Universidade Estadual de CampinasFaculdade de Engenharia de Alimentos

TA 514 – Bioquímica de Alimentos

Preparo de Solução Tampão

Grupo II:

Camila Sousa Natália Carvalho 092470Renan Alex Lazarin 092810Tatiana Sakamoto

Campinas, 21 de Março de 2011

Sumário

Introdução............................................................................................2Objetivos..............................................................................................4Materiais e Métodos.............................................................................4

Preparo de Solução Tampão..............................................................4Verificação da Capacidade Tamponante...........................................5

Resultados e Discussões......................................................................5Preparo de Solução Tampão..............................................................5Verificação da Capacidade Tamponante...........................................6Solubilidade das Proteinas do Leite...................................................7Capacidade Tamponante de Diversos Sistemas................................7Curvas de Titulação de Soluções:......................................................8

Conclusões.........................................................................................10Referências Bibliográficas..................................................................10

Introdução

Qualquer solução que contenha um ácido fraco e uma base fraca tem a capacidade de absorver pequenas quantidades de um ácido forte ou de uma base forte com uma variação muito pequena no pH. Quando pequenas quantidades de um ácido forte são adicionadas, elas são neutralizadas pela base fraca, enquanto que pequenas quantidades de uma base forte são neutralizadas pelo ácido fraco. Tais soluções são chamadas tampões, pois elas resistem a variações significativas no pH.

Um tampão cujo pH seja menor que 7 pode ser preparado misturando-se um ácido fraco com um sal derivado do ácido fraco, e um tampão cujo pH seja, maior que 7 pode ser preparado misturando-se uma base fraca com um sal derivado de base fraca. Pelo conveniente ajuste entre a razão de concentrações dos constituintes do tampão, pode ser preparado um tampão com qualquer pH desejado. Contudo, a faixa de pH mais efetiva para qualquer tampão está sobre ou próxima do pH em que as concentrações do ácido (ou base) e do sal são iguais. Em um tampão ácido, a concentração de H+ (e o pH) são determinados pelas concentrações relativas do ácido fraco (HA) e sua base conjugada (que é o ânion, A-):

Ka = [H+][A-] / [HA]

Resolvendo para [H+] e aplicando logaritmo, temos:

pH = pKa + log {[A-] / [HA]}

E esta é a equação de Henderson-Hasselbalch para o cálculo do pH, válida para pHs entre 4 e 10.

Um fator determinante da eficiência do tampão é a sua concentração que é a soma das concentrações do ácido e da base conjugada. Quanto maior a concentração de um tampão, maior a disponibilidade das espécies capazes de doar ou receber prótons e sua eficiência é máxima no pH igual ao pKa.

- Qual a importância do sistema tampão no sistema biológico?

Os tampões biológicos são aqueles encontrados nos seres vivos. Eles são responsáveis pela regulação dos líquidos do organismo que inclui a monitoramento da concentração do íon hidrogênio, de modo a assegurar o ambiente ótimo para as funções celulares.

A redução do pH no sistema biológico é denominada acidose e o seu aumento constitui a alcalose. Ambos, acidose e alcalose, podem diminuir acentuadamente a eficiência das reações químicas celulares, por isso, o metabolismo celular exige um estreito limite para a concentração do íon hidrogênio.Como o metabolismo celular produz ácidos que devem ser neutralizados, a fim de preservar o pH ou, em outras palavras, manter estável a concentração do íon hidrogênio, a regulação do equilíbrio entre os ácidos e as bases do organismo depende de um mecanismo imediato, representado pelo sistema tampão

- Explique se a adição de qualquer volume de base interfere significativamente no valor final do pH de uma solução tampão.

A solução de um ácido fraco em água apresenta uma concentração de HA muito maior do que a de A, como resultado da pequena dissociação que é característica do ácido fraco. Se esta solução for submetida a uma contínua adição de álcali, haverá uma progressiva dissociação do ácido, cuja concentração diminuirá, e um conseqüente aumento da concentração de A, acompanhados do aumento do valor do pH. Se a quantidade de álcali adiciona for grande, a concentração de HÁ acaba tornando-se tão reduzida que passa a ser insuficiente para compensar, com sua dissociação, novas adições de álcali. A partir desse ponto, o pH sofrerá aumentos significativos a cada nova adição de álcali, mostrando que o sistema perdeu suas propriedades tampão.

