REGLAMENTAI - EUR-Lex

I

(Aktai priimti remiantis EB ir (arba) Euratomo steigimo sutartimis kuriuos skelbti privaloma)

REGLAMENTAI

KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) Nr 1522009

2009 m sausio 27 d

nustatantis oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos ėminių ėmimo ir analizės metodus

(Tekstas svarbus EEE)

EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA

atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį

atsižvelgdama į 2004 m balandžio 29 d Europos Parlamento irTarybos reglamentą (EB) Nr 8822004 dėl oficialios kontrolėskuri atliekama siekiant užtikrinti kad būtų įvertinama arlaikomasi pašarus ir maistą reglamentuojančių teisės aktųgyvūnų sveikatos ir gerovės taisyklių (1) ypač į jo 11 straipsnio4 dalies a b ir c punktus

kadangi

(1) Šie aktai buvo priimti Direktyvai 70373EEB įgyvendinti irvis dar galioja pagal Reglamento (EB) Nr 882200461 straipsnio 2 dalį

mdash 1971 m birželio 15 d pirmoji Komisijos direktyva71250EEB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (2)

mdash 1971 m lapkričio 18 d antroji Komisijos direktyva71393EEB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (3)

mdash 1972 m balandžio 27 d trečioji Komisijos direktyva72199EEB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (4)

mdash 1972 m gruodžio 5 d ketvirtoji Komisijos direktyva7346EEB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (5)

mdash 1976 m kovo 1 d pirmoji Komisijos direktyva 76371EEB nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taiky-tinus Bendrijos analizės metodus (6)

mdash 1976 m kovo 1 d septintoji Komisijos direktyva 76372EEB nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taiky-tinus Bendrijos analizės metodus (7)

mdash 1978 m birželio 15 d aštuntoji Komisijos direktyva78633EEB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (8)

mdash 1981 m liepos 31 d devintoji Komisijos direktyva81715EEB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (9)

mdash 1984 m liepos 25 d dešimtoji Komisijos direktyva84425EEB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (10)

mdash 1986 m balandžio 9 d Komisijos direktyva 86174EEB nustatanti paukščių kombinuotųjų pašarų ener-getinės vertės apskaičiavimo metodus (11)

2009 2 26 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys L 541

(1) OL L 165 2004 4 30 p 1 pataisyta OL L 191 2004 5 28 p 1(2) OL L 155 1971 7 12 p 13(3) OL L 279 1971 12 20 p 7(4) OL L 123 1972 5 29 p 6

(5) OL L 83 1973 3 30 p 21(6) OL L 102 1976 4 15 p 1(7) OL L 102 1976 4 15 p 8(8) OL L 206 1978 7 29 p 43(9) OL L 257 1981 9 10 p 38(10) OL L 238 1984 9 6 p 34(11) OL L 130 1986 5 16 p 53

mdash 1993 m liepos 28 d vienuoliktoji Komisijos direktyva9370EEB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (1)

mdash 1993 m gruodžio 17 d dvyliktoji Komisijos direktyva93117EB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (2)

mdash 1998 m rugsėjo 3 d Komisijos direktyva 9864EBnustatanti Bendrijos analizės metodus pašaruoseesančioms aminorūgštims žaliems aliejams ir rieba-lams bei olakvindoksui nustatyti ir iš dalies pakeičiantiDirektyvą 71393EEB (3)

mdash 1999 m balandžio 20 d Komisijos direktyva 199927EB nustatanti Bendrijos analizės metodus ampro-liumui diklazurilui ir karbadoksui pašaruose nustatytiiš dalies keičianti Direktyvas 71250EEB bei 7346EEB ir panaikinanti Direktyvą 74203EEB (4)

mdash 1999 m liepos 23 d Komisijos direktyva 199976EB nustatanti Bendrijos analizės metodą kuriuonustatoma lasalocido natrio druska pašaruose (5)

mdash 2000 m liepos 6 d Komisijos direktyva 200045EBnustatanti Bendrijos analizės metodus pašaruoseesantiems A vitaminui E vitaminui ir triptofanuinustatyti (6)

mdash 2002 m liepos 26 d Komisijos direktyva 200270EB nustatanti dioksinų ir dioksinų tipo PCB kon-centracijos pašaruose nustatymo reikalavimus (7)

mdash 2003 m gruodžio 23 d Komisijos direktyva 2003126EB dėl gyvūninės kilmės sudedamųjų daliųnustatymo analizės metodo taikomo valstybineipašarų kontrolei (8)

(2) Kadangi Direktyva 70373EEB buvo pakeista Reglamentu(EB) Nr 8822004 reikėtų tos direktyvos įgyvendinimoaktus pakeisti vienu reglamentu Tuo pačiu metu metodaiturėtų būti suderinti su mokslo ir technikos žinių raidaMetodai kurie nebeatitinka numatytos paskirties turėtųbūti panaikinti Numatyta tinkamu metu atnaujinti ėminiųėmimo nuostatas kad būtų galima atsižvelgti į naujausiuspašarų gamybos laikymo vežimo ir pateikimo į rinkąpasiekimus tačiau tam tikrą laiką reikia palikti galiojančiasėminių ėmimo nuostatas

(3) Todėl Direktyvos 71250EEB 71393EEB 72199EEB7346EEB 76371EEB 76372EEB 78633EEB 81715EEB 84425EEB 86174EEB 9370EEB 93117

EB 9864EB 199927EB 199976EB 200045EB200270EB ir 2003126EB turėtų būti panaikintos

(4) Šiame reglamente numatytos priemonės atitinka Maistograndinės ir gyvūnų sveikatos nuolatinio komiteto nuo-monę

PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ

1 straipsnis

Ėminių ėmimas oficialiai pašarų kontrolei susijusiai su sudeda-mųjų dalių priedų ir nepageidaujamų medžiagų nustatymuišskyrus pesticidų likučius ir mikroorganizmus atliekamas pagalI priede aprašytus metodus

2 straipsnis

Ėminiai analizei ruošiami ir rezultatų išraiška pateikiama pagalII priede aprašytus metodus

3 straipsnis

Oficialiai pašarų kontrolei skirta analizė atliekama taikantmetodus aprašytus III priede (Analizės metodai taikomipašarinių medžiagų ir kombinuotųjų pašarų sudėčiai kontro-liuoti) IV priede (Analizės metodai leidžiamų pašarų priedųkoncentracijai kontroliuoti) V priede (Analizės metodai nepa-geidaujamoms medžiagoms pašaruose kontroliuoti) ir VI priede(Analizės metodai gyvūninės kilmės sudedamosioms dalimsnustatyti atliekant oficialiąją pašarų kontrolę)

4 straipsnis

Paukščių kombinuotųjų pašarų energinė vertė apskaičiuojamapagal VII priedą

5 straipsnis

VIII priede aprašyti analizės metodai skirti daugiau neleidžiamųnaudoti pašarų priedų neteisėtam buvimui kontroliuoti taikomipatvirtinimo tikslais

6 straipsnis

Direktyvos 71250EEB 71393EEB 72199EEB 7346EEB76371EEB 76372EEB 78633EEB 81715EEB 84425EEB 86174EEB 9370EEB 93117EB 9864EB 199927EB 199976EB 200045EB 200270EB ir 2003126EBpanaikinamos

Nuorodos į panaikintas direktyvas laikomos nuorodomis į šįreglamentą ir aiškinamos pagal IX priede pateiktas atitikčiųlenteles

L 542 LT Europos Sąjungos oficialusis leidinys 2009 2 26

(1) OL L 234 1993 9 17 p 17(2) OL L 329 1993 12 30 p 54(3) OL L 257 1998 9 19 p 14(4) OL L 118 1999 5 6 p 36(5) OL L 207 1999 8 6 p 13(6) OL L 174 2000 7 13 p 32(7) OL L 209 2002 8 6 p 15(8) OL L 339 2003 12 24 p 78

7 straipsnis

Šis reglamentas įsigalioja dvidešimtą dieną nuo jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje

Jis taikomas nuo 2009 m rugpjūčio 26 d

Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse

Priimta Briuselyje 2009 m sausio 27 d

Komisijos vardu

Androulla VASSILIOU

Komisijos narė


I PRIEDAS

ĖMINIŲ ĖMIMO METODAI

1 TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Ėminiai skirti oficialiai pašarų kontrolei imami pagal toliau aprašytus metodus Taip gauti ėminiai laikomireprezentatyviaisiais partijos ėminiais

2 ĖMINIUS IMANTYS PAREIGŪNAI

Ėminius ima pareigūnai kuriuos tam įgalioja valstybės narės

3 APIBRĖŽTYS

Partija produkto kiekis sudarantis tyrimo vienetą ir pasižymintis savybėmis kurios laikomos tolygiomis

Atskirasis ėminys kiekis paimtas iš vienos partijos vietos

Jungtinis ėminys jungtinių ėminių paimtų iš vienos ėminio partijos visuma

Sumažintasis ėminys jungtinio ėminio dalis atspindinti jo visumą gauta jį redukuojant

Galutinis ėminys sumažintojo arba homogenizuoto jungtinio ėminio dalis

4 APARATAS

41 Ėminių ėmimo aparatas turi būti pagamintas iš medžiagų negalinčių užteršti produktų iš kurių imami ėminiaiToks aparatas gali būti oficialiai patvirtintas valstybių narių

42 Aparatas rekomenduojamas kietųjų pašarų ėminiams imti

421 Ėminių ėmimas rankiniu būdu

4211 Plokščiadugnė bertuvė vertikaliais kraštais

4212 Ėminių ėmimo zondas su ilgu plyšiu arba pertvaromis Zondo matmenys turi atitikti ėminio tiriamosios daliesypatybes (talpyklos gylį maišo matmenis ir pan) ir pašarų dalelių dydį

422 Ėminių ėmimas mechaniniu būdu

Judančių pašarų ėminiams imti gali būti naudojamas patvirtintas mechaninis aparatas

423 Dalytuvas

Aparatas skirtas padalyti ėminį į maždaug vienodo dydžio dalis gali būti naudojamas atskiriesiems ėminiams imtibei sumažintiesiems ir galutiniams ėminiams ruošti

5 KIEKYBINIAI REIKALAVIMAI

5A Tikrinant vienodai pašaruose pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus

5A1 PartijaPartija turi būti tokia kad iš jos būtų galima paimti kiekvienos jos sudedamosios dalies ėminį


5A2 Atskirieji ėminiai

5A21 Piltiniai pašarai Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius

5A211 Partija ne didesnė kaip 25 metrinės tonos septyni

5A212 Partija didesnė kaip 25 metrinės tonos kvadratinė šaknis iš 20 kartų partiją suda-rančių metrinių tonų skaičiaus () bet nedaugiau kaip 40 atskirųjų ėminių

5A22 Supakuoti pašarai Mažiausias pakuočių iš kurių imami ėminiaiskaičius ()

5A221 Pakuotės kurių masė didesnė kaip 1 kg

5A2211 Partiją sudaro nuo vienos iki keturiųpakuočių

visos pakuotės

5A2212 Partiją sudaro nuo penkių iki 16 pakuočių keturios pakuotės

5A2213 Partiją sudaro daugiau kaip 16 pakuočių kvadratinė šaknis iš partiją sudarančiųpakuočių skaičiaus () be ne daugiau kaip20 pakuočių

5A222 Pakuotės kurių masė ne didesnė kaip 1 kg keturios

5A23 Skystieji arba pusiau skysti pašarai Mažiausias talpyklų iš kurių imami ėminiaiskaičius ()

5A231 Talpyklų tūris didesnis kaip 1 l

5A2311 Partiją sudaro nuo vienos iki keturiųtalpyklų

visos talpyklos

5A2312 Partiją sudaro nuo penkių iki 16 talpyklų keturios

5A2313 Partiją sudaro daugiau kaip 16 talpyklų kvadratinė šaknis iš partiją sudarančių talpy-klų skaičiaus () be ne daugiau kaip20 talpyklų

5A232 Talpyklų tūris ne didesnis kaip 1 l keturios

5A24 Pašarų briketai ir mineralų laižalai Mažiausias briketų arba laižalų iš kuriųimami ėminiai skaičius ()vienas pašarų briketas arba laižalas25 vienetų partijai bet ne daugiau kaip keturibriketai arba laižalai

5A3 Jungtinis ėminysReikia paruošti vieną jungtinį vienos tiriamosios ėminio dalies ėminį Jungtinį ėminįsudarančių atskirųjų ėminių suminis kiekis turi būti ne mažesnis kaip

5A31 Piltiniai pašarai 4 kg

5A32 Supakuoti pašarai

5A321 pakuotės kurių masė didesnė kaip 1 kg 4 kg

5A322 pakuotės kurių masė ne didesnė kaip 1 kg keturių pirminių pakuočių turinio masė

5A33 Skystieji arba pusiau skysti pašarai

5A331 talpyklų tūris didesnis kaip 1 l keturi litrai

5A332 talpyklų tūris ne didesnis kaip 1 l keturių pirminių talpyklų turinio tūris

5A34 Pašarų briketai arba laižalai

5A341 kiekvieno masė didesnė kaip 1 kg 4 kg

5A342 kiekvieno masė ne didesnė kaip 1 kg keturių pirminių briketų arba laižalų masė


5A4 Galutiniai ėminiaiPrireikus iš jungtinio ėminio jį mažinant ruošiami galutiniai ėminiai Reikia atlikti bent vienogalutinio ėminio analizę Analizuojamo galutinio ėminio kiekis turi būti ne mažesnis kaip

Kietieji pašarai 500 g

Skystieji arba pusiau skysti pašarai 500 ml

5B Kontroliuojant nepageidaujamas medžiagas arba produktus kurie gali netolygiai pasiskirstytipašaruose pvz aflatoksinus rugių skalsę ricinžolę ir crotalaria ()

5B1 Partija žr 5A1

5B2 Atskirieji ėminiai

5B21 Piltiniai pašarai žr 5A21

5B22 Supakuoti pašarai Mažiausias pakuočių iš kurių imami ėminiaiskaičius

5B221 partiją sudaro nuo vienos iki keturiųpakuočių

visos pakuotės

5B222 partiją sudaro nuo penkių iki 16 pakuočių keturios

5B223 partiją sudaro daugiau kaip 16 pakuočių kvadratinė šaknis iš partiją sudarančiųpakuočių skaičiaus () be ne daugiau kaip40 pakuočių

5B3 Jungtiniai ėminiaiJungtinių ėminių skaičius skirsis atsižvelgiant į partijos dydį Toliau nurodomas mažiausias išvienos partijos paimtų jungtinių ėminių skaičius Kiekvieną jungtinį ėminį sudarančiųatskirųjų ėminių suminė masė turi būti ne mažesnė kaip 4 kg

5B31 Piltiniai pašarai

Partijos svoris metrinėmis tonomis Mažiausias partijos jungtinių ėminių skaičius

iki 1 1

nuo daugiau kaip 1 iki 10 2


daugiau kaip 40 4

5B32 Supakuoti pašarai

Supakuotų pašarų partijos pakuočių skai-čius

Mažiausias partijos jungtinių ėminių skaičius

nuo 1 iki 16 1

nuo 17 iki 200 2

nuo 201 iki 800 3

daugiau kaip 800 4

5B4 Galutiniai ėminiaiIš jungtinio ėminio jį mažinant gaunami galutiniai ėminiai Reikia atlikti bent vieno galutinioėminio vienam jungtiniam ėminiui analizę Analizei paimto galutinio ėminio masė negali būtimažesnė kaip 500 g

() Jei gautas skaičius yra trupmena ji turėtų būti suapvalinama iki sveiko skaičiaus() Jei pakuotės arba talpyklos turinio masė ne didesnė kaip 1 kg arba tūris ne didesnis kaip 1 l ir pašarų briketų arba laižalų

masė ne didesnė kaip 1 kg atskirasis ėminys yra vienos pirminės pakuotės arba talpyklos vieno briketo arba laižalo turinys() Metodai numatyti 5A taikomi aflatoksinams rugių skalsei ricinžolei ir crotalaria kontroliuoti visaverčiuose pašaruose ir

pašarų papilduose


6 ĖMINIŲ ĖMIMO RUOŠIMO IR PAKAVIMO INSTRUKCIJOS

61 Bendrosios nuostatos

Ėminiai turi būti imami ir ruošiami kiek įmanoma greičiau turint omenyje atsargumo priemones kurios yrabūtinos siekiant užtikrinti kad produktas nepakistų ir nebūtų užterštas Įrankiai ėminiams imti ir talpyklų kuriosejie laikomi paviršiai turi būti švarūs ir sausi

62 Atskirieji ėminiai

62A Kontroliuojant vienodai pašaruose pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus

Atskirieji ėminiai turi būti imami atsitiktinai iš visos partijos ir jie turi būti maždaug vienodo dydžio

62A1 P i l t i n i a i p a š a r a i

Partija vizualiai dalijama į tam tikrą skaičių maždaug vienodų dalių Atsitiktinai pasirenkamas dalių skaičiusatitinkantis pagal 5A2 punktą reikalaujamą atskirųjų ėminių skaičių ir iš kiekvienos dalies paimama bent povieną ėminį

Jei tinka ėminius galima imti keičiant partijos vietą (kraunant arba iškraunant)

62A2 S u p a k u o t i p a š a r a i

Atrinkus reikiamą skaičių pakuočių ėminiams imti kaip nurodyta 5A2 punkte dalis kiekvienos pakuotės turiniopaimama bertuve arba zondu Prireikus ėminiai imami atskirai ištuštinus pakuotes Prireikus atskirai kiekvienojungtinio ėminio gabalai turi būti sutrupinti juos atskiriant nuo ėminio ir grąžinti atgal

62A3 Homog e n i n i a i a r b a h omog e n i z u o j am i s k y s t i e j i a r b a p u s i a u s k y s t i p a š a r a i

Atrinkus reikiamą skaičių talpyklų ėminiams imti kaip nurodyta 5A2 punkte jų turinys prireikushomogenizuojamas ir iš kiekvienos talpyklos paimamas tam tikras kiekis

Atskiruosius ėminius galima imti išpilant talpyklos turinį

62A4 N e homog e n i z u o j am i s k y s t i e j i a r b a p u s i a u s k y s t i p a š a r a i

Atrinkus reikiamą skaičių talpyklų ėminiams imti kaip nurodyta 5A2 punkte ėminiai imami iš skirtingų lygių

Be to ėminius galima imti išpilant talpyklos turinį tačiau pirmosios frakcijos turėtų būti išpiltos lauk

Abiem atvejais visas paimto ėminio tūris neturi būti mažesnis kaip 10 l

62A5 P a š a rų b r i k e t a i i r m i n e r a lų l a i ž a l a i

Atrinkus ėminiams imti reikalingą kiekį pašarų briketų arba laižalų kaip nurodyta 5A2punkte imama kiekvienobriketo arba laižalo dalis

62B Kontroliuojant nepageidaujamas medžiagas arba produktus kurie gali netolygiai pasiskirstyti pašaruose pvz aflatoksinusrugių skalsę ricinžolę ir crotalaria

Partija vizualiai dalijama į tam tikrą skaičių maždaug vienodų dalių atitinkančių 5B3 punkte numatytą jungtiniųėminių skaičių Jeigu šis skaičius didesnis už 15B2 punkte numatytas suminis atskirųjų ėminių skaičiuspaskirstomas maždaug vienodai skirtingoms dalims Tada imami maždaug tokie vienodo dydžio ėminiai (1) kadsuminis ėminių kiekis iš kiekvienos dalies būtų ne mažesnis kaip kiekvienam jungtiniam ėminiui gauti būtinas4 kg kiekis Iš skirtingų dalių paimti atskirieji ėminiai neturi būti sujungiami


(1) Supakuotų pašarų iš kurių imami ėminiai pakuočių turinio dalis paimama zondu arba bertuve prieš tai atskirai ištuštinus pakuotes jeireikia

63 Jungtinių ėminių ruošimas


Atskirieji ėminiai sumaišomi kad būtų gautas vienas jungtinis ėminys


Atskirieji ėminiai iš kiekvienos partijos dalies sumaišomi ir gaunamas 5B3 punkte nurodytas jungtinių ėminiųskaičius imantis priemonių užrašyti kiekvieno jungtinio ėminio kilmę

64 Galutinių ėminių ruošimas

Kiekvieno jungtinio ėminio medžiaga gerai sumaišoma kad būtų gautas homogenizuotas ėminys (1) Prireikusjungtinis ėminys iš pradžių sumažinamas bent iki 2 kg arba dviejų litrų (sumažintasis ėminys) mechaniniu arbaautomatiniu dalytuvu arba taikant ketvirčiavimo metodą

Tada ruošiami bent trys maždaug vienodo kiekio galutiniai ėminiai atitinkantys 5A4 arba 5B4 punktųkiekybinius reikalavimus Kiekvienas ėminys sudedamas į atitinkamą talpyklą Imamasi visų reikalingų atsargumopriemonių kad gabenant arba saugant negalėtų pasikeisti ėminio sudėtis jis nebūtų užterštas arba sufalsifikuotas

65 Galutinių ėminių pakavimas

Talpyklos arba pakuotės plombuojamos ir ženklinamos (visa etiketė turi būti po plomba) taip kad jų nebūtųgalima atidaryti nepažeidus plombos

7 ĮRAŠAI APIE ĖMINIUS

Turi būti daromi įrašai apie visus ėminius kad vienareikšmiškai būtų galima nustatyti kiekvieną partiją

8 ĖMINIŲ PASKIRTIES VIETA

Bent vienas kiekvieno jungtinio ėminio galutinis ėminys kuo skubiau siunčiamas į įgaliotąją kontrolės laboratorijąkartu su analizę atliekančiam asmeniui būtina informacija


(1) Prireikus atskirai kiekvieno jungtinio ėminio visi gabalai turi būti sutrupinti juos atskiriant nuo ėminio ir grąžinti atgal

II PRIEDAS

BENDROSIOS NUOSTATOS DĖL PAŠARŲ ANALIZĖS METODŲ

A ĖMINIŲ RUOŠIMAS ANALIZEI

1 Tikslas

Toliau aprašytos procedūros taikomos analizei ruošiant į kontrolės laboratorijas atsiųstus galutinius ėminius paimtuspagal I priede pateiktas nuostatas

Šie ėminiai turi būti ruošiami taip kad pagal analizės metodą sverti numatyto kiekio ėminiai būtų vienalyčiai ir atitiktųgalutinius ėminius

2 Taikytinos atsargumo priemonės

Ėminių ruošimo procedūra kurios reikia laikytis priklauso nuo taikomo analizės metodo Todėl labai svarbuužtikrinti kad ėminių ruošimo procedūra atitiktų taikomą analizės metodą

Visi būtinosios operacijos turi būti atliktos taip kad kiek įmanoma būtų išvengta ėminio užteršimo ir jo sudėtiespokyčių

Malama maišoma ir sijojama kiek įmanoma greičiau kad ėminį kuo mažiau veiktų oras ir šviesa Nenaudojamimalūnėliai ir smulkintuvai kurie gali gerokai įkaitinti ėminį

Šilumai ypač jautrių pašarų ėminius rekomenduojama malti rankiniu būdu Be to užtikrinama kad pati aparatūranebūtų užteršimo mikroelementais šaltiniu

Jei ėminio paruošti neįmanoma gerokai nepakintant jo drėgmės kiekiui jis nustatomas prieš ėminio ruošimą ir jįparuošus pagal III priedo A dalyje pateiktą metodą

3 Procedūra

Ėminys dalijamas į analizei ir palyginimui skirtus atitinkamus poėminius taikant reikiamus dalijimo būdus pvzpakaitinį perkasimą stacionarųjį arba sukamąjį latakinį dalytuvą Kūgio supylimo ir ketvirčiavimo metodasnerekomenduojamas nes gali būti gauti poėminiai su didele dalijimo paklaida Palyginamasis ėminys laikomastinkamame švariame ir sausame sandariai uždaromame inde ir bent 100 g poėminiai ruošiami analizei kaip nurodytatoliau

31 Pašarai kuriuos galima malti be paruošimo

Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip prireikus visas sumaltas ėminys sijojamas per sietą su kvadratinėmis 1 mmdydžio akutėmis (pagal ISO R565 rekomendaciją) Vengiama malti labai smulkiai

Sijotas ėminys sumaišomas ir sudedamas į tinkamą švarų ir sausą sandariai užkemšamą indą Dar kartą sumaišomaprieš sveriant analizei reikiamą ėminio kiekį

32 Pašarai kurie prieš malant džiovinami

Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip ėminys džiovinamas drėgmės kiekiui sumažinti iki 8ndash12 taikant pradiniodžiovinimo procedūrą aprašytą III priedo A dalyje pateikto drėgmės nustatymo metodo 43 punkte Tada tęsiamakaip nurodyta 31 skirsnyje

33 Skystieji arba pusiau skysti pašarai

Ėminys supilamas į tinkamą švarų ir sausą sandariai užkemšamą indą Dar kartą sumaišoma prieš sveriant analizeireikiamą ėminio kiekį

34 Kiti pašarai

Ėminiai kurių neįmanoma paruošti pagal kurią nors pirmiau pateiktą procedūrą apdorojami taikant bet kurią kitąprocedūrą kuri užtikrintų kad analizei pasverti ėminiai būtų vienalyčiai ir atitiktų galutinius ėminius


4 Ėminių laikymas

Ėminiai turi būti laikomi temperatūroje kurioje nekistų jų sudėtis Vitaminų analizei skirti ėminiai arba šviesai ypačjautrūs ėminiai laikomi rudo stiklo induose

B NUOSTATOS DĖL ANALIZĖS METODAMS NAUDOJAMŲ REAGENTŲ IR APARATŪROS

1 Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip visi analiziniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a g) Atliekant pėdsakųanalizę reagentų grynumas turi būti patikrintas atliekant tuščiąjį bandymą Atsižvelgiant į gautą rezultatą gali tektipapildomai gryninti reagentus

2 Visoms tirpalų ruošimo skiedimo skalavimo arba plovimo operacijoms apie kurias kalbama analizės metoduosenenurodant naudojamo tirpiklio arba skiediklio tipo turi būti naudojamas vanduo Paprastai vanduodemineralizuojamas arba distiliuojamas Konkrečiais atvejais nurodytais analizės metode jam turi būti taikomosspecialios gryninimo procedūros

3 Atsižvelgiant į paprastai kontrolės laboratorijų turimą įrangą analizės metoduose nurodomi tik specialios paskirtiesarba tam tikru būdu naudojami prietaisai ir aparatūra Jie turi būti švarūs ypač kai reikia nustatyti mažus cheminiųmedžiagų kiekius

C ANALIZĖS METODŲ TAIKYMAS IR REZULTATŲ IŠRAIŠKA

1 Ekstrahavimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra ekstrahavimo procedūra Paprastai galima taikyti kitas nei metoduinustatyta ekstrahavimo procedūras jei įrodoma kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gautasekstrahavimo veiksmingumas atitinka metodu nustatytos procedūros veiksmingumą

2 Gryninimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra gryninimo procedūra Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatytagryninimo procedūras jei įrodoma kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gauti analizės rezultataiatitinka rezultatus gautus taikant metodu nustatytą procedūrą

3 Taikyto analizės metodo pateikimas ataskaitoje

Paprastai kiekvienai pašaruose esančiai cheminei medžiagai nustatyti pateikiamas vienas analizės metodas Jeipateikiami keli metodai kontrolės laboratorijos taikomas konkretus metodas turi būti nurodytas analizės ataskaitoje

4 Nustatymų skaičius

Analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas turi būti tinkamo pakartojamumo vidutinė vertė gauta atliekant mažiausiaidu atskirų ėminio dalių nustatymus

Tačiau jei analizuojant nepageidaujamas medžiagas pirmojo nustatymo rezultatas yra gerokai (gt 50 ) mažesnis neikontroliuojama specifikacijos vertė papildomas nustatymas nebūtinas jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros

Jei atliekant nurodyto medžiagos arba sudedamosios dalies kiekio kontrolę pirmojo nustatymo rezultatas patvirtinanurodytą kiekį t y analizės rezultatas atitinka priimtiną nurodyto kiekio kitimo intervalą papildomas nustatymasnebūtinas jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros

Kai kuriais atvejais priimtinas kitimo intervalas yra apibrėžtas teisės aktuose pvz Tarybos direktyvoje 79373EEB (1)

5 Analizės rezultato pateikimas ataskaitoje

Analizės rezultatas turi būti išreikštas analizės metode nustatytu būdu nurodant atitinkamą reikšminių skaitmenųskaičių ir prireikus darant pataisą dėl drėgmės kiekio galutiniame ėminyje prieš ruošimą


(1) OL L 86 1979 4 6 p 30

6 Matavimo neapibrėžtis ir išgavos dydis atliekant nepageidaujamų medžiagų analizę

Dėl nepageidaujamų medžiagų kaip apibrėžta Direktyvoje 200232EB įskaitant dioksinus ir dioksinų tipo PCBlaikoma kad gyvūnų pašarams skirtas produktas neatitinka nustatyto didžiausio kiekio jei manoma kad analizėsrezultatas viršija didžiausią kiekį įskaitant išplėstinę matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą Atitikčiai įvertintinaudojama analizuojant gauta koncentracija atlikus išgavos dydžio pataisą ir ir atėmus išplėstinę matavimoneapibrėžtį Ši procedūra taikoma tais atvejais kai galima įvertinti analizės metodo matavimo neapibrėžtį ir išgavosdydžio pataisą (tai pvz neįmanoma kai atliekama mikroskopinė analizė)

Analizės rezultatas užrašomas taip (jei taikant analizės metodą galima įvertinti matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydį)

a) su pataisa dėl išgavos dydžio nurodant išgavos dydį Pataisa dėl išgavos dydžio nebūtina jei jis yra 90ndash110

b) kaip bdquox +- Uldquo čia x ndash analizės rezultatas U ndash išplėstinė matavimo neapibrėžtis taikant aprėpties faktorių 2 kurisužtikrina maždaug 95 patikimumo lygį

Tačiau jei analizės rezultatas yra gerokai (gt 50 ) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė ir su ta sąlyga kadtaikomos atitinkamos kokybės procedūros o analizės tikslas yra tik patikrinti atitiktį teisinėms nuostatoms analizėsrezultatą būtų galima pateikti ataskaitoje be išgavos dydžio pataisos ir išgavos dydžio bei matavimo neapibrėžties taisatvejais galima nenurodyti


III PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI TAIKOMI PAŠARINIŲ MEDŽIAGŲ IR KOMBINUOTŲJŲ PAŠARŲ SUDĖČIAIKONTROLIUOTI

A DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1 Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašarų drėgmės kiekį Jei pašarai turi lakiųjų medžiagų pvz organinių rūgščiųreikia turėti omenyje kad nustatant drėgmės kiekį nustatomas didelis kiekis lakiųjų medžiagų

Jis netaikomas analizuojant pieno produktus kaip pašarus mineralines medžiagas ir mišinius kuriuos iš esmėssudaro mineralinės medžiagos gyvūninius ir augalinius riebalus bei aliejus arba aliejingąsias sėklas ir vaisius

2 Metodas

Ėminys džiovinamas nurodytomis sąlygomis kurios priklauso nuo pašarų tipo Masės sumažėjimas nustatomassveriant Tiriant kietuosius pašarus kurių drėgmės kiekis didelis būtina atlikti pradinį džiovinimą

3 Aparatūra

31 Smulkintuvas pagamintas iš drėgmės nesugeriančių medžiagų kuris būtų lengvai valomas kuriuo būtų galimagreitai ir vienodai susmulkinti ėminį per daug jam neįkaistant ir kuris kiek įmanoma apsaugotų ėminį nuosąlyčio su išorės oru ir atitiktų 411 ir 412 nustatytus reikalavimus (pvz plaktukiniai ar vandeniu aušinamimikrosmulkintuvai sudedamieji kūginiai malūnėliai mažo apsisukimų dažnio arba krumpliaratiniai smulkintu-vai)

32 Analizinės svarstyklės tikslumas 1 mg

33 Sausi korozijai atsparaus metalo arba stikliniai indai su sandariai uždengiamais dangčiais darbinis paviršiusėminiui paskleisti maždaug 03 gcm2 tankiu

34 Elektrinė pastovios temperatūros džiovinimo spinta (plusmn 2 oC) tinkamai ventiliuojama ir užtikrinanti greitątemperatūros reguliavimą (1)

35 Reguliuojama elektrinė vakuuminė džiovinimo spinta turinti alyvos siurblį ir mechanizmą kuriuo galima įleistikaršto sauso oro arba naudojanti džioviklį (pvz kalcio oksidą)

36 Eksikatorius su stora perforuota metalo arba porceliano plokšte ir veiksmingu džiovikliu

4 Procedūra

NB Šiame skirsnyje aprašyti veiksmai turi būti atliekami iškart po ėminių pakuočių atidarymo Analizė turibūti atliekama bent du kartus

41 Ėminių ruošimas

411 P a š a r a i i š s k y r u s p a š a r u s p a g a l 4 1 2 i r 4 1 3

Paimama bent 50 g ėminio Prireikus ėminys susmulkinamas arba sumalamas taip kad būtų išvengta drėgmėskiekio pokyčio (žr 6)

412 J a v a i i r k r u o po s

Paimama bent 50 g ėminio Susmulkinama į daleles kurių bent 50 išbyra per 05 mm akučių sietą ir ant 1 mmskersmens apvalių akučių sieto lieka ne daugiau kaip 10


(1) Džiovinimo spintos grūdams miltams kruopoms ir miltams džiovinti šiluminė galia turi būti tokia kad nustačius 131 oC temperatūrąspinta į kurią džiūti vienu metu sudedamas didžiausias galimas ėminių kiekis vėl pasiektų tą temperatūrą per mažiau kaip 45 minVentiliacija turi būti tokia kad rezultatų gautų dvi valandas spintoje džiovinant tiek paprastų kviečių ėminių kiek jų gali tilpti irrezultatų gautų po 4 valandų džiovinimo skirtumas būtų mažesnis kaip 015

413 S k y s t i a r p a s tų t i p o p a š a r a i k u r i u o s d a u g i a u s i a s u d a r o a l i e j a i i r r i e b a l a i

Maždaug 25 g ėminio pasveriama 10 mg tikslumu įdedamas reikiamas kiekis sauso smėlio pasverto 10 mgtikslumu ir maišoma tol kol gaunamas vienalytis produktas

42 Džiovinimas


Indas su dangčiu (33) pasveriamas 1 mg tikslumu Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ėminyssupilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą įkaitintą iki103 oC Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau kad per daug nenukristų temperatūra spintoje Džiovinamaketurias valandas skaičiuojant nuo to momento kai spintos temperatūra vėl pasiekia 103 oC Indas uždengiamasdangčiu išimamas iš džiovinimo spintos 30ndash45 min laikomas eksikatoriuje (36) kad atvėstų ir pasveriamas1 mg tikslumu

Jei pašarus daugiausia sudaro aliejai ir riebalai džiovinama spintoje dar 30 min 130 oC temperatūroje Dviejųsvėrimo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 01 drėgmės kiekio

422 J a v a i m i l t a i k r u o p o s i r r u pū s m i l t a i

Indas su dangčiu (33) pasveriamas 05 mg tikslumu Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ėminyssupilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą įkaitintą iki130 oC Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau kad per daug nenukristų temperatūra spintoje Džiovinama dvivalandas skaičiuojant nuo to momento kai spintos temperatūra vėl pasiekia 130 oC Indas uždengiamas dangčiuišimamas iš džiovinimo spintos 30ndash45 min laikomas eksikatoriuje (36) kad atvėstų ir pasveriamas 1 mgtikslumu

423 Kombinuotieji pašarai kurie turi daugiau nei 4 sacharozės arba laktozės pašarinės žaliavos pvz saldžiosiosceratonijos ankštys hidrolizuotieji javų produktai salyklas džiovinti runkelių griežiniai žuvų hidrolizatai ircukraus žlaugtai kombinuotieji pašarai turintys daugiau nei 25 mineralinių druskų įskaitant kristalizacinįvandenį

Indas su dangčiu (33) pasveriamas 05 mg tikslumu Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ėminyssupilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas Neuždengtas indas dedamas į vakuuminę džiovinimo spintą(35) įkaitintą iki 80ndash85 oC Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau kad per daug nenukristų temperatūraspintoje

Slėgis sumažinamas iki 100 mm Hg stulpelio ir tokiame slėgyje keturias valandas džiovinama karšto sauso orosrove arba džiovikliu (20 ėminių reikia apie 300 g) Pastaruoju atveju pasiekus nurodytą slėgį vakuuminissiurblys išjungiamas Džiovinimo trukmė skaičiuojama nuo to momento kai džiovinimo spintos temperatūra vėlpakyla iki 80ndash85 oC Džiovinimo spintos slėgis atsargiai padidinamas iki atmosferos slėgio Spinta atidaromaindas nedelsiant uždengiamas dangčiu išimamas iš spintos laikomas 30ndash45 min eksikatoriuje (36) kad atvėstųir pasveriamas 1 mg tikslumu Džiovinama dar 30 min vakuuminėje džiovinimo spintoje 80ndash85 oCtemperatūroje ir dar kartą pasveriama Šių dviejų svėrimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 01 drėgmės kiekio

43 Pradinis džiovinimas

431 P a š a r a i i š s k y r u s i š v a r d y t u s 4 3 2

Kietieji labai drėgni pašarai kuriuos sunku susmulkinti turi būti iš anksto džiovinami taip

Į tinkamą indą (pvz ant 20 times 12 cm aliuminio plokštės su 05 cm kraštu) pasveriama 50 g nesusmulkinto ėminio10 mg tikslumu (prireikus presuotus arba į gabalus sulipusius pašarus galima kažkiek sutrupinti) Džiovinamadžiovinimo spintoje 60ndash70 oC temperatūroje tol kol drėgmės kiekis nesumažėja iki 8ndash12 Ėminys išimamas išdžiovinimo spintos neuždengtas valandą vėsinamas laboratorijoje ir pasveriamas 10 mg tikslumu Nedelsiantsusmulkinamas kaip nurodyta 411 ir džiovinamas kaip nurodyta 421 arba 423 atsižvelgiant į pašarų tipą

432 J a v a i

Javai kurių drėgmės kiekis didesnis nei 17 turi būti iš anksto džiovinami taip


Į tinkamą indą (pvz ant 20 times 12 cm aliuminio plokštės su 05 cm kraštu) pasveriama 50 g nesusmulkintoėminio 10 mg tikslumu 5ndash7 min džiovinama džiovinimo spintoje 130 oC temperatūroje Ėminys išimamas išdžiovinimo spintos neuždengtas dvi valandas vėsinamas laboratorijoje ir pasveriamas 10 mg tikslumuNedelsiant susmulkinamas kaip nurodyta 412 ir džiovinamas kaip nurodyta 422

5 Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio masės procentais (X) apskaičiuojamas pagal šias formules

51 Džiovinimas kai netaikomas pradinis džiovinimas

X =m minusm0eth THORN

m 100

kurioje

m = tiriamojo ėminio pradinis svoris gramaism0 = išdžiovinto tiriamojo ėminio svoris gramais

52 Džiovinimas kai taikomas pradinis džiovinimas

Xp =m2 minusm0eth THORN m1

m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

kurioje

m = tiriamojo ėminio pradinis svoris gramaism1 = tiriamojo ėminio svoris po pradinio džiovinimo gramaism2 = tiriamojo ėminio svoris po smulkinimo arba malimo gramaism0 = išdžiovinto tiriamojo ėminio svoris gramais

53 Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečių matavimų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 02 drėgmės kiekioabsoliučiosios vertės

6 Pastaba

Jei paaiškėja kad ėminį būtina susmulkinti ir pastebima kad produkto drėgmės kiekis pakito pašarųkomponentų analizės rezultatus reikia perskaičiuoti pagal pradinės būklės ėminio drėgmės kiekį

B GYVŪNINIŲ IR AUGALINIŲ RIEBALŲ BEI ALIEJŲ DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti vandens ir lakiųjų medžiagų kiekį gyvūninės ir augalinės kilmės riebaluose beialiejuose

2 Metodas

Ėminys džiovinamas 103 oC temperatūroje iki pastoviosios masės (masės sumažėjimas tarp dviejų paeiliuiatliekamų svėrimų turi būti mažesnis arba lygus 1 mg) Nuodžiūvis nustatomas sveriant

3 Aparatūra

31 Indas plokščiu dugnu iš korozijai atsparios medžiagos skersmuo 8ndash9 cm aukštis ndash 3 cm

32 Maždaug 10 cm ilgio gyvsidabrio termometras su padalomis nuo 80 oC iki bent 110 oC su pastorintuburbuliuku ir plėtimosi vamzdžiu viršutiniame gale

33 Smėlio vonia arba elektrinė kaitlentė


34 Eksikatorius su veiksmingu džiovikliu

35 Analizinės svarstyklės

4 Procedūra

Į sausą pasvertą indą (31) į kurį įdėtas termometras (32) 1 mg tikslumu pasveriama apie 20 g homogenizuotoėminio Nuolat maišant termometru kaitinama ant smėlio vonios arba kaitlentės (33) taip kad maždaug per7 min temperatūra pasiektų 90 oC

Kaitinimas sumažinamas stebint kaip dažnai nuo indo dugno kyla burbuliukai Temperatūra turi būti neaukštesnė kaip 105 oC Maišoma toliau braukiant per indo dugną tol kol nebesusidaro burbuliukų

Siekiant užtikrinti visišką drėgmės pašalinimą dar keletą kartų kaitinama iki 103 oC plusmn 2 oC kaskart tarpkaitinimų atvėsinant ėminį iki 93 oC Tada paliekama eksikatoriuje (34) atvėsti iki kambario temperatūros irpasveriama Šis veiksmas kartojamas tol kol ėminio svoris tarp iš eilės atliekamų kaitinimo veiksmų sumažėja nedaugiau kaip 2 mg

NB Ėminio svorio padidėjimas po kartotinių kaitinimo veiksmų rodo kad oksiduojasi riebalai todėl šiuoatveju rezultatai skaičiuojami pagal svėrimo duomenis gautus prieš tai kai svoris pradėjo didėti


Drėgmės kiekis ėminio procentine dalimi (X) apskaičiuojamas pagal šią formulę

X = m1 minusm2eth THORN 100m

kurioje

m = tiriamojo ėminio svoris gramaism1 = indo su turiniu svoris prieš kaitinimą gramaism2 = indo du turiniu svoris po kaitinimo gramais

Mažesni nei 005 rezultatai turi būti užrašomi kaip bdquomažiau nei 005 ldquo

Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečiai atliktos drėgmės kiekio analizės rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei005 absoliučiąja verte

C ŽALIŲ BALTYMŲ KIEKIO NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti žalių baltymų kiekį pašaruose pagal Kjeldalio metodu nustatomą azoto kiekį

2 Metodas

Ėminys skaidomas sieros rūgštimi esant katalizatoriui Rūgštus tirpalas šarminamas natrio hidroksido tirpaluGautas amoniakas distiliuojamas ir surenkamas žinomame kiekyje sieros rūgšties kurios perteklius titruojamasnatrio hidroksido standartiniu tirpalu

Pagal kitą metodą išsiskyręs amoniakas distiliuojamas į tirpalą su boro rūgšties pertekliumi tada titruojamavandenilio chlorido rūgšties arba sieros rūgšties tirpalu

3 Reagentai

31 Kalio sulfatas


32 Katalizatorius vario (II) oksidas CuO arba vario (II) sulfato pentahidratas CuSO4 5H2O

33 Cinko granulės

34 Sieros rūgštis ρ20 = 184 gml

35 Sieros rūgštis standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas c(H2SO4) = 025 moll



38 Indikatorius metilraudonasis 300 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio σ = 95ndash96 (VV)

39 Natrio hidroksido tirpalas (galima naudoti techninį hidroksidą) β = 40 g100 ml (mV 40 )

310 Natrio hidroksidas standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas c(NaOH) = 025 moll


312 Pemzos granulės išplautos vandenilio chlorido rūgštyje ir iškaitintos

313 Acetanilidas (lyd temp = 114 oC N kiekis = 1036 )

314 Sacharozė (neturinti azoto)

315 Boro rūgštis (H3BO3)

316 Indikatoriaus metilraudonojo tirpalas 100 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio arba metanolio

317 Bromkrezolio žaliojo tirpalas 100 mg bromkrezolio žaliojo ištirpinama 100 ml etanolio arba metanolio

318 Boro rūgšties tirpalas (10 glndash40 gl atsižvelgiant į naudojamą aparatūrą)

Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai į boro rūgšties tirpalus turi būti įdėta metilraudonojo irbromkrezolio žaliojo indikatorių Jei ruošiamas 1 litras boro rūgšties tirpalo prieš skiedžiant iki žymės įpilama7 ml metilraudonojo indikatoriaus tirpalo (316) ir 10 ml bromkrezolio žaliojo tirpalo (317)

Priklausomai nuo naudojamo vandens skirtingų partijų boro rūgšties tirpalų pH vertė gali skirtis Dažnai būtinakoreguoti nedideliu šarmo tirpalo tūriu kad būtų gautas teigiamas tuščiasis ėminys

Pastaba Paprastai tinkamai korekcijai pakanka maždaug 3 mlndash4 ml NaOH (311) 1 litrui 10 gl boro rūgštiesTirpalas laikomas kambario temperatūroje apsaugotas nuo šviesos ir amoniako garų šaltinių

319 Vandenilio chlorido rūgšties standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas c(HCl) = 010 moll

Pastaba Galima naudoti kitokios koncentracijos tūrinės titrimetrijos tirpalus (35 36 37 310 311 ir 319) jeiapskaičiuojant būtų daroma korekcija dėl koncentracijos Koncentracijos vertės visuomet išreiškiamosketuriais skaičiais po kablelio

4 Aparatūra

Aparatūra tinkama skaidyti distiliuoti ir titruoti pagal Kjeldalio procedūrą

5 Procedūra

51 Skaidymas

1 g ėminio pasveriama 0001 g tikslumu ir ėminys supilamas į skaidymo aparato kolbą Įdedama 15 g kaliosulfato (31) ir atitinkamas kiekis katalizatoriaus (32) (03ndash04 g vario oksido arba 09ndash12 g vario (II) sulfatopentahidrato) įpilama 25 ml sieros rūgšties (34 prireikus įmetamos kelios pemzos granulės (312) irsumaišoma


Kolba iš pradžių šildoma kartkartėmis ją sukiojant ant nestiprios ugnies tol kol masė suanglėja ir nelieka putųtada šildoma stipriau tol kol tirpalas pradeda nuolat virti Kaitinimas yra pakankamas jei verdanti rūgštiskondensuojasi ant kolbos sienelių Reikia žiūrėti kad neperkaistų šoninės kolbos sienelės ir prie jų nepriliptųorganinių medžiagų dalelių

Kai tirpalas tampa skaidrus ir šviesiai žalias virinama dar dvi valandas vėliau paliekama atvėsti

52 Distiliavimas

Atsargiai įpilama pakankamai vandens kad visiškai ištirptų sulfatai Paliekama atvėsti ir įdedamos kelios cinkogranulės (33) Tęsiama pagal 521 arba 522

521 D i s t i l i a v im a s į s i e r o s rū g š t į

Į distiliavimo aparato surinkimo kolbą įpilama lygiai 25 ml sieros rūgšties (35) arba (37) tirpalo atsižvelgiantį tai kiek ėminyje galėtų būti azoto Įlašinami keli lašai metilraudonojo indikatoriaus (38)

Skaidymo aparato kolba prijungiama prie distiliavimo aparato kondensatoriaus kurio antgalis ne mažiau kaipper centimetrą įmerkiamas į surinkimo kolboje esantį skystį (žr 83 pastabą) Neleidžiant amoniakui garuoti (žr81 pastabą) į kolbą lėtai įpilama 100 ml natrio hidroksido tirpalo (39) Kolba kaitinama tol kol amoniakasbaigiamas distiliuoti

522 D i s t i l i a v im a s į bo r o rū g š t į

Jei amoniakas distiliate titruojamas rankiniu būdu taikoma toliau nurodyta procedūra Jei distiliavimo įrenginysyra visiškai automatizuotas įskaitant amoniako distiliate titravimą laikomasi gamintojo instrukcijų dėldistiliavimo įrenginio naudojimo

Surinkimo kolba su 25 mlndash30 ml boro rūgšties tirpalo (318) statoma po kondensatoriaus išleidžiamuojuantgaliu taip kad tiekimo vamzdis būtų žemiau boro rūgšties perteklių turinčio tirpalo paviršiaus Distiliavimoįrenginys nustatomas dozuoti 50 ml natrio hidroksido tirpalo (39) Distiliavimo įrenginys naudojamas pagalgamintojo instrukcijas ir amoniakas distiliuojamas įpilant natrio hidroksido tirpalo Distiliatas surenkamas į bororūgšties tirpalą Distiliato kiekis (distiliavimo garais trukmė) priklauso nuo azoto kiekio ėminyje Laikomasigamintojo instrukcijų

Pastaba Pusiau automatizuotame distiliavimo įrenginyje natrio hidroksido pertekliaus įpylimas ir distiliavimasgarais atliekamas automatiškai

53 Titravimas

Tęsiama pagal 531 arba 532

531 S i e r o s rū g š t i s

Atsižvelgiant į naudotos sieros rūgšties koncentraciją sieros rūgšties perteklius surinkimo kolboje titruojamasnatrio šarmo (310 arba 311) tirpalu tol kol pasiekiamas ekvivalentinis taškas

532 B o r o rū g š t i s

Surinkimo kolbos turinys titruojamas iš biuretės vandenilio chlorido rūgšties standartiniu tūrinės titrimetrijostirpalu (319) arba sieros rūgšties standartiniu tūrinės titrimetrijos tirpalu (36) ir užrašomas sunaudoto titrantotūris

Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai ekvivalentinis taškas pasiekiamas pirmą kartą atsiradustirpalo rožinei spalvai Biuretės rodmuo įvertinamas 005 ml tikslumu Apšviesta magnetinė maišyklė arbafotometrinis detektorius gali padėti lengviau pamatyti ekvivalentinį tašką

Tai galima atlikti automatiškai naudojant distiliavimo garais įrenginį su automatiniu titravimu

Konkretus distiliatorius (titratorius) naudojamas pagal gamintojo instrukcijas


Pastaba Naudojant automatizuotą titravimo sistemą titruoti pradedama iškart kai prasideda distiliavimas irsunaudojama 1 boro rūgšties tirpalo (318)

Jei naudojamas visiškai automatizuotas distiliavimo įrenginys amoniako automatinį titravimą galimaatlikti naudojant potenciometrinę pH sistemą ekvivalentiniam taškui nustatyti

Šiuo atveju naudojamas automatinis titratorius su pH-metru pH-metras tinkamai sukalibruotas pH 4ndashpH 7 intervale pagal įprastas laboratorines pH-metro kalibravimo procedūras

Titravimo ekvivalentinis taškas pagal pH atitinka pH vertę 46 šis taškas yra stačiausias titravimo kreivėstaškas (perlinkio taškas)

54 Tuščiasis bandymas

Siekiant patvirtinti kad reagentai neturi azoto atliekamas tuščiasis bandymas (skaidymas distiliavimas irtitravimas) vietoj ėminio naudojant 1 g sacharozės (314)


