Relatório G5

DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES CINÉTICAS DA

INVERTASE EM CÉLULAS LIVRES E IMOBILIZADAS EM

ALGINATO

Alunos:

Ana Miranda, nº25264

Ângela Marques, nº24141

Cláudia Lima, nº25267

28 Março 2014

Alunos:

MESTRADO EM BIOENGENHARIA

LABORATÓRIOS DE BIOPROCESSOS

MÓDULO 1

DOCENTE: LÍGIA RODRIGUES

Universidade do Minho

Escola de Engenharia

Trabalho prático 1

[INVERTASE – CINÉTICA DA ENZIMA LIVRE E IMOBILIZADA]

1

Índice

Sumário ............................................................................................................................. 2

Introdução ........................................................................................................................ 3

Cinética Enzimática ...................................................................................................... 4

Influência da temperatura e do pH na actividade enzimática ................................... 6

Imobilização de enzimas .............................................................................................. 8

Material e Métodos ........................................................................................................ 11

Resultados e Discussão ................................................................................................... 13

Conclusão........................................................................................................................ 21

Bibliografia ...................................................................................................................... 22

Anexos ............................................................................................................................ 23


2

Sumário

Diversas abordagens são usadas no estudo do mecanismo de acção de enzimas, mas a

abordagem principal é determinar a taxa da reacção enzimática.

Neste trabalho experimental o objectivo era estudar a cinética da enzima invertase da

Saccharomyces cerevisiae, livre e imobilizada em esferas de alginato de sódio, ou seja,

determinar o valor da velocidade máxima (máxima velocidade a que a enzima degrada

o substrato) e determinar o valor do Km que é uma medida da afinidade enzimática

para o substrato (essa afinidade é igual a 1/km). Se Km for elevado a afinidade é baixa.

A invertase é uma enzima que catalisa a degradação da sacarose em glucose e frutose

(Sacarose + H2O → Glucose + Frutose).

Inicialmente, recorreu-se ao método de DNS que, através de uma reta de calibração,

permite calcular a concentração de açúcar invertido e observar como esta afeta a

atividade enzimática. Obteve-se a absorvância e a concentração dos açúcares

redutores (tendo-se feito cinco ensaios), de seguida calculou-se a velocidade de reação

para cada concentração inicial de sacarose. Posteriormente colocaram-se estes

resultados num gráfico (velocidade de reação x concentração de sacarose), obtendo-se

uma curva de Michaelis-Menten. Esta curva é descrita pela equação que leva o mesmo

nome.

Este trabalho teve também como obejctivo verificar a existencia de limitações á

transferencia de massa interna e determinar os factores de eficiência, assim como a

difusividade da sacarose no gel de alginato. Por último averiguou-se o efeito do

diâmetro das esferas nos parametros cinéticos e nas limitações difusionais internas.


3

Introdução

A Biotecnologia é atualmente considerada uma alternativa útil aos processos

tecnológicos convencionais nos campos analítico e industrial. Isto porque, ao contrário

da catálise química, os sistemas biológicos têm a vantagem de conseguir conversões

de químicos complexos sob condições ambientais moderadas com elevada

especificidade e eficiência. Sistemas biológicos ajudam a obter uma maior eficiência do

processo, um aumento da capacidade fabril e aumento da rentabilidade dos produtos.

Apesar destas vantagens, o uso de enzimas em aplicações industriais tem sido limitada

por diversos fatores, principalmente pelo seu custo elevado, estabilidade e

quantidades reduzidas disponíveis.

Com o desenvolvimento desta área, fortaleceu-se a ideia de que dentro dos seres

vivos, existem substâncias capazes de catalisar de modo muito específico

determinadas reacções químicas. Uma enzima é um catalisador biológico, que mesmo

em baixas concentrações aumenta a velocidade da reacção. As enzimas diminuem a

energia de activação sem afetarem o equilíbrio da reacção.

Alguns microrganismos são capazes de produzir diversas enzimas de interesse

industrial. Dentro desses microrganismos a levedura Saccharomyces cerevisiae,

popularmente conhecida como fermento de panificação, produz a enzima invertase. A

invertase (β-fructofuranosidade) é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose em

açúcar invertido invertido, isto é, numa mistura equimolar dos seus dois monómeros

constituintes: glicose e frutose (fig 1).

O seu substrato preferencial é a sacarose porém, também, pode hidrolisar ramonose e

estaquiose.

Figura 1 - Hidrolise da sacarose catalisada pela invertase. A glicose e a frutose

são açúcares redutores.


4

A invertase está classificada na família GH32 de glicosídeos hidrolases, e encontra-se

presente nos animais, mas também em plantas superiores, fungos e bactérias.

Leveduras (Saccharomyces sp.) produzem diferentes tipos de invertases:

intracelulares, ligadas à parede, e, mais raramente, extracelulares. As enzimas ligadas à

parede apresentam uma grande fração glicídica através da qual acredita-se que se

liguem a mananas da parede celular. A temperatura ótima de atuação é 55 ˚C para

soluções diluídas de sacarose e de 65 ˚C a 70 ˚C para soluções com concentração

superior a 10%. Soluções acima de 20% de sacarose apresentam taxas decrescentes de

hidrólise em virtude da reduzida disponibilidade de água no meio reacional.