Figura. Titulação de um ácido fraco com álcali. Na região assinalada, as adições de álcali provocam pequenas variações do pH; fora dessa região, a variação é grande.

- Qual a importância das soluções tampões na ação das enzimas?

Mudanças extremas de pH podem alterar a estrutura da enzima devido a uma repulsão de cargas. Mudanças mais brandas de pH podem levar a uma dissociação de enzimas oligoméricas. Por outro lado, as mudanças de pH que não afetam totalmente a estrutura de uma enzima podem diminuir sua atividade apenas por estar afetando resíduos do sítio catalítico. Sendo assim, o pH é um fator de grande importância para atividade enzimática, podendo esta ser maior ou menor em determinadas faixas de pH. O sistema tampão é importante justamente para garantir uma faixa de pH em que a atividade enzimática se dê com sua maior eficiência, garantindo processos enzimáticos mais rápidos, como mostra a Figura 2, por exemplo.

Figura 2: Curva da atividade enzimática com variação de pH.

Objetivos

- Preparo de soluções tampão e verificação da capacidade tamponante. - Cálculo de pH, concentração de ácido fraco e sua base conjugada empregados no - preparo de sistemas tampão. Conhecimento da faixa de capacidade tamponante de diferentes soluções tampão.

Materiais e Métodos

- Béquer;- Bagueta;- Pipeta;- Balão volumétrico;- Potenciômetro;- Ácido clorídrico (HCl);- Fosfato de Sódio monobásico;- Fosfato de sódio dibásico;- Água destilada;- Suco de fruta comercial (sabor uva)

Preparo de Solução Tampão

- Preparou-se 100 mL de fosfato de sódio monobásico 0,2 Mol/L e 100 mL de solução de fosfato de sódio dibásico 0,2 Mol/L.

- Preparou-se 100 ml de tampão fosfato 0,2 Mol/L pH 7,0 em um béquer e medindo o pH em potenciômetro.

Verificação da Capacidade Tamponante

- Adicionou-se 5 mL de HCl 0,1 Mol/L no béquer contendo 100 mL de tampão fosfato 0,2 Mol/L pH 7,0 e verificou-se o pH em potenciômetro.

- Transferiu-se 100 mL de água destilada em um béquer e adicionou-se 5 mL de HCl 0,1 Mol/L, medido o pH antes de depois da adição de ácido.

- Verificou-se o pH do suco de fruta comercial (100 mL). Adicionou-se 5 mL de HCl 0,1 Mol/L no béquer contendo 100 mL de suco de fruta e mediu-se novamente o pH.

Resultados e Discussões

Preparo de Solução Tampão

a) Cálculo para preparo 100 mL de fosfato de sódio monobásico 0,2 Mol/L e 100 mL de solução de fosfato de sódio dibásico 0,2 Mol/L.

Dados: Fosfato de sódio monobásico PA: (NaH2PO4.H20) PM = 138,00 Solução de fosfato de sódio dibásico 0,5 M Ácido fosfórico: pKa = 2,1; pKa2 = 7,2; pKa3 = 12,4

NaH2PO4.H20 1 mol ---- 138g0,2 mol ---- x x = 27,6 g/L = 2,76 g/100mL

Fosfato de sódio dibásico (0,5M)

C1.V1 = C2.V20,5.V1 = 0,2.100 V1= 40mL Completar volume pra 100mL com

água destilada

b) Cálculo para a quantidade de fosfato de sódio monobásico 0,2 Mol/L e de solução de fosfato dibásico 0,2 Mol/L para preparo de 100 mL de tampão fosfato 0,2 Mol/L pH 7,0.

pH = pKa + log [A-] [HA]

7 = 7,2 + log [A-] log [A-] = -0,2 [HA] = 1,585 [HA] = 1,585.[A-] [HA] [HA] [A-]

[A-] + [HA] = 0,2

[HA] = 1,585.[A-] [A-] + [HA] = 0,2 2,585.[A-] = 0,2 [A-] = 0,077mol e [HA] = 0,123mol

Para [A-]:C1.V1 = C2.V20,2.V1 = 0,077.100 V1 = 38,5mL

Para [HA]:C1.V1 = C2.V20,2.V1 = 0,123.100 V1 = 61,5mL

c) Verificação de pH em potenciômetro.

