verIFRJ – Campus MaracanãCoordenadoria de BiotecnologiaDisciplina: Técnicas de Análises BioquímicasTurma: BM171Professores: Hiram Araújo e Leila Pontes

Relatório de Técnicas de AnálisesRelatório de Técnicas de Análises BioquímicasBioquímicas

HPLC (High-Performance Liquid Cromatography)HPLC (High-Performance Liquid Cromatography)

Avaliação:

Critério: Nota:

Apresentação

Introdução

Objetivos

Material Utilizado/ Métodos

Resultados

Discussão

Conclusão

Referências Bibliográficas

Total:

Alunos: Alexandre G. Garcez Arthur de Lima Bruno Oliveira

Rio de Janeiro, 13 de junho de 2011.SumárioSumário

Introdução Pág.: 3; 4

Objetivos Pág.: 4

Material Utilizado e Métodos Pág.: 5; 6

Resultados

Discussões

Pág.: 6; 7;

8; 9; 10Conclusão Pág.: 10

Referências Bibliográficas Pág.: 11

Anexo Pág.: 12

1.1. IntroduçãoIntrodução

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) – do inglês High-performance

Liquid Cromatography (HPLC) – é o tipo de cromatografia mais utilizado, empregada para

separar e determinar as espécies em diversos materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos.

Esse tipo de método cromatográfico caracteriza-se pelo aumento do número de pratos

teóricos, o que está relacionado com a área da fase estacionária, de modo que quanto menor

o tamanho da partícula, maior a resistência ao fluxo da fase móvel. Desta forma, para que

haja uma boa resolução, na HPLC são utilizadas partículas de fase estacionária resistentes a

altas pressões, constituindo uma estrutura mais complexa e cara (figura 1) se comparada à

cromatografia líquida clássica. A partir disso, a cromatografia de alta eficiência pode

empregada em cromatografias de adsorção, troca-iônica, partição, afinidade e exclusão.

Figura 1: Diagrama esquematizando a instrumentação utilizada na HPLC. Fonte: SKOOG, D. A. et al.

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. In: ______. Fundamentos de Química Analítica. 8. ed. São

Paulo: Thomson, 2008. p 926.

As colunas utilizadas na HPLC são comumente feitas de aço e suportam pressões de

até 5,5x107Pa, tendo de 15 a 50cm de comprimento e de 1 a 4mm de diâmetro, sendo

algumas forradas com uma superfície espelhada, que permite um empacotamento mais

eficiente da coluna.

A fase estacionária da HPLC é uma resina, que pode ser de três tipos diferentes, e

que se baseiam numa estrutura sólida e rígida, diferente das resinas em gel. Já a escolha da

fase móvel depende do tipo de separação desejada: separações isocráticas requerem uma

única bomba e dois ou mais solventes misturados em proporções fixas; enquanto que nas

separações em gradiente, requere-se duas bombas que bombeiam dois solventes diferentes

em proporções pré-determinadas. Um dos requisitos com relação à fase móvel na HPLC é

que os solventes sejam altamente puros, uma vez que, caso contrário, podem danificar a

coluna e interferir no sistema de detecção.

As bombas utilizadas na HPLC podem ser de pressão constante, permitindo um

fluxo sem pulsos pela coluna, mas que pode reduzir a velocidade deste caso haja uma

redução da permeabilidade da coluna, ou também podem ser de troca constante, que

mantém sempre o mesmo fluxo através da coluna independente de alterações desta durante

a cromatografia.

Os detectores mais comuns em HPLC baseiam-se em métodos

espectrofotométricos, que lêem absorbâncias tanto no espectro do visível quanto do

ultravioleta. Também são utilizados detectores de fluorescência e detectores eletroquímicos,

de modo que nos três tipos de detectores a sensibilidade é aumentada após a amostra passar

por um processo de derivatização, em que o analito é convertido antes ou após a sua

passagem pela coluna em um derivado químico.

2.2. ObjetivosObjetivos

• Verificar a presença das metilxantinas, cafeína e a teobromina, em amostra de

achocolatado por HPLC com coluna de fase reversa (C18), além de aplicar o método

quantitativo de padronização externa para determinar o teor de cafeína.

• Discutir a respeito da eficiência e limitações da técnica utilizada.