Tabela 1 - Algumas das propriedades das invertases da Saccharomyces cerevisiae .

Fonte: Brenda

Existem actualmente várias aplicações desta enzima, principalmente na indústria

alimentar, pois a frutose é mais doce que a sacarose (cerca de 40%) e não cristaliza tão

facilmente melhorando a textura de doces e gelados.

Cinética Enzimática

A cinética enzimática estuda a acção das enzimas, a sua actividade catalítica e seu

estudo é feito in vitro. Para esses estudos podem ser usados, como fonte de enzima,

preparações que a contenham em estado mais ou menos purificado, no entanto,

quanto mais purificada estiver a preparação enzimática mais fácil será o seu estudo

cinético.

Enzima Livre Enzima Imobilizada

Km [mM] 41.2 7.43

pH ótimo 4.6 4.6

Temperatura ˚C 45 65


5

K1

K2

K3

Foram Leonor Michaelis e Maud Menten, quem primeiro estudou estas relações,

apresentando em 1913 um estudo quantitativo das variações da velocidade de uma

reação de acordo com o aumento da concentração de substrato na mesma (Fig.2).

Figura 2 – Gráfico que relaciona a velocidade da reação coma a concentração de

substrato

Assim, através da equação:

Em que E é a enzima, S o substrato e E-S o complexo enzima-substrato.

Do estudo desta reacção surge a constante de Michaelis:

[[ ][ ]

[ ]]

Em que é uma constante de equilíbrio para a dissociação do complexo E-S, onde [E] é a

concentração de enzima livre, [S] a concentração de substrato e [E-S] a concentração

de enzima que se ligou ao substrato. Substituindo na expressão de

[ ] [ ] [ ]

,fica:

[ ] [ ] [ ]

[ ]

[ ][ ]

[ ] [ ]

[ ]

[ ]

[ ]

[ ]

[ ]

[ ]

[ ]

[ ]


6

A velocidade da reacção é directamente proporcional à concentração de enzima

ligada, significava que v=k [E- S] e Vmáx= k [E0] (E0 é a concentração total de enzima

ligada ao substrato, e velocidade máxima corresponde a do momento em que todas as

enzimas estão ligadas ao substrato) e, portanto,

[ ]

[ ] , que substituindo na expressão de Km fica

[ ]

[ [ ]

Esta equação, denominada Equação de Michaelis Menten permite não só obter o valor

de Vmax como também de Km (valores estes compreendidos entre 10-8 M e 10-2 M).

Esta constante permite medir a afinidade da enzima para o substrato, que é igual a

1/Km, ou seja, se a afinidade for elevada Km é baixo, sendo necessária uma baixa

concentração de substrato para se atingir a velocidade máxima.

Mais uma vez, obtendo um gráfico que relacione a velocidade da reacção com a

concentração de substrato, deduz-se que:

, entao [ ]

Por outras palavras Km é igual à concentração de substrato para qual a velocidade é

igual a metade da velocidade máxima.

Influência da temperatura e do pH na actividade enzimática

A velocidade da reacção enzimática é condicionada por diversos factores, entre os

quais o pH e a temperatura do meio em que se dá a reacção.

O efeito da temperatura na velocidade das reações enzimáticas pode ser mutio

complexo, uma vez que a temperatura pode afetar vários parâmetros da reação, como

por exemplo a estabilidade da enzima, a velocidade da transformação do complexo ES,

a afinidade entre o substrato e a enzima, a ionização de grupos importantes na catálise

e a afinidade de ativadores e inibidores para a enzima.

A temperatura exerce dois efeitos antagónicos sobre um sistema enzimático, ou seja,

ao aumentarmos a temperatura aumentamos a constante de equilíbrio, e por


7

conseguinte a velocidade da reacção. No entanto, a partir de um determinado valor de

temperatura a proteína enzimática começa a desnaturar, diminuindo a sua actividade.

Verifica-se então que existe uma temperatura óptima para qual a reacção tem

velocidade máxima, e corresponde a um compromisso entre a temperatura que

favorece a reacção e a temperatura de desnaturação da enzima.

Figura 3 - Efeito da temperatura na actividade enzimática.

Por outro lado temos o pH do meio, o qual influencia directamente a reacção

enzimática. Assim, pH extremos (básicos ou ácidos) modificam irreversivelmente a

estrutura da enzima, desnaturando-a ou modificando a ligação entre apoenzima (parte

não proteica do enzima equivalente aos cofactores orgânicos) e coenzima (parte

proteica da enzima). O pH influencia também o estado de ionização do substrato e dos

aminoácidos do centro activo em geral.

Figura 4 - Efeito do pH na actividade enzimática.


8

Imobilização de enzimas

A imobilização pode ser definida como o movimento não independente das células ou

enzimas na parte aquosa dos sistemas, por estarem alojadas dentro ou na superfície

de um agente imobilizador.

O uso de sistemas com células imobilizadas tem sido considerado como uma

alternativa viável para se aumentar a produtividade em razão das elevadas densidades

celulares normalmente obtidas.