Foi verificado que o tampão tem pH = 6,96

O pH esperado era 7, porém o valor de 6,96 é bem aceito em termos práticos, já que para que o pH se dar com tanta exatidão, seria necessário pesar massas muito precisas e não haver nenhum tipo de resíduo ou sobras de reagentes em qualquer um dos materiais utilizados, o que se distancia um pouco da realidade de um laboratório químico.

Verificação da Capacidade Tamponante

a) Cálculo do pH teórico esperado, após adição de 5 mL de HCl 0,1mol/L em 100 ml de solução tampão fosfato 0,2 mol/L e pH 7.

pH teórico esperado:

NaH2PO4 + H2O NaH-PO4 + H3O+

0,123 + 0,0005 = 0,1235pH = pKa + log [A-] pH = 7,2 + log 0,075 pH = 6,983

[HA] 0,1235 pH antes de adicionar 5mL de HCL 0,1Mol/L: pH (antes) = 6,96

pH depois de adicionar 5mL de HCL 0,1Mol/L: pH (depois) = 6,32

O pH esperado era de 6,983, porém, na prática o pH foi de 6,32. Essa diferença pode ter ocorrido por dois motivos:

- a maneira de calcular o pH teórico se dá de uma forma generalizada, ou seja, não é levado em conta qual sistema tampão se está trabalhando, sendo assim, é muito natural o teórico desvencilhar-se da prática;- cada sistema tampão tem uma capacidade tamponante específica e uma faixa de pH atuante também específica, o que poderia representar que o sistema tampão fosfato não tem uma grande capacidade de manter o pH ou sua eficiência não se dá nessa faixa de pH=7, porém, esta última afirmação não é verdadeira de acordo com a literatura.

b) Adicão de 5 mL de HCl 0,1 Mol/L em 100 mL de água destilada

pH (antes) = 6,02

pH (depois) = 3,0

Ao adicionarmos HCl à água destilada, verificamos que o pH reduziu-se. Isso ocorreu pelo fato de o ácido clorídrico, quando dissociado, liberar prótons.A água destilada possui moléculas de H+ dissociado. Quando adicionamos o HCl que, quando dissociado libera prótons, a solução passa a mais moléculas de H+. Esse aumento da concentração de prótons torna a solução ácida e, conseqüentemente, diminui o pH.

H2O H+ + OH- (antes)

H2O H+ + OH-HCl H+ + Cl- (depois)

c) Adicão de 5 mL de HCl 0,1 Mol/L em 100 mL de suco de fruta.

pH do suco de fruta comercial: pH (antes) = 3,63

pH do suco de fruta + 5mL de HCL 0,1Mol/L: pH (depois) = 3,53

É notável que o pH do suco diminui muito pouco com a adição de ácido clorídrico, podendo indicar a presença de um sistema tamponante em sua composição. Os ácidos presentes em frutas são ácidos orgânicos e, portanto ácidos fracos (exemplo: ácido cítrico, ácido majoritário em várias frutas), estas apresentam complexa e diversificada composição podendo haver associação desses ácidos com íons presentes e formação de um sistema tampão, ou reação dos íons H+ adicionados com algum componente, explicando assim o motivo de não ocorrer acentuado decréscimo no pH com a adição de ácido como ocorre na água destilada, na qual nenhuma associação ou reação com os íons hidrogênio adicionados é possível.

Solubilidade das Proteinas do Leite

Em 200 mL de leite desnatado 2%

adição de :

10 mL de solução HCl 0,6 mol/L

10 mL de água10 mL de

solução NaOH 0,6 mL/L

pH 5,57 6,81 11,63

AspectoMuito

precipitado, pouco turvo

Pouco precipitado, bastante turvo

Sem precipitado, límpido

A caseína, proteína majoritária no leite, é carregada negativamente, o que garante repulsão das moléculas e, portanto, dispersão no produto. Com adição de ácido, as cargas são neutralizadas, o que causa aproximação das moléculas e conseqüente precipitação. A formação de precipitado se deve, portanto, à aglomeração da caseína.

Na 2ª solução ocorreu turbidez, decorrente dos sólidos em suspensão no leite. Já na 1ª solução, a turbidez foi pouca, uma vez que as proteínas foram precipitadas, ocorrendo menor concentração de sólidos solúveis no restante do sistema e provocando menor turbidez.

