Rekombinan DNA dengan Menggunakan Enzim Restriksi EcoRI

Pendahuluan

Biologi molekular dalam perkembangannya berlangsung sangat cepat. Berbagai teknik untuk menggabungkan urutan DNA menjadi kombinasi baru (DNA rekombinan) semula dikembangkan sebagai alat riset untuk menyelidiki dan memanipulasi gen; tetapi teknik tersebut juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi gen yang cacat berkaitan dengan suatu penyakit; akhirnya teknik tersebut akan digunakan untuk memperbaiki defek (cacat) genetik. Teknologi DNA rekombinan sedikit banyak telah digunakan di laboratorium klinik, dan survei sepintas lalu terhadap kepustakaan yang sekarang beredar menghasilkan kesimpulan bahwa teknik ini akan segera menggantikan banyak prosedur pemeriksaaan klinis yang sekarang berlaku.1Tujuan pembuatan makalah ini adalah untuk mengetahui hasil dari gen bagi protein P, apakah normal atau abnormal. Melalui rekombinan DNA dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI.Genetika

Genetika adalah cabang biologi yang berurusan dengan hereditas dan variasi. Unit-unit herediter yang ditransmisikan dari satu generasi ke generasi berikutnya (dengan kata lain, diwariskan) disebut gen. Gen terletak dalam molekul-molekul panjang asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleid acid, DNA) yang ada dalam semua sel.2Istilah gen pertama kali dikemukakan pada tahun 1909 oleh seorang ahli biologi Denmark bernama Wilhelm Johannsen (1857-1927) untuk menggambarkan suatu unit pewarisan.3

Gen adalah unit informasi yang mengarahkan aktivitas sel atau organisme selama masa hidupnya. Gen meneruskan pesannya kepada keturunan yang dihasilkan ketika sel atau organisme membelah atau bereproduksi, sehingga gen juga merupakan unit pewarisan sifat. Dalam percobaan klasik yang dilakukan George Beadle dan Edward Tatum (1940) ditunjukkan kalau gen membawa informasi yang diperlukan untuk membuat suatu enzim tunggal, sedangkan banyak protein mengandung sejumlah rantai polipeptida.4Asam Deoksiribonukleat (DNA)

DNA (asam deoksiribonukleat) merupakan materi genetik dari sebagian besar organisme. Tiap kromosom adalah suatu molekul DNA yang sangat panjang. Molekul kimia penyusun DNA dinamakan nukleotida. Satu nukleotida terdiri dari satu molekul gula dan satu molekul fosfat yang terikat pada salah satu basa DNA, yaitu Timin, Adenin, Guanin dan Sitosin.3Bentuk molekul DNA adalah salah satu ciri khasnya. Bentuk molekul DNA menyerupai tangga spiral atau dikenal secara ilmiah dengan sebutan heliks ganda. Molekul tersebut memiliki dua untai yang saling berpilin dengan penghubung-penghubung di antara kedua untai tersebut sehingga membentuk anak tangga. Meskipun sangat panjang (sekitar 1,5 meter), DNA sebenarnya merupakan molekul yang cukup sederhana. Ada empat macam nukleotida yang diwakili oleh huruf A,G,C dan T. Seuntai DNA dapat memiliki sekuens (urutan) yang tersusun dari keempat huruf tersebut dalam susunan yang bervariasi. Apabila kita mengetahui sekuens huruf pada satu untai DNA, kita dapat langsung mengetahui pula sekuens huruf di untai pasangannya, karena keempat huruf tersebut membentuk pasangan yang saling melengkapi. A selalu berpasangan dengan T, dan G selalu berpasangan dengan C.3Sekuens DNA sebenarnya merupakan barisan kata yang terdiri dari tiga huruf menyandi salah satu dari 20 asam amino. Misalnya, satu set huruf AGC menyandi asam amino serin, TTC adalah sandi untuk asam amino fenilanin, dan seterusnya.3DNA bersama dengan suatu matriks protein membentuk nukleoprotein dan terorganisasi menjadi struktur yang disebut kromosom yang ditemukan dalam nukleus atau daerah inti sel. Sebuah gen mengandung kode informasi bagi produksi protein. Normalnya, DNA adalah molekul yang stabil dengan kapasitas untuk bereplikasi sendiri. Terkadang, bisa terjadi perubahan spontan pada suatu bagian DNA. Perubahan itu disebut mutasi, dapat menyebabkan perubahan kode DNA yang mengakibatkan produksi protein yang salah atau tidak lengkap. Hasil netto sebuah mutasi seringkali terlihat sebagai perubahan pada tampilan fisik suatu individu ataupun perubahan pada hal-hal lain yang dapat terukur pada organisme itu, disebut karakter atau sifat. Melalui proses mutasi, sebuah gen dapat berubah menjadi dua atau lebih bentuk alternatif yang disebut alel.2

Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika mengacu pada berbagai macam prosedur pengubahan mekanisme informasi genetik secara sengaja. Seorang ahli biologi menjadi insiyur dan merekonstruksi molekul DNA atau keseuruhan genom (seluruh rangkaian gen) di dalam nukleus dengan tujuan untuk mengobati penyakit-penyakit genetik spesifik ataupun memperoleh pemahaman yang lebih baik mengenai aparatus genetik.4Prosedur-prosedur DNA rekombinan (penjalinan gen, gene splicing) adalah contoh rekayasa genetika yang paling dikenal. DNA dari organisme asing, biasanya merupakan species yang benar-benar berbeda, diintroduksi, dan diintegrasi dengan genom organisme tertentu. Genom hibrid yang baru pun diperoleh dengan karakteristik-karakteristik organisme penyumbang DNA diekspresikan pada organisme penerima.4Rekayasa genetika yang melibatkan keseluruhan genom dilakukan pada penyatuan nukleus-nukleus yang berasal dari dua species yang berbeda. Biasanya kromosom-kromosom salah satu spesies tetap fungsional, sementara yang berasal dari spesies kedua cenderung mengalami kerusakan. Akan tetapi, sebagian kromosom dari spesis kedua mungkin bisa tetap berfungsi di dalam nukleus hasil kombinasi. Percobaan-percobaan semacam itu sangat berguna untuk menjabarkan fungsi-fungsi spesifik sejumlah kecil gen-gen kromosom spesies kedua yang tetap berfungsi.4Rekombinan DNA

Alat utama bagi penelitian-penelitian mengenai DNA rekombinan adalah enzim restriksi (endonuklease), plasmid, dan virus. Enzim-enzim restriksi diisolasi untuk pertama kalinya pada saat yang sama dengan penemuan retrovirus. Enzim restriksi bekerja seperti gunting yang memungkinkan DNA dipotong pada daerah-daerah tertentu. Plasmid adalah potongan DNA berbentuk sirkular yang terdapat di luar kromosom bakteri dan sejumlah khamir. Gen yang terdapat dalam plasmid mungkin berjumlah satu, sedikit ataupun banyak. Pada berbagai bakteri, plasmid mengandung gen-gen yang memberikan kekebalan terhadap berbagai jenis antibiotik.4Dalam salah satu teknik rekombinan, DNA asing diinkubasi bersama plasmid yang telah dibuka oleh enzim-enzim restriksi. Enzim-enzim tersebut menghasilkan ujung-ujung lengket (sticky ends) yang memungkinkan perakitan ulang untai DNA dengan mudah. DNA asing berinkoperasi dengan plasmid, yang kemudian menutup dan masuk ke dalam bakteri penerima. Saat bakteri membelah, plasmid bereplikasi dan diteruskan ke masing-masing sel anakan.4Dengan menggunakan peralatan biokimiawi dan mekanis dari teknologi DNA, para saintis dapat membuat DNA rekombinan in vitro (di dalam gelas- yaitu di dalam tabung atau botol reaksi). Mereka kemudian dapat memasukkan DNA tersebut ke dalam sel kultur yang mereplikasi DNA dan mungkin mengekspresikan gennya, menghasilkan suatu produk yang diinginkan. Bakteri E.Coli sering digunakan sebagai organisme inang untuk DNA rekombinan karena bakteri ini mudah tumbuh dan sifat biokimiawinya telah dipahami dengan baik.5Enzim Restriksi Digunakan untuk Membuat DNA Rekombinan

Pengklonan gen dan rekayasa genetik telah dimungkinkan oleh penemuan enzim yang bisa memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi spesifik yang jumlahnya terbatas. Enzim ini disebut enzim restriksi, ditemukan dalam bakteri pada akhir tahun 1960-an. Di alam, enzim ini melindungi bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari organisme lain, seperti virus atau sel bakteri lain. Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong-motong DNA asing, suatu proses yang disebut restriksi. Sebagian besar enzim restriksi ini sangat spesifik, mengenali urutan nukleotida pendek dalam molekul DNA dan memotong pada titik tertentu di dalam urutan ini. Sel bakteri ini melindungi DNA-nya sendiri dari restriksi dengan menambahkan gugus metil (-CH3) pada adenin atau sitosonin di dalam urutan yang dikenali oleh enzim restriksi tersebut. Ratusan enzim restriksi telah diidentifikasi dan diisolasi, dan banyak yang telah tersedia komersial.5Enzim restriksi memotong ikatan fosfodiester kovalen pada kedua untai, sering dalam bentu menyerupai tangga. Karena urutan target biasanya muncul (dengan sendirinya) berkali-kali dalam molekul DNA yang panjang, suatu enzim akan membuat banyak potongan. Salinan molekul DNA selalu menghasilkan serangkaian fragmen restriksi yang sama apabila dipaparkan dengan enzim itu. Dengan kata lain, enzim restriksi memotong molekul DNA dengan cara yang dapat direproduksi. Fragmen restriksi itu berupa fragmen DNA untai-ganda dengan sedikitnya satu ujung untai-tunggal dari molekul DNA lain yang dipotong oleh enzim yang sama. Gabungan yang dibentuk dengan cara ini hanya bertahan untuk sementara, karena hanya sedikit ikatan hidrogen yang menyatukan fragmen-fragmen itu. Akan tetapi, penggabungan DNA ini dapat dibuat permanen dengan enzim DNA ligase, yang menyegel untai itu dengan mengkatalis pembentukan fosfodiester. Kita sekarang telah memiliki DNA rekombinan, DNA yang telah disambung dari dua sumber yang berbeda.5Mutasi