As enzimas têm, intrinsecamente, excelentes propriedades, como: atividade,

seletividade e especificidade. Estas características permitem o desenho de processos

de síntese de produtos muito complexos em condições ecossustentadas. Mas, apesar

do elevado potencial de aplicação das enzimas, é necessário serem otimizadas, de

modo a cumprirem suas funções biológicas com eficácia e eficiência. A catálise de

reações em processos metabólicos complexos pode ser regulada em vários níveis e,

assim, algumas reações passam a ter as características para serem aplicadas em

processos industriais.

O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com

atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo, em comparação à

sua forma livre. Idealmente, a enzima imobilizada deverá exibir uma atividade

catalítica superior. Além disso, não deverão ocorrer alterações estruturais, bem como

modificações no centro ativo. A imobilização pode inibir ou aumentar a atividade e a

estabilidade da enzima, porém não existe uma regra que prediga a manutenção destes

parâmetros após o processo de imobilização.

Devido ao custo relativamente alto da invertase, o processo enzimático é mais caro do

que a hidrólise ácida. Para reduzir o custo do produto final, a aplicação de invertase

imobilizada tem sido considerada uma solução adequada. Esta enzima imobilizada tem

muitas vantagens, porque pode ser reutilizada várias vezes permanecendo ativa. Os

processos industriais convencionais envolvem a incubação da mistura desta enzima

assim como do seu substrato. Após a conclusão de cada conjunto de reações, o

produto formado é recuperado por desnaturação enzima. Neste processo ocorre a

perda dos centros ativos da enzima e enzima não pode ser reutilizada. A imobilização

protege a actividade da enzima de condições desfavoráveis, como pH, temperatura,


9

solventes orgânicos e/ou compostos inibidores presentes no meio de fermentação,

promove a separação e recuperação da enzima. A aplicação da invertase imobilizada

proporciona uma considerável redução nos custos operacionais.

Na seleção de um suporte para uma determinada aplicação, devem ser analisadas as

suas propriedades físicas e químicas.

Muitos estudos foram centrados sobre o suporte para a imobilização da invertase em

diferentes matrizes, como álcool polivinílico (Agkol et al . de 2001), poliacrilamida

(Abdellah et al , 1992; Mansour e Dawoud , 2003) , quitosano e dietilaminoetilcelulose

(Abdellah et al . , 1992) .

A imobilização pode ocorrer através da adsorção (física ou iónica) ou da ligação da

enzima a um material insolúvel, pelo uso de um reagente multifuncional através de

ligações cruzadas, confinamento em matrizes formadas por géis poliméricos ou

encapsulação através de uma membrana polimérica. A Figura 5 apresenta

esquematicamente a classificação dos métodos utilizados para imobilização das

enzimas.

Figura 5 - Classificação dos métodos de imobilização de enzimas. (Fonte:

VECCHIA et al., 2004).


10

A imobilização por meio de aprisionamento em matrizes porosas, como o alginato,

normalmente envolve a sintetização da matriz porosa em torno do biocatalizador a ser

utilizado. Os poros da matriz formada são menores que as células contidas no seu

interior. Este método tem sido extensivamente estudado para a imobilização de

células viáveis, devido à possibilidade de uso de polímeros hifrofílicos.

O alginato é um polissacarídeo linear extraído de cadeias de algas marinhas. Devido à

sua natureza hidrofílica, à sua não-toxicidade, alta estabilidade mecânica, elevada

porosidade de substracto e difusão de produtos, e sobretudo, à sua simplicidade de

requisitos processuais para a imobilização, o alginato tem a propriedade de tornar a

enzima mais estável.

Esta propriedade do alginato torna-o como um dos suportes mais utilizados na

imobilização da inertase.

Como principais desvantagens são citadas: o pequeno volume disponível para a

contenção das células imobilizadas, a perda de células para o meio de fermentação e a

instabilidade dos suportes normalmente utilizados, que limita a utilização dos

agregados por longos períodos.

Figura 6 – Encapsulamento da invertase em esferas de alginato


11

Material e Métodos

Para conseguir determinar as constantes cinéticas da invertase em células livres,

inicialmente, foi preparada a suspensão de Saccharomyces cerevisiae. Para tal, foi

colocado num gobelé, 0,4 g de Saccharomyces cerevisiae dissolvido em 20 ml de

tampão acetato pH 4,5.

De seguida, foram preparadas cinco soluções de sacarose num tampão acetato de pH

4,5 contendo 1% de cloreto de cálcio, em cinco balões volumétricos de 50 ml,

contendo 10, 20, 50, 100 e 150 g/L. A cada uma destas, por ordem crescente de

concentração, procedeu-se à execução do ensaio. Para isso, foi colocada a solução no

reator, previamente termostatizado a 44,5°C. Retirou-se uma amostra de 0,1 ml

correspondente ao tempo inicial e colocou-se num eppendorf, adicionando-se de

imediato 0,1 ml de DNS. Mantendo o reator sob agitação, foram adicionados 0,5 ml de

suspensão de células, correspondendo ao início da contagem.

A partir deste momento, foi retirado 0,1 ml a cada minuto até perfazer 5 minutos.

