Regulacija ekspresije gena

kod prokariota

Bakterije

• Jednoćelijski organizmi koji nemaju jedro i druge organele.

• Geni u najvećem broju slučajeva ne poseduju introne i većina gena organizovana je u operone.

• Operon - grupa gena čiji proteinski produkti imaju srodnu funkciju ili učestvuju u istom metaboličkom procesu, pri čemu se prepisuju sa istog promotora i zajednički su regulisani.

• Policistronska iRNK - prepisana je sa operona i nosi informaciju za sintezu većeg broja proteina.

Transkripcija prokariotskih gena

• Konstitutivni i inducibilni proteini

• Ekspresija inducibilnih proteina indukovana signalima

(najčešće spoljašnjim signalima).

Ekspresija

prokariotskih gena • Transkripcija i translacija

kuplovani procesi kod prokariota.

• Ekspresija gena je usklađena sa ćelijskim potrebama za određenim proteinom i strogo je regulisan proces.

• Regulacija ekspresije gena moguća je na svakom koraku ekspresije gena, ali najčešće se odvija na nivou transkripcije.

Regulacija ekspresije gena

• Izbor promotora glavni mehanizam regulacije

ekspresije gena i kod prokariota i kod eukariota.

RNK polimeraza

Promotor

Sigma faktor

Regulatorni proteini

• Proces ekspresije gena kod prokariota regulisan je posebnom klasom proteina - regulatornim proteinima transkripcije.

• Oni predstavljaju „vezu” gena sa signalima koji kontrolišu proces transkripcije.

• Kada se bakterije kultivišu u in vitro uslovima spoljašnji signali su …..

Regulacija ekspresije gena

kod prokariota

• I u odsustvu regulatornih

proteina RNK polimeraza

ima mogućnost vezivanja za

promotor i prepisivanja gena.

• Ovaj proces zove se

konstitutivna ekspresija i

on obezbeđuje bazalni nivo

ekspresije gena.

Promotor

Regulatorni proteini transkripcije

• Aktivatori transkripcije – proteini koji imaju pozitivan

efekat na ekspresiju gena.

• Represori transkripcije – proteini koji imaju negativan

efekat na ekspresiju gena, odnosno na njenu redukciju

ili potpunu blokadu.

Regulatorne sekvence

• Aktivatori i represori transkripcije vezuju se za molekul DNK na način koji je specifičan za sekvencu.

• Sekvence koje ovi proteini prepoznaju i za koje se vezuju u molekulu DNK nazivaju se regulatorne sekvence.

• Regulatorni proteini sa suprotnim efektom na transkripciju kod prokariota poseduju različite regulatorne sekvence. One se nalaze u blizini ili u samom promotoru.

Represori transkripcije

• Regulatorne sekvence u okviru promotora za koje se

vezuju represori transkripcije nazivaju se represorne

sekvence.

• Represorne sekvence u okviru promotora operona

nazivaju se operatori.

• Vezivanjem za represornu sekvencu, represor blokira

vezivanje i/ili aktivnost RNK polimeraze.

Aktivatori transkripcije

• Aktivator pomaže vezivanje RNK polimeraze za

promotor (jednom svojom površinom aktivator se vezuje

za mesto vezivanja na molekulu DNK, a drugom

površinom za enzim RNK polimerazu).

• Mehanizam kojim aktivator transkripcije pomaže

vezivanje RNK polimeraze za promotor naziva se

regrutovanje.

Aktivatori transkripcije

• U slučajevima kada svoje dejstvo ispoljavaju nakon

vezivanja RNK polimeraze za promotor, aktivatori

dovode do konformacione promene RNK polimeraze.

Konformaciona promena RNK polimeraze omogućava

tranziciju zatvorenog u otvoreni kompleks transkripcije.

• Ovaj način aktivacije transkripcije naziva se alosterična

aktivacija enzima RNK polimeraze.

• Ekspresija gena može biti regulisana i većim brojem

spoljašnjih signala.

• Svaki signal može „komunicirati“ sa posebnim

regulatornim proteinom.

• Međusobnom interakcijom regulatorni proteini

omogućavaju integraciju različitih signala koja utiče na

ekspresiju jednog gena.

