Rekayasa Genetika Obat (Biomol).pdf

8/16/2019 Rekayasa Genetika Obat (Biomol).pdf

1/5

Umum

Produksi Obat Dan Bibit Unggul Tanaman Berbasis Biologi

Molekuler (II. Produksi obat berbasis biologi molekuler )

on 13 November 2012.

1. A. Abstrak:

Obat yang dikembangkan dalam penelitian ini adalah human erythropoietin (hEPO). Pada penelitian ini gen hEPO

diinsersikan pada pada plasmid pPICZαB yang kemudian ditransformasikan pada genom Pichia pastoris. Untuk keperluan

klinis diperlukan protein yang murni. Purifikasi dilakukan dengan metode histrap dan dilanjutkan dengan kolom

kromatografi filtrasi gel untuk mendapatkan protein yang lebih murni. Hasil penelitian awal menunjukkan bahwa proteintelah terekspresi dengan berat molekul sebesar 37 KiloDalton. Kegiatan yang dilakukan pada tahun 2010 ini adalah

pemurnian protein yang dilan jutkan dengan melakukan uji preklinis (uji farmakokinetik ) dan peptide mapping untuk

karakterisasinya.

Kata kunci : erythropoietin, Pichia pastoris, purifikasi, uji p reklinis, peptide mapping .

PENDAHULUAN

Eritropoietin (EPO) adalah suatu glikoprotein hormon yang mengatur proses eritropoiesis, yaitu proses proliferasi dan

diferensiasi sel progenitor eritroid menjadi eritrosit pada manusia. Menurunnya k andungan EPO d alam tubuh dapat

menyebabkan anemia karena rendahnya proses eritropoiesis. EPO adalah sitokin yang diketahui dapat menstimulasi proses

angiogenesis, vaskulogenesis, dan proliferasi sel endotelial. Gen human EPO diekspresikan sebagian besar pada jaringan

ginjal dan hati sebagai respons terhadap hipoksia.

EPO adalah hematopoietic growth factor pertama yan g telah diklon dan mempunyai untai tunggal 165 asam amino dengan

3 posisi N-glikosilasi pada Asn24, Asn38, dan Asn83, dan 1 posisi O-glikosilasi pada Ser126. Glikosilasi sangat penting

terhadap fungsi hayati EPO. Glikosilasi yang tidak tepat atau modifikasi pada rantai glikan EPO dapat mengakibatkan

perubahan aktivitas secara in vitro maupun in vivo. Jumlah residu asam sialat ( sialic acid ) dan pola percabangan N-glikosilasi dari rantai olig osakarida akan menentukan farmakodinamik, kecepatan katabolisme, dan aktiv itas hayati EPO.

EPO rekombinan telah tersedia dan digunakan untuk pengobatan klinis pada penderita anemia yang disebabkan oleh

kanker, infeksi HIV, myelodysplastic syndromes, gagal ginjal, dan transplantasi sumsum tulang. Untuk kebutuhan klinis

rekombinan EPO ini tersedia dalam jumlah besar hasil ekspresi pada sel mamalia, yaitu pada sel CHO ( chinese hamster

ovary). Namun yang menjadi kendala penggunaan kultur sel mamalia untuk produksi EPO rekombinan adalah efisiensi dan

biaya produksi yang tinggi, dan o leh karena itu sangat dibutuhkan sistem alternatif yang lebih efisien d engan biaya produks

yang lebih murah dalam memproduksi EPO rekombinan. Pichia pastoris merupakan khamir metilotropik yang menawarkan

suatu sistem ekspresi yang sangat menguntungkan untuk produksi protein rekombinan. Dibandingkan dengan sistem

ekspresi dari jenis eukariot lainnya, P . pastoris memiliki keuntungan lebih, yaitu sistem ekspresi dengan efisiensi yang

tinggi karena menggunakan methanol inducible alcohol oxidase gene (AOX1) promoter and vectors yang terintegrasi pada


2/5

genom Pichia, memiliki level sekresi yang tinggi pada media bebas protein, proses fermentasi yang mudah, terbatasnya atau

tidak terjadi glikosilasi berlebih, dan tidak adanya gugus antigenik, yaitu ikatan α-1,3-manosa yang terdapat pada ujung

gugus gula. P . pastoris diketahui menunjukkan glikosilasi yang sangat mirip dengan sel mamalia.