Cada uma destas amostras pipetadas, foram colocadas em cinco eppendorfs diferentes

e acrescentou-se 0,1 ml de DNS. Procedeu-se à preparação de um branco com 0,1 ml

de tampão de acetato pH 4,5 e 0,1 ml de DNS. Estas sete amostras foram mergulhadas

num banho de água a 100 °C durante 5 minutos e de seguida arrefecidas em água à

temperatura ambiente. Foi acrescentado 1 ml de água destilada, a cada uma destas.

Por fim, foi pipetado, de cada uma, 0,2 ml em triplicado para a microplaca e, utilizando

540 nm, foi lida a absorvância.

Para a elaboração da curva de calibração, procedeu-se à preparação das soluções de

glucose em balões volumétricos de 100 ml com concentrações de 0,05, 0,1, 0,2, 0,4,

0,6, 0,8, 1, 2, 3, 4 e 5 g/L. A estas, foram retirados 0,1 ml para 11 eppendorfs diferentes

e adicionou-se 0,1 ml de reagente DNS. Ainda foi preparado um eppendorf com 0,1 ml

de água destilada e 0,1 ml do reagente, denominado branco. Estes, foram

mergulhados no banho de água a 100 °C durante 5 minutos, arrefecidos em água à

temperatura ambiente e adicionado 1 ml de água destilada. Retirou-se de cada um 0,2

ml para uma microplaca em triplicado e foi lida a absorvância a 540 nm. A partir destes

valores procedeu-se à elaboração da curva de calibração (Figura 1 dos anexos).


12

Para a elaboração do ensaio com células imobilizadas, preparou-se 100 ml de solução

de cloreto de cálcio a 2% (p/v) e uma matriz líquida com 1g de alginato de sódio e 45

ml de água destilada. Usando a placa de aquecimento com agitação, aqueceu-se a

matriz liquida, para dissolver o alginato e adicionou-se 2,5 ml de suspensão de células.

Utilizando uma seringa, adicionou-se gota a gota 100 ml da solução de cloreto de

cálcio mantendo-a durante 15 minutos na matriz, para completar a gelificação. Lavou-

se as esferas numa solução de tampão acetato pH 4,5 a 1% (p/v) e secou-se em papel

de filtro. Procedeu-se à pesagem de todas as esferas e dividiu-se em cinco porções

iguais, das quais também se procedeu à pesagem. Ainda foi determinado o diâmetro

médio das mesmas.

Foram preparadas cinco soluções de sacarose num tampão acetato de pH 4,5, em

cinco balões volumétricos de 50 ml, contendo 10, 20, 50, 100 e 150 g/L. A cada uma

destas, por ordem crescente de concentração, procedeu-se ao à execução do ensaio.

Para tal, foi colocada a solução no reator, previamente termostatizado a 43,5°C.

Retirou-se uma amostra de 0,1 ml correspondente ao tempo inicial e colocou-se num

eppendorf, adicionando de imediato 0,1 ml de DNS. Com o meio sob agitação

adicionou-se 0,5 ml de suspensão celular e uma porção de esferas, contendo a enzima

imobilizada. A partir deste momento, retirou-se 0,1 ml a cada 3 minutos até perfazer

um total de 15 minutos de reacção e colocou-se cada uma destas amostras em cinco

eppendorfs com 0,1 ml de DNS. Ainda foi preparada uma solução de branco com 0,1

ml de tampão de acetato pH 4,5 e 0,1 ml de DNS. Estas sete amostras foram

mergulhadas num banho de água a 100°C durante 5 minutos, arrefecidas em água à

temperatura ambiente e adicionado 1 ml de água destilada. Por fim, retirou-se 0,2 ml

de cada eppendorf em triplicado e colocou-se numa microplaca para ler a absorvância

a 540 nm.


13

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

1,600

1,800

2,000

0 50 100 150 200 250 300 350

CO

NC

ENTR

AÇ

ÃO

DE

GLU

CO

SE (

G/L

)

TEMPO (S)

10 g/L 20 g/L 50 g/L 100 g/L 150 g/L

Resultados e Discussão

Os dados obtidos experimentalmente foram utilizados para a determinação dos

parâmetros a estudar e comparar neste estudo.

Foi construída uma reta de calibração para possibilitar o doseamento dos açucares

redutores na reação da invertase, pelo método de DNS. Através dos valores de

absorvância medidos, para cada ensaio em triplicado, foi calculada a concentração de

glucose, com recurso à equação da reta de calibração. Através de regressões lineares,

para as diferentes concentrações de substrato, com concentração de glucose em

função do tempo, obtiveram-se os valores de velocidade (V0) respetivos a cada ensaio.

Em anexo encontram-se as tabelas com os parâmetros calculados, assim como os

respectivos erros associados. A partir dos valores de V0 foi possível calcular os

parâmetros alvo deste estudo, utilizando a equação e ajuste não linear de Michaelis-

Menten.

- Comparação da concentração de glucose em função do tempo, nos diferentes

ensaios das duas vias catalíticas, livre e imobilizada:

As figuras seguintes (Fig 7 e Fig 8), representam graficamente a variação da

concentração de glucose em função do tempo, para cada ensaio em diferente

concentração de substrato.

Figura 7 - Representação gráfica da variação da concentração de glucose em

função do tempo, em enzima livre.