Kooperativan način vezivanja

regulatornih proteina

Proteini koji menjaju arhitekturu

molekula DNK su DNK vezujući

proteini koji pomažu u

kooperativnom načinu vezivanja

drugih DNK vezujućih proteina

Regulatorni proteini transkripcije

• Pored alosterične promene enzima RNK polimeraze i regulatorni proteini mogu menjati svoju konformaciju.

• Tipičan prokariotski regulatorni protein javlja se u dve konformacije: jedna koja omogućava i druga koja blokira njegovo vezivanje za molekul DNK.

• Konformacija regulatornih proteina zavisi od interakcije sa signalom kojim je i regulisana njegova aktivnost i ekspresija gena.

Laktozni operon

Laktozni operon

• Glukoza je glavni izvor

energije za ćeliju E. coli.

• U situacijama kada glukoze

nema u ćeliji, bakterija kao

izvor energije koristi druge

dostupne šećere.

• Laktozni operon je skup gena

čiji proteinski produkti

učestvuju u transportu i

razgradnji disaharida

laktoze.

• lacZ gen – kodira protein β-galaktozidazu koji razlaže

laktozu na galaktozu i glukozu.

• lacY gen – kodira protein laktoznu permeazu koji je

lokalizovan u ćelijskoj membrani i učestvuje u transportu

laktoze.

• lacA gen – kodira enzim koji učestvuje u procesima

oslobađanja toksičnih tiogalaktozida iz ćelije.

Laktozni operon

• Bazalni nivo ekspresije operona registrovan je u

bakterijskim ćelijama u kojima je prisutna i laktoza i

glukoza.

• Lac operon eksprimira se u visokom nivou kada je u

ćeliji prisutna laktoza, a odsustvuje glukoza.

Regulatorni proteini

laktoznog operona

• Ekspresija laktoznog operona regulisana je sa dva

regulatorna proteina (aktivatorom i represorom

transkripcije).

• Oba regulatorna proteina su DNK vezujući proteini a

njihova aktivnost koordinisana je različitim signalima.

Lac represor

• Represor laktoznog operona naziva se Lac represor i

njega kodira gen lacI koji se nalazi u blizini operona, ali

poseduje sopstveni promotor i samostalno se eksprimira.

• U uslovima kada se u ćeliji ne nalazi laktoza, Lac

represor blokira ekspresiju laktoznog operona.

Protein CAP

• Laktozni aktivator poznat je pod skraćenicom CAP

(eng. Catabolite Activator Protein). Neki autori ga

nazivaju i protein CRP (eng. cAMP Receptor Protein).

• U prisustvu laktoze i odsustvu glukoze, CAP aktivator

stimuliše ekspresiju laktoznog operona.

Šećer laktoza je signal koji je

povezan sa Lac represorom

• Prisustvo laktoze je signal koji dovodi do inaktivacije

Lac represora čime se blokira njegovo vezivanje za

operator i na taj način se omogućava transkripcija

laktoznog operona.

https://www.youtube.com/watch?v=oBwtxdI1zvk

Protein CAP aktivator transkripcije

• Kada u ćeliji nema glukoze dolazi do aktivacije proteina

CAP. Mesto vezivanja aktivatora CAP nalazi se 60 bp

uzvodno od mesta starta transkripcije.

• Aktivator se u formi dimera vezuje za svoje mesto

vezivanja i regrutuje enzim RNK polimerazu.

• Samo vezivanje CAP aktivatora za CAP mesto na molekulu DNK nije dovoljno za njegov pozitivan efekat na ekspresiju laktoznog operona.

• Pored domena za vezivanje za molekula DNK, aktivatori poseduju i tzv. aktivirajući domen.

• Aktivirajući domen omogućava kontakt (protein-protein interakciju) aktivatora i enzima RNK polimeraze.

• Zahvaljujući aktivirajućem domenu aktivator ima sposobnost regrutovanja RNK polimeraze.

• Ispitivanjem mutiranih RNK polimeraza utvrđeno je C-terminalni domen α subjedinice RNK polimeraze koji se naziva CTD odgovoran za kontakt sa aktivatorom.

Integracija signala

• Kombinacija aktivnosti ova dva regulatorna proteina

opredeljuje nivo ekspresije Lac operona.

• Kod Lac operona odsustvo glukoze i prisustvo laktoze je

kombinacija signala koja omogućava efikasnu ekspresiju

laktoznog operona.

Laktozni operon

• Nakon ulaska u ćeliju, laktoza prelazi u formu

alolaktoze.