Capacidade Tamponante de Diversos Sistemas

Sistema tampão Faixa de pHCapacidade Tampão

pH de capacidade tampão máxima

T. acetato 4,26 - 5,26 4,76T. fosfato 6,36 – 7,36 6,86T.citrato 2,2 – 8,0 3,04; 4,75; 5,41T.citrato fosfato 2,0 – 12,0 3,04; 4,75; 5,41T. borato 8,23 – 10,23 9,23T. borato – NaOH 7,8 – 10,0 9,0T. tris HCl 7,2 – 9 8,3T. glicina – HCl 1,2 – 3,6 2,34T. glicina – NaOH 8,4 – 13,0 9,6T. carbonato - bicarbonato 9,2 – 10,7 10,2

Fonte: [1] e [2]

Curvas de Titulação de Soluções:

Figura: a)Titulação de 25 mL de solução HCl 0,1 Mol/L com solução de NaOH 0,1 Mol/L ; b)Titulação de 25 mL de solução de glicina 0,1 Mol/L com solução de NaOH 0,1 Mol/L ; c)Titulação de 25 mL de solução

de ácido acético 0,1 Mol/L com solução de NaOH 0,1 Mol/L.

Pelos formatos apresentados pelas curvas de titulação, observa-se que a titulação de HCl com NaOH é típica de uma titulação ácido forte x base forte, não havendo formação de solução tampão intermediária já que todo ácido e toda base estão nas formas totalmente dissociadas, a reação envolvida é:

H+ + OH- H2O

Já nas curvas de titulação das soluções de Acido Acético e de Glicina, observa-se o efeito tamponante, caracterizado pelos platôs quando pH ~ pka.

Ácido acético trata-se de um ácido fraco, no qual a dissociação não é completa, e há equilíbrio entre as formas dissociada e não dissociada (na região pH~pka):

Ac. Acético (HAc) Acetato (Ac-)

Quanto mais próximo do pKa, menor a variação de pH causada por adição de base. Entre pKa +1 e pKa -1, a variação de pH é reduzida (menor declive da curva), pois essa é a região na qual a solução tem poder tamponante.

Em pH < (pKa – 1) há predomínio da forma não dissociada e em pH > (pKa +1) há predomínio da forma dissociada, já em pH~pKa temos equilíbrio entre as duas formas.

A glicina é um aminoácido e sua curva de titulação apresenta dois platôs, como no caso dos ácidos dipróticos, já que a reação tem duas etapas, e dois valores de pka:

Glicina: Forma 1 Forma 2 Forma 3

Em pH < (pKa1-1) há predomínio da forma 1, em pH > (pKa2+1) há predomínio da forma 3 e a forma 2 predomina na faixa (pKa1 + 1)< pH < (pKa2 –1). Nas regiões pH~pKa1 temos equilíbrio entre as formas 1 e 2 e quando pH~pKa2, equilíbrio entre as formas 2 e 3.A faixa de maior capacidade do sistema tamponante corresponde à parte da curva onde o pH sofre pouca alteração com adição de volumes maiores de NaOH.

Na curva de HCl nota-se que essa faixa não existe, já que NaOH neutraliza HCl na medida em que é adicionado ao sistema. Na curva do ácido acético, entre os pH 2 e 4 é possível observar pequeno efeito tamponante no sistema. A curva de titulação para a glicina apresenta resultado tamponante entre os pH 1 e 3 com melhor eficiência, uma vez que é possível adicionar grande quantidade de titulante sem alterar significativamente o pH do sistema. Outra faixa possível de tamponamento para glicina é entre 9 e 10, sem entretanto, ter mesma eficiência.

Conclusões

Sistemas tamponantes podem ser complexos, como é o caso do leite e do suco utilizados em aula prática, e podem ser simples e possíveis de serem sintetizados em laboratório, como a solução tampão de fosfato preparada. Eles são de extrema importância para manutenção das funções biológicas, auxiliam na conservação de alimentos e fornecem características intrínsecas de produtos, já que o pH influencia velocidade, intensidade e mecânica de reações bioquímicas.

Referências Bibliográficas

[1] HANDBOOK, HANBOOK OF BIOCHEMISTRY. 2ª ed., Editora CRC, E.U.A, 1996

[2] LEHNINGER, A.L., et al PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY. 2ª ed., Editora Worth Publisher, E.U.A, 1993.

[3] MARZZOCO, ANITA; TORRES, BAYARDO B. – BIOQUÍMICA BÁSICA. 3ªed., Editora Guanabara Koogan, R.J., 2007