14

-0,100

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0 50 100 150 200 250 300 350

CO

NC

ENTR

AÇ

ÃO

DE

GLU

CO

SE (

G/L

)

TEMPO (S)

10 g/L 20 g/L 50 g/L 100 g/L 150 g/L

Figura 8 - Representação gráfica da variação da concentração de glucose em

função do tempo, em enzima imobilizada.

Verificou-se nos ensaios com a enzima livre uma variação irregular dos resultados uma

vez que ao longo de cada ensaio não há um aumento e estabilização da produção de

glucose. Estes valores reflectem todos os erros associados a pesagens, medições e

diluições. O facto de a reacção ter continuado por mais tempo nos ependorfs devido a

uma possível açao reduzida do reagente de DNS assim com a temperatura dos banhos

não estar no valor pretendido (100ºC), contribuiu também para o aumento deste erro.

Relativamente aos ensaios com a enzima imobilizada verifica-se também valores

bastante discrepantes, justificados pelos erros já referidos. No entanto é possível

perceber que à medida que se aumentou a concentração de substrato, de ensaio para

ensaio, há um aumento de produção de glucose. Apoiando desta forma a teoria

estudada.

Uma vez que os restantes parâmetros em estudo foram calculados com base nestes

dados, os erros associados às concentrações propagam-se para as constantes cinéticas.


15

- Determinação e comparação das constantes cinéticas da invertase da S. cerevisiae

na sua forma livre e imobilizada

De acordo com os estudos realizados em torno da cinética enzimática, o aumento da

concentração de substrato leva a um aumento da velocidade da reação até atingir o

ponto de saturação. Isto é, quando a concentração do substrato é muito elevada todas

as moléculas da enzima estarão ligadas a moléculas de substrato, enzima saturada,

neste ponto a enzima funcionará no máximo da sua velocidade.

Os valores de velocidade máxima, de Km e de K2 encontram-se na tabela ?, para o

biocatalizador livre e imobilizado. Os gráficos utilizados para obtenção destes valores

encontram-se em anexo.

Biocatalizador livre Biocatalizador imobilizado

Vmáx (g/L.s) 0,0038 ± 0,0046 0,0020 ± 0,0011

Km (g/L) 10 ± 56,1771 20 ± 39,9942

K2 (s-1) 0,002 ± 0,0110 0,010 ± 0,0207

Segundo os resultados apresentados na tabela 2, verifica-se que o valor de velocidade

máxima da enzima imobilizada é inferior ao valor para a enzima livre. Esta diminuição

poderá estar relacionada com vários aspectos, tais como instabilidade do suporte que

leva a alterações no microambiente dentro do suporte, desprendimento de enzima do

suporte, ou mesmo perda de enzima no manuseamento das esferas de alginato,

resistência mecânica devido a ligações entre o alginato e o sódio, assim com a

diminuição da acessibilidade do substrato para o centro ativo da enzima imobilizada.

Do ponto de vista prático, Km fornece indicações sobre a eficiência com que a enzima

“trabalha” com dado substrato. Um Km pequeno indica que, para igual concentração

Tabela 2 - Constantes cinéticas para biocatalizador livre e imobilizado, com os

respectivos erros associados


16

de substrato, a enzima é capaz de catalisar a transformação desse substrato a maior

velocidade do que quando o Km é grande.

Quando comparados os Km entre a experiência com a enzima livre e imobilizada,

verifica-se um valor de Km superior para a enzima imobilizada. Esta variação explica-se

pelo facto de que quando a enzima se encontra imobilizada existem limitações à

transferência do substrato, assim o substrato apresenta maior “dificuldade” em chegar

ao centro ativo e desta forma o valor de Km aumenta.

Uma vez que a enzima e o substrato usado para as duas vias catalíticas são o mesmo

então, esta constante deveria manter-se. Contudo, devido às contrapartidas

adjacentes ao processo de imobilização (alteração do microambiente dentro do

suporte, limitações difusionais, etc.), o valor de Km aumenta o que significa que a

enzima atinge metade da velocidade máxima com concentrações maiores de

substrato, relativamente à enzima livre.

Verifica-se ainda que o erro associado aos valores de Km é bastante elevado,

revelando que os valores calculados podem variar entre um largo espectro. A

justificação para este elevado valor de erro está na propagação de erros ao longo de

todos os cálculos efectuados. O Km foi obtido através do ajuste não linear das

velocidades iniciais, ajuste esse que só por si tem um erro associado. Para além disso o

erro já se propaga desde os cálculos iniciais para obter essas velocidades, começando

nos erros associados à preparação e diluição das soluções utilizadas, depois à obtenção

da concentração por meio da equação da reta de calibração e ainda à obtenção das

velocidades por meio de regressões lineares.

O K2 corresponde à constante catalítica, revelando o “poder” catalítico da enzima em

estudo. Analisando os resultados obtidos para este parâmetro e comparando o

biocatalizador livre com imobilizado, verifica-se um aumento no biocatalizador

imobilizado. Este aumento reflecte o facto de a enzima, na forma imobilizada

apresentar maior estabilidade. Contudo esta estabilidade não se reflecte nas restantes

constantes pois estes ensaios foram realizados num curto espaço de tempo e não foi

possível simular as condições ideias a este processo.