• Konverzija laktoze u alolaktozu katalizovana je

enzimom čiji se gen nalazi u okviru Lac operona - β-

galaktozidaza.

• Ovaj enzim je prisutna u ćeliji zahvaljujući bazičnom

nivou ekspresije Lac operona.

Signal represor Lac

• Alolaktoza ima mogućnost interakcije sa Lac

represorom i indukuje njegovu alosteričnu promenu.

• Konformacionom promenom Lac represor gubi

sposobnost vezivanja za laktozni operator a time gubi i

svoj negativni efekat na ekspresiju lac operona.

Signal aktivator CAP

• U uslovima niskog nivoa glukoze, količina cAMP u ćeliji raste. cAMP vezuje se za protein CAP koji trpi konformacionu promenu. Zadobijena konformacija CAP-a omogućava njegovo vezivanje za CAP mesto na molekulu DNK u blizinu promotora.

Laktozni operon

• Obrnuto, u uslovima visokog nivoa glukoze, kada ćelija

nema potrebu za sintezom proteina koji učestvuju u

metabolizmu drugih šećera osim glukoze, količina cAMP

opada usled smanjenja aktivnosti enzima adenilat

ciklaze.

Regulacija ekspresije gena i

enzim RNK polimeraza

Regulacija ekspresije gena i enzim

RNK polimeraza

• Enzim RNK polimeraza prepoznaje promotor svojom

sigma (σ) subjedinicom.

• Kod bakterije E. coli za većinu promotora, RNK

polimeraza vezuje se zahvaljujući σ 70 subjedinici.

• Međutim, u ćeliji se kodira veći broj σ subjedinica koje

imaju mogućnost da zamene σ 70 omogućavajući

ekspresiju sa alternativnih promotora.

Regulacija ekspresije gena i enzim

RNK polimeraza

• Alternativni sigma faktori

• Sigma faktori 70, 28 i 34.

Alosterične promene enzima RNK

polimeraze ili molekula DNK

• Regulatorni protein NtrC

• Reguliše ekspresiju gena glnA

• Metabolizam azota

• Signal – nizak nivo azota

• Fosforilacija

• Regulatorna sekvenca

150bp uzvodno od promotoa

• Proteini koji menjaju

arhitekturu molekula

DNK – IHF

• Konformaciona promena

RNK polimeraze i tranziciju

iz zatvorenog u otvoreni

komples

• Ekspresija gena

Regulatorni protein MerR

• Regulatorni protein MerR kontroliše ekspresiju gena

merT koji kontrolišu otpornost bakterijske ćelije na

toksično dejstvo žive.

• MerR je regulatorni protein koji takođe ima sposobnost

alosterične promene.

• Za razliku od proteina NtrC, aktivnošću proteina MerR

alosteričnu promenu trpi molekul DNK.

Regulatorni protein MerR

• Mesto vezivanja ovog aktivatora nalazi se unutar samog

promotora i to između konsenzusnih sekvenci -10 i -35.

• U uslovima odsustva žive, protein MerR vezan je za

svoje vezujuće mesto u okviru promotora gena merT.

• Konformacija samog promotora je takva da ne sprečava

vezivanje RNK polimeraze ali to vezivanje onemogućava

otpočinjanje transkripcije.

• Konsenzusne -35 i -10 sekvence nalaze se na suprotnim

stranama DNK heliksa tako da se RNK polimeraza

vezuje samo za -35 konsenzusnu sekvencu promotora.

• Živa je signal aktivacije regulatornog proteina MerR.

• Aktivirani protein MerR vrši alosteričnu promenu

promotorske DNK sekvence i to u smislu njenog

„uvrtanja“.

Regulatorni protein MerR

• Ovom alosteričnom

promenom konsenzusne

sekvence -35 i -10 dovode

se na istu „stranu“ DNK

heliksa čime je

omogućeno pravilno

vezivanje RNK polimeraze

za promotor gena.

Kontrola ekspresije gena

mehanizmom antiaktivacije

• Operon araBAD kod E. coli sadrži gene koji kodiraju

enzime uključene u metabolizam L-arabinoze.

• Promotor araBAD operona E. coli aktivira se u prisustvu

arabinoze i u odsustvu glukoze.