Mutasi adalah perubahan materi genetik yang dapat diwariskan dan memunculkan bentuk-bentuk alternatif gen apapun. Bentuk-bentuk alternatif itu disebut alel. Secara garis besar, terdapat dua macam mutasi, yaitu mutasi yang mempengaruhi gen dan mutasi yang mempengaruhi keseluruhan kromosom. Mutasi gen pada tingkat nukleotida disebut mutasi titik.6Mutasi subtitusi basa adalah subtitusi sebuah asam amino dengan asam amino lainnya. Transisi terjadi ketika terdapat kesalahan perpasangan basa yang mengakibatkan tertukarnya satu purin dengan purin lain atau satu pirimidin dengan pirimidin lainnya. Transversi terjadi jika purin digantikan oleh pirimidin ataupun sebaliknya. Karena perubahan-perubahan struktural yang mengarah pada terjadinya transisi relatif kecil, transisi jauh lebih sering terjadi daripada transversi, yang membutuhkan modifikasi-modifikasi molekul DNA yang lebih besar.2,6

Kadang-kadang terjadi mutasi titik di tempat pengenalan enzim restriksi. Oleh karena itu, enzim dapat melakukan pemotongan di tempat pengenalan yang lain tetapi tidak di tempat mutasi. Akibatnya, fragmen restriksi dihasilkan oleh enzim berukuran lebih besar untuk individu dengan mutasi dibandingkan dengan untuk individu normal. Mutasi juga dapat menciptakan tempat restriksi yang tidak terdapat di gen normal. Dalam hal ini, fragmen restriksi akan lebih pendek untuk individu dengan mutasi daripada untuk individu normal. Variasi dalam panjang fragmen restriksi dikenal sebagai restrikski polimorfisme panjang fragmen.1

Karena banyak mutasi yang berkaitan dengan penyakit genetik tidak terjadi di tempat restriksi, untuk mendeteksi mutasi tersebut telah dikembangkan teknik lain. Dapat disintesis probe oglinukleotida yang komplementer bagi suatu urutan DNA pendek yang mengandung mutasi. Dibuat bermacam-macam probe untuk alel yang mengandung mutasi dan untuk alel yang mengandung gen abnormal diperbanyak melalui reaksi berantai polimerase, dan sampel DNA ditempatkan dalam pita sempit pada kertas nitroselulosa (slot blotting). Kertas kemudian diberikan probe untuk urutan normal atau urutan mutan. Autodiagram menunjukkan apakah probe normal atau mutan secara istimewa membentuk pasangan basa dengan DNA, yaitu apakah alelnya normal atau mengalami mutasi. Pembawa, tentu saja, memiliki dua alel yang berbeda, satu berikatan dengan probe normal dan satunya lagi berikatan dengan probe mutan.1Pemeriksaan ini juga dapat dilakukan dengan elektroforesis gel dan teknik Southern Blot. Namun metode slot blotting, lebih sederdahana dan lebih dapat dipertanggungjawabkan untuk digunakan sebagai pemeriksaan penapisan.1

Kesimpulan

Dengan teknik DNA rekombinan, kita bisa mengetahui gen tersebut normal atau abnormal. Melalui enzim restriksi, ia akan memotong membentuk sticky ends atau blunt ends. Apabila terjadi mutasi di titik tempat pengenalan restriksi, maka enzim tidak dapat memotong pada titik terjadi mutasi tersebut. Sehingga fragmennya menjadi lebih besar dari yang besar. Dan menyebabkan keabnormalan gen.

Daftar Pustaka

1. Marcks BD, Marcks A, Smith C. Biokimia kedokteran dasar. Jakarta: EGC; 2000.

2. Elrod S, Stansfield W. Schaums outlines genetika. Edisi ke-4. Jakarta: Erlangga; 2011.

3. Brookes M. Genetika. Jakarta: Erlangga. 2008

4. Fried G, Hademenos G. Schaums outlines biologi. Edisi ke-2. Jakarta: Erlangga; 2011.

5. Campbell N, Reece J, Mitchell L. Biologi. Edisi ke-5. Jakarta; Erlangga; 2002

6. Stansfield W, Colome J, Cano R. Schaums easy outlines biologi molekuler dan sel. Jakarta: Erlangga; 2009.

6