17

De um modo geral verifica-se que todos os valores estão afectados de erros e os

principais motivos para essas discrepâncias são:

a utilização da levedura proveniente de um fermento de padeiro, torna esta

rica em impurezas que terão interferido no seu desempenho, podendo ter

causado obstrução nos poros da matriz;

a impossibilidade de garantir que ao termostatizar a 45ºC a solução de sacarose

estivesse exactamente a 45ºC, visto que o sistema é partilhado por dois grupos

o que pode originar pequenas oscilações de temperatura, assim como a

impossibilidade de garantir que o banho de água estivesse a 100ºC;

o próprio facto de a agitação do reator não ser constante durante tempos

diferentes e entre ensaios pode influenciar o resultado;

a possível formação de agregados mais ou menos maiores na suspensão de

levedura, uma vez que a agitação antes de a colocar no reator não era

controlada nem uniforme ;

mau manuseamento do material em especial das pipetas. Podem surgir erros

ao pipetar e ao transferir para o recipiente;

o facto de ser impossível cumprir escrupulosamente com os tempos

estipulados no protocolo;

aproximações no tratamento dos resultados;

erros de leitura no espectrofotómetro;

o facto de terem sido desprezados vários pontos no traçado das rectas cujo

declive dá a velocidade. A escolha dos pontos pode não ter sido a mais

correcta. Como as velocidades foram utilizadas na determinação das

constantes cinéticas, ocorreu a propagação de erros.


18

- Determinação da atividade específica da invertase para as duas formas

biocatalíticas em estudo

As enzimas possuem normalmente uma alta especificidade em relação às reações que

catalisam e aos substratos que estão envolvidos nessas reações. Como foi utilizada a

mesma enzima e o mesmo substrato nas duas vias catalíticas, estabeleceu-se no

seguinte gráfico a comparação da atividade específica entre a enzima livre e

imobilizada.

A actividade específica da invertase é maior quando usada na forma livre em relação à

imobilizada em esferas de alginato. Uma vez que a atividade específica é diretamente

proporcional à velocidade inicial, verifica-se que na enzima imobilizada, a velocidade é

menor, logo a sua actividade específica é também menor.

0,00E+00

5,00E-04

1,00E-03

1,50E-03

2,00E-03

2,50E-03

3,00E-03

3,50E-03

0 20 40 60 80 100 120 140 160

ATI

VID

AD

E ES

PEC

ÍFIC

A (

S-1

)

[S] (G/L)

enzima livre enzima imobilizada

Figura 9 - Representação gráfica da atividade específica da enzima livre e

imobilizada.


19

- Determinação dos fatores de eficiência, da difusividade de sacarose no gel de

alginato e efeito do diametro das esferas nas limitações difusionais internas

Um dos problemas associados à transferencia de massa é a resistência do sustrato, ou

seja, o sustrato tem dificuldade em difundir-se na matriz de gel.

Ao mesmo tempo, existe uma resistencia difusional das moléculas do produto

formado, que por vezes pode acumular-se próximo do centro do gel, causando a

inibição da enzima por acumulação do produto.

Assim, idealmente, a rede da matriz deve ser espessa o suficiente para que a passagem

do substrato e produto para fora e dentro das esferas ocorra com o menor

impedimento possível.

Uma vez que o fator de eficiência estabelece uma comparação entre a velocidade da

enzima imobilizada relativamente à livre, não é possivel analisar com rigor este

parâmetro, visto que, existem vários erros associados à determinação das velocidades.

Teoricamente o fator de eficiência deve ser maior para maiores concentrações de

substrato. Apesar da variação dos valores obtidos, de um mode geral, observa-se um

aumento significativo do fator de eficiencia entre o primeiro ensaio, 10 g/L, e o último,

150 g/L.

Relativamente à difusividade efetiva, constatou-se um aumento deste parâmetro,

justificado pelo aumento da concentração de substrato do meio. Todavia, registaram-

10 g/L 20 g/L 50 g/L 100 g/L 150 g/L

Fator de

eficiência

Ƞ

0,550 ± 0,559

0,241 ± 0,211

0,500 ± 0,509

0,438 ± 0,297

0,810 ± 0,548

Difusividade

efetiva

Def (cm2/s)

4,75E-08 ± 8,95E-08

2,11E-08 ± 3,98E-08

1,90E-07 ± 3,58E-07

1,22E-07 ± 2,29E-07

7,60E-07 ± 1,43E-06

Tabela 3 - Fator de eficiência e difusividade da sacarose e m alginato, para cada ensaio a

diferentes concentrações de sacarose


20

se valores um pouco discordantes deste aumento associados mais uma vez aos erros já

anteriormente mencionados.

A difusividade efetiva do substrato depende da porosidade interna do suporte e da

tortuosidade. Portanto, o aumento do diâmetro das esferas causa um aumento da

tortuosidade, que por sua vez leva à diminuição da difusividade efetiva do substrato.

O diâmetro das esferas utilizado nesta experiência era significativamente elevado

(≈5mm). Isto explica os baixos valores obtidos para a difusividade.