Apskaičiuojama pagal 61 arba 62

61 Apskaičiavimas titruojant pagal 531

Žalių baltymų kiekis išreikštas svorio procentais apskaičiuojamas pagal šią formulę

V0 minusV1eth THORN c 0014 100 625m

kurioje

V0 = NaOH (310 arba 311) tūris sunaudotas tuščiajam bandymui mlV1 = NaOH (310 arba 311) tūris sunaudotas ėminiui titruoti mlc = natrio hidroksido (310 arba 311) koncentracija mollm = ėminio svoris g


621 T i t r a v im a s v a n d e n i l i o c h l o r i d o rū g š t im i


V1 minusV0eth THORN c 14 625m

kurioje

m = tiriamosios dalies svoris gc = vandenilio chlorido rūgšties standartinio tūrinės titrimetrijos tirpalo (319) koncentracija mollV0 = tuščiajam bandymui sunaudotas vandenilio chlorido rūgšties tūris mlV1 = tiriamajai daliai sunaudotas vandenilio chlorido rūgšties tūris ml

622 T i t r a v im a s s i e r o s rū g š t im i



kurioje

m = tiriamosios dalies svoris gc = sieros rūgšties standartinio tūrinės titrimetrijos tirpalo (36) koncentracija mollV0 = tuščiajam bandymui sunaudotas sieros rūgšties (36) tūris mlV1 = tiriamajai daliai sunaudotas sieros rūgšties (36) tūris ml


7 Metodo tikrinimas

71 Pakartojamumas

Dviejų rezultatų gautų atliekant du lygiagrečius to paties ėminio matavimus skirtumas neturi būti didesnis nei

mdash 02 absoliučiąja verte kai žalių baltymų kiekis mažesnis nei 20

mdash 10 didžiausios vertės kai žalių baltymų kiekis 20ndash40

mdash 04 absoliučiąja verte kai žalių baltymų kiekis didesnis nei 40

72 Tikslumas

Atliekama 15ndash20 g acetanilido (313) analizė (skaidymas distiliavimas ir titravimas) įdėjus 1 g sacharozės(314) 1 g acetilanilido sunaudoja 1480 ml sieros rūgšties (35) Išgavos dydis turi būti ne mažesnis nei 99

8 Pastabos

81 Aparatūra gali būti rankinio pusiau automatinio arba automatinio tipo Jei naudojama aparatūra kai ėminį poskaidymo reikia supilti į distiliavimo įrenginį turi būti supilama be nuostolių Jei distiliavimo aparato kolba neturilašinamojo piltuvo natrio šarmo tirpalas įpilamas prieš pat kolbą prijungiant prie kondensatoriaus skystį iš lėtopilant kolbos sienele

82 Jei skaidymo produktas sukietėja analizė pradedama iš naujo su didesniu nei pirmiau nurodyta sieros rūgštiestirpalo (34) kiekiu

83 Produktams kuriuose azoto kiekis nedidelis į surinkimo kolbą įpilamo sieros rūgšties tirpalo (37) tūris prireikusgali būti sumažintas iki 10 arba 15 ml skiedžiant vandeniu iki 25 ml

84 Atliekant įprastą analizę galima taikyti alternatyviuosius metodus žalių baltymų kiekiui nustatyti bet šiojeC dalyje aprašytas Kjeldalio metodas yra pamatinis metodas Rezultatų gautų alternatyviaisiais metodais(pvz DUMAS) lygiavertiškumas palyginti su pamatiniu metodu turi būti įrodytas kiekvienai matricai atskiraiKadangi alternatyviuoju metodu gauti rezultatai ir pamatiniu metodu gauti rezultatai gali šiek tiek skirtis netgipatikrinus lygiavertiškumą analizės ataskaitoje būtina nurodyti žalių baltymų kiekiui nustatyti taikytą analizėsmetodą

D KARBAMIDO NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti karbamido kiekį pašaruose

2 Metodas

Ėminys suspenduojamas vandenyje kartu su skaidrinančiąja medžiaga Suspensija filtruojama Dedama4-dimetilaminobenzaldehido (4-DMAB) ir karbamido kiekis filtrate nustatomas matuojant optinį tankį esantbangos ilgiui 420 nm

3 Reagentai

31 4-dimetilaminobenzaldehido tirpalas 16 g 4-DMAB ištirpinama 100 ml 96 etanolio ir įpilama 10 mlvandenilio chlorido rūgšties (ρ20 = 119 gml) Šį reagentą galima laikyti ne ilgiau kaip dvi savaitės

32 Carrez I tirpalas vandenyje ištirpinama 219 g cinko acetato Zn(CH3COO)22H2O ir 3 g ledinės acto rūgštiesSkiedžiama vandeniu iki 100 ml

33 Carrez II tirpalas vandenyje ištirpinama 106 g kalio heksacianoferato (II) K4Fe(CN)6 3H2O Skiedžiama vandeniuiki 100 ml

34 Aktyvintosios anglys kurios nesugeria karbamido (turi būti patikrinta)


35 Karbamido 01 (mV) tirpalas

4 Aparatūra

41 Maišiklis (vartytuvas) apsisukimų dažnis maždaug 35ndash40 min-1

42 Mėgintuvėliai 160 times 16 mm su šlifo kamščiais

43 Spektrofotometras

5 Procedūra

51 Ėminio analizė

1 mg tikslumu pasveriama 2 g ėminio kuris kartu su 1 g aktyvintų anglių (34) supilamas į 500 ml matavimokolbą Įpilama 400 ml vandens ir 5 ml Carrez I (32) tirpalo maždaug 30 s maišoma ir įpilama 5 ml Carrez II (33)tirpalo Trisdešimt minučių tirpalas maišomas vartytuve Tirpalas skiedžiamas vandeniu iki žymės sumaišomas irfiltruojamas

Į mėgintuvėlius su šlifo kamščiais įpilama 5 ml skaidraus bespalvio filtrato 5 ml 4-DMAB tirpalo (31) irsumaišoma Mėgintuvėliai statomi į vandens vonią 20 oC (+- 4 oC) temperatūroje Po penkiolikos minučiųspektrofotometru matuojamas ėminio tirpalo optinis tankis esant 420 nm bangos ilgiui Palyginamuoju tirpalunaudojamas tuščiam ėminiui ruošti naudojamų reagentų tirpalas

52 Kalibravimo kreivė

Į 100 ml matavimo kolbas įpilama 1 2 4 5 ir 10 ml karbamido tirpalo (35) ir skiedžiama vandeniu iki žymėsPaimama po 5 ml kiekvieno tirpalo į kiekvieną iš jų įpilama 5 ml 4-DMAB tirpalo (31) sumaišoma ir kaipnurodyta anksčiau matuojamas jų optinis tankis lyginant su kontroliniu tirpalu turinčiu 5 ml 4-DMAB ir 5 mlvandens neturinčio karbamido Brėžiama kalibravimo kreivė


Pagal kalibravimo kreivę nustatomas karbamido kiekis ėminyje

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais

7 Pastabos

71 Tais atvejais kai karbamido kiekis yra didesnis nei 3 imama 1 g ėminio arba pradinis tirpalas skiedžiamas tiekkad jo 500 ml būtų ne daugiau nei 50 mg karbamido

72 Tuo atveju kai karbamido yra mažai ėminio kiekis padidinamas tiek kad filtratas dar liktų skaidrus ir bespalvis

73 Jei ėminyje yra nesudėtingų azoto junginių pvz aminorūgščių optinis tankis matuojamas esant 435 nm bangosilgiui

E LAKIŲJŲ AZOTO BAZIŲ NUSTATYMAS

I MIKRODIFUZIJOS METODAS


Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančių lakiųjų azoto bazių kiekį išreikštą amoniaku

2 Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandeniu tirpalas skaidrinamas ir filtruojamas Lakiosios azoto bazės išstumiamosmikrodifuzijos būdu naudojant kalio karbonato tirpalą surenkamos boro rūgšties tirpale ir titruojamos sierosrūgštimi


3 Reagentai

31 Trichloracto rūgšties tirpalas 20 (mV)

32 Indikatorius 33 mg bromkrezolio žaliojo ir 65 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml 95ndash96 (VV) etanolio

33 Boro rūgšties tirpalas 1 l matavimo kolboje ištirpinama 10 g boro rūgšties 200 ml 95ndash96 (VV) etanolio ir700 ml vandens Įpilama 10 ml indikatoriaus (32) Sumaišoma ir jei reikia gaunama šviesiai raudona tirpalospalva įpilant natrio hidroksido tirpalo 1 ml šio tirpalo suriša ne daugiau nei 300 μg NH3

34 Sotusis kalio karbonato tirpalas 100 ml verdančio vandens ištirpinama 100 g kalio karbonato Atvėsinama irfiltruojama

35 Sieros rūgštis 001 moll

4 Aparatūra


42 Stiklinės arba plastikinės Conway kiuvetės (žr schemą)

43 Mikrobiuretės graduotos 1100 ml padalomis

5 Procedūra

10 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir naudojant 100 ml vandens supilama į 200 ml matavimo kolbą30 min maišoma maišymo būgne Įpilama 50 ml trichloracto rūgšties tirpalo (31) skiedžiama vandeniu ikižymės stipriai supurtoma ir filtruojama per gofruotąjį filtrą

Pipete įlašinama 1 ml boro rūgšties tirpalo (33) į Conway kiuvetės centrinę dalį ir 1 ml ėminio filtrato į kiuvetėsišorinį žiedą Iš dalies uždengiama tepalu suteptu dangčiu Į išorinį žiedą greitai įlašinama 1 ml sočiojo kaliokarbonato tirpalo (34) ir uždengiama taip kad į kiuvetę nepatektų oro Kiuvetė atsargiai sukiojama apie ašįhorizontalioje plokštumoje taip kad abu reagentai susimaišytų Inkubuojama kambario temperatūroje bentketurias valandas arba 40 oC temperatūroje vieną valandą

Lakiosios bazės boro rūgšties tirpale iš mikrobiuretės (43) titruojamos 001 moll sieros rūgštimi (35)

Pagal tą pačią procedūrą atliekamas tuščiasis bandymas bet be analizuojamo ėminio


1 ml 001 moll H2SO4 atitinka 034 mg amoniako

Rezultatai išreiškiami ėminio masės procentais

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei

mdash 10 santykinės vertės kai amoniako kiekis mažesnis nei 10

mdash 01 absoliučiąja verte kai amoniako kiekis 10 arba didesnis

7 Pastaba

Jei amoniako kiekis ėminyje didesnis nei 06 pradinis filtratas skiedžiamas


CONWAY CELL

Scale 11


II DISTILIAVIMO METODAS


Šiuo metodu galima nustatyti lakiųjų azoto bazių kiekį išreikštą amoniaku žuvies miltuose kuriuose beveik nėrakarbamido Jį galima taikyti tik mažesniam nei 025 amoniako kiekiui

2 Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandeniu tirpalas skaidrinamas ir filtruojamas Lakiosios azoto bazės išstumiamosvirimo temperatūroje pridedant magnio oksido ir surenkamos tam tikrame kiekyje sieros rūgšties kuriosperteklius atvirkščiai titruojamas natrio hidroksido tirpalu

3 Reagentai


32 Magnio oksidas

33 Priešpučio emulsija (pvz siloksanas)

34 Sieros rūgšties 005 moll tirpalas

35 Natrio hidroksido 01 moll tirpalas

36 Metilraudonojo tirpalas 03 tirpalas 95ndash96 (VV) etanolyje

4 Aparatūra

41 Maišiklis (vartytuvas) dažnis maždaug 35ndash40 sūkmin

42 Distiliavimo aparatas Kjeldalio tipo

5 Procedūra


Paimamas skaidraus filtrato kiekis atitinkantis numatomą lakiųjų azoto bazių kiekį (paprastai reikia 100 ml)Skiedžiama iki 200 ml įdedama 2 g magnio oksido (32) ir įlašinami keli lašai priešpučio emulsijos (33) Tirpalasturi būti šarminis pagal lakmusą priešingu atveju įdedama dar šiek tiek magnio oksido (32) Tęsiama pagalanalizės metodo taikomo žalių baltymų kiekiui nustatyti (šio priedo C dalis) 52 ir 53 punktus





Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 10 amoniakosantykinės vertės

F AMINO RŪGŠČIŲ (IŠSKYRUS TRIPTOFANĄ) NUSTATYMAS


Naudojant aminorūgščių analizatorių šiuo metodu galima nustatyti laisvųjų (sintetinių ir gamtinių) aminorūgščių ir suminį (peptidų ir laisvųjų) aminorūgščių kiekį pašaruose Šis metodas tinka šioms aminorūgštims


cisteinui (cistinui) metioninui lizinui treoninui alaninui argininui asparto ir glutamino rūgštims glicinuihistidinui izoleucinui leucinui fenilalaninui prolinui serinui tirozinui ir valinui

Šiuo metodu negalima atskirti aminorūgščių druskų ir negalima atskirti aminorūgščių D-ir L-formų Metodasnetinka triptofano arba hidroksigrupę turintiems aminorūgščių analogams nustatyti

2 Metodas

21 Laisvosios aminorūgštys

Laisvosios aminorūgštys ekstrahuojamos praskiesta vandenilio chlorido rūgštimi Kartu ekstrahuojamos azototurinčios makromolekulės nusodinamos sulfosalicilo rūgštimi ir atskiriamos filtruojant Nustatoma filtruototirpalo pH vertė 220 Aminorūgštys atskiriamos jonų mainų chromatografija ir nustatomos fotometriškaivykdant reakciją su ninhidrinu kai bangos ilgis 570 nm

22 Suminis aminorūgščių kiekis

Pasirinkta procedūra priklauso nuo tiriamų aminorūgščių Cisteinas (cistinas) ir metioninas prieš hidrolizę turibūti oksiduojami iki cistino rūgšties ir metionino sulfono Tirozinas turi būti nustatomas neoksiduotų ėminiųhidrolizatuose Visos kitos 1 skirsnyje išvardytos aminorūgštys gali būti nustatomos arba oksiduotuose arbaneoksiduotuose ėminiuose

Oksidacija atliekama peroksiskruzdžių rūgšties ir fenolio mišiniu 0 oC temperatūroje Oksidacijos reagentoperteklius skaidomas natrio disulfitu Oksiduoti ar neoksiduoti ėminiai 23 valandas hidrolizuojami vandeniliochlorido rūgštimi (320) Nustatoma hidrolizatų pH vertė 220 Aminorūgštys atskiriamos taikant jonų mainųchromatografiją ir nustatomos fotometriniu metodu vykdant reakciją su ninhidrinu esant 570 nm (prolinui ndash440 nm)

3 Reagentai

Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba atitinkamos kokybės (elektrinis laidis lt 10 μS) vanduo

31 Vandenilio peroksidas w (ww) = 30

32 Skruzdžių rūgštis w (ww) = 98ndash100

33 Fenolis

34 Natrio disulfitas

35 Natrio hidroksidas

36 5-sulfosalicilo rūgšties dihidratas

37 Vandenilio chlorido rūgštis tankis maždaug 118 gml

38 trinatrio citrato dihidratas

39 22-tiodietanolis (tiodiglikolis)

310 Natrio chloridas

311 Ninhidrinas

312 Petroleteris virimo temperatūros intervalas 40ndash60 oC

313 Norleucinas arba kitas junginys kurį galima naudoti kaip vidinį etaloną

314 Azoto dujos (lt 10 ppm deguonies)

315 1-oktanolis


316 Aminorūgštys

3161 1 skirsnyje išvardytų medžiagų etalonai Grynieji junginiai neturintys kristalizacinio vandens Džiovinamivakuume virš P2O5 arba H2SO4 likus savaitei iki naudojimo

3162 Cistino rūgštis

3163 Metionino sulfonas

317 Natrio hidroksido tirpalas c = 75 moll

300 g NaOH (35) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro



319 Skruzdžių rūgšties ir fenolio tirpalas

889 g skruzdžių rūgšties (32) sumaišoma su 111 g vandens ir įdedama 473 g fenolio (33)

320 Hidrolizės mišinys c = 6 moll HCl tirpalas turintis 1 gl fenolio

įdedama 1 g fenolio (33) į 492 ml HCl (37) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro

321 Ekstrahavimo mišinys c = 01 moll HCl tirpalas turintis 2 tiodiglikolio paimama 82 ml HCl (37)skiedžiama maždaug 900 ml vandens įpilama 20 ml tiodiglikolio (39) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro(tiesiogiai nemaišyti 37 ir 39)

322 5-sulfosalicilo rūgštis szlig = 6

60 g 5-sulfosalicilo rūgšties (36) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro

323 Oksidavimo mišinys (peroksiskruzdžių rūgštis ir fenolis)

Mažoje stiklinėje sumaišoma 05 ml vandenilio peroksido (31) ir 45 ml skruzdžių rūgšties bei fenolio tirpalo(319) Laikoma 1 val 20ndash30 oC temperatūroje kad susidarytų peroksiskruzdžių rūgštis ir prieš supilant į ėminįšaldoma ledo ir vandens vonioje (15 min)

Įspėjimas Vengiama patekimo ant odos ir dėvimi apsauginiai drabužiai

324 Citratinis buferinis tirpalas c = 02 mol Na+l pH 220

maždaug 800 ml vandens ištirpinama 1961 g natrio citrato (38) 5 ml tiodiglikolio (39) 1 g fenolio (33) ir1650 ml HCl (37) Nustatoma pH vertė 220 Skiedžiama vandeniu iki 1 litro

325 Plovimo buferiniai tirpalai paruošti pagal naudojamo analizatoriaus (49) sąlygas

326 Ninhidrino reagentas ruošiamas pagal analizatoriaus (49) sąlygas

327 Aminorūgščių etaloniniai tirpalai Šie tirpalai laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje

3271 Aminorūgščių pradiniai etaloniniai tirpalai (3161)

c = 25 μmolml kiekvienos rūgšties tirpalas vandenilio chlorido rūgštyje

Galima naudoti esančius prekyboje

3272 Cistino rūgšties ir metionino sulfono pradinis etaloninis tirpalas c = 125 μmolml

02115 g cistino rūgšties (3162) ir 02265 g metionino sulfono (3163) ištirpinama citratiniame buferiniametirpale (324) 1 litro matavimo kolboje iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu Laikoma žemesnėje nei5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 12 mėnesių Šis tirpalas nenaudojamas jei pradiniame etaloniniame tirpale(3271) yra cistino rūgšties ir metionino sulfono


3273 Pradinis vidinio etalono pvz norleucino tirpalas c = 20 μmolml

06560 g norleucino (313) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (324) 250 ml matavimo kolboje ikižymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip6 mėnesius

3274 Etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalas naudojamas hidrolizatams c = 5 nmol50 μl cistino rūgšties irmetionino sulfono ir c = 10 nmol50 μl kitų aminorūgščių 22 g natrio chlorido (310) ištirpinama 30 mlcitratinio buferinio tirpalo (324) 100 ml stiklinėje Įpilama 400 ml aminorūgščių pradinio etaloninio tirpalo(3271) 400 ml cistino rūgšties ir metionino sulfono pradinio etaloninio tirpalo (3272) ir 050 ml pradiniovidinio etalono tirpalo (3273) jei naudojamas Natrio hidroksidu (318) nustatoma pH vertė 220

Kiekybiškai supilama į 50 ml matavimo kolbą skiedžiama iki žymės citratiniu buferiniu tirpalu (324) irsumaišoma

Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius

Žr dar 91 pastabą

3275 Etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalas naudojamas hidrolizatams paruoštiems pagal 5331 punktą irekstraktams (52) Kalibravimo tirpalas ruošiamas pagal 3274 bet nededama natrio chlorido


4 Aparatūra

41 100 arba 250 ml apvaliadugnė kolba su grįžtamuoju kondensatoriumi

42 100 ml borosilikatinio stiklo butelis su užsukamu kamščiu ir guminiu ar tefloniniu tarpikliu (pvz Duran Schott)tinkamas naudoti krosnyje

43 Ventiliuojama krosnis su temperatūros reguliatoriumi kurio tikslumas geresnis nei plusmn 2 oC

44 pH-metras (trys skaičiai po kablelio)

45 Membraninis filtras (022 μm)

46 Centrifuga

47 Sukamasis vakuuminis garintuvas

48 Mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė

49 Aminorūgščių analizatorius arba HPLC įranga su jonų mainų kolonėle reakcijos su ninhidrinu įtaisu dariniųgavimo įtaisu ir fotometriniu detektoriumi

Kolonėlės įkrova ndash sulfoninto polistireno dervos galinčios atskirti aminorūgštis vieną nuo kitos ir nuo kitų suninhidrinu reaguojančių medžiagų Srautas buferinio tirpalo ir ninhidrino sistemose reguliuojamas siurbliaissrauto stabilumas ndash plusmn 05 kalibravimo tirpalo ir ėminio analizės metu

Su kai kuriais aminorūgščių analizatoriais galima naudoti hidrolizės procedūras kai hidrolizato natrio jonųkoncentracija c = 08 moll ir jame yra visas po oksidacijos likęs skruzdžių rūgšties perteklius Kitais analizatoriaisnegalima tinkamai atskirti tam tikras aminorūgštis jei hidrolizate yra skruzdžių rūgšties perteklius ir (arba) didelėnatrio jonų koncentracija Tokiu atveju po hidrolizės ir prieš pH nustatymą rūgšties tūris sumažinamas maždaugiki 5 ml ją garinant Garinama vakuume ne aukštesnėje nei 40 oC temperatūroje

5 Procedūra

51 Ėminio ruošimas

Ėminys sumalamas taip kad jį būtų galima sijoti per 05 mm sietą Daug drėgmės turintys ėminiai prieš malimąturi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 oC temperatūroje arba liofilizuojami Daug riebalų turintys ėminiaiprieš malimą ekstrahuojami petroleteriu (312)


52 Laisvųjų amino rūgščių nustatymas pašaruose ir premiksuose

Į kūginę kolbą 02 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas paruošto ėminio (51) kiekis (1ndash5 g) ir įpilama 1000 mlekstrahavimo mišinio (321) Mišinys maišomas 60 min mechanine purtykle arba magnetine maišykle (48)Nuosėdoms leidžiama nusėsti ir 100 ml tirpalo virš nuosėdų paimama pipete į 100 ml stiklinę

Maišant įpilama 50 ml sulfosalicilo rūgšties tirpalo (322) ir maišoma magnetine maišykle 5 min Tirpalas viršnuosėdų filtruojamas arba centrifuguojamas visoms nuosėdoms pašalinti 100 ml gauto tirpalo įpilama į 100 mlstiklinę natrio hidroksido tirpalu (318) nustatoma pH vertė 220 plaunant citratiniu buferiniu tirpalu (324)supilama į tinkamo tūrio matavimo kolbą ir citratiniu buferiniu tirpalu (324) skiedžiama iki žymės

Jei naudojamas vidinis etalonas įpilama 100 ml vidinio etalono (3273) kiekvienam 100 ml gauto tirpalo irskiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (324)

Atliekama chromatografinė analizė pagal 54 punktą

Jei ekstraktai netiriami tą pačią dieną jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje

53 Suminio aminorūgščių kiekio nustatymas

531 Ok s i d a v im a s

01ndash1 g paruošto ėminio (51) 02 mg tikslumu pasveriama

mdash į 100 ml apvaliadugnę kolbą (41) hidrolizei atvirame inde (5323) arba

mdash į 250 ml apvaliadugnę kolbą (41) jei turi būti maža natrio koncentracija (5331) arba

mdash į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (42) hidrolizei uždarytame inde (5324)

Pasvertojoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg o drėgmės ne daugiau nei 100 mg

Kolba (butelis) dedama į ledo ir vandens vonią atšaldoma iki 0 oC įpilama 5 ml oksidavimo mišinio (323) irmaišoma stikline mentele su lenktu galu Kolba (butelis) kartu su viduje esančia mentele uždengiama oruinepralaidžia plėvele ledo ir vandens vonia su taip uždarytu indu dedama į šaldytuvą kuriame temperatūra 0 oCir laikoma jame 16 valandų Po 16 valandų indas išimamas iš šaldytuvo ir oksidavimo reagento pertekliussuskaidomas pridedant 084 g natrio disulfito (34)

Tęsiama pagal 5321

532 H i d r o l i z ė

5321 Ok s i d u o t ų ėm i n i ų h i d r o l i z ė

Į oksiduotą ėminį paruoštą pagal 531 įpilama 25 ml hidrolizavimo mišinio (320) nuplaunant prie indosienelių ir mentelės prilipusius ėminio likučius

Atsižvelgiant į taikomą procedūrą tęsiama pagal 5323 arba 5324

5322 Ne o k s i d u o t ų ėm i n i ų h i d r o l i z ė

Į 100 ml ar 250 ml apvaliadugnę kolbą (41) ar į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (42) 02 mg tikslumupasveriama 01ndash1 g paruošto ėminio (51) Pasvertoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg Atsargiai įpilamahidrolizavimo mišinio (320) ir sumaišoma su ėminiu Tęsiama pagal 5323 arba 5324

5323 H i d r o l i z ė a t v i r am e i n d e

Į kolbą su mišiniu (paruoštu pagal 5321 ar 5322) įdedami 3 stikliniai rutuliukai ir 23 valandas virinama sugrįžtamuoju kondensatoriumi Hidrolizei pasibaigus kondensatorius išplaunamas 5 ml citratinio buferiniotirpalo (324) Kolba nuimama ir atšaldoma ledo vonioje

Tęsiama pagal 533


5324 H i d r o l i z ė u ž d a r am e i n d e

Butelis su mišiniu paruoštu pagal 5321 arba 5322 dedamas į krosnį (43) 110 oC temperatūroje Kad slėgisnedidėtų (dėl dujinių medžiagų susidarymo) ir būtų išvengta sprogimo pirmąją hidrolizės valandą užsukamaskamštis dedamas ant indo viršaus Kamštis neužsukamas Po valandos kamštis užsukamas ir indas laikomaskrosnyje 23 valandas Hidrolizei pasibaigus indas išimamas iš krosnies kamštis atsargiai atsukamas ir butelisstatomas į ledo ir vandens vonią Paliekama atvėsti

Atsižvelgiant į pH reguliavimo procedūrą (533) butelio turinys kiekybiškai supilamas į 250 ml stiklinę arba250 ml apvaliadugnę kolbą naudojant citratinį buferinį tirpalą (324)

Tęsiama pagal 533

533 pH r e g u l i a v im a s

Atsižvelgiant į aminorūgščių analizatoriaus (49) jautrumą natriui pH reguliavimas tęsiamas pagal 5331 arba5332

5331 C h r om a t o g r a f i n ė s a n a l i z ė s s i s t em o s ( 4 9 ) k u r i om s r e i k i a m a ž o s n a t r i o k o n c e n t r a c i j o s

Kai naudojami aminorūgščių analizatoriai kuriems reikia mažos natrio jonų koncentracijos (kai turi būtisumažintas rūgšties tūris) patariama naudoti pradinį vidinio etalono tirpalą (3273)

Šiuo atveju prieš garinimą į hidrolizatą įpilama 200 ml pradinio vidinio etalono tirpalo (3273)

Į hidrolizatus gautus pagal 5323 arba 5324 įlašinami 2 lašai 1-oktanolio

Sukamajame garintuve (47) garinant vakuume ir 40 oC temperatūroje tūris sumažinamas iki 5ndash10 ml Jeinetyčia tūris sumažėja iki mažesnio nei 5 ml tūrio hidrolizatas turi būti išpiltas ir analizė atliekama iš naujo

Natrio hidroksido tirpalu (318) nustatoma pH vertė 220 ir toliau tęsiama pagal 534

5332 V i s i em s k i t i e m s am i n o r ū g š č i ų a n a l i z a t o r i am s ( 4 9 )

Hidrolizatai gauti pagal 5323 arba 5324 iš dalies neutralizuojami atsargiai įpilant 17 ml natrio hidroksidotirpalo (317) tirpalą visą laiką maišant ir žiūrint kad temperatūra būtų žemesnė nei 40 oC

Kambario temperatūroje nustatoma pH vertė 220 naudojant natrio hidroksido tirpalą (317) ir vėliau natriohidroksido tirpalą (318) Tęsiama pagal 534

534 Ėmin i o t i r p a l a s c h r oma t o g r a f i j a i

Hidrolizatas kurio pH vertė nustatyta (5331 arba 5332) kiekybiškai supilamas į 200 ml matavimo kolbąnaudojant citratinį buferinį tirpalą (324) ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (324)

Jei vidinis etalonas dar nebuvo naudotas įpilama 200 ml vidinio etalono (3273) ir iki žymės skiedžiamacitratiniu buferiniu tirpalu (324) Gerai sumaišoma

Atliekama chromatografinė analizė (54)

Jei ėminių tirpalai netiriami tą pačią dieną jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje

54 Chromatografija

Prieš atliekant chromatografinę analizę ekstraktui (52) arba hidrolizatui (534) leidžiama pasiekti kambariotemperatūrą Mišinys kratomas ir filtruojamas per 022 μmmembraninį filtrą (45) Aminorūgščių analizatoriumi(49) atliekama gauto skaidraus tirpalo jonų mainų chromatografija

Įpurkšti galima rankiniu būdu arba automatiškai Svarbu kad matuojant etalonus ir ėminius į kolonėlę plusmn 05 tikslumu būtų įpurškiamas vienodas tirpalo tūris išskyrus atvejus kai naudojamas vidinis etalonas ir kad natriobei aminorūgščių santykis etalone ir ėminio tirpale būtų kiek įmanoma vienodesnis


Paprastai kalibravimo dažnis priklauso nuo ninhidrino reagento stabilumo ir analizinės sistemos Etalonas arbaėminys skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu (324) kad etalono smailės plotas sudarytų 30ndash200 ėminioaminorūgšties smailės ploto

Priklausomai nuo naudojamo analizatoriaus ir dervos tipo aminorūgščių chromatografija šiek tiek skirsisPasirinkta sistema turi atskirti vieną aminorūgštį nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių junginiųAtsakas į kolonėlėje analizuojamų aminorūgščių kiekio pokyčius turi būti tiesinis chromatografinės sistemosnaudojimo intervale

Atliekant chromatografinę analizę taikomi toliau nurodyti įdubos ir viršūnės aukščių santykiai kaianalizuojamas (nustatomų aminorūgščių) ekvimolinis tirpalas Šis ekvimolinis tirpalas turi turėti mažiausiai30 kiekvienos aminorūgšties kurią galima tiksliai išmatuoti aminorūgščių analizatoriaus sistema (49) įkrovosdidžiausio kiekio

Norint atskirti treoniną ir seriną žemesnės iš dviejų persiklojančių aminorūgščių smailių įdubos ir viršūnėsaukščių santykis chromatogramoje neturi būti didesnis nei 210 (jei nustatomas tik cisteinas (cistinas)metioninas treoninas ir lizinas nepakankamas gretimų smailių atsiskyrimas neigiamai veiktų nustatymui)Visoms kitoms aminorūgštims atskyrimas turi būti geresnis nei 1 10

Sistema turi užtikrinti kad lizinas būtų atskirtas nuo bdquolizino dariniųldquo ir ornitino


Matuojamas ėminio ir etalono kiekvienos aminorūgšties smailės plotas ir apskaičiuojamas kiekis (X)aminorūgšties gramais kg ėminio

X =A cM VBm 1 000

Jei naudojamas vidinis etalonas dauginama išDC

A = hidrolizato arba ekstrakto smailės plotas

B = kalibravimo etaloninio tirpalo smailės plotas

C = vidinio etalono hidrolizate arba ekstrakte smailės plotas

D = vidinio etalono kalibravimo etaloninio tirpalo smailės plotas

M = nustatomos aminorūgšties molinė masė

c = etalono koncentracija μmolml

m = ėminio masė (g) (su pataisa pradinei masei jei ėminys buvo džiovinamas ar iš jo šalinami riebalai)

V = visas hidrolizato tūris (534) arba apskaičiuotas visas praskiesto ekstrakto tūris (61) ml

Oksiduotų ėminių hidrolizatuose cistinas ir cisteinas nustatomi kaip cistino rūgštis bet apskaičiuojami kaipcistinas (C6H12N2O4S2 M = 24030 gmol) naudojant M = 12015 gmol (05 times 24030)

Metioninas nustatomas kaip metionino sulfonas oksiduoto ėminio hidrolizatuose bet apskaičiuojamas kaipmetioninas naudojant metionino M = 14921 gmol

Įdėtas laisvasis metioninas nustatomas po ekstrakcijos kaip metioninas apskaičiavimui naudojant tą pačią molinęmasę

61 Visas praskiesto ekstrakto tūris (F) laisvosioms aminorūgštims (52) nustatyti apskaičiuojamas taip

F =100 ml 10 mlthorn 5 mleth THORN

10 ml V

10

V = galutinio ekstrakto tūris


7 Metodo įvertinimas

Metodas buvo patikrintas 1990 m atliekant palyginimą tarptautiniu lygiu naudojant keturis skirtingus pašarus(mišriuosius kiaulių pašarus broilerių kombinuotuosius pašarus baltymų koncentratą premiksus) Vidurkio irstandartinio nuokrypio rezultatai gauti atmetus riktus pateikiami šio punkto lentelėse

Vidurkiai gkg

Pamatinė medžiagaAminorūgštis

Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas

Mišrieji kiaulių pašarai 694n = 15

301n = 17

327n = 17

955n = 13

Broilerių kombinuotiejipašarai

931n = 16

392n = 18

508n = 18

1393n = 16

Baltymų koncentratas 2232n = 16

506n = 17

1201n = 17

4774n = 15

Premiksas 5842n = 16

mdash 9021n = 16

9803n = 16

n = dalyvavusių laboratorijų skaičius

71 Pakartojamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo pakartojamumas išreikštas kaip laboratorijos standartinisnuokrypis pateiktas šiose lentelėse

Laboratorijos standartinis nuokrypis (Sr) gkg




010n = 17

011n = 17

026n = 13


020n = 16

011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15

Premiksas 130n = 16

mdash 219n = 16

206n = 16


Laboratorijos standartinio nuokrypio (Sr) variacijos koeficientas ()



Mišrieji kiauliųpašarai

19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13

Broilerių kombi-nuotieji pašarai

21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16

Baltymų koncentra-tas

27n = 16

26n = 17

22n = 17

24n = 15




Premiksas 22n = 16

mdash 24n = 16

21n = 16


72 Atkuriamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo atkuriamumas išreikštas kaip tarplaboratorinis standartinisnuokrypis pateiktas šiose lentelėse

Tarplaboratorinis standartinis nuokrypis (SR) gkg




030n = 17

023n = 17

030n = 13


048n = 16

034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15

Premiksas 249n = 16

mdash 620n = 16

662n = 16


Tarplaboratorinis standartinio nuokrypio (SR) variacijos koeficientas ()




99n = 17

70n = 17

32n = 13


52n = 16

88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15

Premiksas 43n = 16

mdash 69n = 16

67n = 16


8 Pamatinių medžiagų naudojimas

Tinkamas šio metodo taikymas turi būti patikrintas atliekant kartotinius sertifikuotųjų pamatinių medžiagųmatavimus jei jos yra Rekomenduojama kalibruoti sertifikuotaisiais aminorūgščių kalibravimo tirpalais

9 Pastabos

91 Dėl aminorūgščių analizatorių skirtumų tikrinama pagal galutinę etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalų(žr 5274 ir 5275) ir hidrolizatų (žr 534) koncentraciją


Prietaiso tiesinio atsako intervalas turi būti tikrinamas visoms aminorūgštims

Etaloninis tirpalas skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu kad smailių plotai būtų intervalo viduryje

92 Jei hidrolizatams analizuoti naudojama efektyviosios skysčių chromatografijos įranga bandymų sąlygas reikiaoptimizuoti pagal gamintojo rekomendacijas

93 Taikant metodą pašarams kuriuose yra daugiau nei 1 chloridų (koncentratai mineraliniai pašarai papildai)gali būti gauti sumažinti metionino rezultatai todėl reikia numatyti specialų apdorojimą

G TRIPTOFANO NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančio triptofano suminį kiekį ir laisvąjį triptofaną Šiuo metodu D- irL-formos neatskiriamos

2 Metodas

Suminiam triptofanui nustatyti ėminys 20 valandų hidrolizuojamas šarminėje terpėje sočiuoju bario hidroksidotirpalu 110 oC temperatūroje Po hidrolizės įpilama vidinio etalono

Laisvajam triptofanui nustatyti ėminys ekstrahuojamas silpnai rūgštinėje terpėje esant vidiniam etalonui

Triptofanas ir vidinis etalonas hidrolizate ar ekstrakte nustatomi HPLC metodu naudojant fluorescencinįdetektorių

3 Reagentai

31 Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba tokios pat kokybės vanduo (laidis lt 10 μScm)

32 Etaloninė medžiaga triptofanas (grynumaskiekis ge 99 ) išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido

33 Vidinio etalono medžiaga α-metiltriptofanas (grynumaskiekis ge 99 ) išdžiovintas vakuume virš fosforopentoksido

34 Bario hidroksido oktahidratas (siekiant išvengti BaCO3 susidarymo kuris galėtų trukdyti nustatymuiužtikrinama kad Ba(OH)2 8H2O visiškai nesiliestų su oru) (žr 93 pastabą)


36 Ortofosforo rūgštis w = 85

37 Vandenilio chlorido rūgštis ρ20 = 119 gml

38 Metanolis HPLC grynumo

39 Petroleteris virimo temperatūros intervalas ndash 40ndash60 oC


400 g NaOH (35) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 l vandeniu (31)

311 Vandenilio chlorido rūgštis c = 6 moll

paimama 492 ml HCl (37) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu




313 Vandenilio chlorido rūgštis c= 01 moll


314 Orto fosforo rūgštis c = 05 moll

paimama 34 ml ortofosforo rūgšties (36) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu (31)

315 Koncentruotas triptofano tirpalas (32) c = 250 μmolml

į 500 ml matavimo kolbą įdedama 02553 g triptofano (32) ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (313) irskiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (313) Laikoma ndash18 oC ne ilgiau kaip keturias savaites

316 Koncentruotas vidinio etalono tirpalas c = 250 μmolml

į 500 ml matavimo kolbą įdedama 02728 g α-metiltriptofano (33) ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje(313) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (313) Laikoma ndash18 oC ne ilgiau kaip keturiassavaites

317 Triptofano kalibravimo etaloninis tirpalas ir vidinis etalonas

paimama 200 ml koncentruoto triptofano tirpalo (315) ir 200 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (316) Skiedžiama vandeniu (31) ir metanoliu (38) iki maždaug tokio pat tūrio irmaždaug iki tokios pat metanolio koncentracijos (10ndash30 ) kaip galutinio hidrolizato tūris ir koncentracija

Šis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą

Ruošiamas tirpalas saugomas nuo tiesioginių saulės spindulių

318 Acto rūgštis

319 111-trichlor-2-metil-2-propanolis

320 Etanolaminas w (ww) gt 98

321 1 g 111-trichlor-2-metil-2-propanolio (319) tirpalas 100 ml metanolio (38)

322 HPLC judančioji fazė 300 g acto rūgšties (318) + 900 ml vandens (31) + 500 ml 111-trichlor-2-metil-2-propanolio (319) tirpalo (321) metanolyje (38) (1 g100 ml) Etanolaminu (320) nustatoma pH vertė 500Vandeniu (31) skiedžiama iki 1 000 ml

4 Aparatūra

41 HPLC įranga ir fluorescencinis detektorius

42 Skysčių chromatografijos kolonėlė 125 mm times 4 mm C18 3 μm įkrova arba lygiavertė kolonėlė

43 pH-metras

44 Kolba iš polipropileno talpa 125 ml su plačiu kaklu ir užsukamu dangčiu

45 Membraninis filtras 045 μm

46 Autoklavas 110 (plusmn 2) oC 14 (plusmn 01) bar


48 Sūkurinė maišyklė


5 Procedūra


Ėminys sumalamas taip kad jį būtų galima sijoti per 05 mm sietą Daug drėgmės turintys ėminiai prieš malimąturi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 C temperatūroje arba liofilizuojami Daug riebalų turintys ėminiaiprieš malimą ekstrahuojami petroleteriu (39)

52 Laisvojo triptofano nustatymas (ekstraktas)

Į kūginę kolbą 1 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas kiekis (1ndash5 g) paruošto ėminio (51) Įpilama 1000 mlvandenilio chlorido rūgšties c = 01 moll (313) ir 500 ml koncentruoto vidinio etalono tirpalo (316) 60 minpurtoma mechanine purtykle arba maišoma magnetine maišykle (47) Nuosėdoms leidžiama nusėsti pipetepaimama į cheminę stiklinę 100 ml tirpalo virš nuosėdų Įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties c = 05 moll (314)Natrio hidroksido tirpalu c = 10 moll (310) nustatoma pH vertė 30 Įpilamas pakankamas kiekis metanolio(38) kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10ndash30 Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbąir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei tinkamo tūrio (maždaug iki to paties tūrio kaip kalibravimoetaloninio tirpalo tūris (317))

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 045 μm membraninį filtrą (45) Atliekamachromatografinė analizė pagal 54 skirsnį

Etaloninis tirpalas ir ekstraktai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tąpačią dieną ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 C temperatūroje

53 Suminio triptofano kiekio nustatymas (hidrolizatas)

Į kolbą iš polipropileno (44) 02 mg tikslumu pasveriama 01ndash1 g paruošto ėminio (51) Pasvertojoje ėminiodalyje yra apie 10 mg azoto Įpilama 84 g bario hidroksido oktahidrato (34) ir 10 ml vandens Sumaišomasūkurine maišykle (48) arba magnetine maišykle (47) Teflonu padengtas magnetas paliekamas mišinyje Indosienelės nuplaunamos 4 ml vandens Kolba uždengiama užsukamuoju dangčiu jo neužveržiant Kolba įdedamaį autoklavą (46) su verdančiu vandeniu ir garais ir laikoma 30ndash60 min Autoklavas uždaromas ir 20 valandųkaitinama 110 (plusmn 2) C temperatūroje

Prieš atidarant autoklavą temperatūra sumažinama iki šiek tiek žemesnės nei 100 oC Siekiant išvengti Ba(OH)2times 8H2O išsikristalizavimo į šiltą mišinį įpilama 30 ml kambario temperatūros vandens Švelniai purtoma arbamaišoma Įpilama 200 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (316) Indai 15 minaušinami ant vandens arba ledo vonios

Tada įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties c = 05 moll (314) Indą laikant ant aušinamosios vonios ir maišantturinys neutralizuojama HCl c = 6 moll (311) ir HCl c = 1 moll (312) nustatoma pH vertė 30 Įpilamaspakankamas kiekis metanolio kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10ndash30 Supilamaį atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei reikiamo tūrio(pvz 100 ml) Įpylus metanolio nuosėdos nesusidaro

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 045 μmmembraninį filtrą (45) Chromatografinėanalizė atliekama pagal 54 skirsnį

Etaloninis tirpalas ir hidrolizatai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tąpačią dieną ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 oC temperatūroje

54 HPLC nustatymas

Rekomenduojamos šios izokratinio eliuavimo sąlygos gali būti taikomos kitos sąlygos jei gaunami lygiaverčiairezultatai (žr dar 91 ir 92 pastabas)

Skysčių chromatografijoskolonėlė (42)

125 mm times 4 mm C18 3 μm įkrova arba lygiavertė kolonėlė

Kolonėlės temperatūra kambario temperatūra

Judančioji fazė (322) 300 g acto rūgšties (318) + 900 ml vandens (31) + 500 ml 111-trichlor-2-metil-2-propanolio (319) tirpalo (321) metanolyje (38) (1 g100 ml) Etanolaminu (320)nustatoma pH vertė 500 Skiedžiama iki 1 000 ml vandeniu (31)

Srautas 1 mlmin

Visa eliuavimo trukmė maždaug 34 min

Detektoriaus bangos ilgis sužadinimas 280 nm emisija 356 nm

Įpurškiamas tūris 20 μl



Apskaičiuojamas triptofano kiekis (X) g 100 g ėminio

X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m

A = vidinio etalono smailės plotas kalibravimo etaloninis tirpalas (317)

B = triptofano ekstrakte (52) ar hidrolizate (53) smailės plotas

V1 = koncentruoto triptofano tirpalo (315) įpilamo į kalibravimo tirpalą (317) tūris ml (2 ml)

c = koncentruoto triptofano tirpalo (315) įpilamo į kalibravimo tirpalą (317) koncentracija μmolml (= 250)

V2 = koncentruoto vidinio etalono tirpalo (316) įpilamo į ekstraktą (52) (= 500 ml) arba į hidrolizatą (53)(= 200 ml) tūris

C = ekstrakto (52) arba hidrolizato (53) vidinio etalono smailės plotas

D = triptofano kalibravimo etaloninio tirpalo (317) smailės plotas

V3 = koncentruoto vidinio etalono tirpalo (316) įpilamo į kalibravimo etaloninį tirpalą (317) tūris ml(= 200 ml)

m = ėminio masė g (su pataisa pradinei masei jei jis buvo išdžiovintas arba iš jo buvo pašalinti riebalai)

M = triptofano molekulinė masė (= 20423 gmol)

7 Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 10 didesniojorezultato vertės

8 Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai

Hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (4-asis tarplaboratorinispalyginimas) kurį vykdant ne daugiau kaip 12 laboratorijų analizavo tris ėminius Buvo atliekamos lygiagrečios(5) kiekvieno ėminio analizės Rezultatai pateikti šioje lentelėje

1 ėminysKiaulių pašaras

2 ėminysKiaulių pašaras su L-tripto-

fanu

3 ėminysKiaulių pašaro koncentratas

L 12 12 12n 50 55 50Vidurkis [gkg] 242 340 422sr [gkg] 005 005 008r [gkg] 014 014 022CVr [ ] 19 16 19SR [gkg] 015 020 009R [gkg] 042 056 025CVR [ ] 63 60 22

L = rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius

n = atskirų rezultatų paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran Dixon riktų kriterijų) pašalinimoskaičius

sr = pakartojamumo standartinis nuokrypis

SR = atkuriamumo standartinis nuokrypis

r = pakartojamumas

R = atkuriamumas

CVr = pakartojamumo variacijos koeficientas

CVR = atkuriamumo variacijos koeficientas


Laisvojo triptofano ekstrahavimo metodui sertifikuoti buvo parengtas kitas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas(3ndashasis tarplaboratorinis palyginimas) kurį vykdant ne daugiau kaip 13 laboratorijų analizavo du ėminius Buvoatliekamos lygiagrečios (5) kiekvieno ėminio analizės Rezultatai pateikti šioje lentelėje

4 ėminysKviečių ir sojų mišinys

5 ėminysKviečių ir sojų mišinys (4 ėminys) su

triptofanu (0457 gkg)

L 12 12n 55 60Vidurkis [gkg] 0391 0931sr [gkg] 0005 0012r [gkg] 0014 0034CVr [ ] 134 134SR [gkg] 0018 0048R [gkg] 0050 0134CVR [ ] 471 511





r = pakartojamumas

R = atkuriamumas



Triptofano hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas dar vienas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas kurįatliekant ne daugiau kaip 7 laboratorijos analizavo keturis ėminius Rezultatai pateikti toliau Kiekvienas ėminysbuvo analizuojamas penkis kartus

1 ėminysKiaulių pašaro miši-

nys(CRM 117)

2 ėminysŽuvų miltai su mažu

riebalų kiekiu(CRM 118)

3 ėminysSojų miltai(CRM 119)

4 ėminysNugriebto pieno milte-

liai(CRM 120)

L 7 7 7 7n 25 30 30 30Vidurkis [gkg] 2064 8801 6882 5236sr [gkg] 0021 0101 0089 0040r [gkg] 0059 0283 0249 0112CVr [ ] 104 115 130 076SR [gkg] 0031 0413 0283 0221R [gkg] 0087 1156 0792 0619CVR [ ] 148 469 411 422





r = pakartojamumas

R = atkuriamumas



9 Pastabos

91 Šios specialios chromatografavimo sąlygos gali pagerinti triptofano ir α-metiltriptofano atskyrimą


Izokratinis eliuavimas po kurio kolonėlė plaunama taikant gradientinį eliuavimą

Skysčių chromatografijoskolonėlė


Kolonėlės temperatūra 32 oC

Judančioji fazė A 001 moll KH2PO4metanolis 95 + 5 (V + V)

B Metanolis

Gradiento programa 0 min 100 A 0 B

15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B

Srautas 12 mlmin


92 Chromatografinė analizė bus nevienoda atsižvelgiant į HPLC tipą ir naudojamą kolonėlės įkrovos medžiagąPasirinkta sistema turi užtikrinti triptofano ir vidinio etalono smailių atsiskyrimą iki pat bazinės linijos Be tosvarbu kad irimo produktai būtų gerai atskirti nuo triptofano ir vidinio etalono Siekiant patikrinti ar bazinėjelinijoje kur turi būti vidinio etalono smailė nėra priemaišų analizuojami hidrolizatai be vidinio etalono Svarbukad eliuavimo trukmė būtų pakankamai ilga visiems irimo produktams išplauti antraip pavėlavusios eliuavimosmailės gali trukdyti vėliau atliekamoms chromatografavimo procedūroms

Chromatografavimo sistemos atsakas darbinių koncentracijos verčių intervale yra tiesinis Atsako tiesiškumasnustatomas naudojant vieną (normalią) vidinio etalono koncentraciją ir keičiant triptofano koncentraciją Svarbukad triptofano ir vidinio etalono smailės būtų HPLC ir fluorescencinio detektoriaus sistemos tiesinėje dalyje Jeitriptofano ir (arba) vidinio etalono smailė (-s) yra per žemos ar per aukštos analizė kartojama imant kito dydžioėminį ir (arba) kitą galutinį tūrį

93 Bario hidroksidas

Sendamas bario hidroksidas vis blogiau tirpsta Dėl šios priežasties tirpalas naudojamas nustatymui HPLCmetodu darosi neskaidrus ir dėl to gali būti gauti mažesni triptofano kiekio rezultatai

H ŽALIŲ ALIEJŲ IR RIEBALŲ NUSTATYMAS


Šis metodas taikomas žalių aliejų ir riebalų kiekiui pašaruose nustatyti Metodas netaikomas aliejingosiomssėkloms ir aliejiniams vaisiams

Atsižvelgiant į pašarų tipą bei sudėtį ir į analizės atlikimo priežastį taikoma viena iš dviejų aprašytų procedūrų

11 A procedūra Tiesiogiai ekstrahuojami žali aliejai ir riebalai

Šis metodas taikomas augalinės kilmės pašarams išskyrus pašarus įtrauktus į B procedūros taikymo sritį

12 B procedūra Suminis žalių aliejų ir riebalų kiekis

Šis metodas taikomas gyvūninės kilmės pašarams ir visiems kombinuotiesiems pašarams Šis metodas turi būtitaikomas visoms medžiagoms iš kurių žali aliejai ir riebalai negali būti visiškai ekstrahuoti prieš tai neatlikus jųhidrolizės (pvz grūdų glitimas mielės bulvių baltymai ir produktai kurie apdorojami taikant procesus pvzišspaudimo dribsnių gamybos ir kaitinimo procesus)

13 Rezultatų aiškinimas

Visais atvejais kai rezultatas gautas taikant B procedūrą yra didesnis nei rezultatas gautas pagal A procedūrąteisingu turi būti laikomas rezultatas gautas taikant B procedūrą