Kegiatan penelitian yang dilakukan pada 2010 adalah purifikasi protein yang selanjutnya dilakukan uji farmakokinetik

dengan penguku ran kadar hematokrit p ada hewan mencit. Selain itu dilakukan k arakterisasi susunan asam amino h EPO

( peptide mapping ) dengan menggunakan spektrofotometri tandem MS.

BAHAN DAN METODE

1. Purifikasi dengan Histrap

Isolasi EPO rekombinan menggunakan kromatografi kolom afinitas dengan matriks agen pengkelat nikel. Purifikasi

dilakukan dengan menggunakan kolom histrap. Pada proses ini, matriks yang terdapat pada kolom disetimbangkan dalam

bufer bin ding (bufer fosfat pH 7.4) yang mengandun g 20 mM natrium fosfat, 500 mM NaCl, d an 2 0 mM imidazol. Sampel

supernatan yang mengandung eritropoietin rekombinan hasil ekspresi pada P . pastosris galur X-33 (20 ml) diaplikasikan

pada kolom yang telah diekuilibrasi. Selanjutn ya kolom dicuci dengan menggunakan bufer binding. Elusi dilakukan dengan

bufer elusi yan g mengandung 20 mM natrium fosfat, 500 mM NaCl dan 500 mM imidazol. Hasil elusi difraksionasi masing-

masing 1 ml dan ditampung dalam tabung polipropilena 1.5 ml (GE Healthcare 2009). Selanjutnya analisis blot Western

dilakukan untuk mencari fraksi yang mengandung EPO rekombinan paling tinggi.

2. Purifikasi Eluat Hasil Histrap dengan Kromatografi Filtrasi Gel Sephadex LH-20

Eluat hasil histrap yang mengandung EPO rekombinan diaplikasikan ke dalam kolom Sephadex LH-20 dengan volume 40

ml untuk mendapatkan protein yang lebih murni dan menghilangkan imidazol yang terdapat dalam eluat hasil histrap.

Kolom Sephadex LH-20 yang telah dipak diekuilibrasi dengan bufer fosfat yang mengandung 50 mM natrium fosfat pH 6.7

dengan 125 mM NaCl sebanyak 80 ml. Kemudian sebanyak 4 ml eluat hasil histrap diaplikasikan kedalam kolom dan

dilanjutkan dengan elusi sebanyak 60 ml bufer fosfat dengan laju air 1 ml/menit. Hasil elu si difraksionasi masing-masing 1

ml dan ditampung dalam tabung propilena 1.5 ml.

3. Uji Biologis rhEPO

Human rekombinan erythropoietin yang telah dipurifikasi di uji biologisnya. Uji biologis yang dilakukan yaitu melihat

jumlah retikulosit yang terdapat dalam tubuh mencit setelah pemberian rhEPO. rhEPO disuntikan pada mencit strain DDY

dengan berat badan rata-rata ±30 gram. Dibuat 4 kelompok mencit dengan pemberian dosis rhEPO berbeda. Masing-masing

kelompok diberi dosis yaitu 20 IU/ml, 80 IU/ml, 160 IU/ml dan kontrol PBS (tanpa ada rhEPO), dengan metode penyuntikan

single injection, Setelah 1 minggu, darah mencit diambil dengan menggunakan tabung mikro hematoktrit. Selanjutnya darah

tersebut diamati dengan menghitung jumlah retikulositnya.

1. 1. Peptide mapping

Protein y ang telah murni dielektroforesis dengan menggunakan SDS PAGE selama 90 menit, 90 volt. Selanjutnya dilakuk an pewarnaan gel dengan coomassie briliant blue. Setelah pita protein target terwarnai, dilakukan pemotongan pita dari gel

yang selanjutnya dikering anginkan. Gel yang sudah kering dilakukan analisis dengan Spektrofotometer Tandem MS.

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Purifikasi dengan Histrap

Hasil purifikasi supernatan P. pastoris galur X-33 yang mengandung EPO dengan metode Histrap menunjukkan dua fraksi

yang mengandung EPO rekombinan dengan konsentrasi tinggi, y aitu terdapat pada fraksi 1 (Lajur 3) dan 2 (Lajur 4). Untuk

fraksi 3 (Lajur 5) didapatkan pita tipis yang menandakan di dalam fraksi tersebut hanya mengandung sedikit protein EPO.