Em simultâneo, foi realizada a mesma experiência com diferentes diametros de

esferas. De um modo geral, os resultados obtidos para a difusividade efetiva nessas

experiências, apoiam as afirmaçoes anteriores, isto é, para diâmetros inferiores a 5mm

a difusividade efetiva apresenta valores superiores.


21

Conclusão

Após a discusão dos resultados obtidos, averigou-se que: o fermento de padeiro

uitilizado para este experimento, continha enzima com baixa atividade catalítica, o que

influenciou à partida todos os resultados; A imobilização tem efeito significativo nas

constantes cinéticas da enzima, Vmáx, Km e K2; O fator de eficiência aumenta quando

a velocidade da enzima imobilizada aumenta em relação à livre, que por sua vez

aumenta com um aumento do substrato; As limitações à transferência de massa

interna dependem da difusividade do substrato na matriz, podendo ser compensadas

pelo o aumento da concentração de substrato no meio; O diâmetro das esferas de

alginato está diretamente relacionado com a difusividade efetiva do substrato na

matriz.


22

Bibliografia

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Invertase (EC.3.2.1.26) in Alginate Gel and its Kinetics. Food Journal. p.73-78, 2008.


23

Anexos

- Figura 1

y = 0,2623x + 0,0092 R² = 0,9966

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

0 1 2 3 4 5 6

Ab

sorv

ânci

as

54

0n

m

Concentração de glucose (g/L)

erro associado à reta de calibração ± 0,0138

Figura 1 – representação gráfica da reta de calibração dos açucares redutores.


24

concentração de substrato (g/L) 10 ± 0,1206 20 ± 0,1224 50 ± 0,6353 100 ± 0,7310 150 ± 0,6264

0,089 0,082 0,084 0,085 0,072

0,092 0,083 0,083 0,084 0,072

0,094 0,08 0,081 0,088 0,073

media abs - branco 0,036 0,026 0,027 0,030 0,016

desvio padrão 0,003 0,002 0,002 0,002 0,001

fator diluição s. d. s.d s.d s.d s.d

0,036 0,026 0,027 0,030 0,016

concentração de glucose (g/L) 0,101 0,063 0,067 0,078 0,027

erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

0,11 0,12 0,105 0,097 0,091

0,107 0,12 0,095 0,098 0,091

0,11 0,114 0,094 0,101 0,093

media abs - branco 0,053 0,062 0,042 0,043 0,036

desvio padrão 0,002 0,003 0,006 0,002 0,001

fator diluição s. d. s.d s.d s.d s.d

0,053 0,062 0,042 0,043 0,036


erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

0,134 0,121 0,114 0,125 0,11

0,11 0,122 0,117 0,125 0,104

0,118 0,12 0,118 0,124 0,104

media abs - branco 0,065 0,065 0,060 0,069 0,050

desvio padrão 0,012 0,001 0,002 0,001 0,003

fator diluição s.d s.d s.d 1/2 1/2

0,065 0,065 0,060 0,137 0,100


erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

0,108 0,105 0,123 0,127 0,111

0,11 0,107 0,128 0,126 0,113

0,112 0,113 0,125 0,126 0,113

media abs - branco 0,054 0,052 0,069 0,070 0,056

desvio padrão 0,002 0,004 0,003 0,001 0,001

fator diluição 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2

0,108 0,105 0,139 0,141 0,113


erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

0,128 0,102 0,087 0,15 0,084

0,126 0,258 0,086 0,147 0,082

0,127 0,254 0,087 0,146 0,078

media abs - branco 0,071 0,149 0,031 0,092 0,025

desvio padrão 0,001 0,089 0,001 0,002 0,003

fator diluição 1/2 1/2 1/5 1/5 1/5

0,142 0,297 0,153 0,458 0,127


erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

0,127 0,1 0,098 0,113 0,091

0,107 0,102 0,099 0,111 0,093

0,115 0,27 0,098 0,112 0,094

media abs - branco 0,060 0,101 0,042 0,056 0,037

desvio padrão 0,010 0,098 0,001 0,001 0,002

fator diluição 1/5 1/5 1/10 1/5 1/5

0,302 0,507 0,423 0,280 0,183


erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

T

E

M

P

O

3

T

E

M

P

O

4

T

E

M

P

O

5

T

E

M

P

O

0

T

E

M

P

O

1

T

E

M

P

O

2

abs a 540nm

abs a 540nm

abs a 540nm

abs a 540nm

abs a 540nm

abs a 540nm

Tabela 1 – valores de absorvância obtidos e valores de concentração de glucose

calculados para os diferentes ensaios, com as crescentes concent rações de sacarose,