2 Metodas

21 A procedūra

Ėminys ekstrahuojamas petroleteriu Tirpiklis išgarinamas o likutis džiovinamas ir sveriamas

22 B procedūra

Ėminys apdorojamas vandenilio chlorido rūgštimi kaitinant Mišinys atvėsinamas ir filtruojamas Likutisplaunamas džiovinamas ir ekstrahuojamas pagal A procedūrą

3 Reagentai

31 Petroleteris virimo temperatūros intervalas ndash 40ndash60 oC bromo skaičius turi būti mažesnis kaip 1 likutis poišgarinimo mažesnis nei 2 mg100 ml

32 Natrio sulfatas bevandenis


34 Pagalbinė filtravimo priemonė pvz diatomitas Hyflo-supercel

4 Aparatūra

41 Ekstrahavimo aparatas Jei naudojamas sifonas (Soksleto aparatas) grąžinamo skysčio srautas yra toks kad pervalandą būtų 10 ciklų jei sifonas nenaudojamas grąžinamo skysčio srautas yra apie 10 mlmin

42 Ekstrahavimo tūtos kurios neturėtų petroleteryje tirpių medžiagų ir kurių akytumas atitiktų 41 punktoreikalavimus

43 Džiovinimo spinta vakuuminė spinta nustatyta 75 plusmn 3 oC arba spinta su oro cirkuliacija nustatyta 100 plusmn 3 oC

5 Procedūra

51 A procedūra (žr 81 punktą)

5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu supilama į ekstrahavimo tūtą (42) ir užkemšama riebalų neturinčiosvatos kamščiu

Tūta dedama į ekstrahavimo aparatą (41) ir ekstrahuojama šešias valandas petroleteriu (31) Petroleterioekstraktas surenkamas į pasvertą sausą kolbą su pemzos gabaliukais (1)

Tirpiklis distiliuojamas Likutis džiovinamas kolbą laikant džiovinimo spintoje (43) pusantros valandos Kolbaatvėsinama eksikatoriuje ir pasveriama Džiovinama dar 30 min siekiant patikrinti ar nekinta riebalų ir aliejųmasė (paeiliui sveriant du kartus masės skirtumas turi būti mažesnis arba lygus 1 mg)

52 B procedūra

25 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu (žr 82 punktą) supilama į 400 ml stiklinę arba 300 ml kūginę kolbąįpilama 100 ml vandenilio chlorido rūgšties (33) ir įmetami keli pemzos gabaliukai Stiklinė uždengiamalaikrodžio stiklu arba kūginė kolba sujungiama su grįžtamuoju kondensatoriumi Mišinys atsargiai užverdamasvirš mažos liepsnos arba ant kaitlentės ir vieną valandą virinamas Reikia žiūrėti kad produktas nepriliptų prieindo sienelių

Atvėsinama ir pridedama pakankamai pagalbinės filtravimo priemonės (34) kad būtų išvengta aliejaus ir riebalųnuostolių filtruojant Filtruojama per sudrėkintą dvigubą riebalų neturintį filtravimo popierių Likutis plaunamasšaltu vandeniu tol kol gaunamas neutralios reakcijos filtratas Patikrinama ar filtrate nėra riebalų Jų buvimasfiltrate rodo kad prieš hidrolizę ėminys turi būti ekstrahuojamas petroleteriu pagal A procedūrą


(1) Jei vėliau atliekami aliejaus arba riebalų kokybės bandymai pemzos gabaliukai pakeičiami stikliniais rutuliukais

Dvigubas filtravimo popierius su likučiu dedamas ant laikrodžio stiklo ir 100 plusmn 3 oC temperatūroje džiovinamaspusantros valandos džiovinimo spintoje su oro cirkuliacija (43)

Dvigubas filtravimo popierius su sausu likučiu įdedamas į ekstrahavimo tūtą (42) kuri užkemšama riebalųneturinčios vatos kamščiu Tūta dedama į ekstrahavimo aparatą (41) ir tęsiama kaip nurodyta 51 punktoantroje ir trečioje pastraipose

6 Rezultato išraiška

Likučio masė išreiškiama ėminio masės procentais

7 Pakartojamumas

To paties tyrėjo atliekamų dviejų lygiagrečių to paties ėminio analizės rezultatų skirtumas ne didesnis nei

mdash 02 absoliučiąja verte kai žalių aliejų ir riebalų kiekis yra mažesnis nei 5

mdash 40 didžiausio rezultato vertės kai kiekis 5ndash10

mdash 04 absoliučiąja verte kai kiekis didesnis nei 10

8 Pastabos

81 Jei produktus turinčius didelį aliejų ir riebalų kiekį sunku susmulkinti arba jie yra netinkami sumažintajamvienalyčiam tiriamajam ėminiui paimti daroma taip

20 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir sumaišoma su 10 g ar didesniu kiekiu bevandenio natrio sulfato (32)Ekstrahuojama petroleteriu (31) kaip nurodyta 51 Gautas ekstraktas skiedžiamas iki 500 ml petroleteriu (31)ir tirpalas sumaišomas 50 ml tirpalo supilama į prieš tai pasvertą nedidelę sausą kolbą su pemzos gabalėliaisTirpiklis distiliuojamas likutis džiovinamas ir tęsiama kaip nurodyta 51 punkto paskutinėje pastraipoje

Pašalinamas tirpiklis iš tūtoje likusio ekstrahavimo likučio likutis susmulkinamas ne didesnėmis nei 1 mmdydžio dalelėmis sudedamas atgal į ekstrahavimo tūtą (natrio sulfato nededama) ir atliekamos 51 punkto antrojeir trečioje pastraipose nurodytos procedūros

Aliejų ir riebalų kiekis ėminio masės procentais apskaičiuojamas pagal šią formulę

(10 m1 + m2) times 5

kurioje

m1 = likučio po pirmojo ekstrahavimo (alikvotinės ekstrakto dalies) svoris gramais

m2 = likučio po antrojo ekstrahavimo svoris gramais

82 Jei produkte yra nedaug aliejų arba riebalų tiriamojo ėminio masė gali būti padidinta iki 5 g

83 Naminių gyvūnėlių ėdalą turintį daug vandens prieš hidrolizę ir ekstrahavimą gali tekti maišyti su bevandeniunatrio sulfatu kaip tai daroma taikant B procedūrą

84 Atliekant 52 punkte aprašytas procedūras veiksmingiau būtų naudoti ne šaltą bet karštą vandenį likučiui pofiltravimo plauti

85 Kai kurių pašarų atveju 15 val džiovinimo trukmę gali tekti padidinti Per ilgo džiovinimo vengiama nes dėl togali būti gauti mažesni rezultatai Gali būti naudojama mikrobangų krosnį

86 Pradinis ekstrahavimas pagal A procedūrą prieš hidrolizę ir pakartotinis ekstrahavimas pagal B procedūrąrekomenduojamas tuo atveju jei žalių aliejų ir riebalų kiekis yra didesnis nei 15 Ekstrahavimo trukmė kažkiekpriklauso nuo pašarų ir nuo juose esančių aliejų arba riebalų tipo


I ŽALIOS LĄSTELIENOS NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti pašarų neriebalines organines medžiagas netirpias rūgštinėje ir šarminėje terpėjekurios paprastai apibūdinamos kaip žalia ląsteliena

2 Metodas

Ėminys iš kurio prireikus pašalinami riebalai veikiamas tam tikros koncentracijos sieros rūgšties ir kaliohidroksido tirpalais virimo temperatūroje Likutis atskiriamas filtruojant plaunamas džiovinamas sveriamas irsudeginamas 475ndash500 oC temperatūros intervale Žalios ląstelienos kiekis tiriamajame ėminyje atitinka masėssumažėjimą po sudeginimo

3 Reagentai

31 Sieros rūgštis c = 013 moll

32 Priešputis (pvz n-oktanolis)

33 Pagalbinė filtravimo priemonė (Celite 545 arba lygiavertė) iškaitinta 500 oC temperatūroje keturias valandas(86)

34 Acetonas

35 Petroleteris kurio virimo temperatūros intervalas 40ndash60 oC


37 Kalio hidroksido tirpalas c = 023 moll

4 Aparatūra

41 Kaitinimo įrenginys skaidymui sieros rūgštimi arba kalio hidroksido tirpalu turintis filtravimo tiglio (42) laikiklįišleidimo vamzdį su čiaupu skysčiui išleisti ir vakuuminį siurblį gali būti suslėgtojo oro Kiekvieną dieną priešnaudojimą blokas penkias minutes šildomas verdančiu vandeniu

42 Stiklinis filtravimo tiglis su sukepinto stiklo filtro plokšte kurios akučių dydis 40ndash90 μm Prieš naudojant pirmąkartą tiglis kelias minutes kaitinamas iki 500 oC ir atvėsinamas (86)

43 Ne mažesnės nei 270 ml talpos cilindras su grįžtamuoju kondensatoriumi tinkamas virinimui

44 Džiovinimo spinta su šilumine rele

45 Mufelinė krosnis su šilumine rele

46 Ekstrahavimo įrenginys kurį sudaro filtravimo tiglio (42) laikiklio plokštė ir išleidimo vamzdis su čiaupuvakuumui prijungti ir skysčiui išleisti

47 Jungiamieji žiedai kaitinimo įrenginiui (41) tigliui (42) ir cilindrui (43) sujungti ir šaltojo ekstrahavimoįrenginiui (46) bei tigliui prijungti

5 Procedūra

1 mg tikslumu pasveriama 1 g paruošto ėminio ėminys dedamas į tiglį (42) (žr 81 82 ir 83 pastabas) irpridedama 1 g pagalbinės filtravimo priemonės

Surenkamas kaitinimo įrenginys (41) ir filtravimo tiglis (42) tada prie tiglio prijungiamas cilindras (43)Į cilindro ir tiglio sąranką įpilama 150 ml verdančios sieros rūgšties (31) ir prireikus įlašinami keli lašaipriešpučio (32)

Užvirinama per 5 plusmn 2 min ir stipriai virinama lygiai 30 min


Atsukamas čiaupas į išleidimo vamzdį (41) sieros rūgštis filtruojama vakuumu per filtravimo tiglį ir likutis triskartus paeiliui plaunamas 30 ml verdančio vandens užtikrinant kad po kiekvieno plovimo likutis būtųfiltruojamas sausai

Išleidžiamasis čiaupas užsukamas į cilindro ir tiglio sąranką įpilama 150 ml verdančio kalio hidroksido tirpalo(37) ir įlašinami keli lašai priešpučio (32) Užvirinama per 5 plusmn 2 min ir stipriai virinama lygiai 30 minFiltruojama ir kartojama plovimo procedūra taikyta sieros rūgščiai

Po paskutinio plovimo ir džiovinimo tiglis su jame esančia medžiaga atjungiamas ir sujungiamas su šaltojoekstrahavimo įrenginiu (46) Prijungiamas vakuumas ir likutis tiglyje tris kartus iš eilės plaunamas 25 ml acetonoporcijomis (34) užtikrinant kad po kiekvieno plovimo likutis būtų filtruojamas sausai

Tiglis džiovinamas džiovinimo spintoje iki pastoviosios masės 130 oC temperatūroje Po kiekvieno džiovinimotiglis atvėsinamas eksikatoriuje ir greitai pasveriamas Tiglis dedamas į mufelinę krosnį ir ne mažiau nei 30 miniškaitinamas 475ndash500 oC temperatūroje iki pastoviosios masės

Po kiekvieno iškaitinimo iš pradžių atvėsinama krosnyje vėliau eksikatoriuje ir pasveriama

Atliekamas tuščiasis bandymas be ėminio Masės sumažėjimas dėl iškaitinimo neturi būti didesnis nei 4 mg


Žalios ląstelienos kiekis ėminio masės procentais gaunamas pagal lygtį

X =m0 minusm1eth THORN 100

m

kurioje

m = ėminio svoris g

m0 = ėminio svorio sumažėjimas po iškaitinimo g

m1 = svorio sumažėjimas po iškaitinimo atliekant tuščiąjį bandymą g

7 Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei

mdash 06 absoliučiąja verte kai žalios ląstelienos kiekis mažesnis nei 10

mdash 6 didžiausiojo rezultato vertės kai žalios ląstelienos kiekis lygus ar didesnis nei 10

8 Pastabos

81 Jei pašarai turi daugiau nei 10 žalių riebalų prieš analizę jie turi būti pašalinti petroleteriu (35) Filtravimotiglis (42) su jame esančia medžiaga prijungiamas prie šaltojo ekstrahavimo įrenginio (46) ir prijungus vakuumąlikutis tris kartus plaunamas 30 ml petroleterio porcijomis (37) užtikrinant kad likutis būtų sausas Tiglis sujame esančia medžiaga prijungiamas prie kaitinimo įrenginio (41) ir analizė tęsiama kaip aprašyta 5 punkte

82 Jei pašarai turi riebalų kurių tiesiogiai negalima ekstrahuoti petroleteriu (35) riebalai turi būti pašalinti kaipnurodyta 81 ir dar kartą šalinami po virinimo su rūgštimi Pavirinus su rūgštimi ir išplovus tiglis su jameesančia medžiaga prijungiamas prie šalto ekstrahavimo indo (46) ir tris kartus plaunamas 30 ml acetono (36)tada tris kartus 30 ml petroleterio porcijomis Filtruojama prijungus vakuumą iki sauso likučio ir analizė tęsiamakaip aprašyta 5 punkte pradedant nuo apdorojimo kalio hidroksido tirpalu


83 Jei pašarai turi daugiau kaip 5 karbonatų išreikštų kalcio karbonatu tiglis (42) su pasvertu ėminiuprijungiamas prie kaitinimo įrenginio (41) Ėminys tris kartus plaunamas 30 ml vandenilio chlorido rūgšties(36) Kiekvieną kartą įpylus rūgšties ėminys paliekamas stovėti prieš filtravimą maždaug vieną minutę Vienąkartą plaunama 30 ml vandens ir procedūra tęsiama kaip aprašyta 5 punkte

84 Jei aparatas naudojamas kaip stovas (prie to paties kaitinimo įrenginio prijungti keli tigliai) atliekant vienąbandymų seriją negalima vykdyti dviejų to paties ėminio atskirų nustatymų

85 Jei po virinimo sunku filtruoti rūgštinius ir šarminius tirpalus per kaitinimo įrenginio išleidimo vamzdįleidžiamas suslėgtasis oras ir filtravimas tęsiamas

86 Siekiant pratęsti stiklinių filtravimo tiglių naudojimo trukmę iškaitinimo temperatūra yra ne aukštesnė nei500 oC Reikia žiūrėti kad kaitinant ir atvėsinant būtų išvengta staigių temperatūros svyravimų

J CUKRAUS NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti redukuojančiųjų sacharidų kiekį ir suminį sacharidų kiekį išreiškiamą gliukozėskiekiu arba jei tinka sacharozės kiekiu dauginant rezultatą iš faktoriaus 095 Metodas tinka kombinuotiesiemspašarams Kitiems pašarams numatyti specialieji metodai Jei būtina laktozė nustatoma atskirai ir į jos kiekįatsižvelgiama apskaičiuojant rezultatus

2 Metodas

Sacharidai ekstrahuojami praskiestu etanoliu tirpalas skaidrinamas I ir II Carrez tirpalais Etanolį pašalinussacharidų kiekis prieš ir po inversijos nustatomi Luff-Schoorl metodu

3 Reagentai

31 Etanolio tirpalas 40 (VV) tankis 0948 gml 20 oC temperatūroje neutralizuotas pagal fenolftaleiną



34 Metiloranžinio 01 (mV) tirpalas

35 Vandenilio chlorido rūgšties 4 moll tirpalas



38 Luff-Schoorl reagentas

Atsargiai maišant citrinų rūgšties tirpalas (382) supilamas į natrio karbonato tirpalą (383) Įpilamas variosulfato tirpalas (381) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro Paliekama nusistovėti per naktį ir tirpalas filtruojamas

Tikrinama gauto reagento koncentracija (Cu ndash 005 moll Na2CO3 ndash 1 moll) žr 54 paskutinę pastraipą TirpalopH yra apie 94

381 Vario sulfato tirpalas 25 g vario sulfato CuSO45H2O neturinčio geležies ištirpinama 100 ml vandens


382 Citrinų rūgšties tirpalas 50 g citrinų rūgšties C6H8O7 H2O ištirpinama 50 ml vandens

383 Natrio karbonato tirpalas 1438 g bevandenio natrio karbonato ištirpinama maždaug 300 ml šilto vandensPaliekama atvėsti

39 Natrio tiosulfato 01 moll tirpalas

310 Krakmolo tirpalas 5 g tirpaus krakmolo mišinys su 30 ml vandens supilamas į 1 litrą verdančio vandensVirinama tris minutes tirpalas atvėsinamas prireikus į jį kaip konservanto įdedama 10 mg gyvsidabrio(II) jodido


312 Kalio jodido tirpalas 30 (mV)

313 Pemzos granulės virintos vandenilio chlorido rūgšties tirpale išplautos ir išdžiovintos

314 3-metilbutan-l-olis

4 Aparatūra

Maišiklis (vartytuvas) apsisukimų dažnis maždaug 35ndash40 min-1

5 Procedūra

51 Ėminio ekstrahavimas

25 g ėminio pasverto 1 mg tikslumu supilama į 250 ml matavimo kolbą Įpilama 200 ml etanolio (31) ir vienąvalandą maišoma maišikliu Įpilama 5 ml Carrez I tirpalo (32) ir maišoma maždaug 30 s Įpilama 5 ml Carrez IItirpalo (33) ir vėl maišoma 1 min Etanoliu (31) skiedžiama iki žymės sumaišoma ir filtruojama Imama 200 mlfiltrato ir garinama didesnei daliai etanolio pašalinti tol kol tūris sumažėja maždaug du kartus Likutis poišgarinimo naudojant šiltą vandenį kiekybiškai supilamas į 200 ml matavimo kolbą tirpalas atvėsinamasskiedžiamas iki žymės vandeniu sumaišomas ir prireikus filtruojamas Šis tirpalas naudojamas redukuojančiųjųsacharidų kiekiui nustatyti ir po inversijos suminiam sacharidų kiekiui nustatyti

52 Redukuojančiųjų sacharidų nustatymas

Pipete paimama ne daugiau 25 ml tirpalo turinčio mažiau nei 60 mg redukuojančiųjų sacharidų kurių kiekisišreiškiamas gliukozės kiekiu Prireikus skiedžiama distiliuotu vandeniu iki 25 ml ir redukuojančiųjų sacharidųkiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu Rezultatas išreiškiamas gliukozės kiekiu ėminyje procentais

53 Suminio invertuotų sacharidų kiekio nustatymas

Pipete paimama 50 ml tirpalo ir supilama į 100 ml matavimo kolbą Įlašinami keli lašai metiloranžinio tirpalo(34) ir atsargiai nuolat maišant pilama vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (35) tol kol neišnyksta tirpaloraudona spalva Įpilama 15 ml vandenilio chlorido rūgšties (36) kolba nuleidžiama į stipriai verdančio vandensvonią kurioje laikoma trisdešimt minučių Tirpalas greitai atvėsinamas iki maždaug 20 oC temperatūros ir į jįįpilama 15 ml natrio hidroksido tirpalo (37) Skiedžiama vandeniu iki 100 ml ir sumaišoma Paimama nedaugiau 25 ml šio tirpalo turinčio mažiau nei 60 mg redukuojančiųjų sacharidų perskaičiuotų į gliukozės kiekįPrireikus distiliuotu skiedžiama vandeniu iki 25 ml ir redukuojančiųjų sacharidų kiekis nustatomas Luff-Schoorlmetodu Rezultatas išreiškiamas gliukozės procentiniu kiekiu arba jei tinka sacharozės kiekiu gautą rezultatąpadauginus iš faktoriaus 095

54 Titravimas Luff-Schoorl metodu

Pipete įpilama 25 ml Luff-Schoorl reagento (38) ir supilama į 300 ml Erlenmejerio kolbą įpilama lygiai 25 mlskaidrinto sacharidų tirpalo Įdedamos dvi pemzos (313) granulės tirpalas šildomas ir maišomas laikant kolbąrankoje virš vidutinės atviros liepsnos kad tirpalas užvirtų maždaug per dvi minutes Erlenmejerio kolba iš kartostatoma ant asbestu padengto vielos tinklelio su maždaug 6 cm skersmens skyle po kuria dega liepsna Liepsnareguliuojama taip kad būtų šildomas tik Erlenmejerio kolbos dugnas Prie kūginės kolbos prijungiamasgrįžtamasis kondensatorius Virinama lygiai dešimt minučių Iš karto po to kolba atvėsinama šaltame vandenyjeir maždaug po penkių minučių titruojama taip


įpilama 10 ml kalio jodido tirpalo (312) ir tuojau pat (atsargiai nes gali stipriai putoti) įpilama 25 ml sierosrūgšties tirpalo (311) Titruojama natrio tiosulfato tirpalu (39) tol kol spalva tampa vos gelsva įpilamakrakmolo tirpalo (310) indikatoriaus ir baigiama titruoti

Toks pats titravimas tik nevirinant atliekamas su tiksliai 25 ml Luff-Schoorl reagento (38) ir 25 ml vandensmišiniu įpilant 10 ml kalio jodido tirpalo (312) ir 25 ml sieros rūgšties tirpalo (311)


Pagal pridedamą lentelę nustatomas laktozės kiekis mg kuris atitinka dviejų titravimų rezultatų skirtumąišreiškiamą 01 moll natrio tiosulfato tirpalo ml Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais

7 Specialiosios procedūros

71 Pašarų turinčių daug melasos ir kitų nelabai vienalyčių pašarų atveju pasveriama 20 g pašarų ir su 500 mlvandens jie supilami į 1 l matavimo kolbą Maišikliu maišoma vieną valandą Skaidrinama naudojant CarrezI (32) ir II (33) tirpalus kaip aprašyta 51 punkte tačiau naudojant keturiskart didesnius reagentų kiekiusSkiedžiama iki žymės 80 (VV) etanoliu

Sumaišoma ir filtruojama Etanolis pašalinamas kaip aprašyta 51 punkte Jei ėminyje nėra dekstrinizuotokrakmolo skiedžiama iki žymės vandeniu

72 Melasos ir pašarinių žaliavų kuriuose yra daug cukraus ir beveik nėra krakmolo (ceratonia siliqua vaisiai džiovintirunkelių griežiniai ir pan) atveju 5 g ėminio sudedama į 250 ml matavimo kolbą įpilama 200 ml distiliuotovandens ir valandą maišoma maišikliu prireikus ir ilgiau Skaidrinama naudojant Carrez I (32) ir II (33) tirpaluskaip aprašyta 51 punkte Skiedžiama iki žymės šaltu vandeniu sumaišoma ir filtruojama Norint nustatytisuminį sacharidų daroma kaip aprašyta 53 punkte

8 Pastabos

81 Siekiant išvengti putojimo prieš virinant su Luff-Schoorl reagentu įpilama (nepaisant tūrio) apie 1 ml3-metilbutan-1-olio (314)

82 Suminio sacharidų po inversijos kiekio perskaičiuoto į gliukozės kiekį ir redukuojančiųjų sacharidų kiekioperskaičiuoto į gliukozės kiekį skirtumą padauginus iš 095 gaunamas sacharozės kiekis procentais

83 Norint nustatyti redukuojančiųjų sacharidų išskyrus laktozę kiekį galima taikyti du metodus

831 Skaičiuojant apytiksliai kitu analizės metodu nustatytas laktozės kiekis dauginamas iš 0675 ir gautas rezultatasatimamas iš redukuojančiųjų sacharidų kiekio

832 Redukuojančių sacharidų išskyrus laktozę kiekį skaičiuojant tiksliai tas pats ėminys turi būti naudojamas dviemgalutiniams nustatymams Viena analizė atliekama su alikvotine dalimi tirpalo gauto pagal 51 punktą kita ndash sualikvotine dalimi tirpalo gauto nustatant laktozę pagal šiam tikslui nustatytą metodą (atlikus kitų sacharidųfermentaciją ir skaidrinimą)

Abiem atvejais turimas sacharidų kiekis nustatomas Luff-Schoorl metodu ir perskaičiuojamas į gliukozės kiekįmiligramais Viena iš verčių atimama iš kitos ir skirtumas išreiškiamas ėminio masės procentais

Pavyzdys

Du kiekvienam nustatymui paimti tūriai atitinka 250 mg ėminį

Pirmuoju atveju sunaudota 17 ml natrio tiosulfato 01 moll tirpalo ir tai atitinka 442 mg gliukozės antruojuatveju sunaudota 11 ml ir tai atitinka 276 mg gliukozės

Skirtumas yra 166 mg gliukozės

Taigi redukuojančiųjų sacharidų (išskyrus laktozę) kiekis perskaičiuotas į gliukozės kiekį yra lygus

4 16610

= 664


Verčių lentelė naudojant 25 ml Luff-Schoorl reagento

Na2S2O3 01 moll tūris ml dviejų minučių trukmės šildymas dešimties minučių trukmės virimas

Na2S2O3

01 moll

Gliukozė fruktozė inver-tuoti sacharidai

C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll

ml mg skirtumas mg skirtumas mg skirtumas ml

1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223

K LAKTOZĖS NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti laktozės kiekį pašaruose kai jos yra daugiau nei 05

2 Metodas

Cukrūs ištirpinami vandenyje Tirpalas fermentuojamas pridedant mielių Saccharomyces cerevisiae kurios laktozėsneliečia Po skaidrinimo ir filtravimo laktozės kiekis filtrate nustatomas Luff-Schoorl metodu

3 Reagentai

31 Saccharomyces cerevisiae suspensija 25 g šviežių mielių maišoma su 100 ml vandens Šaldytuve suspensija galimalaikyti ne ilgiau kaip savaitę




Atsargiai maišant citrinų rūgšties tirpalas (342) supilamas į natrio karbonato tirpalą (343) Įpilamas variosulfato tirpalas (341) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro Paliekama nusistovėti per naktį ir tirpalas filtruojamasTikrinama gauto reagento koncentracija (Cu ndash 005 moll Na2CO3 ndash 1 moll) Tirpalo pH yra apie 94









39 Krakmolo tirpalas 5 g tirpaus krakmolo mišinys su 30 ml vandens supilamas į 1 litrą verdančio vandensVirinama tris minutes tirpalas atvėsinamas prireikus į jį kaip konservanto įdedama 10 mg gyvsidabrio (II)jodido

4 Aparatūra

Vandens vonia su šilumine rele nustatyta 38ndash40 oC

5 Procedūra

1 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į 100 ml matavimo kolbą Įpilama 25ndash30 ml vandens Kolba30 min laikoma verdančio vandens vonioje ir atvėsinama iki maždaug 35 oC temperatūros Įpilama apie 5 mlmielių suspensijos (31) ir sumaišoma Kolba laikoma dvi valandas vandens vonioje 38ndash40 oC temperatūrojeAtvėsinama iki maždaug 20 oC temperatūros

Įpilama 25 ml Carrez I tirpalo (32) ir 30 s maišoma tada įpilama 25 ml Carrez II tirpalo (33) ir vėl maišoma30 s Skiedžiama vandeniu iki 100 ml sumaišoma ir filtruojama Ne daugiau nei 25 ml šio tirpalo kuriameturėtų būti 40ndash80 mg laktozės pipete paimama į 300 ml Erlenmejerio kolbą Prireikus iki 25 ml skiedžiamavandeniu

Tokiu pačiu būdu atliekamas tuščiasis bandymas su 5 ml mielių suspensijos (31) Laktozės kiekis Luff-Schoorlmetodu nustatomas taip įpilama lygiai 25 ml Luff-Schoorl reagento (34) ir įdedamos dvi pemzos (35) granulėsTirpalas maišomas laikant kolbą rankoje ir tuo pat metu šildant virš vidutinės atviros liepsnos kad tirpalasužvirtų maždaug per dvi minutes Erlenmejerio kolba iš karto statoma ant asbestu padengto vielos tinklelio sumaždaug 6 cm skersmens skyle po kuria dega liepsna Liepsna reguliuojama taip kad būtų šildomas tik kūginėskolbos dugnas Prie Erlenmejerio kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius Virinama lygiai dešimt minu-čių Iš karto po to kolba atvėsinama šaltame vandenyje ir maždaug po penkių minučių titruojama taip

įpilama 10 ml kalio jodido tirpalo (36) ir tuojau pat (atsargiai nes gali stipriai putoti) įpilama 25 ml sierosrūgšties tirpalo (37) Titruojama natrio tiosulfato tirpalu (38) tol kol spalva tampa vos gelsva įpilama krakmolotirpalo (39) indikatoriaus ir baigiama titruoti



Pagal pridedamą lentelę nustatomas laktozės kiekis mg kuris atitinka dviejų titravimų rezultatų skirtumąišreiškiamą 01 moll natrio tiosulfato tirpalo ml

Rezultatas pateikiamas kaip bevandenės laktozės kiekis išreikštas ėminio masės procentais

7 Pastaba

Jei produktai turi daugiau nei 40 fermentuojamo sacharido naudojama daugiau nei 5 ml mielių suspensijos




Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223

L KRAKMOLO NUSTATYMAS

POLIARIMETRINIS METODAS


Šiuo metodu galima nustatyti krakmolo ir didelės molekulinės masės krakmolo skilimo produktų kiekįpašaruose siekiant patikrinti atitiktį nurodomai energinei vertei (VII priedo nuostatoms) ir Tarybos direktyvai 9625EB (1)

2 Metodas

Metodas susideda iš dviejų nustatymų Nustatant pirmuoju būdu ėminys veikiamas praskiesta vandeniliochlorido rūgštimi Po tirpalo skaidrinimo ir filtravimo poliarimetriškai matuojamas per jį praeinančiospoliarizuotos šviesos plokštumos sukimas

Analizuojant antruoju būdu ėminys ekstrahuojamas 40 etanoliu Filtratas rūgštinamas vandenilio chloridorūgštimi skaidrinamas filtruojamas ir matuojamas per jį praeinančios poliarizuotos šviesos plokštumos sukimaskaip tai buvo daroma pirmuoju būdu

Dviejų matavimų skirtumas padaugintas iš žinomo faktoriaus atitinka krakmolo kiekį ėminyje

3 Reagentai

31 Vandenilio chlorido rūgštis 25 (mm) tirpalas tankis 1126 gml


(1) OL L 125 1996 5 23 p 35

32 Vandenilio chlorido rūgštis 113 (mV) tirpalas

Koncentracija turi būti patikrinta titruojant 01 moll natrio hidroksido tirpalu įlašinus metilraudonojo 01 (mV) tirpalo 94 (VV) etanolyje Reikia 3094 ml 01 moll NaOH norint neutralizuoti 10 ml



35 Etanolis 40 (VV) tirpalas tankis 0948 gml 20 oC temperatūroje

4 Aparatūra

41 250 ml Erlenmejerio kolba su tipine šlifo jungtimi ir grįžtamasis kondensatorius

42 Poliarimetras arba sacharimetras

5 Procedūra


Ėminys susmulkinamas taip kad jį visą būtų galima persijoti per sietą su 05 mm apvaliomis akutėmis

52 Suminio poliarizuotos šviesos plokštumos sukimo (P ir S) nustatymas (žr 71 pastabą)

1 mg tikslumu pasveriama 25 g sumalto ėminio kuris supilamas į 100 ml matavimo kolbą Įpilama 25 mlvandenilio chlorido rūgšties tirpalo (32) kratoma kad ėminys tolygiai pasiskirstytų ir dar įpilama 25 mlvandenilio chlorido rūgšties tirpalo (32) Kolba panardinama į verdančio vandens vonią pirmąsias tris minutesstipriai ir visą laiką kratoma kad nesusidarytų aglomeratų Vandens vonioje turi būti pakankamai daug kadpanardinus į ją matavimo kolbą jis nenustotų viręs Kratomos kolbos negalima išimti iš vonios Lygiai po 15 minkolba išimama iš vonios įpilama 30 ml šalto vandens ir iš karto atvėsinama iki 20 oC

Įpilama 5 ml Carrez I tirpalo (33) ir kratoma 30 s Įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (34) ir vėl kratoma maždaug30 s Skiedžiama iki žymės vandeniu sumaišoma ir filtruojama Jei filtratas nėra visiškai skaidrus (tai pasitaikoretai) nustatymas kartojamas naudojant daugiau Carrez I ir II tirpalų pvz 10 ml

200 mm ilgio vamzdyje poliarimetru arba sacharimetru matuojama kokiu kampu tirpalas suka poliarizuotosšviesos plokštumą

53 Medžiagų tirpstančių 40 etanolyje poliarizuotos šviesos plokštumos sukimo (Pprime ir Sprime) nustatymas

1 mg tikslumu pasveriama 5 g ėminio ėminys supilamas į 100 ml matavimo kolbą ir įpilama apie 80 mletanolio (35) (žr 72 pastabą) Kolba laikoma vieną valandą kambario temperatūroje per tą laiką šešis kartuskolba stipriai kratoma kad ėminys gerai susimaišytų su etanoliu Skiedžiama iki žymės etanoliu (35) sumaišomair filtruojama

50 ml filtrato (atitinka 25 g ėminio) įpilama į 250 ml Erlenmejerio kolbą įpilama 21 ml vandenilio chloridorūgšties (31) ir stipriai kratoma Prie Erlenmejerio kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius kolbapanardinama į verdančio vandens vonią Lygiai po 15 min Erlenmejerio kolba išimama iš vonios jos turinyssupilamas į 100 ml matavimo kolbą plaunant Erlenmejerio kolbą trupučiu šalto vandens ir atvėsinama iki20 oC

Skaidrinama naudojant Carrez I (33) ir II (34) tirpalus skiedžiama iki žymės vandeniu sumaišoma filtruojamair matuojamas poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas kaip nurodyta 52 punkto 2ndashoje ir 3ndashoje pastraipoje


Krakmolo kiekis () ėminyje apskaičiuojamas taip

61 Matavimas poliarimetru

Krakmolo kiekis ethTHORN =2 000 P minus P0eth THORN

αfrac12 20degD

P = suminis poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas laipsniais


P = 40 etanolyje tirpių medžiagų tirpalo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas laipsniais

αfrac12 20degD= savitasis gryno krakmolo tirpalo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas Visuotinai priimtos

skaitmeninės šio faktoriaus vertės yra šios

+ 1859o ryžių krakmolo+ 1857o bulvių krakmolo+ 1846o kukurūzų krakmolo+ 1827o kviečių krakmolo+ 1815o miežių krakmolo+ 1813o avižų krakmolo+ 1840o kitų rūšių krakmolo taip pat krakmolo mišinių kombinuotuose pašaruose

62 Matavimas sacharimetru

Krakmolo kiekis ethTHORN =2 000

αfrac12 20degD

2 N 0665eth THORN S minus S0eth THORN100

minus266 N S minus S0eth THORN

αfrac12 20degD

S = suminis poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas sacharimetro laipsniais

S = 40 (vv) etanolyje tirpių medžiagų tirpalo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas sacharimetrolaipsniais

N = sacharozės masė g100 ml vandens kai 200 mm ilgio vamzdyje poliarizuotos šviesos plokštuma pasukama100o sacharimetro laipsnių1629 g prancūziškų sacharimetrų2600 g vokiškų sacharimetrų2000 g kitų sacharimetrų

αfrac12 20degD savitasis gryno krakmolo poliarizuotos šviesos plokštumos sukimas (žr 61 punktą)

63 Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių tam pačiam ėminiui atliktų nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei04 absoliučiąja verte kai krakmolo yra mažiau nei 40 ir 1 santykine verte kai krakmolo yra 40 arbadaugiau

7 Pastabos

71 Jei ėminyje yra daugiau nei 6 karbonatų skaičiuojamų kaip kalcio karbonatas jie prieš suminio poliarizuotosšviesos plokštumos sukimo matavimą turi būti suardomi įpilant lygiai tiek kiek reikia praskiestos sieros rūgšties

72 Jei produkte yra daug laktozės pvz pieno miltelių serume ar nugriebto pieno milteliuose įpylus 80 ml etanolio(35) daroma taip prie kolbos prijungiamas grįžtamasis kondensatorius ir kolba 30 min panardinama į vandensvonią 50 oC temperatūroje Kolba paliekama atvėsti ir analizė tęsiama kaip nurodyta 53 punkte

73 Yra žinoma kad šios medžiagos kai jų pašaruose yra didelis kiekis sukelia trukdžius nustatant krakmolo kiekįpoliarimetriniu metodu todėl gali būti gauti netikslūs rezultatai

mdash (cukrinių) runkelių produktai pvz (cukrinių) runkelių išspaudos (cukrinių) runkelių melasa (cukrinių)runkelių išspaudos su melasa (cukrinių) runkelių žlaugtai (runkelių) cukrus

mdash citrusų vaisių minkštimas

mdash linų sėmenys linų sėmenų išspaudos ekstrahuoti linų sėmenys

mdash rapso sėklos rapso sėklų išspaudos ekstrahuotos rapso sėklos rapso sėklų lukštai

mdash saulėgrąžų sėklos ekstrahuotos saulėgrąžų sėklos ekstrahuotos iš dalies išlukštentos saulėgrąžų sėklos

mdash kopros išspaudos ekstrahuota kopra

mdash bulvių masė

mdash dehidratuotos mielės


mdash produktai turintys daug inulino (pvz topinambų trupiniai ir miltai)

mdash spirgučiai

M ŽALIŲ PELENŲ KIEKIO NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti žalių pelenų kiekį pašaruose

2 Metodas

Ėminys sudeginamas 550 oC temperatūroje likutis pasveriamas

3 Reagentai

Amonio nitrato tirpalas 20 (mV)

4 Aparatūra

41 Kaitlentė

42 Elektrinė mufelinė krosnis su šilumine rele

43 Kvarciniai porcelianiniai arba platininiai tigliai ėminiui sudeginti stačiakampiai (maždaug 60 times 40 times 25 mm)arba apvalieji (skersmuo 60ndash75 mm aukštis 20ndash40 mm)

5 Procedūra

Maždaug 5 g ėminio (25 g tuo atveju kai analizuojami linkę išsipūsti produktai) pasveriama 1 mg tikslumu irsupilama į ėminiui sudeginti skirtą tiglį kuris pats prieš tai buvo iškaitintas 550 oC temperatūroje atvėsintas irpasvertas Tiglis statomas ant kaitlentės ir iš lėto kaitinamas tol kol medžiaga suanglėja Iškaitinama pagal 51arba 52

51 Tiglis dedamas į reguliuojamos temperatūros mufelinę krosnį nustatytą 550 oC Medžiaga laikoma tojetemperatūroje kol virsta baltais šviesiai pilkais ar rausvais pelenais kuriuose greičiausiai nebeliko anglingųjųdalelių Tiglis dedamas į eksikatorių atvėsti ir iš karto sveriamas

52 Tiglis dedamas į reguliuojamos temperatūros mufelinę krosnį nustatytą 550 oC Kaitinama 3 h Tiglis dedamasį eksikatorių atvėsti ir iš karto sveriamas Kaitinama dar 30 min siekiant užtikrinti kad pelenų masė nekinta(masės skirtumas tarp dviejų nuoseklių svėrimų turi būti mažesnis arba lygus 1 mg)


Likučio masė apskaičiuojama atimant tiglio masę


7 Pastabos

71 Medžiagų kurias sunku paversti pelenais pelenai iš pradžių turi būti kaitinami ne trumpiau kaip tris valandasatvėsinami ir į juos įlašinami keli lašai 20 amonio nitrato tirpalo arba vandens (lašinama atsargiai kad pelenaineišsisklaidytų arba nesušoktų į gabalus) Išdžiovinus toliau kaitinama krosnyje Prireikus veiksmas kartojamastol kol medžiaga visiškai virsta pelenais

72 Jei medžiagos atsparios apdorojimui aprašytam 71 punkte daroma taip po trijų valandų kaitinimo pelenaisupilami į šiltą vandenį ir filtruojami per mažą bepelenį filtrą Filtras su turiniu sudeginamas prieš tai naudotametiglyje Į atvėsintą tiglį supilamas filtratas tirpalas išgarinamas iki sauso likučio likutis iškaitinamas irpasveriamas


73 Analizuojant aliejus ir riebalus tinkamo dydžio tiglyje tiksliai pasveriamas 25 g ėminys Ėminys anglinamaspadegant jį bepelenio filtravimo popieriaus juostele Sudeginus likutis sudrėkinamas kiek įmanoma mažesniukiekiu vandens Likutis džiovinamas ir iškaitinamas kaip aprašyta 5 skyriuje

N VANDENILIO CHLORIDO RŪGŠTYJE NETIRPIŲ PELENŲ KIEKIO NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti neorganinių medžiagų kurios netirpsta vandenilio chlorido rūgštyje kiekįpašaruose Atsižvelgiant į bandinio tipą galima taikyti du metodus

11 A metodas Taikomas organiniams pašarams ir didesnei daliai kombinuotųjų pašarų

12 B metodas Taikomas neorganiniams junginiams ir mišiniams taip pat kombinuotiesiems pašarams kuriuoseA metodu nustatytas vandenilio chlorido rūgštyje netirpių medžiagų kiekis yra didesnis nei 1

2 Metodas

21 A metodas Ėminys paverčiamas pelenais pelenai virinami vandenilio chlorido rūgštyje neištirpusi dalisfiltruojama ir sveriama

22 B metodas Ėminys apdorojamas vandenilio chlorido rūgštimi Tirpalas filtruojamas likutis paverčiamas pelenaiskurie apdorojami pagal A metodą

3 Reagentai

31 Vandenilio chlorido rūgštis 3 moll

32 Trichloracto rūgštis 20 (mV) tirpalas


4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra

51 A metodas

Ėminys sudeginamas taip pat kaip nustatant žalių pelenų kiekį Galima panaudoti pelenus gautus atliekant šiąanalizę

Pelenai supilami į 250ndash400 ml cheminę stiklinę naudojant 75 ml vandenilio chlorido rūgšties (31) Mišinys lėtaiužvirinamas ir atsargiai virinamas penkiolika minučių Šiltas tirpalas filtruojamas per bepelenį filtrą ir likutisplaunamas šiltu vandeniu tol kol plovimo vanduo nerodo rūgščios reakcijos Filtras su likučiu džiovinamas irpasvertame tiglyje sudeginamas ne žemesnėje nei 550 oC bet ne aukštesnėje nei 700 oC temperatūroje Tiglisatvėsinamas eksikatoriuje ir pasveriamas

52 B metodas

5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir supilama į 250ndash400 ml cheminę stiklinę Įpilama 25 ml vandens ir25 ml vandenilio chlorido rūgšties (31) sumaišoma ir palaukiama dujų skyrimosi pabaigos Įpilama dar 50 mlvandenilio chlorido rūgšties (31) Palaukiama dar galimo dujų skyrimosi pabaigos stiklinė statoma į verdančiovandens vonią ir laikoma joje trisdešimt minučių prireikus ir ilgiau kad visiškai būtų hidrolizuotas krakmolas


kurio galėjo būti ėminyje Šiltas tirpalas filtruojamas per bepelenį filtrą likutis plaunamas 50 ml šilto vandens(žr 7 pastabą) Filtras su likučiu dedamas į tiglį ėminiui sudeginti džiovinamas ir sudeginamas ne žemesnėje nei550 oC bet ne aukštesnėje nei 700 oC temperatūroje Pelenai supilami į 250ndash400 ml cheminę stiklinę naudojant75 ml vandenilio chlorido rūgšties (31) tęsiama kaip nurodyta antroje 51 punkto pastraipoje


Likučio masė apskaičiuojama atimant tiglio masę Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais

7 Pastaba

Jei ėminys sunkiai filtruojamas analizė atliekama iš naujo 50 ml vandenilio chlorido rūgšties (31) pakeičiant50 ml 20 trichloracto rūgšties (32) ir plaunant filtrą šiltu 1 trichloracto rūgšties tirpalu (33)

O KARBONATŲ NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose karbonatų kiekį kuris paprastai išreiškiamas kalcio karbonato kiekiu

Tačiau tam tikrais atvejais (pvz naudojant geležies karbonatą) būtina taikyti specialųjį metodą

2 Metodas

Karbonatai skaidomi vandenilio chlorido rūgštimi išsiskyręs anglies dioksidas surenkamas į matavimo biuretę irjo tūris palyginamas su tūriu kuris tomis pačiomis sąlygomis susidaro iš žinomo kalcio karbonato kiekio

3 Reagentai

31 Vandenilio chlorido rūgštis tankis 110 gml

32 Kalcio karbonatas

33 Sieros rūgštis maždaug 005 moll nudažyta metilraudonuoju

4 Aparatūra

Scheibler-Dietrich aparatas (žr piešinį) ar panašus aparatas

5 Procedūra

Atsižvelgiant į karbonatų kiekį ėminyje sveriamas toks ėminio kiekis

mdash 05 g produktų kuriuose karbonatai išreikšti kalcio karbonato kiekiu sudaro nuo 50 iki 100


mdash 2ndash3 g kitų produktų

Ėminys supilamas į specialų aparato butelį (4) į kurį įstatytas iš nedūžtančios medžiagos pagamintas mažasmėgintuvėlis su 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (31) ir butelis prijungiamas prie aparato Trišakis čiaupas (5)pasukamas taip kad vamzdis (1) susijungtų su atmosfera Kilnojamu vamzdžiu (2) kuris yra pripildytasnudažytos sieros rūgšties (33) ir prijungtas prie matavimo biuretės (1) skysčio lygis nustatomas ties nulio padalaČiaupas (5) pasukamas taip kad biuretė (1) ir vamzdis (3) būtų sujungti ir patikrinama ar skysčio lygis yra tiesnulio padala


Vandenilio chlorido rūgštis (31) palenkiant butelį (4) po truputį supilama ant ėminio Slėgis išlyginamasnuleidžiant vamzdį (2) Butelis (4) kratomas tol kol anglies dioksidas nustoja skirtis

Grąžinamas pradinis slėgis sulyginant skysčio lygį biuretėje (1) ir vamzdyje (2) Po kelių minučių jei dujų tūrisdaugiau nekinta rodmuo užrašomas

Tomis pačiomis sąlygomis atliekamas kontrolinis bandymas su 05 g kalcio karbonato (32)


Karbonatų išreikštų kalcio karbonatu kiekis apskaičiuojamas pagal formulę

X =V 100V1 2m

kurioje

X = karbonatų išreikštų kalcio karbonatu procentinis kiekis ėminyje (ww)V = CO2 tūris kuris susidaro iš ėminio mlV1 = CO2 tūris kuris susidaro iš 05 g CaCO3 mlm = ėminio tiriamosios dalies masė gramais

7 Pastabos

71 Jei ėminio masė didesnė nei 2 g iš pradžių į butelį (4) įpilama 15 ml distiliuoto vandens ir prieš bandymo pradžiąsumaišoma Toks pats vandens tūris naudojamas atliekant kontrolinį bandymą

72 Jei naudojamas aparatas turi kitokį tūrį nei Scheibler-Dietrich aparato tūris sveriamo ėminio masė ir kontrolinioėminio masė bei rezultatų apskaičiavimas turi būti atitinkamai pakeisti



P SUMINIO FOSFORO KIEKIO NUSTATYMAS

FOTOMETRINIS METODAS


Šiuo metodu galima nustatyti suminio fosforo kiekį pašaruose Jis labiausiai tinka analizuoti produktus kuriuosenedaug fosforo Kai kuriais atvejais (kai produkte daug fosforo) galima taikyti gravimetrinį metodą

2 Metodas

Ėminys mineralizuojamas sausuoju deginimu (organinių pašarų) arba skaidant rūgštyje (mineralinių junginių irskystųjų pašarų) ir ir įdedamas į rūgšties tirpalą Tirpalas veikiamas molibdovanadato reagentu Taip susidariusiogeltono tirpalo optinis tankis matuojamas spektrofotometru esant 430 nm bangos ilgiui

3 Reagentai


32 Vandenilio chlorido rūgštis ρ20 = 110 gml (maždaug 6 moll)

33 Azoto rūgštis ρ20 = 1045 gml

34 Azoto rūgštis ρ20 = 138ndash142 gml


36 Molibdovanadato reagentas 1 litro matavimo kolboje sumaišoma 200 ml amonio heptamolibdato tirpalo(361) 200 ml amonio monovanadato tirpalo (362) ir 134 ml azoto rūgšties (34) Skiedžiama vandeniu ikižymės

361 Amonio heptamolibdato tirpalas karštame vandenyje ištirpinama 100 g amonio heptamolibdato tetrahidrato(NH4)6Mo7O244H2O Įpilama 10 ml amoniako (tankis 091 kgl) ir skiedžiama vandeniu iki 1 l

362 Amonio monovanadato tirpalas 235 g amonio monovanadato NH4VO3 ištirpinama 400 ml karšto vandensNuolat maišant lėtai įpilama 20 ml praskiestos azoto rūgšties (7 ml HNO3 (34) ir 13 ml H2O) ir skiedžiamavandeniu iki 1 l

37 Etaloninis fosforo tirpalas 1 mgml ištirpinkite 4387 g kalio dihidrofosfato KH2PO4 vandenyje Skiedžiamavandeniu iki 1 l

4 Aparatūra

41 Kvarciniai porcelianiniai arba platininiai tigliai ėminiui sudeginti

42 Elektrinė mufelinė krosnis su šilumine rele nustatyta 550 oC temperatūrai

43 250 ml Kjeldalio kolba

44 Matavimo kolbos ir tikslios pipetės


46 Maždaug 16 mm skersmens mėgintuvėliai su 145 mm skersmens kamščiais talpa 25ndash30 ml

5 Procedūra

51 Tirpalo ruošimas

Atsižvelgiant į ėminio tipą ruošiamas tirpalas kaip nurodyta 511 arba 512


511 Įp r a s t i n ė p r o c e dū r a

Pasveriama 1 g arba daugiau ėminio 1 mg tikslumu Ėminys dedamas į Kjeldalio kolbą įpilama 20 ml sierosrūgšties (35) kolba kratoma kad medžiaga visiškai susimaišytų su rūgštimi ir nepriliptų ant kolbos sieneliųpakaitinama iki virimo ir virinama 10 min Kolba paliekama šiek tiek atvėsti įpilama 2 ml azoto rūgšties (34)nestipriai pakaitinama šiek tiek atvėsinama įpilamas dar nedidelis kiekis azoto rūgšties (34) ir vėl užvirinamaProcedūra kartojama tol kol gaunamas bespalvis tirpalas Atvėsinama įpilama truputį vandens skystis supilamasį 500 ml matavimo kolbą Kjeldalio kolbą plaunant karštu vandeniu Paliekama atvėsti skiedžiama vandeniu ikižymės sumaišoma ir filtruojama

512 Ėmin i a i k u r i u o s e y r a o r g a n i n ių med ž i a gų i r n ė r a k a l c i o i r m a g n i o d i h i d r o f o s f a tų