• Regulacija ekspresije operona vrši se posredstvom dva

aktivatora – AraC (proteinski produkt gena araC) i

proteina CAP.

Protein AraC i aktivator i represor

transkripcije

• U uslovima kada je L-arabinoza prisutna u bakterijskoj

ćeliji, regulatorni protein AraC vezuje se za ovaj šećer.

• Protein AraC zadobija konformaciju koja mu omogućava

vezivanje za DNK u obliku dimera.

• Mesto vezivanja proteina AraC na molekulu DNK naziva

se araI i sadrži dva polu-mesta araI1 i araI2.

Protein AraC i aktivator i represor

transkripcije

• Kada L-arabinoza nije prisutna u bakterijskoj ćeliji, nema

ni ekspresije operona araBAD.

• U odsustvu L-arabinoze, protein AraC ima konformaciju

koja omogućava da se jedan monomer veže za araI1

mesto a drugi monomer vezuje se za udaljeno polu-

mesto koje se naziva araO2. S obzirom na to da je polu-

mesto araI2 za vezivanje monomera proteina AraC

prazno nema ni ekspresije araBAD operona.

Regulacija ekspresije gena kod

prokariota nakon inicijacije

transkripcije

Prevremena terminacija

transkripcije - atenuacija

• Ekspresija gena koji kodiraju enzime uključene u proces

biosinteze ak triptofana kod E. coli. Pet gena za ove

enzime nalazi se u okviru trp operona i eksprimiraju se

kada u ćeliji postoji mala količina triptofana.

• Ekspresija operona regulisana je regulatornim proteinom

- triptofanskim represorom – represor Trp.

• Vezivanjem za triptofan (ko-represor), represor Trp trpi

konformacionu promenu koja mu omogućava da se veže

za operator u okviru promotora.

Vodeća sekvenca

Prevremena terminacija

transkripcije - atenuacija • Kada u ćeliji postoji visoka količin triptofana RNK

polimeraza započne prepisivanje trp operona, često ne

dolazi do prepisivanja kompletne policistronske iRNK

već se prepisuje kratki transkript tzv. vodeće (leader)

sekvenca.

5' kraj policistronske iRNK trp operona

Vodeća sekvenca

Ukosnice vodeće sekvence

• Ukosnice mogu formirati region 1 i 2, region 2 i 3 kao i

region 3 i 4.

• Ukosnica koju formiraju regioni 3 i 4 naziva se

atenuatorska ukosnica (petlja).

• Na poslednji region koji ima mogućnost formiranja

ukosnice nastavlja se niz od osam uracila koji se naziva

atenuator.

• U okviru ovog niza nalazi se mesto atenuacije na kome

se završava transkripcija vodeće sekvence RNK dužine

od 139 nukleotida.

Vodeći peptid

Trp polipeptid

Kraj vodeće sekvence

Atenuacija

• U okviru otvorenog okvira čitanja vodeće sekvence (u

regionu 1 koji je odgovoran za formiranje ukosnice)

nalaze se dva uzastopna kodona za triptofan.

• Njihova funkcija je da zaustave ribozom za vreme

translacije leader peptida.

Mala količina triptofana u ćeliji

• Kada je u ćeliji prisutna mala količina triptofana, postoji i mala količina tRNK koja nosi triptofan.

• Tokom translacije se na dva kodona za tritofan zaustavlja ribozom koji „maskira“ region 1.

• Ribozom fizički sprečava formiranje ukosnice između 1. i 2. regiona.

Mala količina triptofana u ćeliji

• Tako je region 2 slobodan za formiranje ukosnice sa

regionom 3.

• Pošto se formira petlja između 2. i 3. regiona, ne dolazi

do formiranja atenuatorske petlje.

• Bez formiranog atenuatorske petlje RNK polimeraza

prepisuje kompletan trp operon i sinteza svih proteina čiji

se geni naleze u okviru operona.

Visoka količina triptofana u ćeliji

• Ne dolazi do zaustavljanja ribozoma na dva kodona triptofana u okviru regiona 1 vodeće sekvence.

• Ribozom prelazi preko regiona 1 i blokira region 2 u trenutku kada se kompletira transkribovanje regiona 3 i 4 vodeće sekvence.

• Regioni 3 i 4 imaju sposobnost formiranja atenuatorske ukosnice.

Visoka količina triptofana u ćeliji

• Kao posledica formiranja atenuatora dolazi do

zaustavljanja transkripcije na kraju vodeće sekvence.