em enzima livre


25

conc substrato (g/l) 10 20 50 100 150

0,117 0,086 0,097 0,101 0,084

0,129 0,086 0,093 0,103 0,087

0,135 0,086 0,091 0,104 0,086

media abs - branco 0,045 0,004 0,012 0,021 0,004

desvio padrão 0,009 0,000 0,003 0,002 0,002

concentração de glucose (g/L) 0,136 -0,020 0,009 0,044 -0,021

erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

0,087 0,080 0,102 0,113 0,128

0,094 0,080 0,104 0,113 0,121

0,095 0,080 0,095 0,114 0,126

media abs - branco 0,010 -0,002 0,018 0,031 0,043

desvio padrão 0,004 0,000 0,005 0,001 0,004

concentração de glucose (g/L) 0,003 -0,043 0,035 0,084 0,129

erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

0,084 0,114 0,12 0,112 0,131

0,086 0,117 0,125 0,111 0,134

0,085 0,116 0,122 0,115 0,133

media abs - branco 0,003 0,034 0,040 0,031 0,051

desvio padrão 0,001 0,002 0,003 0,002 0,002

concentração de glucose (g/L) -0,024 0,093 0,119 0,082 0,158

erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

0,093 0,107 0,139 0,15 0,164

0,093 0,109 0,138 0,158 0,167

0,094 0,107 0,149 0,156 0,163

media abs - branco 0,011 0,026 0,060 0,073 0,083

desvio padrão 0,001 0,001 0,006 0,004 0,002


0,125 0,148 0,149 0,167 0,172

0,124 0,147 0,148 0,168 0,171

0,121 0,148 0,147 0,165 0,171

media abs - branco 0,041 0,066 0,066 0,085 0,089

desvio padrão 0,002 0,001 0,001 0,002 0,001


erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

0,132 0,175 0,189 0,228 0,222

0,133 0,174 0,189 0,221 0,228

0,129 0,176 0,192 0,221 0,224

media abs - branco 0,049 0,093 0,108 0,141 0,143

desvio padrão 0,002 0,001 0,002 0,004 0,003


erro (±) 0,121 0,123 0,635 0,731 0,627

T

E

M

P

O

0

abs a 540nm

abs a 540nm

abs a 540nm

abs a 540nm

abs a 540nm

abs a 540nm

T

E

M

P

O

1

T

E

M

P

O

2

T

E

M

P

O

3

T

E

M

P

O

4

T

E

M

P

O

5

Tabela 2 – valores de absorvância obtidos e valores de concentração de glucose

calculados para os diferentes ensaios, com as crescentes concentrações de sacarose ,

em enzima imobilizada


26

- Figura 2

A

B

C

D

y = 0,002x + 0,0196 R² = 0,9585

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 100 200 300 400

con

cen

traç

ão d

e g

luco

se (

g/L)

tempo (s)

10 g/l y = 0,0058x - 0,0573

R² = 0,9435

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

0 100 200 300 400

con

cen

traç

ão d

e g

luco

se (

g/L)

tempo (s)

20 g/l

y = 0,0026x - 0,0522 R² = 0,9171

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 100 200 300 400

con

cen

traç

ão d

e g

luco

se (

g/L)

tempo (s)

50 g/l

y = 0,0032x + 0,019 R² = 0,95

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 100 200 300 400

con

cen

traç

ão d

e g

luco

se (

g/L)

tempo (s)

100 g/l


27

E

Tabela 3: valores de V0, com respectivos erros associados, relativos a cada concentração de substrato, para a enzima na forma livre

[S] (g/L) V0 (g/L.s) variância

10 0,0020 ± 0,0013

20 0,0058 ± 0,0043

50 0,0026 ± 0,0024

100 0,0032 ± 0,0014

150 0,0021 ± 0,0006

- Figura 3

A

B

y = 0,0021x + 0,0025 R² = 0,9784

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 100 200 300 400

con

cen

traç

ão d

e g

luco

se (

g/L)

tempo (s)

150 g/l

y = 0,0011x - 0,1605 R² = 0,9374

-0,2

-0,15

-0,1

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0 100 200 300 400

con

cen

traç

ão d

e g

luco

se (

g/L)

tempo (s)

10 g/L

y = 0,0014x - 0,1076 R² = 0,9775

-0,150

-0,100

-0,050

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0 100 200 300 400

con

cen

traç

ão d

e g

luco

se (

g/L)

tempo (s)

20 g/L

Figura 2 – representação gráfica das retas de calibração das concentrações de glucose em

função do tempo, para cada ensaio a diferentes concentrações de sacarose (A, B, C, D e E),

para a enzima na forma livre.


28

C

D

E

Tabela 4: valores de V0, com respectivos erros associados, relativos a cada concentração de substrato, para a enzima na forma imobilizada

[S] (g/L) V0 (g/L.s) variância

10 0,0011 ± 0,0009

20 0,0014 ± 0,0006

50 0,0013 ± 0,0006

100 0,0014 ± 0,0007

150 0,0017 ± 0,0011

y = 0,0013x - 0,0189 R² = 0,9796

-0,050

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0 100 200 300 400

con

cen

traç

ão d

e g

luco

se (

g/L)

tempo (s)

50 g/L

y = 0,0014x + 0,0116 R² = 0,9227

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0 100 200 300 400

con

cen

traç

ão d

e g

luco

se (

g/L)

tempo (s)

100 g/L

y = 0,0017x - 0,0134 R² = 0,9806

-0,100

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0 100 200 300 400

con

cen

traç

ão d

e g

luco

se (

g/L)

tempo (s)

150 g/L

Figura 3 – representação gráfica das retas de calibração das concentrações de glucose em

função do tempo, para cada ensaio a diferentes concentrações de sacarose (A, B, C, D e E),

para a enzima na forma imobilizada.

Documents

Relatório G5