Deginimo tiglyje pasveriama 1 mg tikslumu maždaug 25 g ėminio Ėminys labai gerai sumaišomas su 1 g kalciokarbonato (31) Deginama krosnyje 550 oC temperatūroje tol kol gaunami balti ar pilki pelenai (nedidelis angliųkiekis netrukdo) Pelenai supilami į 250 ml cheminę stiklinę Įpilama 20 ml vandens ir vandenilio chloridorūgšties (32) tol kol nustoja skirtis burbuliukai Įpilama dar 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (32) Stiklinėstatoma ant smėlio vonios ir skystis garinamas iki sauso likučio netirpiam silicio dioksidui gauti Likutisištirpinamas 10 ml azoto rūgšties (33) ir tirpalas virinamas ant smėlio vonios arba kaitlentės 5 min neišgarinantiki sauso likučio Skystis supilamas į 500 ml matavimo kolbą keletą kartų stiklinę plaunant karštu vandeniuKolba paliekama atvėsti skiedžiama vandeniu iki žymės sumaišoma ir filtruojama

52 Spalvos gavimas ir optinio tankio matavimas

Pagal 511 arba 512 gauto filtrato alikvotinė dalis skiedžiama taip kad gauta fosforo koncentracija būtų nedidesnė nei 40 μgml Į mėgintuvėlį (46) įpilama 10 ml šio tirpalo ir 10 ml molibdovanadato reagento (36)Sumaišoma ir tirpalas paliekamas stovėti bent 10 min 20 oC temperatūroje Spektrofotometru matuojamasoptinis tankis esant 430 nm bangos ilgiui ir palyginamuoju tirpalu naudojant tirpalą gautą įpilant 10 mlmolibdovanadato reagento (36) į 10 ml vandens


Iš etaloninio tirpalo (37) ruošiami tirpalai kurių fosforo koncentracija 5 μgml 10 μgml 20 μgml 30 μgml ir40 μgml Paimama po 10 ml kiekvieno iš šių tirpalų ir į juos įpilama po 10 ml molibdovanadato reagento (36)Tirpalai sumaišomi ir paliekami stovėti bent 10 min 20 oC temperatūroje Matuojamas optinis tankis kaipnurodyta 52 Brėžiama kalibravimo kreivė kurios ordinatė ndash optinis tankis abscisė ndash fosforo koncentracijaKoncentracijos verčių intervale nuo 0 μgml iki 40 μgml kreivės dalis yra tiesinė


Fosforo kiekis tiriamajame ėminyje nustatomas pagal kalibravimo kreivę


Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio bandymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei

mdash 3 didžiausiojo rezultato vertės kai fosforo kiekis mažesnis nei 5

mdash 015 absoliučiąja verte kai fosforo kiekis 5 arba didesnis

Q CHLORIDŲ CHLORO NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti vandenyje tirpių chloridų chloro kiekį paprastai išreiškiamą natrio chlorido kiekiuMetodas tinka visiems pašarams

2 Metodas

Chloridai ištirpinami vandenyje Jei produkte yra organinių medžiagų jis skaidrinamas Tirpalas šiek tiekparūgštinamas azoto rūgštimi ir chloridai nusodinami sidabro chlorido pavidalu veikiant sidabro nitrato tirpaluSidabro perteklius yra titruojamas amonio tiocianatu pagal Volhardo metodą


3 Reagentai

31 Amonio tiocianato tirpalas 01 moll

32 Sidabro nitrato tirpalas 01 moll

33 Sotusis amonio-geležies (III) sulfato (NH4)Fe(SO4)2 tirpalas

34 Azoto rūgštis tankis 138 gml

35 Dietileteris

36 Acetonas

37 Carrez I tirpalas vandenyje ištirpinama 219 g cinko acetato Zn(CH3COO)2 2H2O ir 3 g ledinės acto rūgštiesSkiedžiama vandeniu iki 100 ml


39 Aktyvintosios anglys neturinčios chloridų ir jų neabsorbuojančios

4 Aparatūra


5 Procedūra


Atsižvelgiant į ėminio pobūdį tirpalas ruošiamas pagal 511 512 arba 513 punktą

Kartu atliekamas tuščiasis bandymas nededant analizuojamo ėminio

511 O r g a n i n ių med ž i a gų n e t u r i n t y s ėmin i a i

1 mg tikslumu pasveriama ne daugiau nei 10 g ėminio kuriame chloro chloridų pavidalu būtų ne daugiau nei3 g 500 ml matavimo kolboje ėminys ištirpinamas 400 ml vandens kurio temperatūra maždaug 20 oCTrisdešimt minučių tirpalas maišomas maišymo būgne praskiedžiamas iki žymės sumaišomas ir filtruojamas

512 O r g a n i n ių med ž i a gų t u r i n t y s ėmin i a i i š s k y r u s 5 1 3 p un k t e i š v a r d y t u s p r o d u k t u s

1 mg tikslumu pasveriama ne daugiau nei 5 g ėminio kuris kartu su 1 g aktyvintųjų anglių supilamas į 500 mlmatavimo kolbą Įpilama 400 ml vandens kurio temperatūra apie 20 oC ir 5 ml Carrez I tirpalo (37) maišoma30 s įpilama 5 ml Carrez II tirpalo (38) Maišymo būgne maišoma trisdešimt minučių skiedžiama iki žymėssumaišoma ir filtruojama

513 V i r t i p a š a r a i l i nų s ėmenų i š s p a u d o s i r m i l t a i p r o d u k t a i k u r i u o s e d a u g l i nųs ėmenų mi l tų i r k i t i p r o d u k t a i k u r i u o s e d a u g g l i t ė s ių a r ko l o i d i n ių med ž i a gų( p v z d e k s t r i n u o t a s k r a kmo l a s )

Tirpalas ruošiamas taip kaip aprašyta 512 punkte bet nefiltruojamas Skystis nupilamas nuo nuosėdų(prireikus centrifuguojamas) 100 ml skysčio įpilama į 200 ml matavimo kolbą Skystis maišomas su acetonu(36) šiuo tirpikliu skiedžiamas iki žymės tirpalas sumaišomas ir filtruojamas

52 Titravimas

Pipete į Erlenmejerio kolbą paimama 25ndash100 ml (pagal numatomą chlorido kiekį) tirpalo paruošto pagal 511512 ar 513 punktus Paimtoje alikvotinėje tirpalo dalyje turi būti ne daugiau nei 150 mg chloro (Cl) Prireikustirpalas skiedžiamas ne mažiau nei 50 ml vandens įpilama 5 ml azoto rūgšties (34) 20 ml sočiojo amonio-geležies (III) sulfato tirpalo (33) ir du lašai amonio tiocianato tirpalo (31) lašinamo iš biuretės pripildytos ikinulinės žymės Iš biuretės įpilama tiek sidabro nitrato tirpalo (32) kad susidarytų 5 ml perteklius Įpilama 5 mldietileterio (35) ir stipriai purtoma kad nuosėdos koaguliuotų Sidabro nitrato perteklius titruojamas amoniotiocianato tirpalu (31) tol kol atsiradusi raudonai ruda spalva neišnyksta per vieną minutę



Chloro kiekis išreikštas natrio chlorido kiekio (X) apskaičiuojamas pagal tokią formulę

X =5845 V1 minusV2eth THORN

m

čia

V1 = įpilto 01 moll sidabro nitrato tirpalo tūris mlV2 = analizei suvartoto 01 moll amonio tiocianato tirpalo tūris mlm = ėminio svoris

Jei tuščiasis bandymas rodo kad 01 moll sidabro nitrato tirpalo buvo sunaudota šis tūris atimamas iš tūrio (V1ndash V2)

7 Pastabos

71 Titravimą taip pat galima atlikti potenciometriškai

72 Tuo atveju jei produktuose yra daug aliejų ir riebalų iš pradžių dietileteriu ar petroleteriu pašalinami riebalai

73 Analizuojant žuvų miltus chloridus galima titruoti Mohro metodu


IV PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI LEIDŽIAMŲ PAŠARŲ PRIEDŲ KONCENTRACIJAI KONTROLIUOTI

A A VITAMINO NUSTATYMAS


Šis metodas taikomas A vitaminui A (retinoliui) pašaruose ir premiksuose nustatyti A vitaminą sudaro visų-trans-(padėčių)-retinolis ir jo cis-izomerai kurie yra nustatomi šiuo metodu A vitamino kiekis yra išreiškiamastarptautiniais vienetais (IU) vienam kg Vienas IU atitinka 0300 μg visų-trans-(padėčių)-vitamino A ar 0344 μgvisų-trans-(padėčių)-vitamino A acetato arba 0550 μg visų-trans-(padėčių)-vitamino A palmitato aktyvumą

Kiekybinio nustatymo riba ndash 2 000 IU A vitaminokg

2 Metodas

Ėminys hidrolizuojamas šarminiu kalio hidroksido tirpalu ir A vitaminas ekstrahuojamas petroleteriu Tirpiklisišgarinamas likutis ištirpinamas metanolyje ir jei reikia skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos A vitaminokiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (RP-HPLC) metodu naudojantultravioletinį arba fluorescencinį detektorių Chromatografavimo parametrai pasirenkami taip kad neatsiskiriavisų-trans-(padėčių)-vitamino A alkoholis ir jo cis-izomerai

3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96

32 Petroleteris virimo temperatūros intervalas 40 oCndash60 oC

33 Metanolis

34 Kalio hidroksido tirpalas c = 50 g100 ml

35 Natrio askorbato tirpalas c = 10 g100 ml (žr 77 pastabas)

36 Natrio sulfidas Na2S xH2O (x = 7ndash9)

361 Natrio sulfido tirpalas glicerolyje c = 05 moll szlig = 120 gl (kai x = 9) (žr 78 pastabas)

37 Fenolftaleino tirpalas etanolyje (31) c = 2 g100 ml

38 2-propanolis

39 HPLC judančioji fazė metanolio (33) ir vandens mišinys pvz 980 + 20 (V + V) Tikslus santykis nustatomaspagal naudojamos kolonėlės charakteristikas

310 Azotas be deguonies

311 Visos-trans-vitamino A acetatas ypač grynas sertifikuoto aktyvumo pvz 280 times 106 IUg

3111 Visos-trans-vitamino A acetato pradinis tirpalas į 100 ml matavimo kolbą 01 mg tikslumu pasveriama 50 mgA vitamino acetato (311) Ištirpinama 2-propanolyje (38) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės Šio tirpalovardinė koncentracija yra lygi 1 400 IU A vitamino viename ml Tikslus kiekis turi būti nustatytas pagal 5631

312 Visos-trans-vitamino A palmitatas ypač grynas sertifikuoto aktyvumo pvz 180 times 10 6 IUg

3121 Visos-trans-vitamino A palmitato pradinis tirpalas į 100 ml matavimo kolbą 01 mg tikslumu pasveriama 80 mgA vitamino palmitato (312) Ištirpinama 2-propanolyje (38) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės Šiotirpalo vardinė koncentracija yra lygi 1 400 IU A vitamino viename ml Tikslus kiekis turi būti nustatytaspagal 5632


313 26-di-tret-butil-4-metilfenolis (BHT) (žr 75 pastabas)

4 Aparatūra

41 Vakuuminis sukamasis garintuvas

42 Rudo stiklo indai

421 plokščiadugnės arba kūginės kolbos 500 ml su šlifo mova

422 matavimo kolbos su šlifo kamščiais siaurakaklės 10 25 100 ir 500 ml

423 kūginiai dalijamieji piltuvai 1 000 ml su šlifo kamščiais

424 kriaušės formos kolbos 250 ml su šlifo mova

43 Allihn kondensatorius apvalkalo ilgis 300 mm su šlifo jungtimi su dujų tiekimo vamzdžio adapteriu

44 Gofruotasis filtravimo popierius fazėms atskirti skersmuo 185 mm (pvz Schleicher amp Schuell 597 HY 12)

45 HPLC įranga su įpurškimo sistema

451 Skysčių chromatografijos kolonėlė 250 mm times 4 mm C18 5 ar 10 μm įkrova ar lygiavertė kolonėlė (veikimokriterijus tik viena visų retinolio izomerų smailė HPLC sąlygomis)

452 Reguliuojamo bangos ilgio fluorescencinis arba ultravioletinis detektorius

46 Spektrofotometras ir 10 mm kvarco kiuvetės

47 Vandens vonia ir magnetinė maišyklė

48 Ekstrahavimo aparatas (žr 1 paveikslą) kurį sudaro

481 1 l talpos stiklinis cilindras su šlifo mova ir kamščiu

482 šlifo įmova su atšaka ir reguliuojamo ilgio vamzdžiu einančiu per centrą Reguliuojamo ilgio vamzdžio apatinisgalas yra U formos viršutinis ndash siaurėjančio antgalio formos kad cilindre esančio tirpalo viršutinis sluoksnisgalėtų būti supiltas į dalijamąjį piltuvą

5 Procedūra

Pastaba A vitaminas yra jautrus ultravioletinei spinduliuotei ir oksidavimui Visi veiksmai atliekami tamsoje(naudojami rudo stiklo indai arba aliuminio folija apvynioti indai) ir nesant deguonies (šalinamas azotosrove) Ekstrahuojant oras virš skysčio pakeičiamas azotu (vengiant per didelio slėgio kartkartėmis reikiaištraukti kamštį)


Ėminys sumalamas kad jį būtų galima sijoti per sietą su 1 mm dydžio akutėmis vengiant šilumos susidarymoTuri būti malama prieš pat svėrimą ir muilinimą kad nebūtų A vitamino nuostolių

52 Muilinimas

Atsižvelgiant į A vitamino kiekį 1 mg tikslumu pasveriama 2ndash25 g ėminio ėminys supilamas į plokščiadugnę arkūginę 500 ml tūrio kolbą (421) Maišant iš eilės įpilama 130 ml etanolio (31) maždaug 100 mg BHT (313)2 ml natrio askorbato tirpalo (35) ir 2 ml natrio sulfido tirpalo (36) Prie kolbos prijungiamas kondensatorius(43) ir kolba įmerkiama į vandens vonią su magnetine maišykle (47) Šildoma iki virimo ir verdama 5 min sugrįžtamuoju kondensatoriumi Tuomet per kondensatorių (43) įpilama 25 ml kalio hidroksido tirpalo (34) ir dar25 min verdama su grįžtamuoju kondensatoriumi maišant silpna azoto srove Kondensatorius plaunamasmaždaug 20 ml vandens ir kolbos turinys aušinamas iki kambario temperatūros


53 Ekstrahavimas

Muilinimo tirpalas dekantuojant kiekybiškai supilamas į 1 000 ml dalijamąjį piltuvą (423) ar į ekstrahavimoaparatą (48) iš viso plovimui sunaudojant 250 ml vandens Muilinimo kolba iš eilės plaunama 25 ml etanolio(31) ir 100 ml petroleterio (32) plovimo skysčiai supilami į dalijamąjį piltuvą ar į ekstrahavimo aparatąVandens ir etanolio santykis gautame bendrame tirpale turi būti apie 21 Stipriai purtoma 2 min ir 2 minpaliekama nusistovėti

531 E k s t r a h a v im a s n a u d o j a n t d a l i j am ą j į p i l t u v ą ( 4 2 3 )

Kai sluoksniai atsiskiria (žr 73 pastabą) petroleterio sluoksnis supilamas į kitą dalijamąjį piltuvą (423)Ekstrahavimas kartojamas du kartus su 100 ml petroleterio (32) ir du kartus su 50 ml petroleterio (32)

Dalijamajame piltuve sujungti ekstraktai du kartus plaunami 100 ml vandens švelniai sukant piltuvą (kadnesusidarytų emulsija) purtant piltuvą ekstraktai toliau plaunami 100 ml vandens porcijomis tol kol vandeninissluoksnis lieka bespalvis kai įpilama fenolftaleino tirpalo (37) (paprastai pakanka plauti keturis kartus) Išplautasekstraktas filtruojamas per sausą gofruotąjį filtrą fazėms atskirti (44) į 500 ml matavimo kolbą (422) kad būtųpašalintas visas suspenduotas vanduo Dalijamasis piltuvas ir filtras plaunami 50 ml petroleterio (32) skiedžiamapetroleteriu (32) iki žymės ir gerai sumaišoma

532 E k s t r a h a v im a s n a u d o j a n t e k s t r a h a v imo a p a r a t ą ( 4 8 )

Sluoksniams atsiskyrus (žr 73 pastabą) stiklinio cilindro (481) kamštis keičiamas šlifo įmova (482) irreguliuojamo vamzdžio apatinis U formos galas nustatomas taip kad jis būtų šiek tiek virš sluoksniųskiriamosios ribos Iš azoto tiekimo linijos per atšaką pučiant suslėgtąjį azotą viršutinis petroleterio sluoksnissupilamas į 1 000 ml dalijamąjį piltuvą (423) Į stiklinį cilindrą įpilama 100 ml petroleterio (32) cilindrasužkemšamas ir gerai supurtomas Sluoksniams leidžiama atsiskirti ir kaip pirmiau viršutinis sluoksnis supilamasį dalijamąjį piltuvą Ekstrahavimo procedūra kartojama dar kartą su 100 ml petroleterio (32) vėliau du kartus su50 ml petroleterio (32) ir petroleterio sluoksniai supilami į dalijamąjį piltuvą

Sujungti petroleterio ekstraktai plaunami kaip aprašyta 531 ir tęsiama kaip ten aprašyta

54 Ėminio tirpalo ruošimas HPLC analizei

Į 250 ml kriaušės formos kolbą (424) pipete paimama alikvotinė petroleterio tirpalo (531 ar 532) dalisSukamajame garintuve (41) esant sumažintam slėgiui tirpiklis išgarinamas beveik iki sauso likučio kai voniostemperatūra ne aukštesnė nei 40 oC Įleidžiant azoto (310) slėgis didinamas iki atmosferos slėgio kolbanuimama nuo sukamojo garintuvo Likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (310) ir likutis iš karto tirpinamasžinomame tūryje (10ndash100 ml) metanolio (33) (A vitamino koncentracija turi būti 5 IUmlndash30 IUml intervale)

55 Nustatymas HPLC metodu

A vitaminas atskiriamas C18 atvirkštinių fazių kolonėlėje (451) koncentracija matuojama naudojantultravioletinį detektorių (325 nm) arba fluorescencinį detektorių (sužadinimas 325 nm emisija 475 nm) (452)

Alikvotinė metanolinio tirpalo gauto pagal 54 dalį dalis (pvz 20 μl) įpurškiama ir plaunama judančiąja faze(39) Apskaičiuojamas kelių to paties ėminio įpurkštų tirpalų vidutinis smailių aukštis (plotas) ir kelių įpurkštųkalibravimo tirpalų (562) vidutiniai smailių aukščiai (plotai)

H P LC s ą l y g o s

Rekomenduojamos šios sąlygos galima taikyti kitas sąlygas jei gaunami lygiaverčiai rezultatai


250 mm times 4 mm C18 5 arba 10 μm įkrova arba lygiavertė

Judančioji fazė (39) metanolio (33) ir vandens mišinys pvz 980 + 20 (V + V)

Srautas 1ndash2 mlmin

Detektorius (452) ultravioletinis (325 nm) arba fluorescencinis detektorius(sužadinimas 325 nm emisija 475 nm)


56 Kalibravimas

561 D a r b i n ių e t a l o n i n ių t i r p a lų r u o š im a s

Į 500 ml plokščiadugnę ar kūginę kolbą (421) pipete paimama 20 ml A vitamino acetato pradinio tirpalo(3111) arba 20 ml A vitamino palmitato pradinio tirpalo (3121) ir hidrolizuojama kaip aprašyta 52 bet beBHT Vėliau ekstrahuojama petroleteriu (32) pagal 53 dalį ir skiedžiama petroleteriu (32) iki 500 ml 100 ml šioekstrakto sukamajame garintuve (žr 54) išgarinama beveik iki sauso likučio likęs tirpiklis pašalinamas azotosrove (310) ir likutis ištirpinamas 100 ml metanolio (33) Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 560 IUA vitamino viename ml Tikslus kiekis nustatomas pagal 5633 Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamasiš naujo prieš naudojimą

Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimama 20 ml šio darbinio etaloninio tirpalo skiedžiama iki žymės metanoliu(33) ir sumaišoma Šio praskiesto darbinio tirpalo vardinė koncentracija yra 56 IU A vitamino viename ml

562 K a l i b r a v imo t i r p a lų r u o š im a s i r k a l i b r a v imo k r e i v ė s g av im a s

Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilama 10 20 50 ir 100 ml praskiesto darbinio etaloninio tirpaloskiedžiama iki žymės metanoliu (33) ir sumaišoma Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 28 56 140 ir 280 IUA vitamino viename ml

Kelis kartus įpurškiama 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatomi vidutiniai smailių aukščiai (plotai) Pagalvidutinius smailių aukščius (plotus) brėžiama kalibravimo kreivė atsižvelgiant į UV kontrolės rezultatus (5633)

563 E t a l o n i n ių t i r p a lų UV e t a l o n a v im a s

5631 A v i t am i n o a c e t a t o p r a d i n i s t i r p a l a s

Į 50 ml matavimo kolbą (422) pipete paimama 20 ml A vitamino acetato pradinio tirpalo (3111) ir2-propanoliu (38) skiedžiama iki žymės Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 56 IU A vitamino viename mlĮ 25 ml matavimo kolbą pipete paimama 30 ml šio praskiesto A vitamino acetato tirpalo ir 2-propanoliu (38)skiedžiama iki žymės Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 672 IU A vitamino viename ml Spektrofotometru(46) matuojamas šio tirpalo ultravioletinis spektras pagal 2-propanolį (38) 300 nmndash400 nm diapazoneEkstinkcijos maksimumas turi būti nuo 325 nm iki 327 nm

A vitamino kiekio apskaičiavimas

A vitamino IUml = E326 times 190

(E1 1 cm A vitamino acetato = 1 530 esant 326 nm 2-propanolyje)

5632 A v i t am i n o p a lm i t a t o p r a d i n i s t i r p a l a s

Į 50 ml matavimo kolbą (422) pipete paimama 20 ml A vitamino palmitato pradinio tirpalo (3121) ir2-propanoliu (38) skiedžiama iki žymės Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 56 IU A vitamino viename mlĮ 25 ml matavimo kolbą pipete paimama 30 ml šio praskiesto A vitamino palmitato tirpalo ir 2-propanoliu (38)skiedžiama iki žymės Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 672 IU A vitamino viename ml Spektrofotometru(46) matuojamas šio tirpalo ultravioletinis spektras pagal 2-propanolį (38) 300 nmndash400 nm diapazoneEkstinkcijos maksimumas turi būti nuo 325 nm iki 327 nm



(E1 1 cm A vitamino palmitato = 957 esant 326 nm 2-propanolyje)

5633 A v i t am i n o d a r b i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s

Į 50 ml matavimo kolbą (422) pipete paimama 30 ml nepraskiesto A vitamino darbinio etaloninio tirpaloparuošto pagal 561 ir 2-propanoliu (38) skiedžiama iki žymės Į 25 ml matavimo kolbą pipete paimama50 ml šio tirpalo ir 2-propanoliu (38) skiedžiama iki žymės Vardinė šio tirpalo koncentracija yra 672 IUA vitamino viename ml Spektrofotometru (46) matuojamas šio tirpalo ultravioletinis spektras pagal 2-propanolį(38) 300 nmndash400 nm diapazone Ekstinkcijos maksimumas turi būti nuo 325 nm iki 327 nm



A vitamino IUml = E325 times183

(E1 1 cm A vitamino alkoholio = 1 821 esant 326 nm 2-propanolyje)


Naudojant ėminio tirpalo A vitamino smailių vidutinį aukštį (plotą) pagal kalibravimo kreivę (562) nustatomaėminio tirpalo koncentracija IUml

A vitamino kiekis ėminyje IUkg apskaičiuojamas pagal šią formulę

w =500 c V2 1 000

V1 m[UIkg]

kurioje

c = A vitamino koncentracija ėminio tirpale (54) IUml

V1 = ėminio tirpalo (54) tūris ml

V2 = alikvotinės tirpalo (54) dalies tūris ml

m = tiriamosios dalies svoris g

7 Pastabos

71 Jei ėminių A vitamino koncentracija yra maža gali būti naudinga sujungti dviejų po muilinimo gautų įkrovų(pasvertas kiekis 25 g) petroleterio ekstraktus į vieną ėminio tirpalą skirtą nustatymui HPLC metodu

72 Analizei paimtame ėminyje riebalų ne daugiau nei 2 g

73 Jei fazės neatsiskiria emulsijai suardyti įpilama maždaug 10 ml etanolio (31)

74 Jei tai menkės kepenų aliejus ir kiti grynieji riebalai muilinimo trukmė prailginama iki 45 minndash60 min

75 Vietoje BHT galima naudoti hidrochinoną

76 Naudojant tiesioginių fazių kolonėlę įmanomas retinolio izomerų atskyrimas Bet šiuo atveju atliekantapskaičiavimus visų cis- ir trans-izomerų smailių aukščiai (plotai) turi būti sudėti

77 Vietoje natrio askorbato tirpalo galima naudoti maždaug 150 mg askorbo rūgšties

78 Vietoje natrio sulfido tirpalo galima naudoti maždaug 50 mg EDTA

79 Analizuojant A vitaminą pieno pakaitaluose ypač reikia kreipti dėmesį į

mdash muilinimą (52) dėl ėminyje esančio riebalų kiekio gali tekti naudoti didesnį kalio hidroksido tirpalo (34)tūrį

mdash ekstrahavimą (53) dėl emulsijų buvimo gali tekti keisti vandens ir etanolio santykį 21

Norint patikrinti ar šiai konkrečiai matricai (pieno pakaitalui) taikomu analizės metodu gaunami patikimirezultatai išgavos dydis patikrinamas paėmus papildomą tiriamąją dalį Jei išgavos dydis mažesnis nei 80 turibūti daroma analizės rezultato pataisa dėl išgavos dydžio

8 Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliekamų to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 15 didžiausiojo rezultato vertės


9 Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai (1)

Premiksai Pašarai su pre-miksais

Mineralų kon-centratas

Baltyminiai paša-rai Paršelių pašarai

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

vidurkis [IUkg] 1702 times 106 121 times 106 537 100 151 800 18 070

sr [IUkg] 051 times 106 0039 times 106 22 080 12 280 682

r [IUkg] 143 times 106 0109 times 106 61 824 34 384 1 910

CVr [ ] 30 35 41 81 38

sR [IUkg] 136 times 106 0069 times 106 46 300 23 060 3 614

R [IUkg] 381 times 106 0193 times 10 6 129 640 64 568 10 119

CVR [ ] 80 62 86 15 20

L = laboratorijų skaičiusn = atskirų verčių skaičiussr = pakartojamumo standartinis nuokrypissR = atkuriamumo standartinis nuokrypisr = pakartojamumasR = atkuriamumasCVr = pakartojamumo variacijos koeficientasCVR = atkuriamumo variacijos koeficientas


(1) Atliko Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA) pašarų darbo grupė (VDLUFA)


B E VITAMINO NUSTATYMAS


Metodas taikomas E vitaminui pašaruose ir premiksuose nustatyti E vitamino kiekis išreiškiamas mgDL-α-tokoferolio acetato vienam kg pašaro 1 mg DL-α-tokoferolio acetato atitinka 091 mg α-tokoferolio(E vitamino)

Kiekybinio nustatymo riba ndash 2 mg E vitaminokg Šią kiekybinio nustatymo ribą galima pasiekti tik naudojantfluorescencinį detektorių Naudojant ultravioletinį detektorių kiekybinio nustatymo riba ndash 10 mgkg

2 Metodas

Ėminys hidrolizuojamas etanoliniu kalio hidroksido tirpalu ir E vitaminas ekstrahuojamas petroleteriu Tirpiklisišgarinamas likutis ištirpinamas metanolyje ir jei reikia skiedžiamas iki reikiamos koncentracijos E vitaminokiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (RP-HPLC) metodu naudojantfluorescencinį arba ultravioletinį detektorių

3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis



36 Natrio sulfidas Na2S x H2O (x = 7ndash9)

361 Natrio sulfido tirpalas glicerolyje c = 05 moll β = 120 gl (kai x = 9) (žr 78 pastabas)




310 DL-α-tokoferolio acetatas ypač grynas sertifikuoto aktyvumo

3101 DL-α-tokoferolio acetato pradinis tirpalas 100 mg DL-α-tokoferolio acetato (310) pasveriama 01 mg tikslumuir supilama į 100 ml matavimo kolbą Ištirpinama etanolyje (31) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės 1 mlšio tirpalo yra 1 mg DL-α-tokoferolio acetato (apie UV kontrolę žr 5613 apie stabilizavimą žr 74 pastabas)

311 DL-α-tokoferolis ypač grynas sertifikuoto aktyvumo

3111 DL-α-tokoferolio pradinis tirpalas 100 mg DL-α-tokoferolio (311) pasveriama 01 mg tikslumu ir supilamaį 100 ml matavimo kolbą Ištirpinama etanolyje (31) ir tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės 1 ml šio tirpaloyra 1 mg DL-α-tokoferolio (apie UV kontrolę žr 5623 apie stabilizavimą žr 74 pastabas)

312 26-di-tert-butil-4-metilfenolis (BHT) (žr 75 pastabas)

4 Aparatūra

41 Sukamasis garintuvas










451 Skysčių chromatografijos kolonėlė 250 mm times 4 mm C18 5 ar 10 μm įkrova arba lygiavertė kolonėlė







5 Procedūra

Pastaba E vitaminas yra jautrus ultravioletinei spinduliuotei ir oksidavimui Visi veiksmai atliekami tamsoje(naudojami rudo stiklo indai arba aliuminio folija apvynioti indai) ir nesant deguonies (šalinamas azotosrove) Ekstrahuojant oras virš skysčio pakeičiamas azotu (vengiant per didelio slėgio kartkartėmis reikiaištraukti kamštį)


Ėminys sumalamas kad jį būtų galima sijoti per sietą su 1 mm dydžio akutėmis vengiant šilumos susidarymoTuri būti malama prieš pat svėrimą ir muilinimą kad nebūtų E vitamino nuostolių

52 Muilinimas

Atsižvelgiant į E vitamino kiekį 001 g tikslumu pasveriama 2ndash25 g ėminio ėminys supilamas į plokščiadugnę arkūginę 500 ml tūrio kolbą (421) Maišant iš eilės įpilama 130 ml etanolio (31) maždaug 100 mg BHT (312)2 ml natrio askorbato tirpalo (35) ir 2 ml natrio sulfido tirpalo (36) Prie kolbos prijungiamas kondensatorius(43) ir kolba įmerkiama į vandens vonią su magnetine maišykle (47) Šildoma iki virimo ir verdama 5 min sugrįžtamuoju kondensatoriumi Tuomet per kondensatorių (43) įpilama 25 ml kalio hidroksido tirpalo (34) ir dar25 min verdama su grįžtamuoju kondensatoriumi maišant silpna azoto srove Kondensatorius plaunamasmaždaug 20 ml vandens ir kolbos turinys aušinamas iki kambario temperatūros

53 Ekstrahavimas








Sujungti petroleterio ekstraktai plaunami kaip tai aprašyta 531 ir tęsiama kaip ten aprašyta


Į 250 ml kriaušės formos kolbą (424) pipete paimama alikvotinė petroleterio tirpalo (531 ar 532) dalisSukamajame garintuve (41) esant sumažintam slėgiui tirpiklis išgarinamas beveik iki sauso likučio kai voniostemperatūra ne aukštesnė nei 40 oC Įleidžiant azoto (39) slėgis didinamas iki atmosferos slėgio kolba nuimamanuo sukamojo garintuvo Likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (310) ir likutis iš karto tirpinamas žinomametūryje (10ndash100 ml) metanolio (33) (DL-α-tokoferolio koncentracija turi būti 5 μgmlndash30 μgml intervale)


E vitaminas atskiriamas C18 atvirkštinių fazių kolonėlėje (451) koncentracija matuojama naudojantfluorescencinį detektorių (sužadinimas 295 nm emisija 330 nm) ar ultravioletinį detektorių (292 nm) (452)








Detektorius (452) fluorescencinis detektorius(sužadinimas 295 nm emisija 330 nm) arba ultravioletinis detektorius (292 nm)

56 Kalibravimas (DL-α-tokoferolio acetato ar DL-α-tokoferolio)

561 DL - α - t o ko f e r o l i o a c e t a t o e t a l o n a s

5611 D a r b i n i o e t a l o n i n i o t i r p a l o r u o š im a s

Į 500 ml plokščiadugnę ar kūginę kolbą (421) pipete paimama 25 ml DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo(3101) ir hidrolizuojama kaip aprašyta 52 Vėliau ekstrahuojama petroleteriu (32) kaip aprašyta 53 irskiedžiama petroleteriu iki 500 ml 25 ml šio ekstrakto garinama sukamajame garintuve (žr 54) beveik iki sausolikučio likęs tirpiklis pašalinamas azoto srove (39) ir likutis ištirpinamas 250 ml metanolio (33) Šio tirpalovardinė koncentracija yra 455 μg DL-α-tokoferolio viename ml tai atitinka 50 μg DL-α-tokoferolio acetatoviename ml Darbinis etaloninis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą



Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilama 10 20 40 ir 100 ml darbinio etaloninio tirpalo skiedžiama ikižymės metanoliu (33) ir sumaišoma Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 25 50 100 ir 250 μgml DL-α-tokoferolio acetato t y 228 455 910 μgml ir 228 μgml DL-α-tokoferolio

Kelis kartus įpurškiama 20 μl kiekvieno etaloninio tirpalo ir nustatomi vidutiniai smailių aukščiai (plotai) Pagalvidutinius smailių aukščius (plotus) brėžiama kalibravimo kreivė

5613 DL - α - t o ko f e r o l i o a c e t a t o p r a d i n i o t i r p a l o ( 3 1 0 1 ) UV e t a l o n a v im a s

50 ml DL-α-tokoferolio acetato pradinio tirpalo (3101) etanoliu skiedžiama iki 250 ml ir spektrofotometru(46) matuojamas pagal etanolį (31) šio tirpalo ultravioletinis spektras 250 nmndash320 nm diapazone

Absorbcijos maksimumas atitinka 284 nm

E1 1 cm = 436 esant 284 nm etanolyje

Esant šiam praskiedimui gauta ekstinkcijos koeficiento vertė turi būti 084ndash088

562 D L - α - t o ko f e r o l i o e t a l o n a s


Į 50 ml matavimo kolbą pipete paimama 20 ml DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3111) ištirpinamametanolyje (33) ir metanoliu skiedžiama iki žymės Šio tirpalo vardinė koncentracija yra 40 μg DL-α-tokoferolioviename ml tai atitinka 440 μg DL-α-tokoferolio acetato viename ml Darbinis etaloninis tirpalas turi būtiruošiamas iš naujo prieš naudojimą


Į keletą 20 ml tūrio matavimo kolbų įpilama 10 20 40 ir 100 ml darbinio etaloninio tirpalo skiedžiama ikižymės metanoliu (33) ir sumaišoma Šių tirpalų vardinė koncentracija yra 20 40 80 ir 200 μgml DL-α-tokoferolio t y 220 440 879 μgml ir 220 μgml DL-α-tokoferolio acetato


5623 DL - α - t o ko f e r o l i o p r a d i n i o t i r p a l o ( 3 1 1 1 ) UV e t a l o n a v im a s

20 ml DL-α-tokoferolio pradinio tirpalo (3111) etanoliu skiedžiama iki 250 ml ir spektrofotometru (46)matuojamas pagal etanolį (31) šio tirpalo ultravioletinis spektras 250ndash320 nm diapazone Absorbcijosmaksimumas atitinka 292 nm


Esant šiam praskiedimui ekstinkcijos koeficiento vertė turi būti 06


Naudojant ėminio tirpalo E vitamino smailių vidutinį aukštį (plotą) pagal kalibravimo kreivę (5612 ar 5622)nustatoma ėminio tirpalo koncentracija μgml (apskaičiuota α-tokoferolio acetatui)

E vitamino kiekis ėminyje w mgkg nustatomas pagal šią formulę

w =500 c V2

V1 m[mgkg]

kurioje

c = ėminio tirpalo (54) E vitamino (kaip α-tokoferolio acetato) koncentracija μgmlV1 = ėminio tirpalo (54) tūris mlV2 = tirpalo (54) paimtos alikvotinės dalies tūris mlm = tiriamosios dalies svoris g


7 Pastabos

71 Jei ėminių E vitamino koncentracija yra maža gali būti naudinga sujungti dviejų po muilinimo gautų įkrovų(pasvertas kiekis 25 g) petroleterio ekstraktus į vieną ėminio tirpalą skirtą nustatymui HPLC metodu



74 Po DL-α-tokoferolio acetato ar DL-α-tokoferolio tirpalų spektrofotometrinių matavimų atitinkamai pagal 5613ar 5623 į tirpalą (3101 ar 3102) įdedama maždaug 10 mg BHT (312) ir tirpalas laikomas šaldytuve(laikymo trukmė ne ilgesnė kaip keturios savaitės)


76 Naudojant tiesioginių fazių kolonėlę įmanoma atskirti α- β- γ- ir δ-tokoferolius



79 E vitamino acetatas labai greitai hidrolizuojasi šarminėje terpėje taigi yra labai jautrus oksidavimui ypač jei yrametalų pėdsakų pvz geležies arba vario Dėl šios priežasties nustatant E vitaminą premiksuose kai jokoncentracija didesnė nei 5 000 mgkg gali vykti jo skilimas Todėl patvirtinimui reikia rekomenduoti HPLCmetodą ir E vitamino preparato skaidymą fermentais netaikant šarminio muilinimo stadijos

8 Pakartojamumas



Premiksas Pašarai su pre-miksais


Baltyminiaipašarai Paršelių pašarai

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

vidurkis [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [ ] 22 38 27 41 38

sR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [ ] 48 55 60 60 127

L = laboratorijų skaičius

n = atskirų verčių skaičius


sR = atkuriamumo standartinis nuokrypis

r = pakartojamumas

R = atkuriamumas






C GELEŽIES VARIO MANGANO IR CINKO MIKROELEMENTŲ NUSTATYMAS


Šiuo metodu galima nustatyti geležies vario mangano ir cinko mikroelementų kiekį pašaruose Kiekybinionustatymo riba

mdash geležies (Fe) 20 mgkg

mdash vario (Cu) 10 mgkg

mdash mangano (Mn) 20 mgkg

mdash cinko (Zn) 20 mgkg

2 Principas

Ėminys po organinės medžiagos (jei ji buvo) suskaidymo ištirpinamas druskos rūgštyje Po atitinkamopraskiedimo geležis varis manganas ir cinkas nustatomi atominės absorbcijos spektrometrijos metodu

3 Reagentai

Įvadinės pastabos

Reagentams ir analizei skirtiems tirpalams ruošti reikia naudoti vandenį kuriame nebūtų nustatomų katijonųtodėl vanduo gaunamas du kartus distiliuojant distiliatoriuje iš borosilikatinio ar kvarcinio stiklo arba du kartusapdorojant jonitine derva

Reagentai turėtų būti bent analiziškai gryni Nustatomų elementų nebuvimas turi būti tikrinamas atliekanttuščiąjį bandymą Prireikus reagentai turi būti papildomai gryninami

Vietoje žemiau aprašomų etaloninių tirpalų galima naudoti prekyboje esančius etaloninius tirpalus jei tik jie turigarantiją ir prieš naudojimą buvo patikrinti

31 Vandenilio chlorido rūgštis (d119 gml)

32 Vandenilio chlorido rūgštis (6 moll)


34 Vandenilio fluorido rūgšties 38ndash40 (VV) tirpalas kuriame geležies (Fe) būtų mažiau nei 1 mgl o likučio poišgarinimo masė (sulfato pavidalu) mažesnė nei 10 mgl

35 Sieros rūgštis (d 184 gml)

36 Vandenilio peroksidas (maždaug 100 tūrių deguonies (30 masės))

37 Etaloninis geležies tirpalas (1 000 μg Feml) ruošiamas kaip nurodyta toliau arba naudojamas lygiavertisprekyboje esantis tirpalas 1 g geležies vielos ištirpinama 200 ml 6 moll vandenilio chlorido rūgšties (32)įpilama 16 ml vandenilio peroksido (36) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro

371 Darbinis etaloninis geležies tirpalas (100 μg Feml) ruošiamas etaloninį tirpalą (37) skiedžiant vandeniusantykiu 1 9

38 Etaloninis vario tirpalas (1 000 μg Cuml) ruošiamas kaip nurodyta toliau arba naudojamas lygiavertisprekyboje esantis tirpalas

mdash 1 g vario miltelių užpilama 25 ml 6 moll vandenilio chlorido rūgšties (32) įpilama 5 ml vandenilioperoksido (36) ir gautas tirpalas skiedžiamas vandeniu iki 1 litro


381 Darbinis etaloninis vario tirpalas (10 μg Cuml) ruošiamas etaloninį tirpalą (38) skiedžiant vandeniu santykiu 19 ir taip gautą tirpalą dar kartą skiedžiant vandeniu santykiu 1 9

39 Etaloninis mangano tirpalas (1 000 μg Mnml) ruošiamas kaip nurodyta toliau arba naudojamas lygiavertisprekyboje esantis tirpalas

mdash 1 g mangano miltelių tirpinama 25 ml 6 moll vandenilio chlorido rūgšties (32) ir skiedžiama vandeniu iki1 litro

391 Darbinis etaloninis mangano tirpalas (10 μg Mnml) ruošiamas etaloninį tirpalą (39) skiedžiant vandeniusantykiu 1 9 ir taip gautą tirpalą dar kartą skiedžiant vandeniu santykiu 1 9

310 Etaloninis cinko tirpalas (1 000 μg Znml) ruošiamas kaip nurodyta toliau arba naudojamas lygiavertisprekyboje esantis tirpalas

mdash 1 g cinko strypelio arba lapelių (a g) tirpinama 25 ml 6 moll vandenilio chlorido rūgšties (32) irskiedžiama vandeniu iki 1 litro

3101 Darbinis etaloninis cinko tirpalas (10 μg Znml) ruošiamas etaloninį tirpalą (310) skiedžiant vandeniu santykiu1 9 ir taip gautą tirpalą dar kartą skiedžiant vandeniu santykiu 1 9

311 Lantano chlorido tirpalas 12 g lantano oksido ištirpinama 150 ml vandens įpilama 100 ml 6 moll vandeniliochlorido rūgšties (32) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro

4 Aparatūra

41 Mufelinė krosnis su temperatūros reguliatoriumi ir pageidautina su rašytuvu

42 Stikliniai indai turi būti iš atsparaus borosilikatinio stiklo rekomenduojama naudoti aparatūrą kuri būtų skirtatik mikroelementams nustatyti

43 Spektrofotometras atominei absorbcinei analizei atlikti atitinkantis metodo jautrio ir glaudumo reikalavimusreikiamame koncentracijos intervale

5 Procedūra (1)

51 Ėminiai turintys organinių medžiagų

511 Ėmin i o s u d e g i n im a s i r a n a l i z e i s k i r t o t i r p a l o r u o š im a s (2)

5111 5ndash10 g ėminio pasverto 02 mg tikslumu įdedama į platininį arba kvarcinį tiglį (43) (žr (b) pastabą)džiovinama 105 oC temperatūroje džiovinimo spintoje tada tiglis dedamas į šaltą mufelinę krosnį (41) Krosnisuždaroma (žr (c) pastabą) ir per maždaug 90 min temperatūra laipsniškai pakeliama iki 450ndash475 oC Tokiojetemperatūroje tiglis laikomas 4ndash16 h (pvz per naktį) kad būtų pašalintos visos organinės medžiagos krosnisatidaroma ir paliekama ataušti (žr d) pastabą)

Pelenai sudrėkinami vandeniu ir supilami į 250 ml tūrio cheminę stiklinęTiglio turinys išplaunamas į cheminęstiklinę tam sunaudojant iš viso maždaug 5 ml vandenilio chlorido rūgšties (31) kuri pilama lėtai ir atsargiai(dėl CO2 susidarymo gali vykti audringa reakcija) Vandenilio chlorido rūgštis (31) į stiklinę lašinama maišanttirpalą tol kol nustoja skirtis dujų burbuliukai Išgarinama iki sauso likučio retkarčiais maišant stikline lazdele


(1) Galima taikyti kitus skaidymo būdus jei būtų įrodyta kad gaunami panašūs rezultatai (pvz skaidymas autoklave aukšto dažniospinduliuote)

(2) Žaliuose pašaruose (šviežiuose arba džiovintuose) gali būti didelis kiekis augalinio silicio dioksido kuriame gali būti mikroelementų todėljis turi būti pašalintas Todėl šių pašarų ėminiams turi būti taikoma ši pakeista procedūra Veiksmas 5111 atliekamas iki filtravimoFiltravimo popierius su netirpiu likučiu du kartus plaunamas verdančiu vandeniu ir dedamas į kvarcinį arba platininį tiglį Filtrasdeginamas mufelinėje krosnyje (41) žemesnėje kaip 550 oC temperatūroje tol kol visiškai išnyksta anglinė medžiaga Paliekama atauštiįlašinami keli lašai vandens 10ndash15 ml vandenilio fluorido rūgšties (34) ir garinama iki sauso likučio maždaug 150 oC temperatūroje Jeilikutyje dar lieka kažkiek silicio dioksido likutis pakartotinai tirpinamas keliuose mililitruose vandenilio fluorido rūgšties (34) irišgarinamas iki sauso likučio Įlašinami penki lašai sieros rūgšties (35) ir kaitinama tol kol nustoja skirtis balti dūmai Įpylus 5 ml 6 moll vandenilio chlorido rūgšties (32) ir apie 30 ml vandens tirpalas pašildomas filtruojamas į 250 ml matavimo kolbą ir skiedžiamasvandeniu iki žymės (HCl koncentracija apie 05 moll) Toliau nustatymas tęsiamas nuo 512 punkto

Į likutį įpilama 15 ml 6 moll vandenilio chlorido rūgšties (32) ir apie 120 ml vandens Maišoma stikline lazdelekuri paliekama stiklinėje stiklinė uždengiama laikrodžio stiklu Stiklinės turinys lėtai užverdamas ir virinamastol kol galima pamatyti kad daugiau pelenų nebeištirpsta Filtruojama per bepelenį filtravimo popierių ir filtratassupilamas į 250 ml matavimo kolbą Stiklinė ir filtras plaunami 5 ml karšto vandenilio chlorido rūgšties tirpalo(32) ir du kartus verdančiu vandeniu Matavimo kolbos turinys skiedžiamas vandeniu iki žymės (HClkoncentracija maždaug 05 moll)

5112 Jei likutis ant filtro yra juodas (anglis) filtras vėl dedamas į krosnį ir sudeginamas 450ndash475 oC temperatūroje Šissudeginimas kuris trunka tik kelias valandas (trisndashpenkias valandas) yra baigtas kai pelenai tampa balti arbabeveik balti Likutis tirpinamas maždaug 2 ml vandenilio chlorido rūgšties (31) garinamas iki sauso likučio irįpilama 5 ml 6 moll vandenilio chlorido rūgšties (32) Pakaitinama tirpalas filtruojamas į matavimo kolbą irskiedžiamas vandeniu iki žymės (HCl koncentracija yra apie 05 moll)

Pastabos

a) Atliekant pėdsakų analizę svarbu visą laiką turėti omenyje užteršimo ypač cinku variu ir geležimi pavojųDėl šios priežasties įrangoje kuri naudojama ėminiams ruošti šių elementų turi nebūti

Bendram užteršimo pavojui sumažinti dirbama dulkių neturinčioje aplinkoje su labai švaria įranga irrūpestingai išplautais stikliniais indais Cinko nustatymas yra ypač jautrus įvairių rūšių teršalams pvzteršalams ant stiklinių indų reagentuose dulkėms ir pan

b) Sudeginamo ėminio masė apskaičiuojama pagal apytikrį mikroelementų kiekį pašaruose atsižvelgiantį naudojamo spektrofotometro jautrį Tam tikriems pašarams kuriuose mikroelementų mažai gali prireikti10ndash20 g masės ėminio ir gauti iš jo tik 100 ml tūrio galutinį tirpalą

c) Turi būti deginama uždarytoje krosnyje nepučiant oro arba deguonies

d) Pirometro rodoma temperatūra neturi būti aukštesnė nei 475 oC

512 S p e k t r o fo t ome t r i n i s n u s t a t yma s

5121 K a l i b r a v imo t i r p a lų r u o š im a s

Iš darbinių etaloninių tirpalų nurodytų 371 381 391 ir 3101 punktuose kiekvienam nustatomamelementui ruošiama keletas kalibravimo tirpalų kurių kiekvieno HCl koncentracija yra apie 05 moll ir lantanochlorido koncentracija (geležies mangano ir cinko atveju) atitinka 01 (mV) La koncentraciją

Pasirenkama mikroelementų koncentracija turi atitikti naudojamo spektrofotometro jautrio ribas Toliau kaippavyzdys pateikiamose lentelėse rodoma kalibruoti naudojamų tirpalų sudėties tipiniai intervalai tačiauatsižvelgiant į naudojamo spektrofotometro tipą ir jautrį gali tekti pasirinkti kitas koncentracijos vertes

Geležis

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5

ml darbinio etaloninio tirpalo (371)(1 ml = 100 μg Fe)

0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7

+ 10 ml lantano chlorido tirpalo (311) ir skiedžiama vandeniu iki 100 ml

Varis

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10

ml darbinio etaloninio tirpalo (381)(1 ml = 10 μg Cu)

0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Manganas

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10

ml darbinio etaloninio tirpalo (391)(1 ml = 10 μg Mn)

0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Cinkas

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08

ml darbinio etaloninio tirpalo (3101)(1 ml = 10 μg Zn)

0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


5122 T i r p a l o r u o š i m a s a n a l i z e i

Variui nustatyti pagal 511 punktą paruoštą tirpalą paprastai galima naudoti tiesiogiai Jei reikia kad jokoncentracija būtų kalibruoti naudojamų tirpalų koncentracijos verčių intervale alikvotinė dalis gali būti paimtapipete į 100 ml matavimo kolbą ir skiedžiama iki žymės 05 moll vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (33)

Geležiai manganui ir cinkui nustatyti pagal 511 punktą paruošto tirpalo alikvotinė dalis paimama pipeteį 100 ml matavimo kolbą įpilama 10 ml lantano chlorido tirpalo (311) ir skiedžiama iki žymės 05 moll vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (33) (Be to žr 8 punkto pastabą)

5123 Tu š č i a s i s b a n d ym a s

Tuščiąjį bandymą turi sudaryti visos nurodytos procedūros pakopos išskyrus tai kad nededama ėminiomedžiagos Kaip tuščiasis ėminys neturi būti naudojamas bdquo0ldquo koncentracijos kalibravimo tirpalas

5124 A t om i n ė s a b s o r b c i j o s m a t a v im a s

Matuojama kalibravimo tirpalų ir analizuojamo tirpalo atominė absorbcija naudojant oro-acetilenooksiduojančiąją liepsną esant šiems bangų ilgiams

Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm

Kiekvienas matavimas atliekamas keturis kartus

52 Mineraliniai pašarai

Jei ėminyje nėra organinių medžiagų sudeginimas prieš analizę nereikalingas Daroma kaip aprašyta5111 punkte pradedant nuo antrosios pastraipos Galima praleisti išgarinimo su fluoro vandenilio rūgštimipakopą


Naudojant kalibravimo kreivę apskaičiuojama mikroelementų koncentracija analizuojamame tirpale ir rezultatasišreiškiamas mikroelemento mg kiekiu vienam ėminio kilogramui (milijonosiomis dalimis)