3.3. Material Utilizado e MétodosMaterial Utilizado e Métodos

• Material Utilizado:

▪ Água Milli-Q

▪ Metanol

▪ Agitador Magnético com aquecimento (Marca: NovaTécnica, Modelo: NTNO3)

▪ Proveta de 100mL

▪ Béquer 50mL

▪ Vidro de relógio

▪ Bastão de vidro

▪ Funil

▪ Papel de Filtro

▪ Balão volumétrico 100mL

▪ Suporte universal

▪ Argola

▪ 2x Pipeta volumétrica de 1mL

▪ Pró pipete

▪ Solução de Carrez I K4[Fe(CN)6]

▪ Solução de Carrez II Zn(C2H3O2)2

▪ Swinex (25mm / 0,45uL)

▪ Tubo do tipo Eppendorf

▪ Seringa Syringe (1mL)

▪ Seringa

▪ Padrões de concentração TC1, TC2, TC5, TC10, TC20, TC50 em ppm (partes por milhão)

▪ Achocolatado Nescau (0,4998g) (Validade: 01/09/2010)

▪ Café Nescafé Solúvel (Validade: 01/12/2011)

▪ Café Nescafé descafeinado (Validade: 01/02/2011)

▪ Balança Scientech® SA210

▪ UltiMate® 3000 HPLC focused (Marca: DIONEX)

▪ Coluna cromatográfica C-18 de 100 x 2,1mm com poro de 3µm

▪ Coluna cromatográfica C-18 de 100 x 4,6mm

▪ Detector de UV_VIS

▪ Detector Diode Array

• Métodos:

Pesou-se aproximadamente 0,20g de chocolate em pó, em becher de 100mL.

Adicionou-se 50 mL de água milli-Q, ferveu-se por aproximadamente 5 minutos e deixou-

se em repouso até atingir a temperatura ambiente. Transferiu-se quantativamente a solução

resultante para balão volumétrico de 100mL. Adicionou-se 1 mL de cada uma das duas

soluções de carrez e após agitação, deixou-se o sistema em repouso por 5 min. Avolumou-

se então, até o traço de referência, em seguida filtrou-se, abandonando os primeiros 5 mL.

Uma pequena parte de cada uma das soluções finais filtrou-se novamente para tubos

eppendorf, usando filtro para amostra aquosa, com 25 mm de diâmetro e 0,45 µm de poro.

Com a amostra em mãos deu-se início a cromatografia no aparelho de HPLC. Usou-

se os 6 padrões (TC 1, TC 2, TC 5, TC 10, TC 20, TC 50) que já estavam prontos. Antes de

injetá-los no aparelho, lavou-se a seringa de vidro com água milli-Q 3 vezes e após rinsou-

se novamente por 3 vezes, só que com o padrão que seria injetado, repetindo este

procedimento antes de cada injeção. Feito isso, injetou-se cada padrão separadamente

esperando-se sempre o tempo de eluição completa de todos os componentes. A quantidade

injetada foi superior a 20 µL. Após, colocar-se todas os padrões no aparelho, adicionou-se a

amostra, realizando antes a lavagem da seringa 3 vezes com água milli-Q e rinsagem com a

própria amostra 3 vezes.

Por fim, realizou-se a análise da cromatografia realizada, observando-se as

características dos gráficos obtidos.

4.4. Resultados Resultados

Nossos resultados desta prática são expressos através de uma tabela adquirida pelo

computador acoplado ao HPLC, que nos expressa valores como o tempo de retenção (Ret.

Time), a área dos picos do cromatograma (Area), o peso molecular (Height), a concentração

(Amount) - além da média destes valores (Average), e o desvio padrão (Rel. Std. Dev.) - das

moléculas de cafeína e de teobromina presentes em cada um dos padrões e na amostra de

achocolatado, café solúvel e café descafeinado. Todos os valores a seguir são provenientes

de um detector de luz UV/Visível:

Cafeína

Sample Sample Name Ret.Time (min)

Area (mAU*min)

Height (mAU)

Amount (µg/mL) Type

Plates (EP)

1 TC1 2,067 5,8715 53,1657 1,3234 MB 28162 TC2 2,067 10,7175 107,4134 2,4156 bMB 29433 TC5 2,06 27,6 270,5283 6,2208 MB 28814 TC10 2,06 53,4727 538,1205 12,0522 MB 29905 TC20 2,06 102,7172 1047,049 23,1515 MB 30476 TC50 2,053 213,7789 2146,645 48,1838 MB 29277 Achocolatado 2,06 5,0635 54,265 1,1413 BMb 31428 Café solúvel 2,067 47,3775 488,8662 10,6785 BMB 31149Ca Café descafeinado 2,067 1,7296 23,6063 0,3898 BMB 4420

Average: 2,061 59,8887 602,4553 13,4984 2964Rel.Std.Dev: 0,22% 127,42% 127,57% 127,42% 3,64%

Teobromina

Sample Sample Name Ret.Time (min)

Area (mAU*min)

Height (mAU)

Amount (µg/mL) Type

Plates (EP)

1 TC1 1,44 6,3971 64,4558 1,4221 BM 17222 TC2 1,44 11,9196 130,7436 2,6497 BMB 17653 TC5 1,44 29,6647 326,5343 6,5945 bM 17734 TC10 1,44 56,6686 642,9679 12,5975 BM 18485 TC20 1,44 108,0406 1236,078 24,0175 BM 18646 TC50 1,44 214,482 2396,779 47,6796 M 17657 Achocolatado 1,44 56,2543 627,0766 12,5054 MB 18728 Café solúvel n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.9 Café descafeinado 1,467 22,7203 293,3458 5,0508 Rd n.a.

