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Para Rafaela.

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Dies santificatus illuxit nobis...

Deus Santificado iluminai-nos...

memria de minha me Celina e de meu pai Eduardo. Amor e gratido sem fim.

Ao meu irmo Eduardo, minha cunhada Maria Lcia e minha sobrinha Rafaela

agradeo sempre e por tudo.

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AGRADECIMENTO ESPECIAL

minha queridssima orientadora, Profa. Dra. Denise Maria Zezell, por ser um

exemplo de profissionalismo e elegncia. No ambiente acadmico foi um refgio de

liberdade que proporcionou um convvio produtivo e harmonioso. Sua maneira nica

de nos orientar, sua participao e seu empenho em nosso sucesso fazem toda

diferena!

Por seu amparo e por sua amizade,

muito obrigada.

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O segredo da felicidade fazer do seu dever o seu prazer

Ulisses Guimares

AGRADECIMENTOS

Universidade de So Paulo, na pessoa do magnfico reitor Prof. Dr. Joo

Grandino Rodas e ao Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares (IPEN-

CNEN/ SP) na pessoa do ilustrssimo superintendente Prof. Dr. Nilson Dias Vieira

Jnior, meus sinceros agradecimentos.

Aos professores do Centro de Lasers e Aplicaes (CLA) nas pessoas dos

Professores Doutores Anderson Zanardi de Freitas, Eduardo Landulfo, Gess

Eduardo Calvo Nogueira, Martha Simes Ribeiro e Snia Lcia Baldochi pela

contribuio cientfica, Prof. Dr. Niklaus Ursus Wetter e Prof. Dr. Wagner de Rossi.

Obrigada por participarem desta etapa to significativa de minha vida.

Agradeo especialmente a minha colega e grande amiga Profa. Dra. Patrcia

Aparecida da Ana (UFABC) por ter me recebido e amparado desde meus primeiros

dias nesta Instituio, assim como pela grandiosa contribuio no desenvolvimento

deste trabalho. um privilgio desfrutar de sua amizade e convvio.

Ao tcnico do Laboratrio de Biofotnica do CLA, meu amigo Valdir de Oliveira

pela cumplicidade diria, pela ajuda no desenvolvimento desta tese e pela amizade.

secretria do CLA, Sra. Sueli Venancio, pela presteza, graa e tranqilidade com

que sempre me atendeu.

Ao Jos Tort, Marco Hortellani e ao Marcos Antnio Scapin pelo inestimvel auxlio

tcnico ao presente estudo.

Aos tcnicos da oficina Marco Antnio Andrade e Paulo Csar da Silva por

desenvolverem equipamentos especficos para o bom desenvolvimento desta

pesquisa.

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Aos funcionrios da segurana, Sr. Luiz Daniel Rosa e Sr. Rubens Gomes Alves por

sempre me receberem com um sorriso e com o habitual bom humor, que contribuiu

para o andamento da minha pesquisa me encorajando, mesmo nos momentos de

exausto.

funcionria da copa, Sra. Marta de Jesus da Silva por sempre cuidar de ns com

tanto carinho.

incansvel Dra. Flvia Rodrigues do Centro de Cincia e Tecnologia de

Materiais do IPEN/CNEN-SP que colaborou na obteno das imagens de microscopia

eletrnica de varredura.

Ao Dr. Pablo Antonio Vasquez e Paulo de Souza Santos do Centro de Tecnologia

das Radiaes pelo pronto atendimento s minhas solicitaes e pela gentileza e boa

vontade com que sempre trabalham.

Dra. Glucia Bueno Benedetti pelo auxlio nas anlises estatsticas e por sua

inabalvel disponibilidade e boa vontade. Obrigada por sua amizade.

Aos ex-colegas do Centro de Lasers e Aplicaes que so meus caros amigos

Claudia Emlio, Felipe Albero, Jos da Silva Rabelo Neto, Melissa Santos Folgosi

Correa, Renato Juliani Ribamar Vieira e Silvia Cristina Nuez por continuarem a

nos inspirar.