7 Pakartojamumas

Dviejų rezultatų gautų tam pačiam analizę atliekančiam asmeniui atliekant du lygiagrečius matavimus su tuopačiu ėminiu skirtumas ne didesnis nei

mdash 5 mgkg absoliučiąja verte kai nustatomo mikroelemento kiekis ne didesnis nei 50 mgkg

mdash 10 didžiausio rezultato kai nustatomo mikroelemento kiekis yra 50ndash100 mgkg

mdash 10 mgkg absoliučiąja verte kai nustatomo mikroelemento kiekis yra 100ndash200 mgkg

mdash 5 didžiausio rezultato kai nustatomo mikroelemento kiekis yra didesnis nei 200 mgkg

8 Pastaba

Dideli fosfatų kiekiai gali trukdyti nustatyti geležį manganą ir cinką Tokie trukdžiai turi būti pašalinti įpilantlantano chlorido tirpalo (311) Tačiau jei ėminyje masių santykis (Ca + mg)P gt 2 lantano chlorido tirpalo(311) į analizės tirpalą ir etaloninius tirpalus galima nepilti

D HALOFUGINONO NUSTATYMAS

DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-(3-hidroksi-2-piperidil)acetonil]-chinazolin-4-(3H)-ono hidrobromidas


Metodas taikomas halofuginonui nustatyti pašaruose Kiekybinio nustatymo riba ndash 1 mgkg

2 Metodas

Apdorotas karštu vandeniu halofuginonas ekstrahuojamas kaip laisvoji bazė į etilacetatą ir po to atskiriamas kaipvandenilio chloridas į vandeninį rūgšties tirpalą Ekstraktas gryninamas taikant jonų mainų chromatografijąHalofuginono kiekis nustatomas atvirkštinės fazės efektyviąja skysčių chromatografija (HPLC) naudojantultravioletinį detektorių

3 Reagentai

31 Acetonitrilas HPLC grynumo

32 Amberlito XAD-2 derva

33 Amonio acetatas

34 Etilacetatas

35 Acto rūgštis ledinė

36 Halofuginono etaloninė medžiaga (DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-hidroksi-2-piperidil)acetonil]-chinazolin-4-(3H)-ono hidrobromidas E 764)

361 H a l o f u g i n o no p r a d i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 1 00 μ g m l

Į 500 ml matavimo kolbą 01 mg tikslumu pasveriama 50 mg halofuginono (36) ištirpinama amonio acetatobuferiniame tirpale (318) iki žymės skiedžiama buferiniu tirpalu ir sumaišoma Šis tirpalas lieka stabilus trissavaites 5 oC temperatūroje jei laikomas tamsoje

362 K a l i b r a v imo t i r p a l a i

Į keletą 100 ml matavimo kolbų įpilama 10 20 30 40 ir 60 ml pradinio etaloninio tirpalo (361)Skiedžiama iki žymės judančiąja faze (321) ir sumaišoma Šių tirpalų halofuginono koncentracija yra 10 2030 40 ir 60 μgml Šie tirpalai turi būti ruošiami prieš pat naudojimą


37 Vandenilio chlorido rūgštis (ρ20 maždaug 116 gml)

38 Metanolis

39 Sidabro nitratas

310 Natrio askorbatas

311 Natrio karbonatas


313 EDTA (etilendiamintetraacto rūgšties dinatrio druska)

314 Vanduo HPLC grynumo

315 Natrio karbonato tirpalas c = 10 g100 ml

316 Natrio karbonato tirpalas sočiajame natrio chlorido tirpale c = 5 g100 ml

Vandenyje ištirpinama 50 g natrio karbonato (311) skiedžiama iki 1 litro ir dedama natrio chlorido (312) tiekkad gaunamas sotus tirpalas

317 Vandenilio chlorido rūgštis maždaug 01 moll

10 ml HCI (37) skiedžiama vandeniu iki 1 litro

318 Amonio acetato buferinis tirpalas maždaug 025 moll

Vandenyje (314) ištirpinama 193 g amonio acetato (33) 30 ml acto rūgšties (35) ir skiedžiama iki 1 litro

319 Amberlito XAD-2 dervos ruošimas

Reikiamas kiekis amberlito (32) plaunamas vandeniu tol kol pašalinami visi chlorido jonai kaip rodo bandymassu sidabro nitrato tirpalu (320) atliekamas su išpilama vandenine faze Derva plaunama 50 ml metanolio (38)metanolis išpilamas ir derva laikoma ant jos užpylus švaraus metanolio

320 Sidabro nitrato tirpalas maždaug 01 moll

017 g sidabro nitrato (39) ištirpinama 10 ml vandens

321 HPLC judančioji fazė

500 ml acetonitrilo (31) maišoma su 300 ml amonio acetato buferiniu tirpalo (318) ir 1 200 ml vandens(314) Acto rūgštimi (35) nustatoma pH 43 Tirpalas filtruojamas per 022 μm filtrą (48) ir degazuojamas(pvz 10 min ultragarsu) Šis tirpalas stabilus vieną mėnesį jei laikomas uždarame inde ir tamsoje

4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia


43 Centrifuga

44 HPLC įranga su kintamo bangos ilgio ultravioletiniu detektoriumi arba diodų matricos detektoriumi


45 Stiklinė kolonėlė (300 mm times 10 mm) su sukepinto stiklo filtru ir čiaupu

46 Stiklo pluošto filtrai skersmuo 150 mm


47 Membraniniai filtrai 045 μm


5 Procedūra

Pastaba Halofuginonas kaip laisvoji bazė yra nepatvarus šarminiuose ir etilacetato tirpaluose todėl etilacetatelaikomas ne ilgiau nei 30 min


511 Siekiant patikrinti ar nėra halofuginono arba trukdančiųjų medžiagų atliekama pašaro tuščiojo ėminio analizė

512 Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį į jį pridedant halofuginono kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyjenustatomas išgavos dydis 3 mgkg koncentracijai gauti į 10 g pašaro tuščiojo ėminio reikia įpilti 300 μl pradinioetaloninio tirpalo (361) sumaišyti ir prieš ekstrahavimą (52) palaukti 10 min

Pastaba Šiame metode pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminio tipą ir atliekant analizę jame neaptiktahalofuginono

52 Ekstrahavimas

Į 200 ml centrifugos mėgintuvėlį 01 g tikslumu pasveriama 10 g paruošto ėminio įdedama 05 g natrioaskorbato (310) 05 g EDTA (313) 20 ml vandens ir sumaišoma Mėgintuvėlis įdedamas 5 min į vandens vonią(80 oC) Atvėsinus iki kambario temperatūros įpilama 20 ml natrio karbonato tirpalo (315) ir sumaišoma Tuojpat įpilama 100 ml etilacetato (34) ir 15 s stipriai purtoma ranka Atkimštas mėgintuvėlis dedamastrims minutėms į ultragarso vonią (41) Centrifuguojama 2 min ir etilacetato fazė per stiklo pluošto filtrą (46)nupilama į 500 ml dalijamąjį piltuvą Kartojamas ėminio ekstrahavimas dar su 100 ml etilacetato Sujungtiekstraktai vieną minutę plaunami 50 ml natrio chloridu prisotintu natrio karbonato tirpalu (316) vandeninissluoksnis išpilamas

Organinis sluoksnis 1 min ekstrahuojamas 50 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalu (317) Apatinis rūgštiessluoksnis išleidžiamas į 250 ml dalijamąjį piltuvą Organinis sluoksnis dar kartą 15 min ekstrahuojamas kita50 ml vandenilio chlorido rūgšties porcija ir gautas ekstraktas sujungiamas su pirmuoju ekstraktu Abu sujungtirūgšties ekstraktai maždaug 10 s plaunami 10 ml etilacetatu (34) atliekant sukamuosius judesius

Visas vandeninis sluoksnis kiekybiškai supilamas į 250 ml talpos apvaliadugnę kolbą organinė fazė išpilamaVisas likęs etilacetatas pašalinamas iš rūgšties tirpalo garinant sukamajame garintuve (42) Vandens voniostemperatūra neturi būti aukštesnė nei 40 oC Esant maždaug 25 milibar vakuumui visas likęs etilacetatas turėtųbūti pašalintas per 5 min kai temperatūra 38 oC

53 Gryninimas

531 Amb e r l i t o ko l o n ė l ė s r u o š im a s

XAD-2 kolonėlė ruošiama kiekvienam ėminio ekstraktui 10 g paruošto amberlito (319) supilama į stiklinękolonėlę (45) su metanoliu (38) Ant dervos sluoksnio uždedamas nedidelis stiklo vatos kamštis Metanolisišleidžiamas iš kolonėlės ir derva plaunama 100 ml vandens paliekant jo tiek kad skystis apsemtų dervospaviršių Prieš naudojimą kolonėlė 10 min paliekama pusiausvyrai nusistovėti Niekuomet neleidžiama skysčiuivisiškai ištekėti iš kolonėlės

532 Ėmin i o g r y n i n im a s

Visas ekstraktas (52) kiekybiškai supilamas ant paruoštos amberlito kolonėlės (531) viršaus ir plaunamaišpilant eliuatą Eliuavimo srautas neturi būti didesnis nei 20 mlmin Apvaliadugnė kolba plaunama 20 mlvandenilio chlorido rūgšties tirpalo (317) ir šiuo tirpalu plaunama dervos kolonėlė Rūgšties tirpalo likutisišpučiamas oro srautu Plovimo tirpalai išpilami Į kolonėlę įpilama 100 ml metanolio (38) ir į 250 mlapvaliadugnę kolbą ir surenkama nuo 5 ml iki 10 ml eliuato Likęs metanolis 10 min laikomas pusiausvyrai suderva nusistovėti ir eliuavimas tęsiamas esant ne didesniam nei 20 mlmin srautui surenkant eliuatą į tą pačiąkolbą Metanolis išgarinamas sukamajame garintuve (42) Vandens vonios temperatūra neturi būti aukštesnė nei40 oC Plaunant judančiąja faze (321) likutis kiekybiškai supilamas į 10 ml matavimo kolbą Skiedžiamajudančiąja faze iki žymės ir sumaišoma Alikvotinė dalis filtruojama per membraninį filtrą (47) Šis tirpalasnaudojamas HPLC nustatymui (54)


54 HPLC nustatymas

541 P a r ame t r a i

Rekomenduojamos šios sąlygos gali būti taikomos kitos sąlygos jei gaunami lygiaverčiai rezultatai

Skysčių chromatografijos kolonėlė (441)

HPLC judančioji fazė (321)

Srautas 15 mlminndash2 mlmin

Detektoriaus bangos ilgis 243 nm

Įpurškiamas tūris 40 μlndash100 μl

Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas kelis kartus įpurškiant 30 μgml koncentracijos kalibravimotirpalo (362) tol kol nustoja keistis smailės aukštis (arba plotas) ir sulaikymo trukmė

542 K a l i b r a v imo k r e i v ė

Kiekvienas kalibravimo tirpalas (362) įpurškiamas kelis kartus ir matuojami kiekvienos koncentracijos smailiųaukščiai (arba plotai) Brėžiama kalibravimo kreivė kurios ordinačių ašyje ndash kalibravimo tirpalų smailių aukščių(arba plotų) vidurkiai o abscisių ašyje ndash atitinkama koncentracija μgml

543 Ėmin i o t i r p a l a s

Kelis kartus įpurškiamas ėminio ekstraktas (532) kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalo tūrį ir matuojamashalofuginono smailių vidutinis aukštis (plotas)


Ėminio tirpalo koncentracija μgml nustatoma pagal ėminio tirpalo halofuginono smailių vidutinį aukštį (plotą) irkalibravimo kreivę (542)

Halofuginono kiekis w (mgkg) ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę

w =c 10m

kurioje

c = halofuginono koncentracija ėminio tirpale μgml

m = tiriamosios dalies svoris gramais

7 Rezultatų patvirtinimas

71 Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas taikant kochromatografiją arba naudojant diodų matricos detektoriųkuriuo lyginami ėminio ekstrakto ir 60 μgml koncentracijos kalibravimo tirpalo (362) spektrai

711 Ko ch r oma t o g r a f i j a

Ėminio ekstrakto tirpalo koncentracija padidinama įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (362) tūrį Pridėtohalofuginono kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą halofuginono kiekį

Turi padidėti tik halofuginono smailės aukštis įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą Smailės plotis jospusaukštyje turi atitikti pradinį plotį plusmn 10 tikslumu


712 Ap t i k im a s n a u d o j a n t d i o dų ma t r i c ą

Rezultatai vertinami pagal šiuos kriterijus

a) ėminio ir etalono spektrų didžiausios absorbcijos bangos ilgis užrašomas kaip chromatogramos smailėsviršūnės bangos ilgis turi būti vienodas paklaidos ribose kurias lemia aptikimo sistemos skiriamoji gebaDiodų matricos detektoriaus tipinė vertė būtų plusmn 2 nm

b) nuo 225 nm iki 300 nm ėminio ir etalono spektras užrašytas apie chromatogramos smailės viršūnę šiomsspektro dalims turi nesiskirti 10ndash100 santykinio optinio tankio intervale Šis kriterijus vykdomas kai yratie patys maksimumai ir jokiame matavimo taške dviejų spektrų skirtumas nėra didesnis nei 15 etalonoanalitės optinio tankio vertės

c) nuo 225 nm iki 300 nm ėminio ekstraktui gautos smailės kylančios viršūnės ir nusileidžiančios daliųspektrai šioms spektro dalims turi nesiskirti vienas nuo kito 10ndash100 santykinio optinio tankio intervaleŠis kriterijus vykdomas kai yra tie patys maksimumai ir visuose stebimuose taškuose spektrų skirtumas yrane didesnis nei 15 smailės viršūnę atitinkančio optinio tankio vertės

Jei vienas iš šių kriterijų nevykdomas analitės buvimas nepatvirtinamas

72 Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 05 mgkg kaihalofuginono yra iki 3 mgkg

73 Išgavos dydis

Išgavos dydis gautas tuščiajam ėminiui su analitės priedu yra ne mažesnis nei 80

8 Tarplaboratorinių tyrimų rezultatai

Buvo atlikti tarplaboratoriniai tyrimai (1) kurių metu aštuonios laboratorijos analizavo tris ėminius

Rezultatai

A ėminys(tuščiasis)Kaip gautas

B ėminys (miltai) C ėminys (granulės)

Kaip gautas Po dviejųmėnesių Kaip gautas Po dviejų mėne-

sių

Vidurkis [mgkg] ND 280 242 289 245SR [mgkg] mdash 045 043 040 042CVR [ ] mdash 16 18 14 17Rec [ ] 86 74 88 75

ND = neaptiktaSR = atkuriamumo standartinis nuokrypisCVR = atkuriamumo variacijos koeficientas ( )Rec = išgavos dydis ( )

E ROBENIDINO NUSTATYMAS

13-bi[(4-chlorbenziliden)amino]guanidino hidrochloridas


Šiuo metodu nustatoma robenidino koncentracija pašaruose Kiekybinio nustatymo riba ndash 5 mgkg


(1) The Analyst 108 1983 p 1 252ndash1 256

2 Metodas

Ėminys ekstrahuojamas parūgštintu metanoliu Ekstraktas džiovinamas alikvotinė ekstrakto dalis gryninamanaudojant kolonėlę su aliuminio oksidu Robenidinas iš kolonėlės plaunamas metanoliu koncentruojamas irjudančiąja faze skiedžiamas iki reikiamo tūrio Robenidino kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosiosskysčių chromatografijos (HPLC) metodu naudojant ultravioletinį detektorių

3 Reagentai

31 Metanolis

32 Parūgštintas metanolis

40 ml vandenilio chlorido rūgšties (ρ20 = 118 gml) įpilama į 500 ml matavimo kolbą skiedžiama iki žymėsmetanoliu (31) ir sumaišoma Tirpalas turi būti ruošiamas prieš naudojimą


34 Molekulinis sietas

3A tipo 8 ndash 12 mešų granulės (16ndash25 mm granulės kristalinis aliumosilikatas akučių skersmuo 03 mm)

35 Aliuminio oksidas I laipsnio rūgštinio aktyvumo skirtas chromatografijai kolonėlėje

100 g aliuminio oksido supilama į tinkamą indą ir įpilama 2 ml vandens Indas užkemšamas ir kratomasmaždaug 20 min Laikomas gerai uždarytame inde

36 Kalio dihidrofosfato tirpalas c = 0025 moll

340 g kalio dihidrofosfato ištirpinama vandenyje (HPLC grynumo) skiedžiama 1 000 ml matavimo kolboje ikižymės ir sumaišoma

37 Natrio hidrofosfato tirpalas c = 0025 moll

355 g bevandenio natrio hidrofosfato (arba 445 g dihidrato arba 895 g dodekahidrato) ištirpinama vandenyje(HPLC grynumo) skiedžiama 1 litro matavimo kolboje iki žymės ir sumaišoma


Sumaišomi šie reagentai

650 ml acetonitrilo (33)

250 ml vandens (HPLC grynumo)

50 ml kalio dihidrofosfato tirpalo (36)

50 ml natrio hidrofosfato tirpalo (37)

Filtruojama per 022 μm akytumo filtrą (46) tirpalas degazuojamas (pvz 10 min veikiant ultragarsu)

39 Etaloninė medžiaga

Grynas robenidinas 13-bi[(4-chlorbenziliden)amino]guanidino hidrochloridas

391 Rob e n i d i n o p r a d i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 3 00 μ g m l

01 mg tikslumu pasveriama 30 mg robenidino etaloninės medžiagos (39) 100 ml matavimo kolbojeištirpinama parūgštintame metanolyje (32) tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės ir sumaišoma Kolbaapvyniojama aliuminio folija ir laikoma tamsioje vietoje


392 Rob e n i d i n o t a r p i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 1 2 μ g m l

10 ml pradinio tirpalo (391) įpilama į 250 ml matavimo kolbą skiedžiama iki žymės judančiąja faze (38) irsumaišoma Kolba apvyniojama aliuminio folija ir laikoma tamsioje vietoje


Į keletą 50 ml matavimo kolbų įpilama 50 100 150 200 ir 250 ml tarpinio etaloninio tirpalo (392)Skiedžiama iki žymės judančiąja faze (38) ir sumaišoma Šių tirpalų koncentracija atitinkamai yra 12 24 3648 ir 60 μgml Šie tirpalai turi būti ruošiami prieš pat naudojimą


4 Aparatūra

41 Stiklinė kolonėlė

Pagaminta iš geltono stiklo yra su čiaupu ir maždaug 150 ml talpos vidinis skersmuo 10ndash15 mm ilgis 250 mm



44 HPLC įranga su kintamo bangos ilgio ultravioletiniu detektoriumi arba diodinės matricos detektoriumiveikiančiu 250ndash400 nm bangų ilgio intervale


45 Stiklo pluošto filtravimo popierius (Whatman GFA arba lygiavertis)



5 Procedūra

Pastaba Robenidinas yra jautrus šviesai Atliekant visus veiksmus naudojami rudo stiklo indai


511 Siekiant patikrinti ar nėra robenidino arba trukdančiųjų medžiagų atliekama pašaro tuščiojo ėminio analizė

512 Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį į jį pridedant robenidino kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyjenustatomas išgavos dydis 60 mgkg koncentracijai gauti į 250 ml kūginę kolbą įpilama 30 ml pradinioetaloninio tirpalo (391) Azoto srovėje tirpalas garinamas iki maždaug 05 ml Įdedama 15 g pašaro tuščiojoėminio sumaišoma ir prieš ekstrahavimą (52) palaukiama 10 min

Pastaba Taikant šį metodą pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminio tipą ir atliekant analizę jame neaptinkamarobenidino

52 Ekstrahavimas

001 g tikslumu pasveriama maždaug 15 g paruošto ėminio Ėminys supilamas į 250 ml kūginę kolbą į jąįpilama 100 ml parūgštinto metanolio (32) kolba užkemšama ir vieną valandą kratoma ant purtyklės (42)Tirpalas filtruojamas per stiklo pluošto filtravimo popierių (45) visas filtratas surenkamas į 150 ml kūginękolbą Pridedama 75 g molekulinio sieto (34) kolba užkemšama ir kratoma penkias minutes Iš kartofiltruojama per stiklo pluošto filtravimo popierių Toliau tirpalas gryninamas (53)


53 Gryninimas

531 A l i um i n i o o k s i d o ko l o n ė l ė s r u o š im a s

Į stiklinės kolonėlės (41) apačią įkišamas mažas stiklo vatos kamštis kuris stikline lazdele sutankinamasPasveriama 110 g paruošto aliuminio oksido (35) ir supilama į kolonėlę Siekiama kad pilant sąlytis su oru būtųkiek įmanoma mažesnis Švelniai tapšnojama per užpildomos kolonėlės apačią kad aliuminio oksidas suslūgtų


Į kolonėlę pipete įpilama 50 ml pagal 52 punktą paruošto ėminio ekstrakto Pipetės galiukas laikomas priekolonėlės sienelės ir leidžiama tirpalui susigerti į aliuminio oksidą Robenidinas iš kolonėlės išplaunamas 100 mlmetanolio (31) esant 2ndash3 mlmin srautui eliuatas surenkamas į 250 ml apvaliadugnę kolbą Metanolinistirpalas išgarinamas iki sauso likučio sukamajame garintuve (43) esant sumažintam slėgiui kai temperatūra40 oC Likutis ištirpinamas 3ndash4 ml judančiosios fazės (38) ir kiekybiškai supilamas į 10 ml matavimo kolbąApvaliadugnė kolba kelis kartus plaunama 1ndash2 ml judančiosios fazės ir šie plovimo tirpalai supilami į matavimokolbą Tuo pačiu tirpikliu skiedžiama iki žymės ir sumaišoma Alikvotinė tirpalo dalis filtruojama per 045 μmfiltrą (47) Tirpalas naudojamas analizei HPLC metodu (54)

54 HPLC nustatymas







Įpurškiamas tūris 20ndash50 μl

Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas kelis kartus įpurškiant 36 μgml koncentracijos kalibravimotirpalo (393) tol kol nustoja keistis smailių aukščio ir sulaikymo trukmės vertės


Kiekvienas kalibravimo tirpalas (393) įpurškiamas kelis kartus ir matuojami kiekvienos koncentracijos smailiųaukščiai (arba plotai) Brėžiama kalibravimo kreivė kurios ordinačių ašyje ndash kalibravimo tirpalų smailių aukščiųarba plotų vidurkiai o abscisių ašyje ndash atitinkama koncentracija μgml


Kelis kartus įpurškiamas ėminio ekstraktas (532) kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalo tūrį ir matuojamasrobenidino smailių vidutinis aukštis (plotas)


Ėminio tirpalo koncentracija μgml nustatoma pagal ėminio tirpalo robenidino smailių vidutinį aukštį (plotą) irkalibravimo kreivę (542)

Robenidino kiekis w (mgkg) ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę

w =c 200

m

kurioje

c = robenidino koncentracija ėminio tirpale μgml




71 Tapatumas



Ėminio ekstrakto tirpalo koncentracija padidinama įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (393) tūrį Pridėtorobenidino kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą robenidino kiekį

Padidinamas tik robenidino smailės aukštis įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą Smailės plotis jospusaukštyje turi atitikti pradinį plotį maždaug 10 tikslumu


Rezultatai įvertinami pagal šiuos kriterijus

a) ėminio ir etalono spektrų didžiausios absorbcijos bangos ilgis užrašomas kaip chromatogramos smailėsviršūnės bangos ilgis turi būti vienodas paklaidos ribose kurias lemia aptikimo sistemos skiriamoji gebaDiodų matricos detektoriaus tipinė vertė paprastai yra maždaug 2 nm




72 Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 10 didžiausio rezultato gauto didesniam nei 15 mgkg robenidino kiekiui

73 Išgavos dydis



Bendrija surengė tarplaboratorinį tyrimą kuriame 12ndashoje laboratorijų buvo analizuojami keturi paukščių irtriušių pašaro miltų arba granulių pavidalu ėminiai Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas du kartus Rezultataipateikiami lentelėje

Paukščiai Triušiai

Miltai Granulės Miltai Granulės

Vidurkis [mgkg] 2700 2799 436 401sr [mgkg] 146 126 144 166CVr [ ] 54 45 33 41SR [mgkg] 436 336 461 391CVR [ ] 161 120 106 97Išgavos dydis [ ] 900 933 872 802






F DIKLAZURILO NUSTATYMAS

(+)-4-chlorphenil[26-dichlor-4-(2345-tetrahidro-35-diokso-124-triazin-2-il) fenil]acetonitrilas


Metodas taikomas diklazurilui pašaruose ir premiksuose nustatyti Aptikimo riba ndash 01 mgkg ribinė nustatymovertė ndash 05 mgkg

2 Metodas

Pridėjus vidinio etalono ėminys ekstrahuojamas parūgštintu metanoliu Jei tai pašarai ekstrakto alikvotinė dalisgryninama C18 kietosios fazės ekstrahavimo tūta Iš tūtos diklazurilas išplaunamas parūgštinto metanolio irvandens mišiniu Eliuatą išgarinus likutis ištirpinamas DMF ir vandens mišinyje Jei tai premiksai ekstraktasišgarinamas ir likutis ištirpinamas DMF ir vandens mišinyje Diklazurilo kiekis nustatomas atvirkštinių faziųtrigubo gradiento efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (HPLC) naudojant ultravioletinį detektorių

3 Reagentai


32 Amonio acetatas

33 Tetrabutilamonio hidrosulfatas (TBHS)



36 N N-dimetilformamidas (DMF)


38 Etaloninė medžiaga garantuoto grynumo diklazurilas II-24 (+)-4-chlorfenil[26-dichlor-4-(2345-tetrahidro-35-diokso-124-triazin-2-il) fenil]acetonitrilas E 771

381 D i k l a z u r i l o p r a d i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 5 00 μ g m l

Į 50 ml matavimo kolbą 01 mg tikslumu pasveriama 25 mg diklazurilo etaloninės cheminės medžiagos (38)Ištirpinama DMF (36) skiedžiama DMF (36) iki žymės ir sumaišoma Kolba apvyniojama aliuminio folija arbanaudojama rudo stiklo kolba ir padedama į šaldytuvą Esant le 4 oC temperatūrai tirpalas stabilus vieną mėnesį

382 D i k l a z u r i l o e t a l o n i n i s t i r p a l a s 5 0 μ g m l

Į 50 ml matavimo kolbą įpilama 500 ml pradinio etaloninio tirpalo (381) skiedžiama iki žymės DMF (36) irsumaišoma Kolba apvyniojama aliuminio folija arba naudojama rudo stiklo kolba ir padedama į šaldytuvąEsant le 4 oC temperatūrai tirpalas stabilus vieną mėnesį

39 Vidinio etalono medžiaga 26-dichlor-α-(4-chlorfenil)-4-(45-dihidro-35-diokso-124-triazin-2(3H)-il)-α-metil-benzenacetonitrilas

391 V i d i n i o e t a l o n o p r a d i n i s t i r p a l a s 5 00 μ g m l

Į 50 ml matavimo kolbą 01 mg tikslumu pasveriama 25 mg vidinio etalono (39) Ištirpinama DMF (36)skiedžiama DMF (36) iki žymės ir sumaišoma Kolba apvyniojama aliuminio folija arba naudojama rudo stiklokolba ir padedama į šaldytuvą Esant le 4 oC temperatūrai tirpalas stabilus vieną mėnesį

392 V i d i n i o e t a l o n o t i r p a l a s 5 0 μ g m l

Į 50 ml matavimo kolbą įpilama 500 ml pradinio vidinio etalono tirpalo (391) skiedžiama iki žymės DMF (36)ir sumaišoma Kolba apvyniojama aliuminio folija arba naudojama rudo stiklo kolba ir dedama į šaldytuvąEsant le 4 oC temperatūrai tirpalas stabilus vieną mėnesį


393 P r em i k sų v i d i n i o e t a l o n o t i r p a l a s p 1 000 mg m l

(p ndash diklazurilo vardinė koncentracija premikse mgkg)

Į 100 ml matavimo kolbą 01 mg tikslumu pasveriama p10 mg vidinio etalono ultragarso vonioje (46) jisištirpinamas DMF (36) skiedžiama iki žymės DMF ir sumaišoma Kolba apvyniojama aliuminio folija arbanaudojama rudo stiklo kolba ir padedama į šaldytuvą Esant le 4 oC temperatūrai tirpalas stabilus vieną mėnesį

310 Kalibravimo tirpalas 2 μgml

Į 50 ml matavimo kolbą pipete įpilama 200 ml diklazurilo etaloninio tirpalo (382) ir 200 ml vidinio etalonotirpalo (392) Įpilama 16 ml DMF (36) skiedžiama vandeniu iki žymės ir sumaišoma Šis tirpalas turi būtiruošiamas prieš pat naudojimą

311 C18 kietosios fazės ekstrahavimo tūta pvz Bond Elut dydis 1 cm3 sorbento svoris 100 mg

312 Ekstrahavimo tirpiklis parūgštintas metanolis

Į 1 000 ml metanolio (35) pipete įpilama 50 ml vandenilio chlorido rūgšties (37) ir sumaišoma


3131 Eliuentas A amonio acetato ir tetrabutilamonio hidrosulfato mišinio tirpalas

5 g amonio acetato (32) ir 34 g TBHS (33) ištirpinama 1 000 ml vandens (31) ir sumaišoma

3132 Eliuentas B acetonitrilas (34)

3133 Eliuentas C metanolis (35)

4 Aparatūra

41 Mechaninė purtyklė

42 Įranga trigubo gradiento HPLC

421 Skysčių chromatografijos kolonėlė Hypersil ODS 3 μm dalelių įkrova 100 mm times 46 mm arba lygiavertė

422 Reguliuojamo bangos ilgio ultravioletinis detektorius arba diodų matricos detektorius



45 Vakuumavimo sistema

46 Ultragarso vonia

5 Procedūra


511 P a š a r o t u š č i a s i s ėmin y s

Analizuojamas pašaro tuščiasis ėminys siekiant patikrinti ar jame nėra diklazurilo ir trukdančių cheminiųmedžiagų Taikant šį metodą pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminio tipą ir atliekant analizę jame neaptinkamadiklazurilo arba trukdančių medžiagų

512 I š g av o s d y d ž i o n u s t a t ymo b a n d yma s

Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį į jį pridedant diklazurilo kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyjenustatomas išgavos dydis Norint pridėti 1 mgkg į 50 g pašaro tuščiojo ėminio įpilama 01 ml pradinioetaloninio tirpalo (381) gerai sumaišoma paliekama 10 min ir prieš atliekant kitą pakopą (52) kelis kartussumaišoma


Jei nėra pašaro tuščiojo ėminio kuris būtų panašus į ėminio pašarą (žr 511) išgavos dydį galima nustatytitaikant etalono pridėjimo metodą Šiuo atveju į analizuojamą ėminį pridedamas diklazurilo kiekis maždaugatitinkantis diklazurilo kiekį ėminyje Šis ėminys analizuojamas kartu su ėminiu be pridėto diklazurilo ir išgavosdydis gali būti apskaičiuotas iš skirtumo

52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i

Maždaug 50 g ėminio pasveriama 001 g tikslumu Ėminys supilamas į 500 ml kūginę kolbą įpilama 100 mlvidinio etalono tirpalo (392) 200 ml ekstrahavimo tirpiklio (312) ir kolba užkemšama Mišinys kratomas antpurtyklės (41) per naktį Paliekamas 10 min nusistovėti Į tinkamą stiklinį indą paimama tirpalo virš nuosėdųalikvotinė 20 ml dalis ir skiedžiama 20 ml vandens Šis tirpalas supilamas į ekstrahavimo tūtą (311) irsiurbiamas prijungus vakuumą (45) Tūta plaunama 25 ml ekstrahavimo tirpiklio (312) ir vandens mišinio 65+ 35 (V + V) Surinktos frakcijos išpilamos ir junginiai išplaunami 25 ml ekstrahavimo tirpiklio (312) ir vandensmišinio 80 + 20 (V + V) Ši frakcija garinama beveik iki sauso likučio sukamajame garintuve (43) esant 60 oCLikutis ištirpinamas 10 ml DMF (36) įpilama 15 ml vandens (31) ir sumaišoma Filtruojama per membraninįfiltrą (44) Toliau analizuojama HPLC metodu (53)

522 P r em i k s a i

Maždaug 1 g ėminio pasveriama 0001 g tikslumu Ėminys supilamas į 500 ml kūginę kolbą įpilama 100 mlvidinio etalono tirpalo (393) 200 ml ekstrahavimo tirpiklio (312) ir kolba užkemšama Mišinys kratomas antpurtyklės (41) per naktį Paliekamas 10 min nusistovėti Į tinkamo tūrio apvaliadugnę kolbą paimama alikvotinėtirpalo virš nuosėdų dalis 10 000p ml (p ndash vardinė diklazurilo koncentracija premikse mgkg) Garinama 60 oCtemperatūroje beveik iki sauso likučio sukamajame garintuve (43) esant sumažintam slėgiui Likutis ištirpinamas100 ml DMF (36) įpilama 150 ml vandens (31) ir sumaišoma Toliau analizuojama HPLC metodu (53)

53 HPLC nustatymas



Skysčių chromatogra-fijos kolonėlė (421)

100 mm times 46 mm Hypersil ODS 3 μmįkrova arba lygiavertė

Judančioji fazė Eliuentas A (3131) vandeninis amonio acetato ir tetrabuti-lamonio hidrosulfato mišinio tirpalas

Eliuentas B (3132) acetonitrilas

Eliuentas C (3133) metanolis

Eliuavimo būdas mdash tiesinis gradientasmdash pradinės sąlygos A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)mdash po 10 min gradientinis eliuavimas 30 min kol A + B + C = 45 + 20 + 35

(V + V + V)10 min plovimas eliuentu B



Detektoriaus bangosilgis

280 nm

Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas kelis kartus įpurškiant 20 μgml koncentracijos kalibravimotirpalo (310) tol kol nustoja keistis smailės aukščio ir sulaikymo trukmės vertės

532 K a l i b r a v imo t i r p a l a s

Kelis kartus įpurškiama 20 μl kalibravimo tirpalo (310) ir nustatomas diklazurilo bei vidinio etalono smailiųvidutinis smailės aukštis (plotas)


Kelis kartus įpurškiama 20 μl ėminio tirpalo (521 arba 522) ir nustatomas diklazurilo bei vidinio etalonosmailių vidutinis smailės aukštis (plotas)



61 Pašarai

Diklazurilo kiekis w (mgkg) ėminyje nustatomas pagal šią formulę

w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

kurioje

hd s = ėminio tirpalo (521) diklazurilo smailės aukštis (plotas)hi s = ėminio tirpalo (521) vidinio etalono smailės aukštis (plotas)hd c = kalibravimo tirpalo (310) diklazurilo smailės aukštis (plotas)hi c = kalibravimo tirpalo (310) vidinio etalono smailės aukštis (plotas)cd c = diklazurilo koncentracija kalibravimo tirpale (310) μgmlm = tiriamosios dalies svoris gV = ėminio ekstrakto tūris pagal 521 (t y 25 ml)

62 Premiksai


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

kurioje

hd c = kalibravimo tirpalo (310) diklazurilo smailės aukštis (plotas)hi c = kalibravimo tirpalo (310) vidinio etalono smailės aukštis (plotas)hd s = ėminio tirpalo (522) diklazurilo smailės aukštis (plotas)hi s = ėminio tirpalo (522) vidinio etalono smailės aukštis (plotas)cd c = diklazurilo koncentracija kalibravimo tirpale (310) μgmlm = tiriamosios dalies svoris gV = ėminio ekstrakto tūris pagal 522 (t y 25 ml)p = vardinė diklazurilo koncentracija premikse mgkg


71 Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas taikant kochromatografiją arba naudojant diodų matricos detektoriųkuriuo lyginami ėminio ekstrakto (521 arba 522) ir kalibravimo tirpalo (310) spektrai


Ėminio ekstrakto (521 arba 522) koncentracija padidinama įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (310) tūrįPridėto diklazurilo kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą diklazurilo kiekį

Padidinamas tik diklazurilo ir vidinio etalono smailių aukštis įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimąDiklazurilo arba vidinio etalono smailių plotis jų pusaukštyje turi atitikti nepadidintos koncentracijos ėminioekstrakto smailių plotį plusmn 10 tikslumu








72 Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei

mdash 30 didesnės vertės jei diklazurilo kiekis 05 mgkg ndash 25 mgkg

mdash 075 mgkg jei diklazurilo kiekis 25 mgkg ndash 5 mgkg

mdash 15 didesnės vertės jei diklazurilo kiekis didesnis nei 5 mgkg

73 Išgavos dydis

Išgavos dydis gautas (tuščiajam ėminiui) su analitės priedu yra ne mažesnis nei 80


Buvo parengtas tarplaboratorinis tyrimas kurį atliekant 11 laboratorijų tyrė penkių tipų ėminius Šiuos ėminiussudarė du premiksai vienas sumaišytas su organine matrica (O 100) kitas su neorganine matrica (A 100)Teorinė diklazurilo koncentracija ndash 100 mgkg Trijų tipų naminių paukščių pašarų mišinius pagamino trysskirtingi gamintojai (NL) (L1Z1K1) Teorinė diklazurilo koncentracija ndash 1 mgkg Laboratorijoms buvo nurodytakiekvieną ėminį analizuoti vieną arba du kartus (Išsamesnė informacija apie šį tarplaboratorinį tyrimą yrapateikta Journal of AOAC International Volume 77 Nr 6 1994 p 1 359ndash1 361) Rezultatai pateikti šioje lentelėje

1 ėminysA 100

2 ėminysO 100

3 ėminysL1

4 ėminysZ1

5 ėminysK1

L 11 11 11 11 6n 19 18 19 19 12Vidurkis 1008 1035 089 115 089Sr (mgkg) 588 764 015 002 003CVr ( ) 583 738 1732 192 334SR (mgkg) 759 764 017 011 012CVR ( ) 753 738 1861 967 1365

Vardinis kiekis mgkg) 100 100 1 1 1



Sr = pakartojamumo standartinis nuokrypis




9 Pastabos

Turi būti iš anksto parodyta kad diklazurilo atsakas matuojamų koncentracijos verčių intervale yra tiesinis

G NATRIO LASALOCIDO NUSTATYMAS

Polieterio monokarboksirūgšties natrio druska gauta iš Streptomyces lasaliensis



Šiuo metodu galima nustatyti lasalocido natrio druskos koncentraciją pašaruose ir premiksuose Aptikimo riba ndash5 mgkg kiekybinio nustatymo riba ndash 10 mgkg

2 Metodas

Natrio lasalocido druska ekstrahuojama iš ėminio parūgštintu metanoliu ir jos kiekis nustatomas atvirkštiniųfazių efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu naudojant fluorescencinį detektorių

3 Reagentai

31 Kalio dihidrofosfatas (KH2PO4)

32 Ortofosforo rūgštis w (ww) = 85

33 Ortofosforo rūgšties tirpalas c = 20

235 ml ortofosforo rūgšties (32) skiedžiama vandeniu iki 100 ml

34 6-metil-2-heptilaminas (15-dimetilheksilaminas) w (ww) = 99


36 Vandenilio chlorido rūgštis tankis = 119 gml

37 Fosfatinis buferinis tirpalas c = 001 moll

500 ml vandens (311) ištirpinama 136 g KH2PO4 (31) įpilama 35 ml ortofosforo rūgšties (32) ir 100 ml6-metil-2-heptilamino (34) Ortofosforo rūgštimi (33) nustatoma tirpalo pH 40 vandeniu (311) skiedžiama iki1 000 ml


Į 1 000 ml matavimo kolbą įpilama 50 ml vandenilio chlorido rūgšties (36) iki žymos skiedžiama metanoliu(35) ir sumaišoma Šis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat naudojimą

39 HPLC judančioji fazė fosfatinio buferinio tirpalo ir metanolio mišinys 5 + 95 (V + V)

5 ml fosfatinio buferinio tirpalo (37) sumaišoma su 95 ml metanolio (35)

310 Garantuoto grynumo natrio lasalocido etaloninė medžiaga C34H53O8Na (polieterio monokarboksirūgšties natriodruska gauta iš Streptomyces lasaliensis) E763

3101 N a t r i o l a s a l o c i d o p r a d i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 5 00 μ g m l 5 00 μ g m l

Į 100 ml matavimo kolbą 01 mg tikslumu pasveriama 50 mg natrio lasalocido (310) ištirpinamaparūgštintame metanolyje (38) iki žymos skiedžiama tuo pačiu tirpikliu ir sumaišoma Šis tirpalas turi būtiruošiamas prieš pat naudojimą

3102 N a t r i o l a s a l o c i d o t a r p i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 5 0 μ g m l

Į 100 ml matavimo kolbą pipete paimama 10 ml natrio lasalocido pradinio etaloninio tirpalo (3101) iki žymosskiedžiama parūgštintu metanoliu (38) ir sumaišoma Šis tirpalas turi būti ruošiamas prieš pat naudojimą



Į keletą 50 ml matavimo kolbų įpilama 10 20 40 50 ir 100 ml tarpinio etaloninio tirpalo (3102) iki žymosskiedžiama parūgštintu metanoliu (38) ir sumaišoma Natrio lasalocido koncentracija šiuose tirpaluose yra10 μgml 20 μgml 40 μgml 50 μgml ir 100 μgml Šie tirpalai turi būti ruošiami prieš pat naudojimą


4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia (arba purtoma vandens vonia) su temperatūros reguliavimu


43 HPLC įranga su įpurškimo sistema kuria būtų galima įpurkšti 20 μl tūrį

431 Atvirkštinių fazių skysčių chromatografijos kolonėlė 125 mm times 4 mm C18 5 μm įkrova arba lygiavertė kolonėlė

432 Reguliuojamo sužadinimo ir emisijos bangų ilgio fluorescencinis detektorius

5 Procedūra



Norint nustatyti išgavos dydį (512) analizuojamas pašaro tuščiasis ėminys siekiant patikrinti ar jame nėranatrio lasalocido ir trukdančių cheminių medžiagų Taikant šį metodą pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminiotipą ir atliekant analizę jame neaptinkama natrio lasalocido arba trukdančių medžiagų


Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį į jį pridedant natrio lasalocido kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyjenustatomas išgavos dydis Norint gauti 100 mgkg koncentraciją į 250 ml kūginę kolbą įpilama 100 mlpradinio etaloninio tirpalo (3101) ir tirpalas išgarinamas iki maždaug 05 ml Įdedama 50 g pašaro tuščiojoėminio gerai sumaišoma ir paliekama 10 min Prieš ekstrahavimą (52) dar keletą kartų maišoma

Jei nėra pašaro tuščiojo ėminio kuris būtų panašus į ėminio pašarą (žr 511) išgavos dydį galima nustatytitaikant etalono pridėjimo metodą Šiuo atveju į analizuojamą ėminį pridedamas natrio lasalocido kiekismaždaug atitinkantis natrio lasalocido kiekį ėminyje Šis ėminys analizuojamas kartu su ėminiu be pridėto natriolasalocido ir išgavos dydis gali būti apskaičiuotas iš skirtumo

52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i

Į užkemšamą 250 ml kūginę kolbą 001 g tikslumu pasveriama 5ndash10 g ėminio Įpilama 100 ml parūgštintometanolio (38) Kolba užkemšama ir sukama kad ėminys galėtų susimaišyti Kolba 20 min dedama į ultragarsovonią (41) kurioje yra maždaug 40 oC temperatūra tada išimama ir atvėsinama iki kambario temperatūrosKolba paliekama maždaug 1 h kad nusėstų suspenduotos medžiagos Alikvotinė ekstrakto dalis filtruojamaį tinkamą indą per 045 μm membraninį filtrą (42) Toliau atliekamas nustatymas HPLC metodu (53)


Į 250 ml matavimo kolbą 0001 g tikslumu pasveriama apie 2 g nemalto premikso Įpilama 100 ml parūgštintometanolio (38) Kolba sukama kad ėminys galėtų susimaišyti Kolba 20 min dedama į ultragarso vonią (41)kurioje yra maždaug 40 oC temperatūra tada išimama ir atvėsinama iki kambario temperatūros Iki žymosskiedžiama parūgštintu metanoliu (38) ir gerai sumaišoma Kolba paliekama maždaug 1 h kad nusėstųsuspenduotos medžiagos tada alikvotinė ekstrakto dalis filtruojama per 045 μm membraninį filtrą (42)Tinkamas skaidraus filtrato tūris skiedžiamas parūgštintu metanoliu (38) kad natrio lasalocido koncentracijagalutiniame bandymo tirpale būtų apie 4 μgml Toliau atliekamas nustatymas HPLC metodu (53)


53 HPLC nustatymas




125 mm times 4 mm atvirkštinių fazių C18 5 μm įkrova arba lygiavertė

Judančioji fazė (39) Fosfatinio buferinio tirpalo (37) ir metanolio (35) mišinys 5 + 95 (V + V)Srautas 12 mlminDetektoriaus bangų ilgiai

sužadinimo 310 nmemisijos 419 nm


Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas kelis kartus įpurškiant 40 μgml koncentracijos kalibravimotirpalo (3103) tol kol nustoja keistis smailės aukščio (arba ploto) ir sulaikymo trukmės vertės




Kelis kartus įpurškiama ėminio ekstrakto tirpalo gauto 521 arba 522 kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalųtūrį ir nustatomas natrio lasalocido smailių vidutiniai smailės aukščiai (plotai)


Natrio lasalocido koncentracija (μgml) nustatoma pagal įpurkšto ėminio tirpalo (533) smailių vidutinį aukštį(plotą) ir kalibravimo kreivę

61 Pašarai

Natrio lasalocido kiekis w (mgkg) ėminyje nustatomas pagal šią formulę

w =c V1

m[mgkg]

kurioje

c = natrio lasalocido koncentracija ėminio tirpale (521) μgmlV1 = ėminio ekstrakto pagal 521 tūris ml (t y 100)m = tiriamosios dalies svoris g

62 Premiksai


w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje

c = natrio lasalocido koncentracija ėminio tirpale (522) μgmlV2 = ėminio ekstrakto pagal 522 tūris ml (t y 250)f = praskiedimo faktorius pagal 522m = tiriamosios dalies svoris g


71 Tapatumas

Spektrofluorimetrija pagrįsti metodai mažiau jautrūs trukdžiams palyginti su metodais kuriuose naudojamasultravioletinis detektorius Analitės tapatumas gali būti patvirtintas kochromatografijos metodu



Į ėminio ekstraktą (521 ar 522) koncentracija padidinama įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (3103) tūrįPridėto natrio lasalocido kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą natrio lasalocido kiekį Padidinamas tiknatrio lasalocido smailių aukštis atsižvelgiant į pridėtą natrio lasalocido kiekį ir ekstrakto praskiedimą Smailėsplotis jos pusaukštyje turi atitikti pradinio ėminio ekstrakto smailių plotį plusmn 10 tikslumu

72 Pakartojamumas


mdash 15 didesnės vertės jei natrio lasalocido kiekis 30 mgkgndash100 mgkg

mdash 15 mgkg jei natrio lasalocido kiekis 100 mgkgndash200 mgkg

mdash 75 didesnės vertės jei natrio lasalocido kiekis didesnis nei 200 mgkg

73 Išgavos dydis

Išgavos dydis gautas (tuščiajam ėminiui) su analitės priedu turėtų būti ne mažesnis kaip 80 Išgavos dydisgautas premiksams su analitės priedu yra ne mažesnis nei 90


Buvo parengtas tarplaboratorinis tyrimas () 1) kurio metu 12 laboratorijų analizavo du premiksus (1 ir2 ėminiai) ir penkis pašarus (3ndash7 ėminiai) Kiekvienas ėminys analizuotas du kartus Rezultatai pateikti šiojelentelėje

1 ėminysPremiksasviščiukams

2 ėminysPremiksaskalakutams

3 ėminysGranuliuo-tas lesalaskalakutams

4 ėminysTrupininislesalas viš-čiukams

5 ėminysLesalas

kalakutams

6 ėminysLesalaspaukš-čiams A

7 ėminysLesalas

paukščiams B

L 12 12 12 12 12 12 12n 23 23 23 23 23 23 23Vidurkis [mgkg]

5 050 16 200 765 784 929 483 326

sr [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175CVr [ ] 212 252 224 284 244 400 537sR [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349CVR [ ] 566 545 503 934 569 718 1070

Vardinis kiekis[mgkg]

5 000 () 16 000()

80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()

() Gamintojo nurodytas kiekis() Laboratorijoje paruošti pašarai

L = laboratorijų skaičiusn = atskirų rezultatų skaičiussr = pakartojamumo standartinis nuokrypissR = atkuriamumo standartinis nuokrypisCVr = pakartojamumo variacijos koeficientas CVR = atkuriamumo variacijos koeficientas


() Analyst 1995 120 2 175ndash2 180

V PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI NEPAGEIDAUJAMOMS MEDŽIAGOMS PAŠARUOSE KONTROLIUOTI

A LAISVOJO IR SUMINIO GOSIPOLIO KIEKIO NUSTATYMAS


Šiuo metodu nustatomas laisvojo gosipolio suminio gosipolio ir chemiškai giminingų medžiagų kiekis medvilnėssėklose sėklų miltuose ir išspaudose bei šių pašarinių žaliavų turinčiuose kombinuotuose pašaruose kuriuose yradaugiau nei 20 mgkg laisvojo gosipolio suminio gosipolio ir chemiškai giminingų medžiagų

2 Metodas

Gosipolis esant 3-aminopropan-1-oliui ekstrahuojamas propan-2-olio ir heksano mišiniu kai reikia nustatytilaisvąjį gosipolį arba dimetilformamidu ndash suminiam gosipoliui nustatyti Anilino veikiamas gosipolis paverčiamasgosipoldianilinu kurio tirpalo optinis tankis matuojamas esant 440 nm

3 Reagentai

31 Propan-2-olio ir heksano mišinys sumaišoma 60 tūrio dalių propan-2-olio ir 40 tūrio dalių n-heksano

32 Tirpiklis A Į 1 litro matavimo kolbą įpilama maždaug 500 ml propan-2-olio ir heksano mišinio (31) 2 ml3-aminopropan-1-olio 8 ml ledinės acto rūgšties ir 50 ml vandens Skiedžiama iki žymės propan-1-olio ir heksanomišiniu (31) Šis reagentas stabilus vieną savaitę

33 Tirpiklis B 2 ml 3-aminopropan-1-olio ir 10 ml ledinės acto rūgšties pipete įpilama į 100 ml matavimo kolbąAtvėsinama iki kambario temperatūros ir skiedžiama iki žymės N N-dimetilformamidu Šis reagentas stabilus vienąsavaitę

34 Anilinas Jei atliekant tuščiąjį bandymą optinis tankis yra didesnis nei 0022 anilinas distiliuojamas su cinko dulkėmisišpilant pirmąją ir paskutiniąją 10 tūrio distiliato frakcijas Laikomas šaldytuve užkimštame rudo stiklo butelyjereagentas išsilaiko keletą mėnesių

