder, microelementos de MS,5 µM 2,4-D, 1 µM de zeatina, vitaminas estándar de MS, 10 mg/l de ácidoascórbico, y 30 g/l de sacarosa. (pH:5.8).

MEDIO RD1

Macroelementos y hierro de MS, microelementos de MS, 1 µm de BA,vitaminas estándar de MS, 100 mg/l de mio-inositol, 10 mg/l de ácidoascórbico, 30 g/l de sacarosa y 2 g/l de gelrita. (pH:5.8).


MEDIO MA2

Macro y microelementos de MS, biotina 1 mg/l, glutamina 100 mg/l, extractode malta 100 mg/l, 2,4-D 1 mg/l y sacarosa 45 g/l. El medio es ajustado a unpH:5.3.

MEDIO MA3

Sales inorgánicas Concentración (mg/l)

KNO3 2500

CaCl2 · 2H2O 200

MgSO4 · 7 H2O 400

NH4H2PO4 300

MnSO4 · H2O 10

H3BO3 5

ZnSO4 · 7H2O 1

KI 1

CuSO4 · 5H2O 0.2

NaMoO4 · 2H2O 0.1

CoCl2 0.1

Fuente de hierro

FeSO4 · 7H2O 15

Na2DTA 20

Vitaminas de MS

Otros componentes

ANA 0.2

Zeatina 0.05

2iP 0.2

Kinetina 0.1

Lactosa 10 g/l

Sacarosa 45 g/l

Agarosa 7 g/l

pH 5.3


Apéndice 2. Equipo básico requerido

Fuente de nitrógeno líquido

Criotanques 1 para el almacenamiento de nitrógenolíquido (con enrejado y cajas)

1 para almacenar el material vegetal (2 paraseguridad)

Recipientes de Dewar (2)Criotubos de 2 ml Criocañas

Baño de metanol de agitación (-40 °C)

Baño de alcohol (por ejemplo, Mr. Freeze Nalgene™)

Congelador programable (sólo para los propósitos de investigación o para laaplicación a gran escala) o (congelador para -70 °C o –80 °C + Mr. Freeze)

Químicos (DMSO, PEG, etc.)

Microscopio estereoscópico binocular y microscopio de fluorescencia

Equipo de seguridad: guantes y lentes para manipulación del nitrógenolíquido.


Apéndice 3. Lista de abreviaturas

2,4 D 2,4-ácido diclorofenoxiacético

BA, BAP 6-benzilaminopurina

DMSO sulfóxido de dimetilo

EG glicol de etileno

FDA diacetato de fluoresceina

IAA ácido indoleacético

LN nitrógeno líquido

MS Medio Murashige y Skoog

PEG glicol de polietileno

TTC Cloruro de trifenilo tetrazolio


Bibliografía

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