• Translatirani leader peptid nema funkciju u ćeliji i biva

brzo degradovan od strane enzima proteaza.

Uslovi u kojima ne dolazi do

sinteze proteina

• U uslovima kada nema sinteze proteina, ribozom se ne

vezuje za transkript triptofanskog operona, tada se

formiraju dve ukosnice u okviru vodeće sekvence i to

jedna između regiona 1 i 2 i druga između regiona 3 i 4.

Regulacija ekspresije gena

translacionom represijom

Regulacija ekspresije gena

translacionom represijom

• Regulacija ekspresije gena translacionom represijom podrazumeva postojanje neke vrste „represora“ koji blokira proces translacije.

• Primer ove vrste regulacije ekspresije gena su ribozomski proteini (r-proteini) koji su translacioni represori sopstvene sinteze.

Regulacija ekspresije gena

translacionom represijom • r-proteini funkcionišu kao

represori sopstvene translacije i to vezivanjem jednog ili dva ribozomska proteina za iRNK blizu mesta vezivanja ribozoma u toku inicijacije translacije.

• Sličnost sekundarne strukture rRNK i iRNK.

• Kako ribozomski proteini imaju veći afinitet vezivanja za rRNK, vezivanje za iRNK i blokada translacije odvija se samo u situacijama kada su svi potrebni ribozomi formirani.

Uloga molekula RNK u

regulaciji ekspresije kod

prokariota

Mali molekuli RNK kod

prokariota • U bakterijama je detektovano prisustvo molekula RNK

koji po svojoj strukturi i funkciji ne pripadaju ni jednoj od tri najčešće grupe molekula RNK (iRNK, rRNK i tRNK).

• To su mali molekuli RNK (eng. small RNA, sRNA) veličine od 80 do 110 nukleotida.

• Nazivaju se i nekonvencionalne, funkcionalne ili regulatorne RNK.

• Samo je u genomu E. coli detektovano preko 100 gena koji kodiraju za sRNK.

Mali molekuli RNK kod

prokariota

• sRNK učestvuju u procesima degradacije iRNK i kontroli

translacije. Neke sRNK inhibiraju dok druge aktiviraju

proces translacije.

• Bazno sparivanje sRNK i iRNK je potpomognuto

proteinom Hfq koji se naziva i proteinski pratilac

(šaperon) sRNK.

Riboprekidači

• U bakterijama, otkrivena je još jedna posebna klasa

molekula RNK koji imaju ulogu u regulaciji ekspresije

gena na nivou transkripcije ili inicijacije translacije.

• To su regulatorni elementi RNK, specifične sekundarne

strukture, koji se nazivaju riboprekidači (eng.

riboswitch).

Riboprekidači

• Riboprekidači svoju ulogu u procesima regulacije

ekspresije gena postižu upravo promenom svoje

sekundarne strukture.

• Promena njihove sekundarne strukture je posledica

njihovog vezivanja za direktne senzore, male molekule

(metabolite) koji kontrolišu terminaciju transkripcije ili

inicijaciju translacije.

Riboprekidači

• Riboprekidači obično se nalaze u 5’ netranslatirajućem

regionu gena čiju ekspresiju kontrolišu i sastoje se iz dva

regiona: aptamera i ekspresione platforme.

• Riboprekidače karakteriše specifična sekundarna

struktura, ukosnica koju formiraju komplementarni

regioni.

APTAMER

EKSPRESIONA

PLATFORMA

• Vezivanje malog molekula za aptamerni region indukuje

promenu sekundarne strukture riboprekidača koji može

dovesti do terminacije transkripcije.

Ukosnica koja uslovljava

terminaciju transkripcije

Uloga riboprekidača u inhibiciji

translacije

• U odsustvu senzornog molekula, riboprekidač poseduje

sekundarnu strukturu koja omogućava nesmetano

odvijanje translacije.

• Prisutvo senzornog molekula uzrokuje aktiviranje riboprekidača u smislu promene njegove sekundarne strukture.

• Promena strukture uslovljava raskidanje jednih i formiranje drugih ukosnica.

• Formirana ukosnica između regiona 3 i 4 čini mesto vezivanja ribozoma nedostupno za formiranje ribozoma. Na ovaj način blokirana je inicijacija translacije.