35 Etaloninis gosipolio tirpalas A 279 mg gosipolio acetato dedama į 250 ml matavimo kolbą Druska ištirpinama irtirpalas skiedžiamas iki žymės tirpikliu A (32) 50 ml šio tirpalo pipete paimama į 250 ml matavimo kolbą irskiedžiama iki žymės tirpikliu A Gosipolio koncentracija šiame tirpale yra 002 mgml Prieš naudojant tirpalaspaliekamas stovėti kambario temperatūroje vieną valandą

36 Etaloninis gosipolio tirpalas B 279 mg gosipolio acetato dedama į 50 ml matavimo kolbą Druska ištirpinama irtirpalas skiedžiamas iki žymės tirpikliu B (33) Gosipolio koncentracija šiame tirpale yra lygi 05 mgml

Etaloniniai gosipolio tirpalai A ir B stabilūs 24 h jei apsaugomi nuo šviesos

4 Aparatūra

41 Maišiklis (vartytuvas) apsisukimų dažnis maždaug 35 min-1


5 Procedūra

51 Tiriamasis ėminys

Tiriamojo ėminio masė priklauso nuo numatomo gosipolio kiekio jame Pageidautina dirbti su mažu tiriamuojuėminiu ir palyginti didele alikvotine filtrato dalimi kurioje esančio gosipolio kiekio užtektų kad būtų įmanomastikslus fotometrinis matavimas Laisvojo gosipolio esančio medvilnės sėmenyse medvilnės sėklų miltuose irišspaudose kiekiui nustatyti tiriamojo ėminio masė yra ne didesnė nei 1 g kombinuotųjų pašarų ėminio masė galibūti iki 5 g Daugeliui atvejų pakanka 10 ml tūrio alikvotinės filtrato dalies joje yra 50ndash100 μg gosipolio Suminiogosipolio kiekiui nustatyti ėminio masė yra 05ndash50 g taigi 2 ml tūrio alikvotinėje tirpalo dalyje bus 40ndash200 μggosipolio

Analizė atliekama maždaug 20 oC aplinkos temperatūroje


52 Laisvojo gosipolio nustatymas

Tiriamasis ėminys supilamas į šlifo kamščiu užkemšamą 250 ml kolbą kurios dugne būtų stiklo duženų Pipeteįpilama 50 ml tirpiklio A (32) kolba užkemšama ir maišoma vieną valandą maišikliu Filtruojama per sausą filtrą irfiltratas surenkamas į mažą šlifo kamščiu užkemšamą kolbą Filtruojant filtro piltuvas uždengiamas laikrodžiostiklu

Filtrato alikvotinės dalys turinčios 50ndash100 μg gosipolio pipete įpilamos į dvi 25 ml matavimo kolbas (A ir B)Prireikus iki 10 ml tūrio skiedžiama tirpikliu A (32) Kolbų turinys skiedžiamas iki žymės propan-2-olio ir heksanomišiniu (31) Šis tirpalas naudojamas kaip palyginamasis pagal kurį matuojamas ėminio tirpalo optinis tankis

Į dvi kitas 25 ml matavimo kolbas (C ir D) pipete įpilama 10 ml tirpiklio A (32) Kolbos (C) turinys skiedžiamas ikižymės propan-2-olio ir heksano mišiniu (31) Šis tirpalas yra palyginamasis pagal kurį matuojamas tuščiojoėminio tirpalas

Į kiekvieną kolbą (D) ir (B) įpilama po 2 ml anilino (34) Spalvai gauti kolbos 30 min šildomos verdančio vandensvonioje Atvėsinama iki kambario temperatūros turinys skiedžiamas iki žymės propan-2-olio ir heksano mišiniu(31) tirpalas sumaišomas ir kolbos paliekamos vieną valandą stovėti

Esant 440 nm bangos ilgiui ir naudojant 1 cm storio kiuvetes spektrofotometru matuojamas tuščiojo ėminiotirpalo (D) optinis tankis lyginant jį su palyginamuoju tirpalu (C) ir ėminio tirpalo (B) optinis tankis lyginant jį supalyginamuoju tirpalu (A)

Iš ėminio tirpalo optinio tankio vertės atimama tuščiojo ėminio tirpalo optinio tankio vertė (pataisytas optinistankis) Pagal šią vertę kaip nurodyta 6 skyriuje apskaičiuojamas gosipolio kiekis ėminyje

53 Suminio gosipolio kiekio nustatymas

Tiriamasis ėminys kuriame yra 1ndash5 mg gosipolio dedamas į 50 ml matavimo kolbą ir įpilama 10 ml tirpiklioB (33) Tuo pat metu ruošiamas tuščiasis ėminys į kitą 50 ml matavimo kolbą įpilant 10 ml tirpiklio B (33) Abikolbos 30 min šildomos verdančio vandens vonioje Atvėsinama iki kambario temperatūros ir kiekvienos kolbosturinys skiedžiamas iki žymės propan-2-olio ir heksano mišiniu (31) Sumaišoma ir 10ndash15 min paliekamanusistovėti tada filtruojama ir filtratai supilami į kolbas su šlifo kamščiu

Į dvi 25 ml matavimo kolbas įpilama po 2 ml ėminio filtrato o į kitas dvi 25 ml matavimo kolbas ndash po 2 mltuščiojo ėminio filtrato Vienos kolbos iš kiekvieno rinkinio turinys skiedžiamas iki 25 ml žymės popan-2-olio irheksano mišiniu (31) Šie tirpalai bus palyginamieji tirpalai

Į kitas dvi kolbas įpilama po 2 ml anilino (34) Spalvai gauti kolbos 30 min šildomos verdančio vandens voniojeAtvėsinama iki kambario temperatūros skiedžiama iki žymės propan-2-olio ir heksano mišiniu (31) sumaišoma irpaliekama stovėti valandą

Matuojamas optinis tankis kaip nurodyta 52 punkte laisvojo gosipolio atveju Pagal šią vertę apskaičiuojamassuminis gosipolio kiekis kaip nurodyta 6 skyriuje


Rezultatai gali būti skaičiuojami pagal savitąjį optinį tankį (61) arba naudojant kalibravimo kreivę (62)

61 Pagal savitąjį optinį tankį

Savitieji optiniai tankiai aprašytomis sąlygomis turi tokias vertes

laisvojo gosipolio E11 cm

=625

suminio gosipolio E11 cm

=600


Laisvojo ar suminio gosipolio kiekis ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę

gosipolio kiekis ethTHORN = E 1 250

E 11cm p a

kurioje

E = pataisytas optinis tankis kaip nurodyta 52

p = tiriamasis ėminys g

a = alikvotinė filtrato tūrio dalis ml

62 Pagal kalibravimo kreivę

621 L a i s v a s i s g o s i p o l i s

Ruošiami du rinkiniai po penkias 25 ml matavimo kolbas Į kiekvieną rinkinio kolbą įpilamos etaloninio gosipoliotirpalo (35) 20 40 60 80 ir 10 ml alikvotinės tūrio dalys Skiedžiama tirpikliu A (32) iki 10 ml Kiekvienamrinkiniui imama dar po vieną 25 ml kolbą į kurias įpilama tik 10 ml tirpiklio A (32) (tuščiasis bandymas)

Pirmojo rinkinio kolbų (įskaitant tuščiojo ėminio kolbą) turinys skiedžiamos iki žymės propan-2-olio ir heksanomišiniu (31) (palyginamasis rinkinys)

Į kiekvieną antrojo rinkinio kolbą (įskaitant tuščiojo ėminio kolbą) įpilama po 2 ml anilino (34) Spalvai gautikolbos 30 min šildomos verdančio vandens vonioje Kolbos aušinamos iki kambario temperatūros jų turinysskiedžiamas iki žymės propan-2-olio ir heksano mišiniu (31) sumaišoma ir paliekama stovėti vieną valandą(etalonų rinkinys)

Etalonų rinkinio tirpalų optinis tankis matuojamas kaip nurodyta 52 lyginant su atitinkamais palyginamojorinkinio tirpalais Braižoma kalibravimo kreivė optinį tirpalų tankį pateikiant kaip gosipolio kiekio (μg) funkciją

622 S um i n i s g o s i p o l i s

Ruošiamos šešios 50 ml tūrio matavimo kolbos Į pirmą kolbą įpilama 10 ml tirpiklio B (33) į kitas ndash atitinkamai20 40 60 80 ir 10 ml etaloninio gosipolio tirpalo B (36) Kiekvienos kolbos turinys skiedžiamas iki 10 mltirpikliu B (33) Šildoma 30 min verdančio vandens vonioje Atvėsinama iki kambario temperatūros skiedžiama ikižymės propan-2-olio ir heksano mišiniu (31) ir sumaišoma

Po 2 ml šių tirpalų įpilama į du rinkinius po šešias 25 ml matavimo kolbas Pirmojo rinkinio matavimo kolbųturinys skiedžiamas iki 25 ml žymės propan-2-olio ir heksano mišiniu (31) (palyginamųjų tirpalų rinkinys)

Į kiekvieną antrojo rinkinio kolbą įpilama po 2 ml anilino (34) Kolbos 30 min šildomos verdančio vandensvonioje Kolbos atvėsinamos iki kambario temperatūros jų turinys skiedžiamas iki žymės propan-2-olio ir heksanomišiniu (31) sumaišoma ir paliekama stovėti vieną valandą (etalonų rinkinys)

Etaloninio rinkinio tirpalų optinis tankis matuojamas kaip nurodyta 52 lyginant su atitinkamais palyginamojorinkinio tirpalais Braižoma kalibravimo kreivė optinį tirpalų tankį pateikiant kaip gosipolio kiekio (μg) funkciją

63 Pakartojamumas


mdash 15 didesnės koncentracijos kai gosipolio kiekis yra mažesnis nei 500 mgkg

mdash 75 mgkg absoliučiąja verte kai gosipolio kiekis yra ne mažesnis nei 500 mgkg ir ne didesnis kaip750 mgkg

mdash 10 didesnės koncentracijos kai gosipolio kiekis yra didesnis nei 750 mgkg


B DIOKSINŲ (PCDDPCDF) IR DIOKSINŲ TIPO PCB KIEKIO NUSTATYMAS

I ĖMINIŲ ĖMIMO METODAI IR ANALIZĖS REZULTATŲ AIŠKINIMAS


Ėminiai skirti dioksinų (polichlorinuotų dibenzo-p-dioksinų (PCDD) ir polichlorintų dibenzofuranų (PCDF)) irdioksinų tipo polichlorintų bifenilų (PCB) (1) kiekio pašaruose oficialiai kontrolei turi būti imami pagal I priedonuostatas Pašaruose tolygiai pasiskirsčiusių medžiagų arba produktų kontrolei turi būti taikomi kiekybiniaireikalavimai kaip numatyta I priedo 5A punkte Laikoma kad tokiais metodais paimti jungtiniai ėminiai yrareprezentatyvieji pašarų partijų arba jų dalių iš kurių jie paimti ėminiai Atitiktis didžiausiems kiekiamspateiktiems Europos Parlamento ir Tarybos Direktyvoje 200232EB (2) turi būti nustatyta pagal laboratoriniuoseėminiuose gautus kiekius

2 Partijos arba partijos dalies atitiktis specifikacijai

Partija priimama jei atskiros analizės rezultatas yra ne didesnis už atitinkamą didžiausią kiekį nustatytą Direktyvoje200232EB atsižvelgiant į matavimo neapibrėžtį

Partija neatitinka Direktyvoje 200232EB nustatyto didžiausio kiekio jei viršutinės ribos (3) analizės rezultatasįskaitant matavimo neapibrėžtį patvirtintas atliekant kartotinę analizę (4) be jokios pagrįstos abejonės yra didesnisuž didžiausią kiekį


(1) Dioksinų furanų ir dioksinų tipo PCB TEF (toksinio ekvivalentiškumo faktorių) lentelė

Struktūrinis analogas TEF vertė Struktūrinis analogas TEF vertė

Dibenzo-p-dioksinai (PCDD) Dioksinų tipo PCB2378-TCDD 112378-PeCDD 1 Ne orto-PCB123478-HxCDD 01 PCB 77 00001123678-HxCDD 01 PCB 81 00001123789-HxCDD 01 PCB 126 011234678-HpCDD 001 PCB 169 001OCDD 00001 Mono-orto-PCB

PCB 105 00001Dibenzofuranai (PCDF) PCB 114 000052378-TCDF 01 PCB 118 0000112378-PeCDF 005 PCB 123 0000123478-PeCDF 05 PCB 156 00005123478-HxCDF 01 PCB 157 00005123678-HxCDF 01 PCB 167 000001123789-HxCDF 01 PCB 189 00001234678-HxCDF 011234678-HpCDF 0011234789-HpCDF 001OCDF 00001

Vartojamos santrumpos T ndash tetra Pe ndash penta Hx ndash heksa Hp ndash hepta O ndash okta CDD ndash chlordibenzo-p-dioksinas CDF ndashchlordibenzofuranas CB ndash chlorbifenilas

(2) OL L 140 2002 5 30 p 10(3) Sąvoka bdquoviršutinė ribaldquo taikoma kai vertinant kiekvieno kiekybiškai nenustatyto struktūrinio analogo indėlį į suminį TEF naudojama jo

kiekybinio nustatymo ribaSąvoka bdquoapatinė ribaldquo taikoma kai kiekvieno kiekybiškai nenustatyto struktūrinio analogo indėlis į suminį TEF įvertinamas nuliuSąvoka bdquovidurinė ribaldquo taikoma kai vertinant kiekvieno kiekybiškai nenustatyto struktūrinio analogo indėlį į suminį TEF naudojama pusėkiekybinio nustatymo ribos vertės

(4) Kartotinė analizė yra būtina tam kad būtų pašalinta ėminių vidinio tarpusavio užteršimo arba atsitiktinio sumaišymo galimybėPirmosios analizės rezultatas atsižvelgus į matavimo neapibrėžtį yra naudojamas atitikčiai patikrintiJei analizė atliekama užteršimo dioksinais incidentui tirti patvirtinimas atliekant kartotinę analizę nebūtinas jei analizei atrinkti ėminiaisieties keliu yra susieti su užteršimo dioksinais incidentu

Į matavimo neapibrėžtį galima atsižvelgti vienu iš šių būdų

mdash apskaičiuojant išplėstinę neapibrėžtį taikant aprėpties faktorių 2 kuris užtikrina maždaug 95 patikimumolygį Partija neatitinka jei atėmus U išmatuota vertė yra didesnė už didžiausią kiekį Jei dioksinai ir dioksinųtipo PCB nustatomi atskirai dioksinų ir dioksinų tipo PCB sumai turi būti naudojama dioksinų ir dioksinųtipo PCB atskirų analizės rezultatų išplėstinės neapibrėžties suma

mdash nustatant sprendimo ribą (CCα) pagal Komisijos sprendimą 2002657EB (1) (priedo 3125 punktasmedžiagų su nustatytu leidžiamuoju kiekiu atvejis) Partija neatitinka jei išmatuota vertė yra lygi arba didesnėkaip CCα

Šios aiškinimo taisyklės taikomos analizės rezultatui kuris gaunamas oficialiai kontrolei skirtam ėminiui Josneatima valstybėms narėms teisės taikyti gynybos ir arbitražo tikslams nacionalines taisykles

II ĖMINIŲ RUOŠIMAS IR REIKALAVIMAI KELIAMI ANALIZĖS METODAMS KURIE TAIKOMI DIOKSINŲ(PCDDPCDF) IR DIOKSINŲ TIPO PCB KIEKIAMS OFICIALIAI KONTROLIUOTI


Šie reikalavimai taikomi kai pašarų žaliavos ir pašarai analizuojami dioksinams (polichlorintiems dibenz-p-dioksinams (PCDD) ir polichlorintiems dibenzfuranams (PCDF)) ir dioksinų tipo polichlorbifenilams (PCB)nustatyti

Dioksinų buvimas pašaruose gali būti kontroliuojamas atrankos metodu kad būtų galima atrinkti ėminius kuriuosedioksinų ir dioksinų tipo PCB kiekiai būtų 25 mažesni arba didesni nei nagrinėjamas kiekis Ėminiuose sudideliais dioksinų (PCDDPCDF) ir PCB kiekiais jų koncentracijos turi būti nustatomos (patvirtinamos)patvirtinamuoju metodu

Atrankos metodai ndash tai metodai taikomi aptikti dioksinus ir dioksinų tipo PCB kurių kiekis atitinka nagrinėjamąkiekį Ėminių analizės šiais metodais našumas yra didelis ir jie taikomi dideliam skaičiui ėminių atsijoti nustatantgalimai teigiamus ėminius Jie yra specialiai sukurti klaidingiems neigiamiems rezultatams išvengti

Patvirtinamieji metodai ndash tai metodai suteikiantys visą arba papildomą informaciją kuri leidžia vienareikšmiškaiidentifikuoti ir kiekybiškai nustatyti dioksinus ir dioksinų tipo PCB kurių kiekis atitinka nagrinėjamą kiekį

2 Pagrindimas

Kadangi aplinkos ir biologiniuose ėminiuose (įskaitant pašarų žaliavų arba pašarų ėminius) paprastai yra sudėtingųįvairių dioksinų struktūrinių analogų mišinių rizikos įvertinimui palengvinti buvo sukurta toksinio ekvivalentiš-kumo faktorių (TEF) koncepcija Šios TEF vertės yra nustatytos norint į 2378-padėtį pakeistų PCDD bei PCDFmišinių ir dioksinų tipo aktyvumą turinčių kai kurių ne į orto-padėtį ir į orto-padėtį monochlorintų PCBkoncentraciją išreikšti 2378-TCDD toksiškumo ekvivalentais (TE) Atskirų cheminių medžiagų koncentracija tamtikrame ėminyje dauginama iš jų atitinkamo TEF ir sandaugos sudedamos kad būtų gauta TE išreikšta suminėdioksinų tipo junginių koncentracija

Tik šiame reglamente laikoma kad priimta atskiro struktūrinio analogo tam tikra kiekybinio nustatymo riba yraėminio ekstrakto analitės koncentracija kuriai esant gaunamas prietaiso atsakas dviem skirtingiems kontro-liuojamiems jonams kai mažesnio jautrumo signalo SN (signalo ir triukšmo) santykis yra 31 ir vykdomipagrindiniai reikalavimai pvz sulaikymo trukmės ir izotopų santykio pagal nustatymo procedūrą aprašytą EPA1613 metodo B versijoje

3 Kokybės užtikrinimo reikalavimai kurių būtina laikytis ruošiant ėminius

Taikomos II priede pateiktos pagrindinės analizuojamų ėminių ruošimo nuostatos

Papildomai būtina atitikti šiuos reikalavimus

mdash ėminiai turi būti laikomi ir vežami talpyklose pagamintose iš stiklo aliuminio polipropileno ar polietileno Išėminių talpyklų turi būti pašalinti popieriaus dulkių pėdsakai Stikliniai indai plaunami tirpikliais kurie prieštai patikrinti dėl dioksinų buvimo


(1) OL L 221 2002 8 17 p 8

mdash analizuojamas tuščiasis ėminys atliekant visą analizės procedūrą be ėminio

mdash ekstrakcijai paimto ėminio masės turi pakakti tam kad būtų įvykdyti metodo jautrio reikalavimai

4 Reikalavimai laboratorijoms

mdash Laboratorijos įrodo metodo tinkamumą nagrinėjamų koncentracijos verčių intervale pvz 05 1 ir 2 kartusdidesnių už nagrinėjamą koncentraciją esant priimtinam kartotinės analizės variacijos koeficientuiPriimtinumo kriterijų detalės pateikto 5 punkte

mdash Patvirtinamojo metodo kiekybinio nustatymo riba neturėtų būti didesnė kaip viena penktoji nagrinėjamoskoncentracijos vertės kad nagrinėjamos koncentracijos intervale būtų galima užtikrinti priimtinus variacijoskoeficientus

mdash Kaip vidinės kokybės kontrolės priemonės reguliariai turi būti atliekama tuščiųjų ėminių kontrolė ir analitėspridėjimo bandymai arba kontrolinių ėminių analizė (jei įmanoma sertifikuotosios pamatinės medžiagos)

mdash Geriausias būdas įrodyti kompetenciją atlikti specifines analizes būtų sėkmingas dalyvavimas laboratorijoskvalifikaciją įvertinančiuose tarplaboratoriniuose tyrimuose Tačiau sėkmingas dalyvavimas tarplaboratori-niuose pvz dirvožemio arba nuotekų ėminių tyrimuose nebūtinai patvirtina kompetenciją analizuoti maistoproduktų arba pašarų ėminius kurie yra mažiau užteršti Todėl privalomas nuolatinis dalyvavimastarplaboratoriniuose tyrimuose nustatant dioksinų ir dioksinų tipo PCB koncentraciją atitinkamų pašarų(maisto produktų) matricose

mdash Laboratorijas turi akredituoti patvirtinta institucija veikianti pagal ISO Guide 58 siekiant užtikrinti kadlaboratorijos taikytų analizės kokybės garantiją Laboratorijos akredituotos pagal ISOIEB170251999standartą

5 Reikalavimai dioksinų ir dioksinų tipo PCB analizės procedūroms

Pagrindiniai analizės procedūrų priimtinumo reikalavimai

mdash Didelis jautris ir mažos aptikimo ribos Aptinkami PCDD ir PCDF kiekiai turi būti pikogramo TE (10-12 g)eilės dėl labai didelio kai kurių iš šių junginių toksiškumo Žinoma kad PCB kiekiai būna didesni nei PCDD irPCDF junginių Daugeliui PCB struktūrinių analogų pakanka nanogramo (10-9 g) eilės jautrio Tačiau nustatantlabiau toksiškus dioksinų tipo PCB struktūrinius analogus (ypač ne į orto-padėtį pakeistus struktūriniusanalogus) turi būti pasiektas jautris atitinkantis PCDD ir PCDF junginių nustatymo jautrį

mdash Didelis atrankumas (specifiškumas) Reikia atskirti PCDD PCDF ir dioksinų tipo PCB nuo didelio skaičiauskitų kartu ekstrahuojamų ir galbūt analizei trukdančių junginių kurių koncentracija gali būti keliomis eilėmisdidesnė nei nagrinėjamų analičių Taikant dujų chromatografijosmasės spektrometrijos (GCMS) metodusbūtina atskirti įvairius struktūrinius analogus pvz toksinius (pvz septyniolika į 2378-padėtį pakeistųPCDD bei PCDF junginių ir dioksinų tipo PCB) ir kitus struktūrinius analogus Biologiniais tyrimais taip patturi būti įmanoma atrankiai nustatyti TE vertes kaip PCDD PCDF ir dioksinų tipo PCB sumą

mdash Didelis tikslumas (teisingumas ir glaudumas) Atliekant nustatymą gaunamas patikimas tikrosioskoncentracijos ėminyje įvertis Didelis tikslumas (matavimo tikslumas matavimo rezultato ir tikrosios arbapriskirtosios matavimo vertės atitikimo artumas) yra būtinas siekiant išvengti ėminio analizės rezultatoatmetimo dėl mažo TE įverčio patikimumo Tikslumas išreiškiamas kaip teisingumas (išmatuotos vidutinėsanalitės koncentracijos sertifikuotoje medžiagoje vertės ir analitės koncentracijos sertifikuotos vertėsskirtumas išreikštas šios vertės procentais) ir kaip glaudumas (variacijos koeficientas kitaip santykinisstandartinis nuokrypis apskaičiuotas pagal atkuriamumo sąlygomis gautus rezultatus)

Atrankos metodus gali sudaryti biologiniai tyrimai ir GCMS metodai patvirtinamuosius metodus ndash didelėsskiriamosios gebos dujų chromatografijos didelės skiriamosios gebos masės spektrometrijos (HRGCHRMS)metodai


Suminė TE vertė turi atitikti šiuos kriterijus

Atrankos metodai Patvirtinamieji metodai

Klaidingai neigiamų rezultatų dalis lt 1

Teisingumas nuo ndash 20 iki + 20

Glaudumas variacijos koeficientas lt 30 lt 15

6 Specifiniai reikalavimai gcms metodams kuriuos būtina atitikti atliekant atranką arba patvirtinimą

mdash Siekiant patvirtinti analizės procedūros tinkamumą prieš pat analizės pradžią arba ją tik pradėjus pvz priešekstrahavimą turi būti pridedama į 2378-padėtis chlorintų PCDDF vidinių etalonų su žymėtaisiais13C atomais ir dioksinų tipo PCB vidinių etalonų su žymėtaisiais 13C atomais Turi būti pridedama bent vienostruktūrinio analogo kiekvienai nuo tetra- iki oktachlorintų PCDDF homologų grupei ir bent vienostruktūrinio analogo kiekvienai dioksinų tipo PCB homologų grupei (kita vertus pridedama bent vienostruktūrinio analogo kiekvienai masės spektrometrijai taikomai kontroliuoti PCDDF ir dioksinų tipo PCBpasirinkto jono registravimo funkcijai) Būtų aiškiai geriau ypač taikant patvirtinimo metodus naudoti visus17 į 2378-padėtį pakeistų PCDDF vidinius etalonus su žymėtaisiais 13C atomais ir visus 12 dioksinų tipoPCB vidinius etalonus su žymėtaisiais 13C atomais

mdash Be to naudojant atitinkamus kalibravimo tirpalus nustatomi struktūrinių analogų kurių analogo sužymėtaisiais 13C atomais nededama santykiniai atsako faktoriai

mdash Jei augalinės ir gyvūninės kilmės pašarai turi mažiau kaip 10 riebalų vidinius etalonus būtina pridėti priešekstrahavimą Jei gyvūninės kilmės pašarai turi daugiau kaip 10 riebalų vidinius etalonus galima pridėtiarba prieš ekstrahavimą arba po riebalų ekstrahavimo Ekstrahavimo veiksmingumas patvirtinamas pagal taikurioje stadijoje pridedama vidinio etalono ir atsižvelgiant į tai ar rezultatai pateikiami pagal produkto arriebalų kiekį

mdash Prieš GCMS analizę turi būti pridedamas 1 arba 2 atgavimo (pakeitimo) etalonas (-ai)

mdash Būtina išgavos kontrolė Taikant patvirtinamuosius metodus atskirų vidinių etalonų išgavos dydis turi būti60 ndash120 intervale Priimtinos didesnės arba mažesnės atskirų struktūrinių analogų išgavos dydžio vertėsypač kai kurių hepta- ir oktachlorintų dibenzdioksinų ir dibenzfuranų jei jų indėlis į TE vertę yra ne didesniskaip 10 suminės TE vertės (pagrįstos PCDDF ir dioksinų tipo PCB suma) Atrankos metodų atveju išgavosdydis turi būti 30 ndash140 intervale

mdash Dioksinų ir trukdančių chlorintų junginių pvz ne dioksinų tipo PCB ir chlorintų difenileterių atskyrimasatliekamas taikant tinkamus chromatografijos metodus (pageidautina naudoti florisilo aliuminio oksido ir(arba) aktyvintųjų anglių kolonėlę)

mdash Dujų chromatografijos pakanka izomerams atskirti (lt 25 tarp 123478-HxCDF ir 123678-HxCDFsmailių)

mdash Nustatymas atliekamas pagal EPA 1613 metodo B versija Tetra- through octa-chlorinated dioxins and furans byisotope dilution HRGCHRMS arba kitą lygiavertes taikymo charakteristikas turintį metodą

mdash Jei pašarų užteršimas dioksinais (PCDDPCDF) turi būti lygus arba didesnis kaip didžiausias leidžiamas kiekisskirtumas tarp viršutinės ir apatinės ribų neturi būti didesnis kaip 20 Jei pašarų užteršimas daug mažesnisnei didžiausias leidžiamas kiekis skirtumas gali būti 25 ndash 40 intervale

7 Atrankai taikomi analizės metodai

71 Įvadas

Taikant atrankos metodą analizė gali būti atliekama skirtingais būdais vien tik atranka ir kiekybinis būdas


A t r a n ko s bū d a s

Ėminių atsakas lyginamas su nagrinėjamos koncentracijos etaloninio ėminio atsaku Ėminiai kurių atsakasmažesnis kaip etaloninio ėminio laikomi neigiamais ėminiai kurių atsakas yra didesnis laikomi teigiamaisReikalavimai

mdash į kiekvieną bandymų seriją turi būti įtrauktas tuščiasis ir etaloninis (-iai) ėminys (-iai) kurie ekstrahuojami iranalizuojami tuo pat metu ir tomis pačiomis sąlygomis Etaloninio ėminio atsakas turi būti aiškiai didesnisnei tuščiojo ėminio atsakas

mdash įtraukiami papildomi etaloniniai ėminiai kurių koncentracija būtų 05 ir 2 kartus didesnė nei nagrinėjamakoncentracija siekiant parodyti bandymo tinkamas charakteristikas koncentracijos intervale atitinkančiamekontroliuojamą koncentraciją

mdash turi būti įrodytas etaloninio (-ų) ėminio (-ių) tinkamumas bandant kitas matricas pirmiausia įtraukiant tuosėminius kurių HRGCHRMS analizė parodė kad jų TE koncentracija yra artima etaloninio ėminiokoncentracijai arba jei jo nėra iki tokios koncentracijos padidintai tuščiojo ėminio koncentracijai

mdash kadangi atliekant biologinius tyrimus negalima naudoti vidinių etalonų labai svarbūs pakartojamumobandymai norint turėti informaciją apie tos pačios bandymų serijos standartinį nuokrypį Variacijoskoeficientas turi būti mažesnis nei 30

mdash atliekant biologinius tyrimus apibrėžiami tiksliniai junginiai galimi trukdžiai ir didžiausios leidžiamostuščiojo ėminio koncentracijos vertės

K i e k y b i n i s bū d a s

Taikant kiekybinį metodą būtinai naudojama etalonų skiedimo serija dvigubas arba trigubas gryninimas irmatavimas taip pat tuštieji ir išgavos kontroliniai bandymai Rezultatas gali būti išreikštas kaip TE tuo darantprielaidą kad signalą duoda junginiai kurie atitinka TE principą Tai galima atlikti naudojant TCDD (arba dioksinųfuranųdioksinų tipo PCB etaloninį mišinį) kalibravimo kreivei gauti pagal kurią apskaičiuojama TE koncentracijaekstrakte taigi ir ėminyje Vėliau daroma šios koncentracijos pataisa atsižvelgiant į TE koncentraciją tuščiajameėminyje (norint įvertinti naudotuose tirpikliuose ir cheminėse medžiagose esančias priemaišas) ir į išgavos dydį(apskaičiuotą pagal TE koncentraciją kokybės kontrolės ėminyje artimą nagrinėjamai ribinei koncentracijai) Būtinapažymėti kad tariamo išgavos dydžio sumažėjimo priežastimi iš dalies gali būti matricos veiksniai ir TEF verčiųatliekant biologinius tyrimus bei PSO nustatytų oficialiųjų TEF verčių skirtumas

72 Reikalavimai atrankai taikomiems analizės metodams

mdash Atrankai gali būti taikomi GCMS analizės metodai ir biologiniai tyrimai GCMS metodams taikomi 6 punktenustatyti reikalavimai Specifiniai reikalavimai ląstelių biologiniams tyrimams nustatyti 73 punkte rinkiniusnaudojantiems biologiniams tyrimams ndash 74 punkte

mdash Būtina turėti klaidingai teigiamų ir klaidingai neigiamų rezultatų skaičiaus duomenis gautus dideliam ėminiųkurių koncentracija būtų mažesnė ir didesnė už didžiausią leidžiamą arba veiksmų reikalaujančiąkoncentracijos vertę rinkiniui rezultatus lyginant su TE koncentracija gauta patvirtinamuoju analizėsmetodu Faktinė klaidingai neigiamų ėminių dalis turi būti mažesnė nei 1 Klaidingai teigiamų ėminių dalisyra pakankamai maža kad atrankos priemonių taikymas būtų naudingas

mdash Teigiamus rezultatus visuomet būtina patvirtinti taikant patvirtinamąjį analizės metodą (HRGCHRMS) Be toplataus TE intervalo ėminiai patvirtinami HRGCHRMS (maždaug 2 ndash10 neigiamų ėminių) Pateikiamainformacija apie biologinio tyrimo ir HRGCHRMS rezultatų atitiktį

73 Specifiniai reikalavimai ląstelių biologiniams tyrimams

mdash Atliekant biologinį tyrimą kiekvienam bandymui reikalinga etaloninių TCDD arba dioksinųfuranų mišiniokoncentracijos verčių serija (visa koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivė kai R2 gt 095) Tačiauanalizuojant mažos koncentracijos ėminius atrankai galima naudoti didesnio mastelio mažų koncentracijosverčių kreivės dalį

mdash Pastovios trukmės biologinio tyrimo rezultatams kokybės kontrolės lentelėje naudojama TCDD etaloninėkoncentracija (apie 3 kartus didesnė nei kiekybinio nustatymo riba) Taip pat būtų galima naudoti etaloninioėminio santykinį atsaką lyginamą su TCDD kalibravimo kreive nes ląstelių atsakas gali priklausyti nuodidelio skaičiaus veiksnių

mdash Užrašomos ir tikrinamos kiekvieno tipo pamatinės medžiagos kokybės kontrolės (KK) schemos siekiantužtikrinti kad rezultatas atitiktų nustatytas rekomendacijas


mdash Naudojamo ėminio skiedimo indukcija turi būti tiesiojoje atsako kreivės dalyje ypač atliekant kiekybiniusapskaičiavimus Ėminiai kurių atsakas yra aukščiau atsako kreivės tiesiosios dalies turi būti praskiesti irbandymas pakartotas Todėl vienu metu rekomenduojama tirti bent trijų koncentracijos verčių praskiestustirpalus arba daugiau

mdash Kiekvieno ėminio to paties praskiedimo tris kartus kartojamo nustatymo standartinis nuokrypis yra nedidesnis nei 15 o atliekant tris nepriklausomus bandymus ndash ne didesnis nei 30

mdash Aptikimo riba gali būti nustatyta kaip tirpiklio tuščiojo ėminio arba fono atsako standartinis nuokrypispadaugintas iš 3 Kitas būdas ndash taikyti atsaką kuris yra didesnis už fono atsaką (indukcijos faktorius 5 kartusdidesnis nei tirpiklio tuščiojo ėminio) apskaičiuotą pagal tos dienos kalibravimo kreivę Kiekybinionustatymo riba gali būti nustatyta kaip tirpiklio tuščiojo ėminio arba fono atsako standartinis nuokrypispadaugintas iš 5ndash6 arba taikyti atsaką kuris yra aiškiai didesnis už fono atsaką (indukcijos faktorius 10 kartųdidesnis už tirpiklio tuščiojo ėminio) apskaičiuotą pagal tos dienos kalibravimo kreivę

74 Specifiniai reikalavimai biologiniams tyrimams kuriuose naudojami rinkiniai

mdash Būtina užtikrinti kad biologinių tyrimų kuriuose naudojami rinkiniai jautrio ir patikimumo pakaktų kadtyrimus būtų galima taikyti pašarams

mdash Turi būti laikomasi gamintojo nurodytų ėminių ruošimo ir analizės instrukcijų

mdash Bandymų rinkiniai nenaudojami pasibaigus jų naudojimo laikui

mdash Nenaudojamos medžiagos arba komponentai skirti naudoti su kitais rinkiniais

mdash Bandymų rinkiniai laikomi esant temperatūrai atitinkančiai nurodytą laikymo temperatūros intervalą irnaudojami esant nurodytai darbinei temperatūrai

mdash Imunologinių bandymų aptikimo riba yra nustatoma kaip vidurkio ir iš 3 padauginto standartinio nuokrypiogauto 10 kartų kartojant tuščiojo ėminio analizę suma padalyta iš tiesinės regresijos lygties kryptieskoeficiento vertės

mdash Laboratorijoje naudojami palyginamieji etalonai kad būtų galima patikrinti ar atsakas į etaloną atitinkapriimtiną intervalą

8 Rezultatų pateikimas

Jei įmanoma pagal taikomą analizės metodiką analizės rezultatuose nurodomi atskirų PCDDF ir PCB struktūriniųanalogų kiekiai pateikti kaip apatinis ribinis įvertis viršutinis ribinis įvertis ir vidurinis ribinis įvertis kad rezultatųataskaitoje būtų kuo daugiau informacijos ir todėl juos būtų galima aiškinti pagal specifinius reikalavimus

Ataskaitoje taip pat nurodomas ėminio lipidų kiekis taip pat jų ekstrahavimo metodas

Turi būti pateikti atskirų vidinių etalonų atgavimo duomenys jei atgavimo vertės neatitinka 6 punkte nurodytointervalo ribų jei viršijamas didžiausias kiekis ir paprašius visais kitais atvejais

Kadangi būtina atsižvelgti į matavimo neapibrėžtį kai sprendžiama dėl ėminio atitikties šis parametras taip patnurodomas Todėl analizės rezultatai ataskaitoje pateikiami kaip x +- U čia x ndash analizės rezultatas U ndash išplėstinėmatavimo neapibrėžtis taikant aprėpties faktorių 2 kuris užtikrina maždaug 95 patikimumo lygį Jei dioksinai irdioksinų tipo PCB nustatomi atskirai dioksinų ir dioksinų tipo PCB sumai turi būti naudojama dioksinų ir dioksinųtipo PCB atskirų analizės rezultatų išplėstinės neapibrėžties suma

Jei į matavimo neapibrėžtį atsižvelgiama taikant CCα (kaip aprašyta šios B dalies I skyriaus 2 skirsnyje) šisparametras pateikiamas ataskaitoje


VI PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI GYVŪNINĖS KILMĖS SUDEDAMOSJIOMS DALIMS NUSTATYTI ATLIEKANTOFICIALIĄJĄ PAŠARŲ KONTROLĘ

Pašarų sudedamųjų gyvūninės kilmės dalių mikroskopinio aptikimo identifikavimo ar įvertinimo sąlygos


Šios sąlygos turi būti taikomos kai gyvūninės kilmės sudedamosios dalys (apibrėžtos kaip produktai gautiperdirbant žinduolių naminių paukščių ir žuvų kūnus ir kūnų dalis) nustatomos pašaruose atliekant mikroskopinįtyrimą pagal suderintą patikrinimo programą gyvūnų mitybos srityje laikantis Europos Parlamento ir Tarybosreglamento (EB) Nr 8822004 (1) nuostatų Jei šiame priede pateikti metodai taikomi visuose oficialiuosetyrimuose gali būti atliekamas antrasis tyrimas taikant šių metodų variantus arba alternatyviuosius metodussiekiant pagerinti tam tikrų gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių nustatymą ar papildomai tikslinti gyvūninės kilmėssudedamųjų dalių kilmę Be to nustatant tam tikras specifines gyvūninės kilmės sudedamąsias dalis pvz plazmą arkaulus lajuje (žr dar 9 punktą) galima naudoti kito tipo protokolą jei šios analizės papildo analizes numatytaspagal suderintą patikrinimo programą

2 Jautris

Atsižvelgiant į gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių prigimtį pašaruose galima nustatyti labai mažus (lt 01 )kiekius

3 Metodas

Identifikavimui naudojamas tinkamai paruoštas reprezentatyvusis ėminys paimtas pagal I priede pateiktasnuostatas Šis protokolas tinka mažai drėgmės turintiems pašarams Daugiau kaip 14 drėgmės turintys pašaraiprieš apdorojimą džiovinami (tirštinami) Tam tikri pašarai ar pašaruose naudojamos medžiagos (pvz riebalaialiejai) turi būti specialiai apdorojami (žr 9 punktą) Gyvūninės kilmės sudedamosios dalys identifikuojamos pagaltipines mikroskopu nustatomas savybes (t y raumenų skaidulas ir kitas mėsos daleles kremzles kaulus ragusplaukus šerius kraują plunksnas kiaušinių lukštus žuvų kaulus žvynus) Būtina identifikuoti ėminio sieto frakciją(61) ir koncentruotas nuosėdas (62)

4 Reagentai

41 Įliejimo medžiaga

411 Chloralio hidratas (vandeninis 60 mV)

412 Šarmo tirpalas (NaOH 25 mV arba KOH 25 mV) sieto frakcijoms

413 Parafininė alyva arba glicerolis (klampa 68ndash81) nuosėdų mikroskopiniam stebėjimui

42 Plovikliai

421 Alkoholis 96

422 Acetonas

43 Koncentravimo medžiagos

431 Tetrachloretilenas (tankis 162)


(1) OL L 165 2004 4 30 p 1

44 Dažymo reagentai

441 Jodo ir kalio jodido tirpalas (2 g kalio jodido ištirpinama 100 ml vandens ir dažnai purtant pridedama 1 g jodo)

442 Alizarino raudonasis (25 ml 1 moll vandenilio chlorido rūgšties skiedžiama 100 ml vandens ir į šį tirpalą įdedama200 mg alizarino raudonojo)

443 Cistino reagentas (2 g švino acetato 10 g NaOH100 ml H2O)

444 Jodo ir kalio jodido tirpalas (tirpalas 70 etanolyje)

45 Balinimo reagentas

451 Komercinis natrio hipochlorito tirpalas (96 veikliojo chloro)

5 Įranga ir priedai

51 Analizinės svarstyklės (tikslumas 001 g išskyrus koncentruotoms nuosėdoms 0001 g)

52 Malimo priemonės (malūnas arba grūstuvė ypač pašarų analizuojant turinčių gt 15 riebalų)

53 Sietas su kvadratinėmis akutėmis kurių didžiausias plotis 050 mm

54 Dalijamasis piltuvas arba nusodinimo stiklinė kūginiu dugnu

55 Stereomikroskopas (didinimas ne mažiau kaip 40)

56 Sudėtinis mikroskopas (didinimas ne mažiau kaip 400) praeinamosios šviesos arba poliarizuotosios šviesos

57 Tipiniai laboratoriniai stikliniai indai

Visa įranga turi būti kruopščiai išvalyta Dalijamuosius piltuvus ir stiklinius indus reikia plauti plovimo mašinojeSietus reikia valyti kietų šerių šepečiu

6 Procedūra

Granuliuotus pašarus galima pirma išsijoti jei abi frakcijos analizuojamos kaip atskiri ėminiai

Apdorojama ne mažiau kaip 50 g ėminio (jei reikia ėminys atsargiai sumalamas naudojant tinkamą malimo įrangą(52) kad būtų gauta tinkama struktūra) Paimamos dvi reprezentatyviosios ėminio dalys Viena ndash sieto frakcijai(61) (ne mažiau kaip 5 g) kita ndash koncentruotoms nuosėdoms (62) (ne mažiau kaip 5 g) Galima papildomaiidentifikuoti naudojant dažymo reagentus (63)

Siekiant nustatyti gyvūninių baltymų prigimtį ir dalelių kilmę galima naudoti sprendimų patvirtinimo sistemąpvz ARIES o etaloniniai ėminiai gali būti patvirtinami dokumentais

61 Gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių identifikavimas sieto frakcijose

Ne mažiau kaip 5 g ėminio sijojama per sietą (53) į dvi frakcijas

Sieto frakcija (-os) (arba frakcijos reprezentatyvioji dalis) kurią (-as) sudaro didelės dalelės plonu sluoksniupaskleidžiama (-os) ant tinkamo pagrindo ir gyvūninės kilmės sudedamosios dalys sistemingai atrenkamos postereomikroskopu (55) esant įvairiam didinimui

Sieto frakcija (-os) kurią (-as) sudaro mažos dalelės dedamos ant objektinio stiklelio ir gyvūninės kilmėssudedamosios dalys sistemingai atrenkamos po sudėtiniu mikroskopu (56) esant įvairiam didinimui


62 Gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių identifikavimas koncentruotose nuosėdose

Ne mažiau kaip 5 g (001 tikslumu) ėminio dedama į dalijamąjį piltuvą arba nusodinimo stiklinę ir apdorojamabent 50 ml tetrachloretileno (431) Mišinys kelis kartus purtomas arba maišomas

mdash Jei naudojamas uždaromas dalijamasis piltuvas jis paliekamas pakankamai ilgai stovėti kad nusėstų nuosėdos(mažiausiai 3 min) Pakartotinai purtoma ir vėl mažiausiai tris minutes laukiama nuosėdų susidarymoNuosėdos vėl turi atsiskirti

mdash Jei naudojama atvira stiklinė ji paliekama stovėti bent 5 min kad nuosėdos galėtų atsiskirti

Visos nuosėdos išdžiovinamos ir vėliau sveriamos (0001 g tikslumu) Sverti būtina tik jei reikia apskaičiuoti kiekįJei nuosėdose yra daug didelių dalelių jos gali būti sijojamos per sietą (53) į dvi frakcijas Išdžiovintos nuosėdostiriamos ieškant kaulų sudedamųjų dalių po stereomikroskopu (55) ir sudėtiniu mikroskopu (56)

63 Įliejimo medžiagų ir dažymo reagentų naudojimas

Gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių identifikavimą galima palengvinti naudojant specialias įliejimo medžiagas irdažymo reagentus

Chloralio hidratas (411) Atsargiai šildant ląstelių sandarą galima matyti aiškiau nes krakmolo grūdeliai virstageliu ir pašalinamas nereikalingas ląstelių turinys

Šarmo tirpalas (412) Natrio ar kalio hidroksidas nuvalo pašaro medžiagą padėdamas aptikti raumenų skaidulasplaukus ir kitas keratino struktūras

Parafininė alyva ir glicerolis (413) Šioje įliejimo medžiagoje galima gerai identifikuoti kaulų sudedamąsiasdalis nes didesnė įdubų dalis lieka užpildyta oru ir jos atrodo kaip juodos maždaug 5ndash15 μm skylės

Jodo ir kalio jodido tirpalas (441) Naudojamas krakmolui (mėlynai violetinė spalva) ir baltymams (geltonaioranžinė spalva) aptikti Prireikus tirpalus galima skiesti

Alizarino raudonojo tirpalas (442) Kaulus žuvų kaulus ir žvynus nudažo raudona ir rožine spalva Priešdžiovinant nuosėdas (žr 62 skirsnį) visos nuosėdos supilamos į stiklinį mėgintuvėlį ir du kartus plaunamosmaždaug 5 ml alkoholio (421) (kiekvieną kartą naudojama sūkurinė maišyklė tirpalui leidžiama nusistovėtimaždaug vieną minutę ir išpilamas) Prieš dažant šiuo reagentu nuosėdos balinamos įpilant bent 1 ml kaliohipochlorito tirpalo (451) Reakcija turi vykti 10 min Į mėgintuvėlį įpilama vandens nuosėdoms leidžiamanusistovėti 2ndash3 min tada vanduo ir suspenduotos dalelės išpilamos Nuosėdos plaunamos dar du kartus maždaug10 ml vandens (kiekvieną kartą naudojama sūkurinė maišyklė leidžiama nusistovėti ir vanduo išpilamas) Įlašinamanuo dviejų iki dešimt arba daugiau (atsižvelgiant į nuosėdų kiekį) alizarino raudonojo tirpalo lašų Mišinyspurtomas ir reakcijai leidžiama vykti kelias sekundes Nusidažiusios nuosėdos du kartus plaunamos maždaug 5 mlalkoholio (421) ir vieną kartą acetonu (422) (kiekvieną kartą naudojama sūkurinė maišyklė tirpalas paliekamasnusistovėti apie vieną minutę ir išpilamas) Nuosėdos paruoštos džiovinimui

Cistino reagentas (443) Atsargiai šildant cistino turinčių sudedamųjų dalių (plaukų plunksnų ir pan) spalvatampa juodai ruda

64 Pašarų kurie gali turėti žuvų miltų tyrimas

Bent po vieną objektinį stiklelį su sieto ir su nuosėdų smulkiosiomis frakcijomis tiriama po sudėtiniu mikroskopu(žr 61 ir 62 skirsnius)

Kai etiketėje nurodyta kad yra žuvų miltų sudėtinių dalių arba įtariama kad jų yra arba jų buvo rasta pradiniotyrimo metu tiriami bent du papildomi objektiniai stikleliai su pradinio ėminio smulkiąja sieto frakcija ir visanuosėdų frakcija

7 Apskaičiavimas ir įvertinimas

Valstybės narės užtikrina kad atliekant oficialų tyrimą gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių kiekiui įvertinti (ne tikbuvimui nustatyti) yra laikomasi šiame skyriuje nurodytų procedūrų

Apskaičiuoti galima tik tokiu atveju jei gyvūninės kilmės sudedamosios dalys turi kaulų dalelių


Sausumos šiltakraujų rūšių (t y žinduolių ir naminių paukščių) kaulų dalelės ir įvairių tipų žuvų kaulai antmikroskopo objektinio stiklelio gali būti atskirti pagal tipines įdubas Gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių dalisėminio medžiagoje įvertinama atsižvelgiant į

mdash įvertintą kaulų dalelių dalį ( masės) koncentruotose nuosėdose ir

mdash kaulų dalelių dalį ( masės) gyvūninės kilmės sudedamose dalyse

Įvertis turi būti pagrįstas bent trimis (jei įmanoma) objektiniais stikleliais ir bent penkiais laukais viename stiklelyjeDažniausiai kombinuotųjų pašarų koncentruotose nuosėdose yra ne tik sausumos gyvūnų ir žuvų kaulų dalelių betir kitų didelio tankio dalelių pvz mineralų smėlio sumedėjusių augalų dalių ir panašių dalelių

71 Apskaičiuotoji kaulų dalelių procentinės dalies vertė

sausumos gyvūnų kaulų dalelių = (S times c)W

žuvų kaulų ir žvynų dalelių = (S times d)W

(S ndash nuosėdų masė (mg) c ndash nuosėdose esančių sausumos gyvūnų kaulų dalelių apskaičiuotosios dalies pataisosfaktorius ( ) d ndash nuosėdose esančių žuvų kaulų ir žvynų dalelių apskaičiuotosios dalies pataisos faktorius( ) W ndash nuosėdoms gauti paimto ėminio medžiagos masė (mg))

72 Apskaičiuotoji gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių vertė

Kaulų dalis gyvūniniuose produktuose gali būti labai skirtinga (Kaulų dalelių dalis kaulų miltuose yra 50ndash60 o mėsos miltuose ndash 20ndash30 žuvų miltuose kaulų ir žvynų kiekis skiriasi atsižvelgiant į žuvies miltų rūšį ir kilmę irpaprastai lygus 10ndash20 )

Jei yra žinomas ėminyje esančių gyvūninių miltų tipas galima įvertinti kiekį

Sausumos gyvūnų produktų sudedamųjų dalių apskaičiuotas kiekis ( ) = (S times c)(W times f) times 100

Žuvų produktų sudedamųjų dalių apskaičiuotas kiekis ( ) = (S times d)(W times f) times 100

(S ndash nuosėdų masė (mg) c ndash nuosėdose esančių sausumos gyvūnų kaulų sudedamųjų dalių apskaičiuotosios daliespataisos faktorius ( ) d ndash nuosėdose esančių žuvų kaulų ir žvynų dalelių apskaičiuotosios dalies pataisosfaktorius ( ) f ndash kaulų dalies tirto ėminio gyvūninės kilmės sudedamosiose dalyse pataisos faktoriusW ndash nuosėdoms gauti paimto ėminio medžiagos masė (mg))

8 Tyrimo rezultato išraiška

Ataskaitoje pateikiama bent jau informacija apie sudedamąsias dalis gautas iš sausumos gyvūnų ir žuvies miltųApie skirtingus atvejus galėtų būti pateikta taip