Average: 1,44 69,061 774,9479 15,3523 1801Rel.Std.Dev: 0,00% 105,30% 105,40% 105,30% 3,27%

As médias dos valores e o desvio padrão apresentados são referentes apenas ao

achocolatado, por ser a amostra purificada por nosso grupo. Também é possível observar

algumas informações da tabela nos cromatogramas anexados à este relatório.

5.5. Discussão Discussão

Ao observar os cromatogramas dos padrões observamos dois picos, eles são

referentes a teobromina e a cafeína, sendo a teobromina presente no chocolate e a cafeína

presente no café. Através destes cromatogramas é possível a elaboração de uma curva de

calibração com a concentração (em ppm) pelas áreas dos picos, adquiridas pelo aparelho.

Com a curva de calibração pudemos encontrar o teor de teobromina e cafeína em outras

amostras de concentração desconhecida. Esta curva de calibração está apresentada em

anexo, e nela podemos notar uma pequena diferença quanto a concentração prevista pelo

HPLC, isto se deve porque a curva de calibração foi realizada por meio das concentrações

teóricas do padrão, e elas divergem com as concentrações calculadas pelo aparelho, que é

mais preciso.

No cromatograma dessas amostras podemos observar que o achocolatado possui

dois picos, um maior referente a teobromina, e outra referente a cafeína, que também se

apresenta neste em menor quantidade, porém pode aumentar com o tempo de exposição do

chocolate ao ambiente, já que por conta de ambos serem alcalóides bem semelhantes da

família das metil-xantinas, sob estímulos químicos podem acabar se convertendo, e a

cafeína tende a ser um subproduto da teobromina.

No café solúvel podemos observar um pico maior que diz respeito a cafeína

presente na amostra, e no café descafeinado é possível notar que um dos picos foi

identificado como teobromina. Nenhuma das amostras de café possui teobromina, porém

no café descafeinado o programa interpretou como sendo este composto por conta do

tempo de retenção semelhante desta substância, que provavelmente é uma impureza, já que

este tempo foi informado ao aparelho e armazenado em um banco de informações, como

sendo específico à teobromina. Também é importante notar que ainda existe, mesmo que

em concentrações muito pequenas, resquícios de cafeína na amostra de café descafeinado,

pois o processo não apresenta 100% de eficiência. Normalmente é feito dissolvendo-se a

cafeína em água e posteriormente utilizando um solvente orgânico como o metileno ou

acetato etílico que irá absorver esta cafeína da água, e posteriormente pode ser decantado, e

a água evaporada para que o café retorne a forma cristalina.

Foi possível observar impurezas tanto nas amostras de concentração desconhecidas

como nos padrões, porém em um aparelho de HPLC isso não será um problema já que uma

curva de calibração interna será elaborada com base dos tempos de retenção informados ao

aparelho, sendo insensível, portanto, a pequenos ruídos que não deformem os picos das

substâncias alvo na purificação. Caso haja deformação a área utilizada para a elaboração da

curva pode ser também alterada, por conta disso é bastante importante avaliar os melhores

solventes e a melhor proporção entre eles para serem utilizados como fase móvel, também

pode-se usar um gradiente de polaridade, caso a forma isocrática não apresente uma

qualidade de purificação aceitável, mesmo após a alteração das proporções da fase móvel.

Tanto a cafeína quanto a teobromina possuem um caráter predominantemente

apolar, porém a cafeína costuma ser mais polar quando está em condições idênticas as

submetidas a teobromina, isto se deve por conta da diferença entre as constantes de

protonação das duas substâncias. Quanto mais moléculas estiverem protonadas, maior será

o caráter apolar desta substância, e conseqüentemente, sob o efeito de uma fase móvel

apolar, ela eluirá mais rapidamente, por conta de sua fraca interação com a fase

estacionária. Neste ensaio em particular podemos observar que a primeira espécie a eluir é

a teobromina, portanto ela possui um caráter apolar mais acentuado nessas condições.