3/5

Hal tersebut dapat dilihat dari hasil analisis blot Western seperti terlihat pada Gambar 3. Lajur 1 adalah standar EPO berupa

EPO rekombinan yang dihasilkan dari sel mamalia (sel CHO). Lajur 2 berupa marka protein yang sudah d iketahui bo bot

molekulnya. Pita protein EPO rekombinan hasil purifikasi memiliki ukuran yang sama dengan standar EPO rekombinan,

yaitu sekitar 37 kDa.

Gambar 8 Fraksionasi eluat hasil histrap dengan mengunakan kolom kromatografi filtrasi gel Sephadex LH-20 volume 40

mL.

Terdapat 4 fraksi protein yang terukur pada absorbans 280 nm.

Untuk mengetahui fraksi mana yang mengandung EPO rekombinan maka dilakukan analisis dengan menggunakan blot

Western dan hasilnya

1. 1. Uji Biologis rhEPO

Hasil uji retikulosit didapatkan adanya peningkatan jumlah retikulosit dalam tubuh mencit, yang menandakan rhEPO

tersebut bekerja dengan baik, dengan semakin meningkatnya dosis rhEPO dapat meningkatkan pula jumlah retikulosit

dalam tubuh mencit.

4. Peptide mapping


4/5

Gambar 11. Hasil peptide mapping dari protein EPO hasil ekspresi dari P. pastoris dengan menggunakan spektrofotometri

tandem MS.

Dari data yang dihasilkan dapat dilihat bahwa sekitar 40% sekuens protein sesuai dengan protein EPO dari bank gen seperti

dibawah ini:

APPRLICDSRVLERYLLEAKEAEN ITTGCAEHCSL

NEN ITVPDTKVNFYAWKR MEVGQQAVEVWQGL

ALLSEAVLRGQALLVN SSQPWEPLQLHVDKAVS

GLRSLTTLLRALRAQKEAISPPDAASAAPLRTITA

DTFRK LFRVYSNFLRGK LKLYTGEACR TGDR

Susunan diatas merupakan asam amino protein human EPO lengkap. Huruf N dan S tebal adalah oligosakarida Asparagine

(N) dan Serin (S) yang terdapat pada human EPO. Hasil peptide mapping d itunjukkan dengan huruf bergaris bawah. Dari

hasil ini terlihat bahwa sekitar 40% protein bisa dikenali dengan metode Spektrometri Tandem MS, dan menguatkan bahwa

EPO protein yang diproduksi oleh P.pastoris galur X-33 memiliki peptida yang sesuai.

KESIMPULAN

1. Dari hasil purifikasi menunjukkan bahwa diperluakan tahap purifikasi selanjutnya selain dengan metode histrap,

yaitu d engan menggunakan kromatografi filtrasi gel.2. Uji farmakokinetik pada hewan percobaan menunjukkan peningkatan kadar hematokrit darah setelah

disuntikkan protein hEPO

1. Analisis sekuens protein menunjukkan kesesuain susunan asam amino antara hEPO hasil ekspresi pada sistem P. pastoris dengan data dari bank gen.

DAFTAR PUSTAKA

Ausubel FM et al . 1992. Short Protocols in Molecular Biology. Ed ke-2. New York: John Wiley & Sons. Cregg JM, Vedvick

TS, Raschke W. 1993. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. Bio/Technology 11: 905-910.


5/5

Charlton A, Zachariou M. 2008. Immobilezed Metal Ion Affinity Chromatography of Histidine-Tagged Fusion Proteins. Di

dalam: Zachariou M, editor. Methods in Molecular Biology, Vol. 421: Affinity Chromatography: Methods and Protocols. Ed

ke-2. Totowa: Humana Press. Egrie, J. 1999. The cloning and production of recombinant human erythropoietin.

Pharmacotherapy 10:3s-8s. Fernandez JM, Hoeffer JP. 1999. Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of

Expression. San Diego: Academic

Skoko N et al . 2003. Ekspression and characterization of human interferon-I in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.

Biotechnol Appl Biochem 38:257-265.

Documents

Rekayasa Genetika Obat (Biomol).pdf