81 Apie sausumos gyvūnų kilmės sudedamąsias dalis

mdash kiek buvo įmanoma įžiūrėti mikroskopu sausumos gyvūnų kilmės sudedamųjų dalių pateiktame ėminyjenebuvo rasta

arba

mdash kiek buvo įmanoma įžiūrėti mikroskopu pateiktame ėminyje buvo rastos sausumos gyvūnų kilmėssudedamosios dalys

82 Apie žuvų miltų kilmės sudedamąsias dalis

mdash kiek buvo įmanoma įžiūrėti mikroskopu žuvų miltų kilmės sudedamųjų dalių pateiktame ėminyje nebuvorasta

arba

mdash kiek buvo įmanoma įžiūrėti mikroskopu pateiktame ėminyje buvo rastos žuvų miltų kilmės sudedamosiosdalys


Jei buvo rasta žuvų arba sausumos gyvūnų kilmės sudedamųjų dalių tyrimo rezultatų ataskaitoje jei reikia gali būtinurodomas nustatytų sudedamųjų dalių apskaičiuotas kiekis (x lt 01 01ndash05 05ndash5 arba gt 5 )papildomai nurodomas jei įmanoma sausumos gyvūnų tipas ir nustatytos gyvūninės kilmės sudedamosios dalys(raumenų skaidulos kremzlės kaulai ragai plaukai šeriai plunksnos kraujas kiaušinių lukštai žuvų kaulaižvynai)

Tai atvejais kai apskaičiuojamas gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių kiekis turi būti nurodytas pataisos faktorius f

Tais atvejais kai nustatoma kad yra sausumos gyvūnų kaulų dalelių ataskaitoje turi būti papildomas sakinys

bdquoNegalima atmesti galimybės kad pirmiau nurodytos sudedamosios dalys yra gautos iš žinduoliųldquo

Šis papildomas sakinys nebūtinas tais atvejais kai nustatoma kad sausumos gyvūnų kaulų dalelės yra naminiųpaukščių arba žinduolių kaulų dalelės

9 Neprivalomas riebalų ar aliejų analizės protokolas

Riebalams arba aliejui analizuoti gali būti naudojamas šis protokolas

mdash kieti riebalai šildomi pvz mikrobangų krosnyje tol kol suskystėja

mdash 40 ml riebalų iš ėminio indo dugno pipete paimama į centrifugavimo mėgintuvėlį

mdash centrifuguojama 10 min 4 000 min-1 dažniu

mdash jei po centrifugavimo riebalai yra kieti jie dar kartą šildomi mikrobangų krosnyje tol kol suskystėja Dar kartącentrifuguojama 5 min 4 000 min-1 dažniu

mdash šaukšteliu ar mentele pusė nuo skysčio atskirtų nuosėdų dedama į mažą Petri lėkštelę arba ant objektiniostiklelio kad mikroskopu būtų nustatytas galimas gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių turinys (mėsosskaidulos plunksnos kaulų dalelės ) Kaip įliejimo medžiagą atliekant mikroskopinį tyrimą rekomenduo-jama naudoti parafininę alyvą arba glicerolį

mdash likusios nuosėdos naudojamos nusodinimui kaip aprašyta 62 skirsnyje


VII PRIEDAS

PAUKŠČIŲ KOMBINUOTŲJŲ PAŠARŲ ENERGINĖS VERTĖS APSKAIČIAVIMO METODAS

1 Energinės vertės apskaičiavimo metodas ir išraiška

Paukščių kombinuotųjų pašarų energinė vertė turi būti apskaičiuojama pagal toliau nurodytą formulę atsižvelgiantį pašarų tam tikrų analizuojamų komponentų procentines dalis Ši energinė vertė turi būti išreiškiama kaip medžiagųapykaitos energija (ME) megadžauliais (MJ) vienam kombinuotųjų pašarų kilogramui darant pataisą azotui

ME MJkg = 01551 times žalių baltymų kiekio + 03431 times žalių riebalų + 01669 times krakmolo + 01301 times sacharidų kiekio (išreikšto sacharoze)

2 Leidžiamosios nuokrypos taikytinos nurodytoms energinėms vertėms

Jei oficialaus tikrinimo metu nustatoma tikrinimo rezultatų ir nurodytos energinės vertės neatitiktis (mažesnė arbadidesnė pašarų energinė vertė) mažiausia ME leidžiamoji nuokrypa yra 04 MJkg

3 Rezultatų išraiška

Pritaikius anksčiau nurodytą formulę gautas rezultatas turi būti pateikiamas vieno ženklo po kablelio tikslumu

4 Ėminių ėmimo ir analizės metodai

Apskaičiavimo metode nurodytas kombinuotųjų pašarų ėminių ėmimas ir analizuojamų komponentų kiekionustatymas turi būti atliekamas pagal Bendrijos mėginių ėmimo metodus ir analizės metodus taikomus atliekantkombinuotųjų pašarų oficialią kontrolę

Būtina taikyti

mdash nustatant žalių riebalų kiekį III priedo H dalyje pateikto žalių aliejų ir riebalų nustatymo metodo B procedūra

mdash nustatant krakmolo kiekį poliarimetrinį metodą pateiktą III priedo L dalyje


VIII PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI TAIKOMI VYKDANT DAUGIAU NELEIDŽIAMŲ NAUDOTI PAŠARŲ PRIEDŲNETEISĖTO BUVIMO KONTROLĘ

Svarbios pastabos

Atliekant daugiau neleidžiamų naudoti pašarų priedų neteisėto buvimo kontrolę galima taikyti metodus kurie būtųjautresni nei šiame priede pateikti metodai

Šiame priede pateikti analizės metodai naudojami patvirtinimo tikslais

A METILBENZOKVATO NUSTATYMAS

7-benziloksi-6-butil-3-metoksikarbonil-4-chinolonas


Šiuo metodu galima nustatyti metilbenzokvato koncentraciją pašaruose Kiekybinio nustatymo riba ndash 1 mgkg

2 Metodas

Metilbenzokvatas ekstrahuojamas metansulfonrūgšties tirpalu metanolyje Ekstraktas gryninamas dichlormetanutaikant jonų mainų chromatografiją po to vėl dichlormetanu Metilbenzokvato kiekis nustatomas atvirkštiniųfazių efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (HPLC) naudojant ultravioletinį detektorių

3 Reagentai

31 Dichlormetanas



Metanolio (32) ir vandens (HPLC grynumo) mišinys 75 + 25 (V + V)

Tirpalas filtruojamas per 022 μm filtrą (45) ir degazuojamas (pvz 10 min ultragarsu)

34 Metansulfonrūgšties tirpalas c = 2

200 ml metansulfonrūgšties skiedžiama iki 1 000 ml metanoliu (32)

35 Vandenilio chlorido rūgšties tirpalas c = 10

100 ml vandenilio chlorido rūgšties (ρ20 118 gml) skiedžiama iki 1 000 ml vandeniu

36 Katijonitinė derva Amberlite CG-120 (Na) 100 ndash 200 mešų

Prieš naudojimą derva apdorojama paruošiama 100 g dervos ir 500 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (35)suspensija kuri ant kaitlentės pakaitinama nuolat maišant iki virimo Paliekama atvėsti po to rūgštis nupilamaRūgšties likutis per filtravimo popierių nusiurbiamas vakuume Derva du kartus plaunama 500 ml vandens ir poto 250 ml metanolio (32) Derva plaunama dar 250 ml metanolio ir džiovinama siurbiant orą per dervossluoksnį ant filtro Išdžiovinta derva laikoma užkimštame butelyje


37 Etaloninė medžiaga grynas metilbenzokvatas (7-benziloksi-6-butil-3-metoksikarbonil-4-chinolonas)

371 Me t i l b e n z o k v a t o p r a d i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 5 00 μ g m l

01 mg tikslumu pasveriama 50 mg etaloninės medžiagos (37) 100 ml matavimo kolboje ištirpinamametansulfonrūgšties tirpale (34) skiedžiama iki žymės ir sumaišoma

372 Me t i l b e n z o k v a t o t a r p i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 5 0 μ g m l

5 ml pradinio etaloninio tirpalo (371) įpilama į 50 ml matavimo kolbą skiedžiama iki žymės metanoliu (32) irsumaišoma


Į keletą 25 ml matavimo kolbų įpilama 10 20 30 40 ir 50 ml metilbenzokvato tarpinio etaloninio tirpalo(372) Skiedžiama iki žymės judančiąja faze (33) ir sumaišoma Šių tirpalų metilbenzokvato koncentracijaatitinkamai yra 20 40 60 80 ir 100 μgml Šie tirpalai turi būti ruošiami prieš pat naudojimą

4 Aparatūra

41 Laboratorinė purtyklė


43 Stiklinė kolonėlė (250 mm times 15 mm) su čiaupu maždaug 200 ml talpos





5 Procedūra


511 Atliekama pašaro tuščiojo ėminio analizė siekiant patikrinti ar nėra metilbenzokvato arba trukdančiųjųmedžiagų

512 Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį į jį pridedant metilbenzokvato kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyjenustatomas išgavos dydis 15 mgkg koncentracijai gauti į 10 g pašaro tuščiojo ėminio reikia įpilti 600 μlpradinio etaloninio tirpalo (371) sumaišyti ir prieš ekstrahavimą (52) palaukti 10 min (52)

Pastaba Šiame metode pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminio tipą ir atliekant analizę jame neturi būti aptiktametilbenzokvato

52 Ekstrahavimas

001 g tikslumu pasveriama maždaug 20 g paruošto ėminio ir supilama į 250 ml kūginę kolbą Įpilama 100 mlmetansulfonrūgšties tirpalo (34) ir kolba 30 min mechaniškai kratoma ant purtyklės (41) Tirpalas filtruojamasper filtravimo popierių filtratas naudojamas skysčių fazėms atkirti (53)

53 Skysčių fazių atskyrimas

Į 500 ml talpos dalijamąjį piltuvą kuriame yra 100 ml vandenilio chlorido rūgšties tirpalo (35) įpilama 250 mlpagal 52 punktą gauto filtrato Į piltuvą įpilama 100 ml dichlormetano ir purtoma vieną minutę Palaukiamasluoksnių atsiskyrimo ir apatinis (dichlormetaninis) sluoksnis išleidžiamas į apvaliadugnę 500 ml kolbąVandeninio sluoksnio ekstrahavimas pakartojamas su dviem papildomomis 40 ml dichlormetano porcijomis šieekstraktai supilami kartu su pirmuoju ekstraktu į tą pačią apvaliadugnę kolbą Sukamajame garintuve (42) esantsumažintam slėgiui dichlormetaninis ekstraktas išgarinamas iki sauso likučio 40 oC temperatūroje Likutiskolboje ištirpinamas 20ndash25 ml metanolio (32) kolba užkemšama šis visas ekstraktas paliekamas jonų mainųchromatografijai atlikti (54)


54 Jonų mainų chromatografija

541 K a t i j o n i t o ko l o n ė l ė s r u o š im a s

Į stiklinio vamzdžio (43) apačią įkišamas mažas stiklo vatos kamštis Paruošiama 50 g apdoroto katijonito (36)ir 50 ml vandenilio chlorido rūgšties (35) suspensija kuri supilama į stiklinę kolonėlę kurioje dervai leidžiamanusėsti Rūgšties perteklius išleidžiamas kad ji vos apsemtų dervos sluoksnį kolonėlė plaunama vandeniu tol kolplovimo vanduo tampa neutralus pagal lakmusą Į kolonėlę įpilama 50 ml metanolio (32) kuris išleidžiamas ikidervos sluoksnio viršaus

542 Ch r oma t o g r a f i n ė a n a l i z ė ko l o n ė l ė j e

Atsargiai pipete į kolonėlę įpilamas pagal 53 punktą gautas ekstraktas Apvaliadugnė kolba plaunama dviem5ndash10 ml metanolio (32) porcijomis ir šie plovimo skysčiai supilami į kolonėlę Ekstraktas nuleidžiamas ikidervos viršaus kolonėlė plaunama 50 ml metanolio užtikrinant kad srautas būtų ne didesnis kaip 5 mlminIštekėjęs skystis išpilamas Metilbenzokvatas iš kolonėlės plaunamas 150 ml metansulfonrūgšties tirpalo (34)eliuatas surenkamas į 250 ml kūginę kolbą


Pagal 542 punktą gautas eliuatas supilamas į 1 litro talpos dalijamąjį piltuvą Kūginė kolba plaunama 5ndash10 mlmetanolio (32) plovimo tirpalas sujungiamas su dalijamojo piltuvo turiniu Įpilama 300 ml vandenilio chloridorūgšties tirpalo (35) ir 130 ml dichlormetano (31) Purtoma 1 min palaukiama sluoksnių atsiskyrimo Apatinis(dichlormetaninis) sluoksnis išleidžiamas į 500 ml apvaliadugnę kolbą Vandeninio sluoksnio ekstrahavimaskartojamas su dviem papildomomis 70 ml dichlormetano porcijomis šie ekstraktai supilami kartu su pirmuojuį tą pačią apvaliadugnę kolbą

Sukamajame garintuve (42) esant sumažintam slėgiui dichlormetaninis ekstraktas išgarinamas iki sauso likučio40 oC temperatūroje Likutis kolboje ištirpinamas maždaug 5 ml metanolio (32) ir gautas tirpalas kiekybiškaisupilamas į 10 ml matavimo kolbą Apvaliadugnė kolba plaunama dar dviem 1ndash2 ml metanolio porcijomisplovimo skysčiai supilami į tą pačią matavimo kolbą Metanoliu skiedžiama iki žymės ir sumaišoma Alikvotinėtirpalo dalis filtruojama per membraninį filtrą (46) Šis tirpalas paliekamas nustatymui HPLC metodu (56)

56 HPLC nustatymas



mdash skysčių chromatografijos kolonėlė (441)

mdash HPLC judančioji fazė metanolio ir vandens mišinys (33)

mdash srautas 1ndash15 mlmin

mdash detektoriaus bangos ilgis 265 nm

mdash įpurškiamas tūris 20ndash50 μl



Kiekvienas kalibravimo tirpalas (373) įpurškiamas kelis kartus ir matuojami kiekvienos koncentracijos smailiųaukščiai (plotai) Brėžiama kalibravimo kreivė kurios ordinačių ašyje ndash kalibravimo tirpalų smailių aukščių arbaplotų vidurkiai o abscisių ašyje ndash atitinkama koncentracija μgml


Kelis kartus įpurškiamas ėminio ekstraktas (55) kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalo tūrį ir matuojamasmetilbenzokvato smailių vidutinis aukštis (plotas)


Ėminio tirpalo koncentracija μgml nustatoma pagal ėminio tirpalo metilbenzokvato smailių vidutinį aukštį(plotą) ir kalibravimo kreivę (562)


Metilbenzokvato kiekis w (mgkg) ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę

w =c 40m

kurioje

c = metilbenzokvato koncentracija ėminio tirpale μgmlm = tiriamosios dalies svoris gramais


71 Tapatumas



Ėminio ekstrakto koncentracija padidinama įpilant reikiamą tarpinio etaloninio tirpalo (372) tūrį Pridėtometilbenzokvato kiekis turi atitikti įvertintą metilbenzokvato kiekį ėminio ekstrakte

Padidinamas tik metilbenzokvato smailės aukštis atsižvelgiant į pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą Smailėsplotis jos pusaukštyje turi atitikti pradinį plotį maždaug 10 tikslumu



a) ėminio ir etalono spektrų didžiausios absorbcijos bangos ilgis užrašomas kaip chromatogramos smailėsviršūnės bangos ilgis turi būti vienodas paklaidos ribose kurias lemia aptikimo sistemos skiriamoji gebaDiodų matricos detektoriaus tipinė vertė būtų maždaug 2 nm

b) nuo 220 nm iki 350 nm ėminio ir etalono spektras užrašytas apie chromatogramos smailės viršūnę šiomsspektro dalims turi nesiskirti 10ndash100 santykinio optinio tankio intervale Šis kriterijus vykdomas kai yratie patys maksimumai ir jokiame matavimo taške dviejų spektrų skirtumas nėra didesnis kaip 15 etalonoanalitės optinio tankio vertės

c) nuo 220 nm iki 350 nm ėminio ekstraktui gautos smailės kylančios viršūnės ir nusileidžiančios daliųspektrai šioms spektro dalims turi nesiskirti vienas nuo kito 10ndash100 santykinio optinio tankio intervaleŠis kriterijus vykdomas kai yra tie patys maksimumai ir visuose stebimuose taškuose spektrų skirtumas yrane didesnis kaip 15 smailės viršūnę atitinkančio optinio tankio vertės


72 Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis kaip 10 didesnėsvertės kai metilbenzokvato kiekis 4ndash20 mgkg

73 Išgavos dydis



10ndashyje laboratorijų buvo analizuojami 5 ėminiai Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas du kartus

Tuščiasis ėmi-nys Miltai 1 Granulės 1 Miltai 2 Granulės 2

Vidurkis [mgkg] ND 450 450 890 870sr [mgkg] mdash 030 020 060 050



CVr [ ] mdash 670 440 670 570sR [mgkg] mdash 040 050 090 100CVR [ ] mdash 890 1110 1010 1150Išgavos dydis [ ] mdash 9200 9300 9200 8900

ND = neaptiktasr = pakartojamumo standartinis nuokrypisCVr = pakartojamumo variacijos koeficientas sR = atkuriamumo standartinis nuokrypisCVR = atkuriamumo variacijos koeficientas

B OLAKVINDOKSO NUSTATYMAS

2-[N-2-(hidroksietil)karbamoil]-3-metilchinoksalin-N1N4-dioksidas


Šiuo metodu galima nustatyti olakvindokso koncentraciją pašaruose Kiekybinio nustatymo riba ndash 5 mgkg

2 Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandens ir etanolio mišiniu Olakvindokso kiekis nustatomas atvirkštinių faziųefektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu naudojant ultravioletinį detektorių

3 Reagentai

31 Metanolis




Vandens (33) ir metanolio (32) mišinys 900 +100 (V + V)

35 Etaloninė medžiaga grynas olakvindoksas 2-[N-2-(hidroksietil)karbamoil]-3-metilchinoksalin-N1N4-dioksidasE 851

351 O l a k v i n d o k s o p r a d i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 2 50 μ g m l

Į 200 ml matavimo kolbą 01 mg tikslumu pasveriama 50 mg olakvindokso (35) ir įpilama apie 190 mlvandens Kolba 20 min dedama į ultragarso vonią (41) Po apdorojimo ultragarsu tirpalas atvėsinamas ikikambario temperatūros iki žymės skiedžiama vandeniu ir sumaišoma Kolba apvyniojama aliuminio folija irlaikoma šaldytuve Šis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo kiekvieną mėnesį

352 O l a k v i n d o k s o t a r p i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 2 5 μ g m l

100 ml pradinio etaloninio tirpalo (351) įpilama į 100 ml matavimo kolbą skiedžiama iki žymės judančiąjafaze (34) ir sumaišoma Kolba apvyniojama aliuminio folija ir laikoma šaldytuve Šis tirpalas turi būti ruošiamasiš naujo kiekvieną dieną


Į keletą 50 ml matavimo kolbų įpilama 10 ml 20 ml 50 ml 100 ml 150 ml ir 200 ml tarpinio etaloniniotirpalo (352) Skiedžiama iki žymės judančiąja faze (34) ir sumaišoma Kolba apvyniojama aliuminio folijaŠiuose tirpaluose yra 05 μgml 10 μgml 25 μgml 50 μgml 75 μgml ir 100 μgml olakvindokso

Šie tirpalai turi būti ruošiami iš naujo kiekvieną dieną


4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia





5 Procedūra

Pastaba Olakvindoksas yra jautrus šviesai Visi veiksmai turėtų būti atliekami susilpnintoje šviesoje arba turėtųbūti naudojami rudo stiklo indai


511 Atliekama pašaro tuščiojo ėminio analizė siekiant patikrinti ar nėra olakvindokso arba trukdančiųjų medžiagų

512 Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį į jį pridedant olakvindokso kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyjenustatomas išgavos dydis 50 mgkg koncentracijai gauti į 250 ml kūginę kolbą įpilama 100 ml pradinioetaloninio tirpalo (351) ir tirpalas garinamas iki maždaug 05 ml Įdedama 50 g pašaro tuščiojo ėminio geraisumaišoma ir prieš ekstrahavimą (52) palaukiama 10 min kelis kartus maišant

Pastaba Šiame metode pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminio tipą ir atliekant analizę jame neturi būti aptiktaolakvindokso

52 Ekstrahavimas

001 g tikslumu pasveriama maždaug 50 g ėminio Supilama į 1 000 ml kūginę kolbą įpilama 100 ml metanolio(31) ir kolba 5 min dedama į ultragarso vonią (41) Įpilama 410 ml vandens ir kolba 15 min paliekamaultragarso vonioje Kolba išimama iš ultragarso vonios 30 min purtoma purtykle (42) ir filtruojama pergofruotąjį filtrą 100 ml filtrato įpilama į 20 ml matavimo kolbą iki žymės skiedžiama vandeniu ir sumaišomaĖminys filtruojamas per membraninį filtrą (44) (žr 9 pastabą) Atliekami HPLC nustatymas (53)

53 HPLC nustatymas



Analizės kolonėlė (431)

Judančioji fazė (34) vandens (33) ir metanolio (32) mišinys 900 + 100 (V + V)



380 nm




Kiekvienas kalibravimo tirpalas (353) įpurškiamas kelis kartus ir matuojami kiekvienos koncentracijos smailiųaukščiai (plotai) Brėžiama kalibravimo kreivė kurios ordinačių ašyje ndash kalibravimo tirpalų smailių aukščių(plotų) vidurkiai o abscisių ašyje ndash atitinkama koncentracija μgml


Kelis kartus įpurškiamas ėminio ekstraktas (52) kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalo tūrį ir matuojamasolakvindokso smailių vidutinis aukštis (plotas)



Ėminio tirpalo koncentracija μgml nustatoma pagal ėminio tirpalo olakvindokso smailių vidutinį aukštį (plotą) irkalibravimo kreivę (532)

Olakvindokso kiekis w (mgkg) ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę

w =c 1000

m

kurioje

c = olakvindokso koncentracija ėminio ekstrakte (52) μgml

m = tiriamosios dalies svoris g (52)


71 Tapatumas

Analitės tapatumas gali būti patvirtintas taikant kochromatografiją arba naudojant diodų matricos detektoriųkuriuo lyginami ėminio ekstrakto (52) ir 50 μgml koncentracijos kalibravimo tirpalo (353) spektrai


Ėminio ekstrakto (52) koncentracija padidinama įpilant reikiamą tarpinio etaloninio tirpalo (353) tūrį Pridėtoolakvindokso kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą olakvindokso kiekį

Padidinamas tik olakvindokso smailės aukštis įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą Smailės plotis jospusaukštyje plusmn 10 tikslumu turi atitikti olakvindokso ekstrakto smailės pradinį plotį







72 Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis kaip 10 didesnėsvertės kai olakvindokso kiekis 10ndash200 mgkg

73 Išgavos dydis




EB surengė tarplaboratorinius tyrimus kurių metu 13ndashoje laboratorijų buvo tiriami keturi paršelių pašarųėminiai įskaitant pašaro tuščiąjį ėminį Rezultatai pateikiami toliau

1 ėminys 2 ėminys 3 ėminys 4 ėminys

L 13 10 11 11n 40 40 44 44vidurkis [mgkg] mdash 146 480 954Sr [mgkg] mdash 082 205 636SR [mgkg] mdash 162 428 842CVr [ ] mdash 56 43 67CVR [ ] mdash 111 89 88

vardinis kiekis[mgkg] mdash 15 50 100Išgavos dydis mdash 973 960 954

L = laboratorijų skaičiusn = atskirų verčių skaičiussr = pakartojamumo standartinis nuokrypisSR = atkuriamumo standartinis nuokrypisCVr = pakartojamumo variacijos koeficientasCVR = atkuriamumo variacijos koeficientas

9 Pastaba

Nors metodo tinkamumas nebuvo patvirtintas pašarams kuriuose olakvindokso yra daugiau kaip 100 mgkgpatenkinamus rezultatus galima gauti naudojant mažesnės masės ėminį ir (arba) skiedžiant ekstraktą (52) tamkad būtų gauta koncentracija atitinkanti kalibravimo kreivės (532) ribas

C AMPROLIUMO NUSTATYMAS

1-[(4-amino-2-propilpirimidin-5-il)metil]-2-metilpiridinio chlorido hidrochloridas


Šiuo metodu galima nustatyti amproliumo koncentraciją pašaruose ir premiksuose Aptikimo riba ndash 1 mgkgkiekybinio nustatymo riba ndash 25 mgkg

2 Metodas

Ėminys ekstrahuojamas metanolio ir vandens mišiniu Ekstraktas skiedžiamas judančiąja faze filtruojamas permembraninį filtrą ir amproliumo kiekis nustatomas katijonų mainų efektyviosios skysčių chromatografijos(HPLC) metodu naudojant ultravioletinį detektorių

3 Reagentai

31 Metanolis



34 Natrio dihidrofosfato tirpalas c = 01 moll

Vandenyje (33) ištirpinama 1380 g natrio dihidrofosfato monohidrato 1 000 ml matavimo kolboje skiedžiamaiki žymės vandeniu (33) ir sumaišoma


35 Natrio perchlorato tirpalas c = 16 moll

Vandenyje (33) ištirpinama 22474 g natrio perchlorato 1 000 ml matavimo kolboje skiedžiama iki žymėsvandeniu (33) ir sumaišoma

36 HPLC judančioji fazė (žr 91 pastabą)

Acetonitrilo (32) natrio dihidrofosfato tirpalo (34) ir natrio perchlorato tirpalo (35) mišinys 450 + 450 + 100(V + V + V) Prieš naudojimą tirpalas filtruojamas per 022 μm membraninį filtrą (43) ir bent 15 mindegazuojamas (pvz ultragarso vonioje (44))

37 Etaloninė cheminė medžiaga grynas amproliumas l-[(4-amino-2-propilpirimidin-5-il)metil]-2-metilpiridiniochlorido hidrochloridas E 750 (žr 92)

371 Amp r o l i umo p r a d i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 5 00 μ g m l

Į 100 ml matavimo kolbą 01 mg tikslumu pasveriama 50 mg amproliumo (37) ištirpinama 80 ml metanolio(31) ir 10 min kolba dedama į ultragarso vonią (44) Po apdorojimo ultragarsu tirpalas atvėsinamas iki kambariotemperatūros skiedžiama vandenius iki žymės ir sumaišomas Esant le 4 oC temperatūrai tirpalas stabilus vienąmėnesį

372 Amp r o l i umo t a r p i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 5 0 μ g m l

Į 50 ml matavimo kolbą pipete paimama 5 ml pradinio etaloninio tirpalo (371) skiedžiama iki žymėsekstrahavimo tirpikliu (38) ir sumaišoma Esant le 4 oC temperatūrai tirpalas stabilus vieną mėnesį


Į 50 ml matavimo kolbas įpilama 05 1 ir 2 ml tarpinio etaloninio tirpalo (372) Skiedžiama iki žymėsjudančiąja faze (36) ir sumaišoma Šie tirpalai atitinka 05 1 ir 2 μgml amproliumo Šie tirpalai turi būtiruošiami prieš pat naudojimą

38 Ekstrahavimo tirpiklis

Metanolio (31) ir vandens mišinys 2 + 1 (V + V)

4 Aparatūra

41 HPLC įranga su įpurškimo sistema tinkama įpurkšti 100 μl tūrį

411 Skysčių chromatografijos kolonėlė 125 mm times 4 mm katijonitas Nucleosil 10 SA 5 arba 10 μm įkrova arbalygiavertė kolonėlė

412 Kintamo bangos ilgio ultravioletinis detektorius arba diodų matricos detektorius

42 Membraninis filtras medžiaga ndash PTFE 045 μm


44 Ultragarso vonia


5 Procedūra



Norint nustatyti išgavos dydį (512) atliekama pašaro tuščiojo ėminio analizė siekiant patikrinti ar nėraamproliumo arba trukdančiųjų medžiagų Pašaro tuščiasis ėminys atitinka ėminio tipą ir jame neturi būti aptiktaamproliumo arba trukdančių medžiagų



Išgavos dydis nustatomas analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį į jį pridedant amproliumo kurio kiekis būtų panašusį kiekį ėminyje 100 mgkg koncentracijai gauti į 250 ml kūginę kolbą įpilama 100 ml pradinio etaloniniotirpalo (371) ir tirpalas garinamas iki maždaug 05 ml Įdedama 50 g pašaro tuščiojo ėminio gerai sumaišoma irprieš ekstrahavimą (52) palaukiama 10 min kelis kartus maišant

Jei nėra pašaro tuščiojo ėminio kuris būtų panašus į ėminio pašarą (žr 511) išgavos dydį galima nustatytitaikant etalono pridėjimo metodą Šiuo atveju į analizuojamą ėminį pridedamas amproliumo kiekis maždaugatitinkantis amproliumo kiekį ėminyje Šis ėminys analizuojamas kartu su ėminiu be pridėto amproliumo irišgavos dydis gali būti apskaičiuotas iš skirtumo

52 Ekstrahavimas

521 P r em i k s a i ( amp r o l i umo k i e k i s lt 1 ) i r p a š a r a i

Atsižvelgiant į amproliumo kiekį į 500 ml kūginę kolbą 001 g tikslumu pasveriama 5ndash40 g ėminio ir įpilama200 ml ekstrahavimo tirpiklio (38) Kolba įdedama į ultragarso vonią (44) ir laikoma 15 min Kolba išimama išultragarso vonios ir 1 h kratoma ant purtyklės arba maišoma magnetine maišykle (45) Alikvotinė ekstrakto dalisskiedžiama judančiąja faze (36) kad amproliumo koncentracija būtų 05ndash2 μgml ir sumaišoma(žr 93 pastabą) 5ndash10 ml šio praskiesto tirpalo filtruojama per membraninį filtrą (42) Toliau analizuojamaHPLC metodu (53)

522 P r em i k s a i ( amp r o l i umo k i e k i s ge 1 )

Atsižvelgiant į amproliumo kiekį į 500 ml kūginę kolbą 0001 g tikslumu pasveriama 1ndash4 g ėminio ir įpilama200 ml ekstrahavimo tirpiklio (38) Kolba įdedama į ultragarso vonią (44) ir laikoma 15 min Kolba išimama išultragarso vonios ir 1 h kratoma ant purtyklės arba maišoma magnetine maišykle (45) Alikvotinė ekstrakto dalisskiedžiama judančiąja faze (36) kad amproliumo koncentracija būtų 05ndash2 μgml ir sumaišoma 5ndash10 ml šiopraskiesto tirpalo filtruojama per membraninį filtrą (42) Toliau analizuojama HPLC metodu (53)

53 HPLC nustatymas



Skysčių chromatografi-jos

kolonėlė (411) 125 mm times 4 mm katijonitas Nucleosil 10 SA 5 arba 10 μm įkrova arba lygiavertė

Judančioji fazė (36) acetonitrilo (32) natrio dihidrofosfato tirpalo (34) ir natrio perchlorato tirpalo (35)mišinys 450 + 450 + 100 (V + V + V)



264 nm






Kelis kartus įpurškiamas ėminio ekstraktas (52) kurio tūris atitinka kalibravimo tirpalo tūrį ir matuojamasamproliumo smailių vidutinis aukštis (plotas)


Ėminio tirpalo koncentracija μgml nustatoma pagal ėminio tirpalo amproliumo smailių vidutinį aukštį (plotą) irkalibravimo kreivę (532)


Amproliumo kiekis w (mgkg) ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę

w =V c f

m[mgkg]

kurioje

V = ekstrahavimo tirpiklio (38) tūris ml pagal 52 (t y 200 ml)

c = amproliumo koncentracija ėminio ekstrakte (52) μgml

f = praskiedimo faktorius pagal 52



71 Tapatumas



Ėminio ekstrakto (52) koncentracija padidinama įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (373) tūrį Pridėtoamproliumo kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą amproliumo kiekį

Padidinamas tik amproliumo smailės aukštis įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą Smailės plotis jospusaukštyje plusmn 10 tikslumu turi atitikti nepadidintos koncentracijos amproliumo ekstrakto smailės pradinįplotį







72 Pakartojamumas


mdash 15 didesnės vertės jei amproliumo kiekis 25 mgkg ndash 500 mgkg

mdash 75 mgkg jei amproliumo kiekis 500 mgkg ndash 1 000 mgkg

mdash 75 didesnės vertės jei amproliumo kiekis didesnis nei 1 000 mgkg

73 Išgavos dydis

Išgavos dydis gautas (tuščiajam) ėminiui su analitės priedu yra ne mažesnis nei 90



Buvo parengtas tarplaboratorinis tyrimas kurį vykdant buvo analizuojamos trijų rūšių paukščių pašaras (1ndash3 ėminiai) vienas mineralinis pašaras (4 ėminys) ir vienas premiksas (5 ėminys) Rezultatai pateikiami šiojelentelėje

1 ėminys(tuščiasis) 2 ėminys 3 ėminys 4 ėminys 5 ėminys

L 14 14 14 14 15n 56 56 56 56 60vidurkis [mgkg] mdash 455 188 5 129 25 140sr [mgkg] mdash 226 357 178 550CVr [ ] mdash 495 190 346 220sR [mgkg] mdash 295 118 266 760CVR [ ] mdash 647 627 519 300

vardinis kiekis [mgkg] mdash 50 200 5 000 25 000

L = laboratorijų skaičiusn = atskirų verčių skaičiussr = pakartojamumo standartinis nuokrypisCVr = pakartojamumo variacijos koeficientassR = atkuriamumo standartinis nuokrypisCVR = atkuriamumo variacijos koeficientas

9 Pastabos

91 Jei ėminyje yra tiamino chromatogramoje prieš pat amproliumo smailę atsiranda tiamino smailė Taikant šįmetodą amproliumas ir tiaminas turi būti atskirti Jei amproliumas ir tiaminas neatsiskiria šiam metoduinaudojamoje kolonėlėje (411) iki 50 acetonitrilo sudarančio judančiąją fazę (36) pakeičiama metanoliu

92 Pagal Didžiosios Britanijos Pharmacopoeia amproliumo tirpalo (c = 002 moll) vandenilio chlorido rūgštyje(c = 01 moll) spektras turi maksimumus atitinkančius 246 nm ir 262 nm Optinis tankis turi būti apie 084esant 246 nm ir 080 esant 262 nm

93 Ekstraktas visuomet turi būti skiedžiamas judančiąja faze nes kitaip amproliumo smailės sulaikymo trukmė galistipriai pasikeisti dėl joninės jėgos pokyčio

D KARBADOKSO NUSTATYMAS

Metil 3-(2-chinoksalinilmetilen)karbazato N1N4-dioksidas


Šiuo metodu galima nustatyti karbadokso koncentraciją pašaruose premiksuose ir preparatuose Aptikimo riba ndash1 mgkg Kiekybinio nustatymo riba ndash 5 mgkg

2 Metodas

Pasiekus ėminio ir vandens pusiausvyrą ėminys ekstrahuojamas metanolio ir acetonitrilo mišiniu Jei tai pašaraialikvotinė filtruoto ekstrakto dalis gryninama aliuminio oksido kolonėlėje Jei tai premiksai arba preparataialikvotinė filtruoto ekstrakto dalis skiedžiama vandens metanolio ir acetonitrilo mišiniu iki atitinkamoskoncentracijos Karbadokso kiekis nustatomas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos metodu(HPLC) naudojant ultravioletinį detektorių

3 Reagentai

31 Metanolis



33 Acto rūgštis w = 100

34 Aliuminio oksidas neutralusis I laipsnio aktyvumo

35 Metanolio ir acetonitrilo mišinys 1 + 1 (V + V)

Sumaišoma 500 ml metanolio (31) ir 500 ml acetonitrilo (32)

36 Acto rūgštis σ = 10

10 ml acto rūgšties (33) skiedžiama vandeniu iki 100 ml

37 Natrio acetatas


39 Acetatinis buferinis tirpalas c = 001 moll pH = 60

082 g natrio acetato (37) ištirpinama 700 ml vandens (38) ir acto rūgšties tirpalu (36) nustatoma pH vertė 60Tirpalas supilamas į 1000 ml matavimo kolbą skiedžiama vandeniu (38) iki žymės ir sumaišoma


825 ml acetatinio buferinio tirpalo (39) sumaišoma su 175 ml acetonitrilo (32)

Tirpalas filtruojamas per 022 μm filtrą (45) ir degazuojamas (pvz 10 min ultragarso vonioje)


Grynas karbadoksas metil-3-(2-chinoksalinilmetilen)karbazato N1N4-dioksidas E 850

3111 K a r b a d o k s o p r a d i n i s e t a l o n i n i s t i r p a l a s 1 00 μ g m l ( ž r s k i r s n i o P r o c e d ū r a5 p a s t a b ą )

Į 250 ml matavimo kolbą 01 mg tikslumu pasveriama 25 mg karbadokso etaloninės medžiagos (311)Ištirpinama metanolio ir acetonitrilo mišinyje (35) naudojant ultragarso vonią (47) Po apdorojimo ultragarsutirpalas atvėsinamas iki kambario temperatūros skiedžiama vandenius iki žymės ir sumaišomas Kolbaapvyniojama aliuminio folija arba naudojama rudo stiklo kolba ir padedama į šaldytuvą Esant le 4 oCtemperatūrai tirpalas stabilus vieną mėnesį


Į keletą 100 ml matavimo kolbų įpilama 20 50 100 ir 200 ml ml pradinio etaloninio tirpalo (3111)Įpilama 30 ml vandens skiedžiama iki žymės metanolio ir acetonitrilo mišiniu (35) ir sumaišoma Kolbosapvyniojamos aliuminio folija Šių tirpalų koncentracija 20 50 100 ir 200 μgml karbadokso

Kalibravimo tirpalai turi būti ruošiami prieš pat naudojimą

Pastaba Norint nustatyti karbadoksą pašaruose kuriuose jo koncentracija mažesnė nei 10 mgkg turi būtiparuošti mažesnės nei 20 μgml koncentracijos kalibravimo tirpalai

312 Vandens bei [metanolio ir acetonitrilo] (35) mišinys 300 + 700 (V + V)

Sumaišoma 300 ml vandens bei 700 ml metanolio ir acetonitrilo mišinio (35)

4 Aparatūra

41 Laboratorinė purtyklė arba magnetinė maišyklė



43 Stiklinė kolonėlė (ilgis 300ndash400 mm vidinis skersmuo maždaug 10 mm) su pertvara iš sukepinto stiklo irišleidžiamuoju čiaupu

Pastaba Galima naudoti stiklinę kolonėlę su čiaupu arba stiklinę kolonėlę su kūginiu galu tokiu atveju į apatinįgalą įdedamas nedidelis stiklo vatos kamštis ir stikline lazdele nustumiamas žemyn



442 Kintamo bangos ilgio ultravioletinis detektorius arba diodinės matricos detektorius veikiantis 225ndash400 nmbangų ilgio intervale



47 Ultragarso vonia

5 Procedūra

Pastaba Karbadoksas yra jautrus šviesai Visi veiksmai atliekami esant susilpnintai šviesai arba naudojami rudostiklo arba aliuminio foliją apvyniotus stiklinius indus



Norint nustatyti išgavos dydį (512) atliekama pašaro tuščiojo ėminio analizė siekiant patikrinti ar nėrakarbadokso arba trukdančiųjų medžiagų Pašaro tuščiasis ėminys turėtų atitinka ėminio tipą ir jame neturi būtiaptikta karbadokso arba trukdančių medžiagų


Analizuojant pašaro tuščiąjį ėminį (511) į jį pridedant karbadokso kurio kiekis būtų panašus į kiekį ėminyjenustatomas išgavos dydis 50 mgkg koncentracijai gauti į 200 ml kūginę kolbą įpilama 50 ml pradinioetaloninio tirpalo (3111) Tirpalas garinamas azoto srovėje iki maždaug 05 ml Įdedama 10 g pašaro tuščiojoėminio gerai sumaišoma ir prieš ekstrahavimą (52) palaukiama 10 min

Jei nėra pašaro tuščiojo ėminio kuris būtų panašus į ėminio pašarą (žr 511) išgavos dydį galima nustatytitaikant etalono pridėjimo metodą Šiuo atveju į analizuojamą ėminį pridedamas karbadokso kiekis maždaugatitinkantis karbadokso kiekį ėminyje Šis ėminys analizuojamas kartu su ėminiu be pridėto karbadokso irišgavos dydis gali būti apskaičiuotas iš skirtumo

52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i

10 g ėminio pasveriama 001 g tikslumu ir supilama į 200 ml kūginę kolbą Įpilama 150 ml vandenssumaišoma ir paliekama 5 min pusiausvyrai pasiekti Įpilama 350 ml metanolio ir acetonitrilo mišinio (35)kolba užkemšama ir 30 min kratoma ant purtyklės arba maišoma magnetine maišykle (41) Tirpalasfiltruojamas per stiklo pluošto filtravimo popierių (42) Toliau atliekamas gryninimas (53)

522 P r em i k s a i ( 0 1 ndash2 0 )

1 g nesusmulkinto ėminio pasveriama 0001 g tikslumu ir supilama į 200 ml kūginę kolbą Įpilama 150 mlvandens sumaišoma ir paliekama 5 min pusiausvyrai pasiekti Įpilama 350 ml metanolio ir acetonitrilo mišinio(35) kolba užkemšama ir 30 min kratoma ant purtyklės arba maišoma magnetine maišykle (41) Tirpalasfiltruojamas per stiklo pluošto filtravimo popierių (42)


Alikvotinė filtrato dalis paimama pipete į 50 ml matavimo kolbą Įpilama 150 ml vandens skiedžiama iki žymėsmetanolio ir acetonitrilo mišiniu (35) ir sumaišoma Galutiniame tirpale karbadokso koncentracija yra maždaug10 μgml Alikvotinė tirpalo dalis filtruojama per 045 μm filtrą (46)

Toliau analizuojama HPLC metodu (54)

523 P r e p a r a t a i ( gt 2 )

02 g nesusmulkinto ėminio pasveriama 0001 g tikslumu ir supilama į 250 ml kūginę kolbą Įpilama 450 mlvandens sumaišoma ir paliekama 5 min pusiausvyrai pasiekti Įpilama 1050 ml metanolio ir acetonitrilomišinio (35) kolba užkemšama ir turinys homogenizuojamas 15 min ėminys apdorojamas ultragarsu (47)vėliau 15 min kratomas arba maišomas (41) Tirpalas filtruojamas per stiklo pluošto filtravimo popierių (42)

Alikvotinė filtrato dalis skiedžiama vandens bei metanolio ir acetonitrilo mišiniu (312) kad galutinė karbadoksokoncentracija būtų 10ndash15 μgml (10 preparatų praskiedimo faktorius lygus 10) Alikvotinė tirpalo dalisfiltruojama per 045 μm filtrą (46)


53 Gryninimas


Pasveriama 4 g aliuminio oksido (34) ir supilama į stiklinę kolonėlę (43)


Į aliuminio oksido kolonėlę supilama 15 ml filtruoto ekstrakto (521) ir pirmieji 2 ml eliuato išpilamiSurenkamas kitas 5 ml tūris ir alikvotinė dalis filtruojama 045 μm filtrą (46)


54 HPLC nustatymas




kolonėlė (441) 300 mm times 4 mm C18 10 μm įkrova arba lygiavertė kolonėlė

Judančioji fazė (310) acetatinio buferinio tirpalo (39) ir acetonitrilo (32) mišinys 825 + 175 (v + v)



365 nm


Tikrinamas chromatografijos sistemos stabilumas kelis kartus įpurškiant 50 μgml koncentracijos kalibravimotirpalo (3112) tol kol nustoja keistis smailės aukščio (ploto) ir sulaikymo trukmės vertės




Kelis kartus įpurškiama [(532) pašarų (522) premiksų ir (523) preparatų] ėminio ekstrakto ir nustatomaskarbadokso smailių vidutinis aukštis (plotas)


Ėminio tirpalo karbadokso koncentracija μgml nustatoma pagal ėminio tirpalo karbadokso smailių vidutinįaukštį (plotą) ir kalibravimo kreivę (542)


61 Pašarai

Karbadokso kiekis w (mgkg) ėminyje apskaičiuojamas pagal formulę

w =c V1

m[mgkg]

kurioje

c = karbadokso koncentracija ėminio ekstrakte (532) μgml

V1 = ekstrahuojamas tūris ml (t y 50)


62 Premiksai ir preparatai


w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje

c = karbadokso koncentracija ėminio ekstrakte (522 arba 523) μgml

V2 = ekstrahuojamas tūris ml (t y 50 premiksų 150 preparatų)

f = praskiedimo faktorius pagal 522 (premiksų) arba 523 (preparatų)



71 Tapatumas



Ėminio ekstrakto koncentracija padidinama įpilant reikiamą kalibravimo tirpalo (3112) tūrį Pridėtokarbadokso kiekis turi atitikti ėminio ekstrakte nustatytą karbadokso kiekį

Padidinamas tik karbadokso smailės aukštis įvertinant pridėtą kiekį ir ekstrakto praskiedimą Smailės plotis jospusaukštyje maždaug 10 tikslumu turi atitikti smailės pradinį plotį








72 Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 15 didesnės vertėsjei koncentracija 10 mgkg ir didesnė

73 Išgavos dydis



Buvo parengtas tarplaboratorinis tyrimas kurį vykdant aštuonios laboratorijos analizavo šešių tipų pašarusketurių tipų premiksus ir trijų tipų preparatus Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas du kartus (Išsamesnėinformacija apie šį tarplaboratorinį tyrimą yra pateikta Journal of AOAC International Volume 71 1988p 484ndash490) Rezultatai (išskyrus riktus) pateikti toliau

1 lentelė

Tarplaboratorinio pašarų tyrimo rezultatai

1 ėminys 2 ėminys 3 ėminys 4 ėminys 5 ėminys 6 ėminys

L 8 8 8 8 8 8n 15 14 15 15 15 15Vidurkis (mgkg) 500 476 482 497 469 497Sr (mgkg) 290 269 138 155 152 212CVr ( ) 58 56 29 31 32 43SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244CVR ( ) 78 87 46 52 48 49

Vardinis kiekis (mgkg) 500 500 500 500 500 500

2 lentelė

Tarplaboratorinio premiksų ir preparatų tyrimo rezultatai

Premiksai Preparatai

A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8n 14 14 14 14 16 16 16Vidurkis (gkg) 889 929 921 876 946 981 104Sr (gkg) 037 028 028 044 41 51 77CVr ( ) 42 30 30 50 43 52 74SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77CVR ( ) 42 30 43 63 57 65 74

Vardinis kiekis (gkg) 100 100 100 100 100 100 100

L = laboratorijų skaičiusn = atskirų verčių skaičiusSr = pakartojamumo standartinis nuokrypisCVr = pakartojamumo variacijos koeficientasSR = atkuriamumo standartinis nuokrypisCVR = atkuriamumo variacijos koeficientas


IX PRIEDAS

6 STRAIPSNYJE NURODYTOS ATITIKMENŲ LENTELĖS

1 Direktyva 71250EEB

Direktyva 71250EEB Šis reglamentas

1 straipsnio pirmoji pastraipa 3 straipsnis1 straipsnio antroji pastraipa 2 straipsnis2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedo 1 dalis II priedasPriedo 2 dalis mdash

Priedo 3 dalis mdash

Priedo 4 dalis III priedo O dalisPriedo 5 dalis III priedo M dalisPriedo 6 dalis III priedo N dalisPriedo 7 dalis III priedo Q dalisPriedo 9 dalis III priedo K dalisPriedo 10 dalis mdash


Priedo 12 dalis III priedo J dalisPriedo 14 dalis III priedo D dalisPriedo 16 dalis mdash



1 straipsnis 3 straipsnis2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedo I dalis III priedo A dalisPriedo II dalis III priedo E dalisPriedo III dalis III priedo P dalisPriedo IV dalis III priedo H dalis




3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

I priedo 1 dalis III priedo L dalisI priedo 2 dalis III priedo C dalisI priedo 3 dalis mdash

I priedo 4 dalis mdash

I priedo 5 dalis V priedo A dalisII priedas mdash


4 Direktyva 7346EEB



4 straipsnis mdash

I priedo 1 dalis III priedo B dalisI priedo 2 dalis mdash

I priedo 3 dalis III priedo I dalis




3 straipsnis mdash

Priedas I priedas



1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash



Priedo 3 dalis IV priedo C dalis



1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash

Priedas VII priedas




3 straipsnis mdash

Priedas IV priedo D dalis

12 Direktyva 93117EB

Direktyva 93117EB Šis reglamentas

1 straipsnis 3 ir 5 straipsniai2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedo 1 dalis IV priedo E dalisPriedo 2 dalis VIII priedo A dalis

13 Direktyva 9864EB



3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

Priedo A dalis III priedo F dalisPriedo C dalis VIII priedo B dalis





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

7 straipsnis mdash

Priedo A dalis VIII priedo C dalisPriedo B dalis IV priedo F dalisPriedo C dalis VIII priedo D dalis




3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

Priedas IV priedo G dalis




3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

Priedo A dalis IV priedo A dalisPriedo B dalis IV priedo B dalisPriedo C dalis III priedo G dalis



1 straipsnis 1 straipsnis2 straipsnis 2 ir 3 straipsniai3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

I priedas I priedas ir V priedo B (I) dalisII priedas II priedas ir V priedo B (II) dalis





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

Priedas VI priedas


mdash 1993 m liepos 28 d vienuoliktoji Komisijos direktyva9370EEB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (1)

mdash 1993 m gruodžio 17 d dvyliktoji Komisijos direktyva93117EB nustatanti oficialiai pašarų kontroleitaikytinus Bendrijos analizės metodus (2)

mdash 1998 m rugsėjo 3 d Komisijos direktyva 9864EBnustatanti Bendrijos analizės metodus pašaruoseesančioms aminorūgštims žaliems aliejams ir rieba-lams bei olakvindoksui nustatyti ir iš dalies pakeičiantiDirektyvą 71393EEB (3)

mdash 1999 m balandžio 20 d Komisijos direktyva 199927EB nustatanti Bendrijos analizės metodus ampro-liumui diklazurilui ir karbadoksui pašaruose nustatytiiš dalies keičianti Direktyvas 71250EEB bei 7346EEB ir panaikinanti Direktyvą 74203EEB (4)

mdash 1999 m liepos 23 d Komisijos direktyva 199976EB nustatanti Bendrijos analizės metodą kuriuonustatoma lasalocido natrio druska pašaruose (5)

mdash 2000 m liepos 6 d Komisijos direktyva 200045EBnustatanti Bendrijos analizės metodus pašaruoseesantiems A vitaminui E vitaminui ir triptofanuinustatyti (6)

mdash 2002 m liepos 26 d Komisijos direktyva 200270EB nustatanti dioksinų ir dioksinų tipo PCB kon-centracijos pašaruose nustatymo reikalavimus (7)

mdash 2003 m gruodžio 23 d Komisijos direktyva 2003126EB dėl gyvūninės kilmės sudedamųjų daliųnustatymo analizės metodo taikomo valstybineipašarų kontrolei (8)