O uso de água junto ao metanol aumenta a polaridade da fase móvel, o que é

importante, pois caso a força da fase móvel seja muito acentuada muitas espécies podem

eluir em conjunto, carreadas facilmente por ela, e independente de suas pequenas diferenças

de polaridade acabarão aparecendo no cromatograma em tempos de retenção bem

próximos, sendo assim a purificação não teria a eficiência desejada. Uma polaridade muito

acentuada faria exatamente o contrário, aumentando muito o tempo de retenção das

amostras e isto diminuiria a eficiência do ensaio, pois demoraria mais do que o desejável.

É importante também discorrer a respeito da eficiência do HPLC em comparação a

outras cromatografias líquidas, o que é possível observar no cromatograma quando

observamos a largura da base dos picos. Com o aumento do número de pratos teóricos, por

conta da diminuição das partículas utilizadas como fase estacionária, temos maiores

“obstáculos” para as substâncias que eluem, desta forma é possível separar substâncias bem

semelhantes, como a cafeína e a teobromina utilizadas neste ensaio. Outros fatores como o

diâmetro e tamanho da coluna podem interferir na cromatografia, no nosso caso a coluna

utilizada no cromatógrafo com detector UV possui um diâmetro menor, em comparação a

que possui um detector Diode Array, e como possuem o mesmo tamanho e mesma fase

estacionária, a eficiência de separação é maior no primeiro.

O detector Diode Array quando comparado ao detector UV apresenta uma melhor

eficiência, tendo uma sensibilidade maior, já que pode mostrar diferentes substâncias no

processo de separação que não seriam detectadas no detector UV por não absorverem luz

no espectro de onda definido.

6.6. ConclusãoConclusão

No HPLC podemos observar uma eficiência muito maior comparado as outras

cromatografias líquidas, como discutido isto acontece por conta do aumento de número de

pratos teóricos, que independente do caráter da cromatografia (seja de exclusão, adsorção,

troca iônica, bioafinidade, etc) irá gerar maiores “obstáculos” ou estabelecer interações

mais íntimas com as substâncias eluidas, permitindo portanto a observação de pequenas

variações nas características de substâncias distintas, porém semelhantes, sendo possível

portanto separações que não eram realizadas em outras cromatografias.

No ensaio desta prática foi possível a purificação, e a discussão a respeito dos

resultados obtidos, quanto a eficiência e a interpretação dos dados, mostrando inclusive a

importância do técnico entender os detalhes do funcionamento do aparelho, para que não

chegue a resultados errôneos por conta das informações armazenadas no sistema.

7.7. Referências BibliográficasReferências Bibliográficas

Literatura:

1. SKOOG, D. A. et al. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. In: ______.

Fundamentos de Química Analítica. 8. ed. São Paulo: Thomson, 2008. p 924-

945

0,00 0,13 0,25 0,38 0,50 0,63 0,75 0,88 1,00 1,13 1,25 1,37 1,50 1,62 1,75 1,87 2,00 2,12 2,25 2,37 2,50 2,62 2,75 2,87 3,01-50

125

250

375

500

625

800 07_06_2011_CAFEINA #8 Cafe soluvel UV_VIS_1mAU

min

1 - 0,273 2 - 0,420 3 - 0,5874 - 1,120

5 - 1,2136 - 1,473

7 - 1,9208 - Cafeína - 2,067

9 - 2,573 10 - 2,727 11 - 2,893

WVL:272 nm

0,00 0,13 0,25 0,38 0,50 0,63 0,75 0,88 1,00 1,13 1,25 1,37 1,50 1,62 1,75 1,87 2,00 2,12 2,25 2,37 2,50 2,62 2,75 2,87 3,00-200

500

1.000

1.500

2.000 07_06_2011_CAFEINA #9 Cafe descafeinado UV_VIS_1mAU

min

1 - 0,127 2 - 0,340

3 - 1,2204 - Teobromina - 1,467

5 - 1,740 6 - 1,913 7 - Cafeína - 2,067 8 - 2,207 9 - 2,573 10 - 2,727 11 - 2,893

WVL:272 nm

Anexo(da esquerda para a direita: Achocolatado, Café Solúvel, Café Descafeinado)

0,00 0,13 0,25 0,38 0,50 0,63 0,75 0,88 1,00 1,13 1,25 1,37 1,50 1,62 1,75 1,87 2,00 2,12 2,25 2,37 2,50 2,62 2,75 2,87 3,01-100

200

400

600

800

1.000

1.200 07_06_2011_CAFEINA #7 Achocolatado UV_VIS_1mAU

min

1 - 0,293 2 - 0,327 3 - 0,507 4 - 0,5875 - 1,113 6 - 1,200

7 - Teobromina - 1,440

8 - Cafeína - 2,0609 - 2,327 10 - 2,713 11 - 2,880

WVL:272 nm