(2) Kadangi Direktyva 70373EEB buvo pakeista Reglamentu(EB) Nr 8822004 reikėtų tos direktyvos įgyvendinimoaktus pakeisti vienu reglamentu Tuo pačiu metu metodaiturėtų būti suderinti su mokslo ir technikos žinių raidaMetodai kurie nebeatitinka numatytos paskirties turėtųbūti panaikinti Numatyta tinkamu metu atnaujinti ėminiųėmimo nuostatas kad būtų galima atsižvelgti į naujausiuspašarų gamybos laikymo vežimo ir pateikimo į rinkąpasiekimus tačiau tam tikrą laiką reikia palikti galiojančiasėminių ėmimo nuostatas

(3) Todėl Direktyvos 71250EEB 71393EEB 72199EEB7346EEB 76371EEB 76372EEB 78633EEB 81715EEB 84425EEB 86174EEB 9370EEB 93117

EB 9864EB 199927EB 199976EB 200045EB200270EB ir 2003126EB turėtų būti panaikintos

(4) Šiame reglamente numatytos priemonės atitinka Maistograndinės ir gyvūnų sveikatos nuolatinio komiteto nuo-monę

PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ

1 straipsnis

Ėminių ėmimas oficialiai pašarų kontrolei susijusiai su sudeda-mųjų dalių priedų ir nepageidaujamų medžiagų nustatymuišskyrus pesticidų likučius ir mikroorganizmus atliekamas pagalI priede aprašytus metodus

2 straipsnis

Ėminiai analizei ruošiami ir rezultatų išraiška pateikiama pagalII priede aprašytus metodus

3 straipsnis

Oficialiai pašarų kontrolei skirta analizė atliekama taikantmetodus aprašytus III priede (Analizės metodai taikomipašarinių medžiagų ir kombinuotųjų pašarų sudėčiai kontro-liuoti) IV priede (Analizės metodai leidžiamų pašarų priedųkoncentracijai kontroliuoti) V priede (Analizės metodai nepa-geidaujamoms medžiagoms pašaruose kontroliuoti) ir VI priede(Analizės metodai gyvūninės kilmės sudedamosioms dalimsnustatyti atliekant oficialiąją pašarų kontrolę)

4 straipsnis

Paukščių kombinuotųjų pašarų energinė vertė apskaičiuojamapagal VII priedą

5 straipsnis

VIII priede aprašyti analizės metodai skirti daugiau neleidžiamųnaudoti pašarų priedų neteisėtam buvimui kontroliuoti taikomipatvirtinimo tikslais

6 straipsnis

Direktyvos 71250EEB 71393EEB 72199EEB 7346EEB76371EEB 76372EEB 78633EEB 81715EEB 84425EEB 86174EEB 9370EEB 93117EB 9864EB 199927EB 199976EB 200045EB 200270EB ir 2003126EBpanaikinamos

Nuorodos į panaikintas direktyvas laikomos nuorodomis į šįreglamentą ir aiškinamos pagal IX priede pateiktas atitikčiųlenteles


(1) OL L 234 1993 9 17 p 17(2) OL L 329 1993 12 30 p 54(3) OL L 257 1998 9 19 p 14(4) OL L 118 1999 5 6 p 36(5) OL L 207 1999 8 6 p 13(6) OL L 174 2000 7 13 p 32(7) OL L 209 2002 8 6 p 15(8) OL L 339 2003 12 24 p 78

7 straipsnis





Komisijos vardu

Androulla VASSILIOU

Komisijos narė


I PRIEDAS






3 APIBRĖŽTYS






4 APARATAS








423 Dalytuvas













visos pakuotės







visos talpyklos





















5B1 Partija žr 5A1





visos pakuotės






iki 1 1



daugiau kaip 40 4




nuo 1 iki 16 1

nuo 17 iki 200 2

nuo 201 iki 800 3

daugiau kaip 800 4




pašarų papilduose










































II PRIEDAS



1 Tikslas









3 Procedūra









34 Kiti pašarai



4 Ėminių laikymas





















(1) OL L 86 1979 4 6 p 30








III PRIEDAS






2 Metodas


3 Aparatūra







4 Procedūra











42 Džiovinimas













432 J a v a i








m 100

kurioje




m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

kurioje


53 Pakartojamumas


6 Pastaba





2 Metodas


3 Aparatūra







4 Procedūra








kurioje



Pakartojamumas





2 Metodas



3 Reagentai

31 Kalio sulfatas



33 Cinko granulės





















4 Aparatūra


5 Procedūra

51 Skaidymas





52 Distiliavimas









53 Titravimas





















kurioje






kurioje





kurioje



7 Metodo tikrinimas

71 Pakartojamumas





72 Tikslumas


8 Pastabos








2 Metodas


3 Reagentai







4 Aparatūra




5 Procedūra

51 Ėminio analizė








7 Pastabos








2 Metodas



3 Reagentai






4 Aparatūra




5 Procedūra








Pakartojamumas




7 Pastaba



CONWAY CELL

Scale 11





2 Metodas


3 Reagentai


32 Magnio oksidas





4 Aparatūra



5 Procedūra







Pakartojamumas








2 Metodas






3 Reagentai




33 Fenolis








311 Ninhidrinas




315 1-oktanolis


316 Aminorūgštys


































Žr dar 91 pastabą



4 Aparatūra






46 Centrifuga






5 Procedūra


















Tęsiama pagal 5321









Tęsiama pagal 533





Tęsiama pagal 533

















54 Chromatografija











X =A cM VBm 1 000















10 ml V

10





Vidurkiai gkg




301n = 17

327n = 17

955n = 13


931n = 16

392n = 18

508n = 18

1393n = 16


506n = 17

1201n = 17

4774n = 15


mdash 9021n = 16

9803n = 16


71 Pakartojamumas






010n = 17

011n = 17

026n = 13


020n = 16

011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15

Premiksas 130n = 16

mdash 219n = 16

206n = 16






19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13


21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


27n = 16

26n = 17

22n = 17

24n = 15




Premiksas 22n = 16

mdash 24n = 16

21n = 16


72 Atkuriamumas






030n = 17

023n = 17

030n = 13


048n = 16

034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15

Premiksas 249n = 16

mdash 620n = 16

662n = 16






99n = 17

70n = 17

32n = 13


52n = 16

88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15

Premiksas 43n = 16

mdash 69n = 16

67n = 16




9 Pastabos










2 Metodas




3 Reagentai





























318 Acto rūgštis





4 Aparatūra



43 pH-metras







5 Procedūra













54 HPLC nustatymas






Srautas 1 mlmin







X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m











7 Pakartojamumas






fanu







r = pakartojamumas

R = atkuriamumas













r = pakartojamumas

R = atkuriamumas





nys(CRM 117)





liai(CRM 120)






r = pakartojamumas

R = atkuriamumas



9 Pastabos








B Metanolis


15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B

Srautas 12 mlmin

















2 Metodas

21 A procedūra


22 B procedūra


3 Reagentai





4 Aparatūra




5 Procedūra





52 B procedūra









7 Pakartojamumas





8 Pastabos





(10 m1 + m2) times 5

kurioje












2 Metodas


3 Reagentai




34 Acetonas




4 Aparatūra








5 Procedūra














m

kurioje




7 Pakartojamumas




8 Pastabos











2 Metodas


3 Reagentai





















4 Aparatūra


5 Procedūra


















8 Pastabos







Pavyzdys





4 16610

= 664




Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223




2 Metodas


3 Reagentai















4 Aparatūra


5 Procedūra









7 Pastaba





Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223





2 Metodas




3 Reagentai



(1) OL L 125 1996 5 23 p 35






4 Aparatūra



5 Procedūra















αfrac12 20degD









αfrac12 20degD



αfrac12 20degD





63 Pakartojamumas


7 Pastabos










mdash bulvių masė




mdash spirgučiai




2 Metodas


3 Reagentai


4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra







7 Pastabos










2 Metodas



3 Reagentai




4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra

51 A metodas



52 B metodas






7 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai




4 Aparatūra


5 Procedūra












X =V 100V1 2m

kurioje


7 Pastabos









2 Metodas


3 Reagentai










4 Aparatūra







5 Procedūra















Pakartojamumas







2 Metodas



3 Reagentai





35 Dietileteris

36 Acetonas




4 Aparatūra


5 Procedūra










52 Titravimas






m

čia



7 Pastabos





IV PRIEDAS






2 Metodas


3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis






38 2-propanolis









4 Aparatūra

















5 Procedūra




52 Muilinimas



53 Ekstrahavimas





















56 Kalibravimas



























w =500 c V2 1 000

V1 m[UIkg]

kurioje





7 Pastabos













8 Pakartojamumas







L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49




CVr [ ] 30 35 41 81 38



CVR [ ] 80 62 86 15 20









2 Metodas


3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis













4 Aparatūra


















5 Procedūra




52 Muilinimas


53 Ekstrahavimas















































w =500 c V2

V1 m[mgkg]

kurioje



7 Pastabos










8 Pakartojamumas






L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

vidurkis [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [ ] 22 38 27 41 38

sR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [ ] 48 55 60 60 127





r = pakartojamumas

R = atkuriamumas













2 Principas


3 Reagentai

Įvadinės pastabos























4 Aparatūra




5 Procedūra (1)










Pastabos










Geležis

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Varis

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Manganas

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Cinkas

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm







7 Pakartojamumas






8 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai



33 Amonio acetatas

34 Etilacetatas









38 Metanolis

39 Sidabro nitratas



















4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia


43 Centrifuga








5 Procedūra






52 Ekstrahavimas




53 Gryninimas






54 HPLC nustatymas
















w =c 10m

kurioje




71 Tapatumas












72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis




Rezultatai




sių









2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis





























4 Aparatūra










5 Procedūra






52 Ekstrahavimas



53 Gryninimas





54 HPLC nustatymas
















w =c 200

m

kurioje





71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis
















2 Metodas


3 Reagentai


32 Amonio acetatas






























4 Aparatūra








46 Ultragarso vonia

5 Procedūra








52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i




53 HPLC nustatymas













280 nm








61 Pašarai


w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

kurioje


62 Premiksai


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

kurioje



71 Tapatumas












72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis




1 ėminysA 100

2 ėminysO 100

3 ėminysL1

4 ėminysZ1

5 ėminysK1









9 Pastabos







2 Metodas


3 Reagentai























4 Aparatūra






5 Procedūra







52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i





53 HPLC nustatymas















61 Pašarai


w =c V1

m[mgkg]

kurioje


62 Premiksai


w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje



71 Tapatumas





72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis








5 ėminysLesalas

kalakutams


7 ėminysLesalas

paukščiams B

L 12 12 12 12 12 12 12n 23 23 23 23 23 23 23Vidurkis [mgkg]

5 050 16 200 765 784 929 483 326



5 000 () 16 000()

80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()




() Analyst 1995 120 2 175ndash2 180

V PRIEDAS





2 Metodas


3 Reagentai








4 Aparatūra



5 Procedūra






















=625


=600




E 11cm p a

kurioje















63 Pakartojamumas
































2 Pagrindimas








(1) OL L 221 2002 8 17 p 8
































71 Įvadas







































VI PRIEDAS





2 Jautris


3 Metodas


4 Reagentai





42 Plovikliai

421 Alkoholis 96

422 Acetonas




(1) OL L 165 2004 4 30 p 1

















6 Procedūra















































arba




arba

















VII PRIEDAS











Būtina taikyti




VIII PRIEDAS


Svarbios pastabos







2 Metodas


3 Reagentai

31 Dichlormetanas



















4 Aparatūra








5 Procedūra





52 Ekstrahavimas













56 HPLC nustatymas

















w =c 40m

kurioje



71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis














2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis














4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia





5 Procedūra






52 Ekstrahavimas


53 HPLC nustatymas







380 nm











w =c 1000

m

kurioje




71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis









9 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis



















4 Aparatūra






44 Ultragarso vonia


5 Procedūra








52 Ekstrahavimas





53 HPLC nustatymas








264 nm











w =V c f

m[mgkg]

kurioje






71 Tapatumas











72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis









9 Pastabos








2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis









37 Natrio acetatas

















4 Aparatūra











47 Ultragarso vonia

5 Procedūra








52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i


522 P r em i k s a i ( 0 1 ndash2 0 )





523 P r e p a r a t a i ( gt 2 )




53 Gryninimas






54 HPLC nustatymas








365 nm










61 Pašarai


w =c V1

m[mgkg]

kurioje






w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje






71 Tapatumas












72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis




1 lentelė





2 lentelė



A B C D A B C





IX PRIEDAS





3 straipsnis mdash









3 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





4 Direktyva 7346EEB



4 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

Priedas I priedas



1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash






1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash

Priedas VII priedas




3 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash


13 Direktyva 9864EB



3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

7 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

Priedas VI priedas


7 straipsnis





Komisijos vardu

Androulla VASSILIOU

Komisijos narė


I PRIEDAS






3 APIBRĖŽTYS






4 APARATAS








423 Dalytuvas













visos pakuotės







visos talpyklos





















5B1 Partija žr 5A1





visos pakuotės






iki 1 1



daugiau kaip 40 4




nuo 1 iki 16 1

nuo 17 iki 200 2

nuo 201 iki 800 3

daugiau kaip 800 4




pašarų papilduose










































II PRIEDAS



1 Tikslas









3 Procedūra









34 Kiti pašarai



4 Ėminių laikymas





















(1) OL L 86 1979 4 6 p 30








III PRIEDAS






2 Metodas


3 Aparatūra







4 Procedūra











42 Džiovinimas













432 J a v a i








m 100

kurioje




m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

kurioje


53 Pakartojamumas


6 Pastaba





2 Metodas


3 Aparatūra







4 Procedūra








kurioje



Pakartojamumas





2 Metodas



3 Reagentai

31 Kalio sulfatas



33 Cinko granulės





















4 Aparatūra


5 Procedūra

51 Skaidymas





52 Distiliavimas









53 Titravimas





















kurioje






kurioje





kurioje



7 Metodo tikrinimas

71 Pakartojamumas





72 Tikslumas


8 Pastabos








2 Metodas


3 Reagentai







4 Aparatūra




5 Procedūra

51 Ėminio analizė








7 Pastabos








2 Metodas



3 Reagentai






4 Aparatūra




5 Procedūra








Pakartojamumas




7 Pastaba



CONWAY CELL

Scale 11





2 Metodas


3 Reagentai


32 Magnio oksidas





4 Aparatūra



5 Procedūra







Pakartojamumas








2 Metodas






3 Reagentai




33 Fenolis








311 Ninhidrinas




315 1-oktanolis


316 Aminorūgštys


































Žr dar 91 pastabą



4 Aparatūra






46 Centrifuga






5 Procedūra


















Tęsiama pagal 5321









Tęsiama pagal 533





Tęsiama pagal 533

















54 Chromatografija











X =A cM VBm 1 000















10 ml V

10





Vidurkiai gkg




301n = 17

327n = 17

955n = 13


931n = 16

392n = 18

508n = 18

1393n = 16


506n = 17

1201n = 17

4774n = 15


mdash 9021n = 16

9803n = 16


71 Pakartojamumas






010n = 17

011n = 17

026n = 13


020n = 16

011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15

Premiksas 130n = 16

mdash 219n = 16

206n = 16






19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13


21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


27n = 16

26n = 17

22n = 17

24n = 15




Premiksas 22n = 16

mdash 24n = 16

21n = 16


72 Atkuriamumas






030n = 17

023n = 17

030n = 13


048n = 16

034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15

Premiksas 249n = 16

mdash 620n = 16

662n = 16






99n = 17

70n = 17

32n = 13


52n = 16

88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15

Premiksas 43n = 16

mdash 69n = 16

67n = 16




9 Pastabos










2 Metodas




3 Reagentai





























318 Acto rūgštis





4 Aparatūra



43 pH-metras







5 Procedūra













54 HPLC nustatymas






Srautas 1 mlmin







X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m











7 Pakartojamumas






fanu







r = pakartojamumas

R = atkuriamumas













r = pakartojamumas

R = atkuriamumas





nys(CRM 117)





liai(CRM 120)






r = pakartojamumas

R = atkuriamumas



9 Pastabos








B Metanolis


15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B

Srautas 12 mlmin

















2 Metodas

21 A procedūra


22 B procedūra


3 Reagentai





4 Aparatūra




5 Procedūra





52 B procedūra









7 Pakartojamumas





8 Pastabos





(10 m1 + m2) times 5

kurioje












2 Metodas


3 Reagentai




34 Acetonas




4 Aparatūra








5 Procedūra














m

kurioje




7 Pakartojamumas




8 Pastabos











2 Metodas


3 Reagentai





















4 Aparatūra


5 Procedūra


















8 Pastabos







Pavyzdys





4 16610

= 664




Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223




2 Metodas


3 Reagentai















4 Aparatūra


5 Procedūra









7 Pastaba





Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223





2 Metodas




3 Reagentai



(1) OL L 125 1996 5 23 p 35






4 Aparatūra



5 Procedūra















αfrac12 20degD









αfrac12 20degD



αfrac12 20degD





63 Pakartojamumas


7 Pastabos










mdash bulvių masė




mdash spirgučiai




2 Metodas


3 Reagentai


4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra







7 Pastabos










2 Metodas



3 Reagentai




4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra

51 A metodas



52 B metodas






7 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai




4 Aparatūra


5 Procedūra












X =V 100V1 2m

kurioje


7 Pastabos









2 Metodas


3 Reagentai










4 Aparatūra







5 Procedūra















Pakartojamumas







2 Metodas



3 Reagentai





35 Dietileteris

36 Acetonas




4 Aparatūra


5 Procedūra










52 Titravimas






m

čia



7 Pastabos





IV PRIEDAS






2 Metodas


3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis






38 2-propanolis









4 Aparatūra

















5 Procedūra




52 Muilinimas



53 Ekstrahavimas





















56 Kalibravimas



























w =500 c V2 1 000

V1 m[UIkg]

kurioje





7 Pastabos













8 Pakartojamumas







L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49




CVr [ ] 30 35 41 81 38



CVR [ ] 80 62 86 15 20









2 Metodas


3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis













4 Aparatūra


















5 Procedūra




52 Muilinimas


53 Ekstrahavimas















































w =500 c V2

V1 m[mgkg]

kurioje



7 Pastabos










8 Pakartojamumas






L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

vidurkis [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [ ] 22 38 27 41 38

sR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [ ] 48 55 60 60 127





r = pakartojamumas

R = atkuriamumas













2 Principas


3 Reagentai

Įvadinės pastabos























4 Aparatūra




5 Procedūra (1)










Pastabos










Geležis

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Varis

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Manganas

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Cinkas

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm







7 Pakartojamumas






8 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai



33 Amonio acetatas

34 Etilacetatas









38 Metanolis

39 Sidabro nitratas



















4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia


43 Centrifuga








5 Procedūra






52 Ekstrahavimas




53 Gryninimas






54 HPLC nustatymas
















w =c 10m

kurioje




71 Tapatumas












72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis




Rezultatai




sių









2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis





























4 Aparatūra










5 Procedūra






52 Ekstrahavimas



53 Gryninimas





54 HPLC nustatymas
















w =c 200

m

kurioje





71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis
















2 Metodas


3 Reagentai


32 Amonio acetatas






























4 Aparatūra








46 Ultragarso vonia

5 Procedūra








52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i




53 HPLC nustatymas













280 nm








61 Pašarai


w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

kurioje


62 Premiksai


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

kurioje



71 Tapatumas












72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis




1 ėminysA 100

2 ėminysO 100

3 ėminysL1

4 ėminysZ1

5 ėminysK1









9 Pastabos







2 Metodas


3 Reagentai























4 Aparatūra






5 Procedūra







52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i





53 HPLC nustatymas















61 Pašarai


w =c V1

m[mgkg]

kurioje


62 Premiksai


w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje



71 Tapatumas





72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis








5 ėminysLesalas

kalakutams


7 ėminysLesalas

paukščiams B

L 12 12 12 12 12 12 12n 23 23 23 23 23 23 23Vidurkis [mgkg]

5 050 16 200 765 784 929 483 326



5 000 () 16 000()

80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()




() Analyst 1995 120 2 175ndash2 180

V PRIEDAS





2 Metodas


3 Reagentai








4 Aparatūra



5 Procedūra






















=625


=600




E 11cm p a

kurioje















63 Pakartojamumas
































2 Pagrindimas








(1) OL L 221 2002 8 17 p 8
































71 Įvadas







































VI PRIEDAS





2 Jautris


3 Metodas


4 Reagentai





42 Plovikliai

421 Alkoholis 96

422 Acetonas




(1) OL L 165 2004 4 30 p 1

















6 Procedūra















































arba




arba

















VII PRIEDAS











Būtina taikyti




VIII PRIEDAS


Svarbios pastabos







2 Metodas


3 Reagentai

31 Dichlormetanas



















4 Aparatūra








5 Procedūra





52 Ekstrahavimas













56 HPLC nustatymas

















w =c 40m

kurioje



71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis














2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis














4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia





5 Procedūra






52 Ekstrahavimas


53 HPLC nustatymas







380 nm











w =c 1000

m

kurioje




71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis









9 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis



















4 Aparatūra






44 Ultragarso vonia


5 Procedūra








52 Ekstrahavimas





53 HPLC nustatymas








264 nm











w =V c f

m[mgkg]

kurioje






71 Tapatumas











72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis









9 Pastabos








2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis









37 Natrio acetatas

















4 Aparatūra











47 Ultragarso vonia

5 Procedūra








52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i


522 P r em i k s a i ( 0 1 ndash2 0 )





523 P r e p a r a t a i ( gt 2 )




53 Gryninimas






54 HPLC nustatymas








365 nm










61 Pašarai


w =c V1

m[mgkg]

kurioje






w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje






71 Tapatumas












72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis




1 lentelė





2 lentelė



A B C D A B C





IX PRIEDAS





3 straipsnis mdash









3 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





4 Direktyva 7346EEB



4 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

Priedas I priedas



1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash






1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash

Priedas VII priedas




3 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash


13 Direktyva 9864EB



3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

7 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

Priedas VI priedas


I PRIEDAS






3 APIBRĖŽTYS






4 APARATAS








423 Dalytuvas













visos pakuotės







visos talpyklos





















5B1 Partija žr 5A1





visos pakuotės






iki 1 1



daugiau kaip 40 4




nuo 1 iki 16 1

nuo 17 iki 200 2

nuo 201 iki 800 3

daugiau kaip 800 4




pašarų papilduose










































II PRIEDAS



1 Tikslas









3 Procedūra









34 Kiti pašarai



4 Ėminių laikymas





















(1) OL L 86 1979 4 6 p 30








III PRIEDAS






2 Metodas


3 Aparatūra







4 Procedūra











42 Džiovinimas













432 J a v a i








m 100

kurioje




m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

kurioje


53 Pakartojamumas


6 Pastaba





2 Metodas


3 Aparatūra







4 Procedūra








kurioje



Pakartojamumas





2 Metodas



3 Reagentai

31 Kalio sulfatas



33 Cinko granulės





















4 Aparatūra


5 Procedūra

51 Skaidymas





52 Distiliavimas









53 Titravimas





















kurioje






kurioje





kurioje



7 Metodo tikrinimas

71 Pakartojamumas





72 Tikslumas


8 Pastabos








2 Metodas


3 Reagentai







4 Aparatūra




5 Procedūra

51 Ėminio analizė








7 Pastabos








2 Metodas



3 Reagentai






4 Aparatūra




5 Procedūra








Pakartojamumas




7 Pastaba



CONWAY CELL

Scale 11





2 Metodas


3 Reagentai


32 Magnio oksidas





4 Aparatūra



5 Procedūra







Pakartojamumas








2 Metodas






3 Reagentai




33 Fenolis








311 Ninhidrinas




315 1-oktanolis


316 Aminorūgštys


































Žr dar 91 pastabą



4 Aparatūra






46 Centrifuga






5 Procedūra


















Tęsiama pagal 5321









Tęsiama pagal 533





Tęsiama pagal 533

















54 Chromatografija











X =A cM VBm 1 000















10 ml V

10





Vidurkiai gkg




301n = 17

327n = 17

955n = 13


931n = 16

392n = 18

508n = 18

1393n = 16


506n = 17

1201n = 17

4774n = 15


mdash 9021n = 16

9803n = 16


71 Pakartojamumas






010n = 17

011n = 17

026n = 13


020n = 16

011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15

Premiksas 130n = 16

mdash 219n = 16

206n = 16






19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13


21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


27n = 16

26n = 17

22n = 17

24n = 15




Premiksas 22n = 16

mdash 24n = 16

21n = 16


72 Atkuriamumas






030n = 17

023n = 17

030n = 13


048n = 16

034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15

Premiksas 249n = 16

mdash 620n = 16

662n = 16






99n = 17

70n = 17

32n = 13


52n = 16

88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15

Premiksas 43n = 16

mdash 69n = 16

67n = 16




9 Pastabos










2 Metodas




3 Reagentai





























318 Acto rūgštis





4 Aparatūra



43 pH-metras







5 Procedūra













54 HPLC nustatymas






Srautas 1 mlmin







X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m











7 Pakartojamumas






fanu







r = pakartojamumas

R = atkuriamumas













r = pakartojamumas

R = atkuriamumas





nys(CRM 117)





liai(CRM 120)






r = pakartojamumas

R = atkuriamumas



9 Pastabos








B Metanolis


15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B

Srautas 12 mlmin

















2 Metodas

21 A procedūra


22 B procedūra


3 Reagentai





4 Aparatūra




5 Procedūra





52 B procedūra









7 Pakartojamumas





8 Pastabos





(10 m1 + m2) times 5

kurioje












2 Metodas


3 Reagentai




34 Acetonas




4 Aparatūra








5 Procedūra














m

kurioje




7 Pakartojamumas




8 Pastabos











2 Metodas


3 Reagentai





















4 Aparatūra


5 Procedūra


















8 Pastabos







Pavyzdys





4 16610

= 664




Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223




2 Metodas


3 Reagentai















4 Aparatūra


5 Procedūra









7 Pastaba





Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223





2 Metodas




3 Reagentai



(1) OL L 125 1996 5 23 p 35






4 Aparatūra



5 Procedūra















αfrac12 20degD









αfrac12 20degD



αfrac12 20degD





63 Pakartojamumas


7 Pastabos










mdash bulvių masė




mdash spirgučiai




2 Metodas


3 Reagentai


4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra







7 Pastabos










2 Metodas



3 Reagentai




4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra

51 A metodas



52 B metodas






7 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai




4 Aparatūra


5 Procedūra












X =V 100V1 2m

kurioje


7 Pastabos









2 Metodas


3 Reagentai










4 Aparatūra







5 Procedūra















Pakartojamumas







2 Metodas



3 Reagentai





35 Dietileteris

36 Acetonas




4 Aparatūra


5 Procedūra










52 Titravimas






m

čia



7 Pastabos





IV PRIEDAS






2 Metodas


3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis






38 2-propanolis









4 Aparatūra

















5 Procedūra




52 Muilinimas



53 Ekstrahavimas





















56 Kalibravimas



























w =500 c V2 1 000

V1 m[UIkg]

kurioje





7 Pastabos













8 Pakartojamumas







L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49




CVr [ ] 30 35 41 81 38



CVR [ ] 80 62 86 15 20









2 Metodas


3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis













4 Aparatūra


















5 Procedūra




52 Muilinimas


53 Ekstrahavimas















































w =500 c V2

V1 m[mgkg]

kurioje



7 Pastabos










8 Pakartojamumas






L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

vidurkis [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [ ] 22 38 27 41 38

sR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [ ] 48 55 60 60 127





r = pakartojamumas

R = atkuriamumas













2 Principas


3 Reagentai

Įvadinės pastabos























4 Aparatūra




5 Procedūra (1)










Pastabos










Geležis

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Varis

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Manganas

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Cinkas

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm







7 Pakartojamumas






8 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai



33 Amonio acetatas

34 Etilacetatas









38 Metanolis

39 Sidabro nitratas



















4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia


43 Centrifuga








5 Procedūra






52 Ekstrahavimas




53 Gryninimas






54 HPLC nustatymas
















w =c 10m

kurioje




71 Tapatumas












72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis




Rezultatai




sių









2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis





























4 Aparatūra










5 Procedūra






52 Ekstrahavimas



53 Gryninimas





54 HPLC nustatymas
















w =c 200

m

kurioje





71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis
















2 Metodas


3 Reagentai


32 Amonio acetatas






























4 Aparatūra








46 Ultragarso vonia

5 Procedūra








52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i




53 HPLC nustatymas













280 nm








61 Pašarai


w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

kurioje


62 Premiksai


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

kurioje



71 Tapatumas












72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis




1 ėminysA 100

2 ėminysO 100

3 ėminysL1

4 ėminysZ1

5 ėminysK1









9 Pastabos







2 Metodas


3 Reagentai























4 Aparatūra






5 Procedūra







52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i





53 HPLC nustatymas















61 Pašarai


w =c V1

m[mgkg]

kurioje


62 Premiksai


w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje



71 Tapatumas





72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis








5 ėminysLesalas

kalakutams


7 ėminysLesalas

paukščiams B

L 12 12 12 12 12 12 12n 23 23 23 23 23 23 23Vidurkis [mgkg]

5 050 16 200 765 784 929 483 326



5 000 () 16 000()

80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()




() Analyst 1995 120 2 175ndash2 180

V PRIEDAS





2 Metodas


3 Reagentai








4 Aparatūra



5 Procedūra






















=625


=600




E 11cm p a

kurioje















63 Pakartojamumas
































2 Pagrindimas








(1) OL L 221 2002 8 17 p 8
































71 Įvadas







































VI PRIEDAS





2 Jautris


3 Metodas


4 Reagentai





42 Plovikliai

421 Alkoholis 96

422 Acetonas




(1) OL L 165 2004 4 30 p 1

















6 Procedūra















































arba




arba

















VII PRIEDAS











Būtina taikyti




VIII PRIEDAS


Svarbios pastabos







2 Metodas


3 Reagentai

31 Dichlormetanas



















4 Aparatūra








5 Procedūra





52 Ekstrahavimas













56 HPLC nustatymas

















w =c 40m

kurioje



71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis














2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis














4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia





5 Procedūra






52 Ekstrahavimas


53 HPLC nustatymas







380 nm











w =c 1000

m

kurioje




71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis









9 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis



















4 Aparatūra






44 Ultragarso vonia


5 Procedūra








52 Ekstrahavimas





53 HPLC nustatymas








264 nm











w =V c f

m[mgkg]

kurioje






71 Tapatumas











72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis









9 Pastabos








2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis









37 Natrio acetatas

















4 Aparatūra











47 Ultragarso vonia

5 Procedūra








52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i


522 P r em i k s a i ( 0 1 ndash2 0 )





523 P r e p a r a t a i ( gt 2 )




53 Gryninimas






54 HPLC nustatymas








365 nm










61 Pašarai


w =c V1

m[mgkg]

kurioje






w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje






71 Tapatumas












72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis




1 lentelė





2 lentelė



A B C D A B C





IX PRIEDAS





3 straipsnis mdash









3 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





4 Direktyva 7346EEB



4 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

Priedas I priedas



1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash






1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash

Priedas VII priedas




3 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash


13 Direktyva 9864EB



3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

7 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

Priedas VI priedas









visos pakuotės







visos talpyklos





















5B1 Partija žr 5A1





visos pakuotės






iki 1 1



daugiau kaip 40 4




nuo 1 iki 16 1

nuo 17 iki 200 2

nuo 201 iki 800 3

daugiau kaip 800 4




pašarų papilduose










































II PRIEDAS



1 Tikslas









3 Procedūra









34 Kiti pašarai



4 Ėminių laikymas





















(1) OL L 86 1979 4 6 p 30








III PRIEDAS






2 Metodas


3 Aparatūra







4 Procedūra











42 Džiovinimas













432 J a v a i








m 100

kurioje




m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

kurioje


53 Pakartojamumas


6 Pastaba





2 Metodas


3 Aparatūra







4 Procedūra








kurioje



Pakartojamumas





2 Metodas



3 Reagentai

31 Kalio sulfatas



33 Cinko granulės





















4 Aparatūra


5 Procedūra

51 Skaidymas





52 Distiliavimas









53 Titravimas





















kurioje






kurioje





kurioje



7 Metodo tikrinimas

71 Pakartojamumas





72 Tikslumas


8 Pastabos








2 Metodas


3 Reagentai







4 Aparatūra




5 Procedūra

51 Ėminio analizė








7 Pastabos








2 Metodas



3 Reagentai






4 Aparatūra




5 Procedūra








Pakartojamumas




7 Pastaba



CONWAY CELL

Scale 11





2 Metodas


3 Reagentai


32 Magnio oksidas





4 Aparatūra



5 Procedūra







Pakartojamumas








2 Metodas






3 Reagentai




33 Fenolis








311 Ninhidrinas




315 1-oktanolis


316 Aminorūgštys


































Žr dar 91 pastabą



4 Aparatūra






46 Centrifuga






5 Procedūra


















Tęsiama pagal 5321









Tęsiama pagal 533





Tęsiama pagal 533

















54 Chromatografija











X =A cM VBm 1 000















10 ml V

10





Vidurkiai gkg




301n = 17

327n = 17

955n = 13


931n = 16

392n = 18

508n = 18

1393n = 16


506n = 17

1201n = 17

4774n = 15


mdash 9021n = 16

9803n = 16


71 Pakartojamumas






010n = 17

011n = 17

026n = 13


020n = 16

011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15

Premiksas 130n = 16

mdash 219n = 16

206n = 16






19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13


21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


27n = 16

26n = 17

22n = 17

24n = 15




Premiksas 22n = 16

mdash 24n = 16

21n = 16


72 Atkuriamumas






030n = 17

023n = 17

030n = 13


048n = 16

034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15

Premiksas 249n = 16

mdash 620n = 16

662n = 16






99n = 17

70n = 17

32n = 13


52n = 16

88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15

Premiksas 43n = 16

mdash 69n = 16

67n = 16




9 Pastabos










2 Metodas




3 Reagentai





























318 Acto rūgštis





4 Aparatūra



43 pH-metras







5 Procedūra













54 HPLC nustatymas






Srautas 1 mlmin







X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m











7 Pakartojamumas






fanu







r = pakartojamumas

R = atkuriamumas













r = pakartojamumas

R = atkuriamumas





nys(CRM 117)





liai(CRM 120)






r = pakartojamumas

R = atkuriamumas



9 Pastabos








B Metanolis


15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B

Srautas 12 mlmin

















2 Metodas

21 A procedūra


22 B procedūra


3 Reagentai





4 Aparatūra




5 Procedūra





52 B procedūra









7 Pakartojamumas





8 Pastabos





(10 m1 + m2) times 5

kurioje












2 Metodas


3 Reagentai




34 Acetonas




4 Aparatūra








5 Procedūra














m

kurioje




7 Pakartojamumas




8 Pastabos











2 Metodas


3 Reagentai





















4 Aparatūra


5 Procedūra


















8 Pastabos







Pavyzdys





4 16610

= 664




Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223




2 Metodas


3 Reagentai















4 Aparatūra


5 Procedūra









7 Pastaba





Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223





2 Metodas




3 Reagentai



(1) OL L 125 1996 5 23 p 35






4 Aparatūra



5 Procedūra















αfrac12 20degD









αfrac12 20degD



αfrac12 20degD





63 Pakartojamumas


7 Pastabos










mdash bulvių masė




mdash spirgučiai




2 Metodas


3 Reagentai


4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra







7 Pastabos










2 Metodas



3 Reagentai




4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra

51 A metodas



52 B metodas






7 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai




4 Aparatūra


5 Procedūra












X =V 100V1 2m

kurioje


7 Pastabos









2 Metodas


3 Reagentai










4 Aparatūra







5 Procedūra















Pakartojamumas







2 Metodas



3 Reagentai





35 Dietileteris

36 Acetonas




4 Aparatūra


5 Procedūra










52 Titravimas






m

čia



7 Pastabos





IV PRIEDAS






2 Metodas


3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis






38 2-propanolis









4 Aparatūra

















5 Procedūra




52 Muilinimas



53 Ekstrahavimas





















56 Kalibravimas



























w =500 c V2 1 000

V1 m[UIkg]

kurioje





7 Pastabos













8 Pakartojamumas







L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49




CVr [ ] 30 35 41 81 38



CVR [ ] 80 62 86 15 20









2 Metodas


3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis













4 Aparatūra


















5 Procedūra




52 Muilinimas


53 Ekstrahavimas















































w =500 c V2

V1 m[mgkg]

kurioje



7 Pastabos










8 Pakartojamumas






L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

vidurkis [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [ ] 22 38 27 41 38

sR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [ ] 48 55 60 60 127





r = pakartojamumas

R = atkuriamumas













2 Principas


3 Reagentai

Įvadinės pastabos























4 Aparatūra




5 Procedūra (1)










Pastabos










Geležis

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Varis

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Manganas

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Cinkas

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm







7 Pakartojamumas






8 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai



33 Amonio acetatas

34 Etilacetatas









38 Metanolis

39 Sidabro nitratas



















4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia


43 Centrifuga








5 Procedūra






52 Ekstrahavimas




53 Gryninimas






54 HPLC nustatymas
















w =c 10m

kurioje




71 Tapatumas












72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis




Rezultatai




sių









2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis





























4 Aparatūra










5 Procedūra






52 Ekstrahavimas



53 Gryninimas





54 HPLC nustatymas
















w =c 200

m

kurioje





71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis
















2 Metodas


3 Reagentai


32 Amonio acetatas






























4 Aparatūra








46 Ultragarso vonia

5 Procedūra








52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i




53 HPLC nustatymas













280 nm








61 Pašarai


w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

kurioje


62 Premiksai


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

kurioje



71 Tapatumas












72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis




1 ėminysA 100

2 ėminysO 100

3 ėminysL1

4 ėminysZ1

5 ėminysK1









9 Pastabos







2 Metodas


3 Reagentai























4 Aparatūra






5 Procedūra







52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i





53 HPLC nustatymas















61 Pašarai


w =c V1

m[mgkg]

kurioje


62 Premiksai


w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje



71 Tapatumas





72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis








5 ėminysLesalas

kalakutams


7 ėminysLesalas

paukščiams B

L 12 12 12 12 12 12 12n 23 23 23 23 23 23 23Vidurkis [mgkg]

5 050 16 200 765 784 929 483 326



5 000 () 16 000()

80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()




() Analyst 1995 120 2 175ndash2 180

V PRIEDAS





2 Metodas


3 Reagentai








4 Aparatūra



5 Procedūra






















=625


=600




E 11cm p a

kurioje















63 Pakartojamumas
































2 Pagrindimas








(1) OL L 221 2002 8 17 p 8
































71 Įvadas







































VI PRIEDAS





2 Jautris


3 Metodas


4 Reagentai





42 Plovikliai

421 Alkoholis 96

422 Acetonas




(1) OL L 165 2004 4 30 p 1

















6 Procedūra















































arba




arba

















VII PRIEDAS











Būtina taikyti




VIII PRIEDAS


Svarbios pastabos







2 Metodas


3 Reagentai

31 Dichlormetanas



















4 Aparatūra








5 Procedūra





52 Ekstrahavimas













56 HPLC nustatymas

















w =c 40m

kurioje



71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis














2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis














4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia





5 Procedūra






52 Ekstrahavimas


53 HPLC nustatymas







380 nm











w =c 1000

m

kurioje




71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis









9 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis



















4 Aparatūra






44 Ultragarso vonia


5 Procedūra








52 Ekstrahavimas





53 HPLC nustatymas








264 nm











w =V c f

m[mgkg]

kurioje






71 Tapatumas











72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis









9 Pastabos








2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis









37 Natrio acetatas

















4 Aparatūra











47 Ultragarso vonia

5 Procedūra








52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i


522 P r em i k s a i ( 0 1 ndash2 0 )





523 P r e p a r a t a i ( gt 2 )




53 Gryninimas






54 HPLC nustatymas








365 nm










61 Pašarai


w =c V1

m[mgkg]

kurioje






w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje






71 Tapatumas












72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis




1 lentelė





2 lentelė



A B C D A B C





IX PRIEDAS





3 straipsnis mdash









3 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





4 Direktyva 7346EEB



4 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

Priedas I priedas



1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash






1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash

Priedas VII priedas




3 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash


13 Direktyva 9864EB



3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

7 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

Priedas VI priedas






5B1 Partija žr 5A1





visos pakuotės






iki 1 1



daugiau kaip 40 4




nuo 1 iki 16 1

nuo 17 iki 200 2

nuo 201 iki 800 3

daugiau kaip 800 4




pašarų papilduose










































II PRIEDAS



1 Tikslas









3 Procedūra









34 Kiti pašarai



4 Ėminių laikymas





















(1) OL L 86 1979 4 6 p 30








III PRIEDAS






2 Metodas


3 Aparatūra







4 Procedūra











42 Džiovinimas













432 J a v a i








m 100

kurioje




m2thornm minusm1

100

m=100 1 minus

m1 m0

mm2

kurioje


53 Pakartojamumas


6 Pastaba





2 Metodas


3 Aparatūra







4 Procedūra








kurioje



Pakartojamumas





2 Metodas



3 Reagentai

31 Kalio sulfatas



33 Cinko granulės





















4 Aparatūra


5 Procedūra

51 Skaidymas





52 Distiliavimas









53 Titravimas





















kurioje






kurioje





kurioje



7 Metodo tikrinimas

71 Pakartojamumas





72 Tikslumas


8 Pastabos








2 Metodas


3 Reagentai







4 Aparatūra




5 Procedūra

51 Ėminio analizė








7 Pastabos








2 Metodas



3 Reagentai






4 Aparatūra




5 Procedūra








Pakartojamumas




7 Pastaba



CONWAY CELL

Scale 11





2 Metodas


3 Reagentai


32 Magnio oksidas





4 Aparatūra



5 Procedūra







Pakartojamumas








2 Metodas






3 Reagentai




33 Fenolis








311 Ninhidrinas




315 1-oktanolis


316 Aminorūgštys


































Žr dar 91 pastabą



4 Aparatūra






46 Centrifuga






5 Procedūra


















Tęsiama pagal 5321









Tęsiama pagal 533





Tęsiama pagal 533

















54 Chromatografija











X =A cM VBm 1 000















10 ml V

10





Vidurkiai gkg




301n = 17

327n = 17

955n = 13


931n = 16

392n = 18

508n = 18

1393n = 16


506n = 17

1201n = 17

4774n = 15


mdash 9021n = 16

9803n = 16


71 Pakartojamumas






010n = 17

011n = 17

026n = 13


020n = 16

011n = 18

016n = 18

028n = 16


013n = 17

027n = 17

099n = 15

Premiksas 130n = 16

mdash 219n = 16

206n = 16






19n = 15

33n = 17

34n = 17

28n = 13


21n = 16

28n = 18

31n = 18

21n = 16


27n = 16

26n = 17

22n = 17

24n = 15




Premiksas 22n = 16

mdash 24n = 16

21n = 16


72 Atkuriamumas






030n = 17

023n = 17

030n = 13


048n = 16

034n = 18

055n = 18

075n = 16


062n = 17

157n = 17

124n = 15

Premiksas 249n = 16

mdash 620n = 16

662n = 16






99n = 17

70n = 17

32n = 13


52n = 16

88n = 18

109n = 18

54n = 16


123n = 17

130n = 17

30n = 15

Premiksas 43n = 16

mdash 69n = 16

67n = 16




9 Pastabos










2 Metodas




3 Reagentai





























318 Acto rūgštis





4 Aparatūra



43 pH-metras







5 Procedūra













54 HPLC nustatymas






Srautas 1 mlmin







X =A B V1 c V2 MC D V3 10 000m











7 Pakartojamumas






fanu







r = pakartojamumas

R = atkuriamumas













r = pakartojamumas

R = atkuriamumas





nys(CRM 117)





liai(CRM 120)






r = pakartojamumas

R = atkuriamumas



9 Pastabos








B Metanolis


15 min 100 A 0 B

17 min 60 A 40 B

19 min 60 A 40 B

21 min 100 A 0 B

33 min 100 A 0 B

Srautas 12 mlmin

















2 Metodas

21 A procedūra


22 B procedūra


3 Reagentai





4 Aparatūra




5 Procedūra





52 B procedūra









7 Pakartojamumas





8 Pastabos





(10 m1 + m2) times 5

kurioje












2 Metodas


3 Reagentai




34 Acetonas




4 Aparatūra








5 Procedūra














m

kurioje




7 Pakartojamumas




8 Pastabos











2 Metodas


3 Reagentai





















4 Aparatūra


5 Procedūra


















8 Pastabos







Pavyzdys





4 16610

= 664




Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223




2 Metodas


3 Reagentai















4 Aparatūra


5 Procedūra









7 Pastaba





Na2S2O3

01 moll


C6H12O6

LaktozėC12H22O11

MaltozėC12H22O11

Na2S2O3

01 moll


1234567891011121314151617181920212223

24487297122147172198224250276303330357385413442471500530560591622

24242525252526262626272727282829292930303131

3673110147184221258295332370408446484522560599638677717757798839880

37373737373737373838383838383939394040414141

3978117156196235275315355395435475516557598639680722765809854900946

39393940394040404040404141414141424344454646

1234567891011121314151617181920212223





2 Metodas




3 Reagentai



(1) OL L 125 1996 5 23 p 35






4 Aparatūra



5 Procedūra















αfrac12 20degD









αfrac12 20degD



αfrac12 20degD





63 Pakartojamumas


7 Pastabos










mdash bulvių masė




mdash spirgučiai




2 Metodas


3 Reagentai


4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra







7 Pastabos










2 Metodas



3 Reagentai




4 Aparatūra

41 Kaitlentė



5 Procedūra

51 A metodas



52 B metodas






7 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai




4 Aparatūra


5 Procedūra












X =V 100V1 2m

kurioje


7 Pastabos









2 Metodas


3 Reagentai










4 Aparatūra







5 Procedūra















Pakartojamumas







2 Metodas



3 Reagentai





35 Dietileteris

36 Acetonas




4 Aparatūra


5 Procedūra










52 Titravimas






m

čia



7 Pastabos





IV PRIEDAS






2 Metodas


3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis






38 2-propanolis









4 Aparatūra

















5 Procedūra




52 Muilinimas



53 Ekstrahavimas





















56 Kalibravimas



























w =500 c V2 1 000

V1 m[UIkg]

kurioje





7 Pastabos













8 Pakartojamumas







L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49




CVr [ ] 30 35 41 81 38



CVR [ ] 80 62 86 15 20









2 Metodas


3 Reagentai

31 Etanolis σ = 96


33 Metanolis













4 Aparatūra


















5 Procedūra




52 Muilinimas


53 Ekstrahavimas















































w =500 c V2

V1 m[mgkg]

kurioje



7 Pastabos










8 Pakartojamumas






L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

vidurkis [mgkg] 17 380 1 187 926 315 613

sr [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [ ] 22 38 27 41 38

sR [mgkg] 830 650 555 189 78

R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [ ] 48 55 60 60 127





r = pakartojamumas

R = atkuriamumas













2 Principas


3 Reagentai

Įvadinės pastabos























4 Aparatūra




5 Procedūra (1)










Pastabos










Geležis

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Varis

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8


Manganas

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Cinkas

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

Mn 2795 nm

Zn 2138 nm







7 Pakartojamumas






8 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai



33 Amonio acetatas

34 Etilacetatas









38 Metanolis

39 Sidabro nitratas



















4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia


43 Centrifuga








5 Procedūra






52 Ekstrahavimas




53 Gryninimas






54 HPLC nustatymas
















w =c 10m

kurioje




71 Tapatumas












72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis




Rezultatai




sių









2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis





























4 Aparatūra










5 Procedūra






52 Ekstrahavimas



53 Gryninimas





54 HPLC nustatymas
















w =c 200

m

kurioje





71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis
















2 Metodas


3 Reagentai


32 Amonio acetatas






























4 Aparatūra








46 Ultragarso vonia

5 Procedūra








52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i




53 HPLC nustatymas













280 nm








61 Pašarai


w =hds hichis hdc

cdc 10 Vm

[mgkg]

kurioje


62 Premiksai


w =hds hichis hdc

c dc 002V pm

[mgkg]

kurioje



71 Tapatumas












72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis




1 ėminysA 100

2 ėminysO 100

3 ėminysL1

4 ėminysZ1

5 ėminysK1









9 Pastabos







2 Metodas


3 Reagentai























4 Aparatūra






5 Procedūra







52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i





53 HPLC nustatymas















61 Pašarai


w =c V1

m[mgkg]

kurioje


62 Premiksai


w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje



71 Tapatumas





72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis








5 ėminysLesalas

kalakutams


7 ėminysLesalas

paukščiams B

L 12 12 12 12 12 12 12n 23 23 23 23 23 23 23Vidurkis [mgkg]

5 050 16 200 765 784 929 483 326



5 000 () 16 000()

80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()




() Analyst 1995 120 2 175ndash2 180

V PRIEDAS





2 Metodas


3 Reagentai








4 Aparatūra



5 Procedūra






















=625


=600




E 11cm p a

kurioje















63 Pakartojamumas
































2 Pagrindimas








(1) OL L 221 2002 8 17 p 8
































71 Įvadas







































VI PRIEDAS





2 Jautris


3 Metodas


4 Reagentai





42 Plovikliai

421 Alkoholis 96

422 Acetonas




(1) OL L 165 2004 4 30 p 1

















6 Procedūra















































arba




arba

















VII PRIEDAS











Būtina taikyti




VIII PRIEDAS


Svarbios pastabos







2 Metodas


3 Reagentai

31 Dichlormetanas



















4 Aparatūra








5 Procedūra





52 Ekstrahavimas













56 HPLC nustatymas

















w =c 40m

kurioje



71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis














2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis














4 Aparatūra

41 Ultragarso vonia





5 Procedūra






52 Ekstrahavimas


53 HPLC nustatymas







380 nm











w =c 1000

m

kurioje




71 Tapatumas











72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis









9 Pastaba






2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis



















4 Aparatūra






44 Ultragarso vonia


5 Procedūra








52 Ekstrahavimas





53 HPLC nustatymas








264 nm











w =V c f

m[mgkg]

kurioje






71 Tapatumas











72 Pakartojamumas





73 Išgavos dydis









9 Pastabos








2 Metodas


3 Reagentai

31 Metanolis









37 Natrio acetatas

















4 Aparatūra











47 Ultragarso vonia

5 Procedūra








52 Ekstrahavimas

521 P a š a r a i


522 P r em i k s a i ( 0 1 ndash2 0 )





523 P r e p a r a t a i ( gt 2 )




53 Gryninimas






54 HPLC nustatymas








365 nm










61 Pašarai


w =c V1

m[mgkg]

kurioje






w =c V2 f

m[mgkg]

kurioje






71 Tapatumas












72 Pakartojamumas


73 Išgavos dydis




1 lentelė





2 lentelė



A B C D A B C





IX PRIEDAS





3 straipsnis mdash









3 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





4 Direktyva 7346EEB



4 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

Priedas I priedas



1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash






1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




1 straipsnis mdash

2 straipsnis mdash

3 straipsnis mdash

Priedas mdash




3 straipsnis mdash

Priedas VII priedas




3 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash


13 Direktyva 9864EB



3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

7 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash





4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash






3 straipsnis mdash

4 straipsnis mdash

5 straipsnis mdash

6 straipsnis mdash

Priedas VI priedas


Documents

REGLAMENTAI - EUR-Lex