Aos colegas do Centro de Lasers e Aplicaes Ana Claudia Ballet de Cara, Antonio

Jos Silva Santos, Caetano Padial Sabino, Danilo Mariano da Silva, Dbora

Picano Aureliano, Eliane Gonalves Larozza, Fernando Rodrigues Da Silva,

Gustavo Bernardes Nogueira, Ilka Tiemy Kato, Horcio Marconi da Silva, Ivanildo

Antnio Santos, Jonas Jakutis Neto, Leandro Matiolli Machado, Letcia Bonfante

Siachieri, Luiz Claudio Suzuki, Marcello Magri Amaral, Marcus Paulo Raelle,

Matheus Arajo Tunes, Renata Facundes da Costa, Renato Arajo Prates, Rosa

Maria Machado de Sena, Tania Mateus Ioshimura, Thiago da Silva Cordeiro e

Walter Morinobu Nakaema, sempre tero minha profunda admirao, gratido e

amizade. Obrigada pelo alegre convvio!

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Aos inesquecveis amigos do Laboratrio de Biofotnica:

Minha amiga de todas as horas, confidente e conselheira Carolina Benetti que

contribuiu na irradiao das amostras, anlise estatstica, abastecimento dos materiais

de consumo, administrao dos recursos e pela companhia at altas horas no

laboratrio.

Claudia Strefezza e ao Jos Quinto Jnior, colegas que compartilharam as

angstias e alegrias do exerccio da profisso de dentista com o desenvolvimento da

tese de doutorado.

Ao Henrique Coli Schumann, que sua permanncia no grupo seja longa e frutfera

uma vez que seu incio na vida acadmica foi marcado por sua inestimvel

contribuio.

Mara Franco de Andrade pela dedicao ao projeto e auxlio na esterilizao de

materiais.

Ao Marcelo Noronha Veloso querido crtico de todas as horas, amigo, msico

talentoso que tambm contribuiu com a esterilizao das amostras biolgicas.

Ao Moiss de Oliveira Santos que desde a concluso de meu mestrado tem me

apoiado e me alegrado com sua adorvel companhia, me atualizando em todas as

tecnologias que no domino.

Ao querido Paulo Roberto Correa, com sua companhia tranquila e bem humorada

que no se cansava de me recordar dos meus momentos de ausncia no laboratrio,

pelo auxlio na organizao das amostras.

Ao queridssimo Thiago Martini Pereira, o Tita, atrapalhado e inteligente como , meu

grande amigo, por nos ajudar na manuteno do laser.

Viviane Pereira Goulart, amiga carinhosa e devotada, sempre disposta a ajudar e

que muito contribuiu na concluso da tese, apresentao, impresso, enfim esteve

ombro a ombro comigo em momentos cruciais.

Contriburam todos para a realizao desta tese como voluntrios, colaboradores,

pesquisadores, co-orientadores... As palavras no alcanam meu carinho por vocs!

Ao querido amigo Thiago Angelis por seu apoio inestimvel e sua amizade sincera e

verdadeira. Sinto-me privilegiada por t-lo como amigo. Por t-lo como amigo,

agradeo novamente Carol.

Aos voluntrios desta pesquisa, toda minha gratido. No teria sido possvel a

realizao deste sonho sem o empenho de vocs. A entrega de vocs permitiu um

grande salto em minha vida! Reconheo a importncia que tiveram na contribuio

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Cincia, espero que o desenvolvimento desta tese faa jus ao esforo de cada um de

vocs.

Ao meu ex-professor do Curso de Especializao, que tenho a ousadia de chamar de

amigo, Prof. Dr. Tetsuo Saito da Faculdade de Odontologia da Universidade de

So Paulo por sua amizade, por contribuir muito em minha formao acadmica e por

me incentivar a buscar sempre mais.

prottica Cristina da Silva Flores por sua dedicao, profissionalismo, eficincia e

amizade durante longos vinte anos de parceria. Obrigada por sua inestimvel

contribuio no planejamento e execuo dos dispositivos palatinos.

minha assistente e querida amiga Tamra Santos que no s administrou minha

ausncia no consultrio, mas tambm contribuiu muitssimo na organizao, preparo e

execuo deste projeto. Obrigada, doutorinha.

s colegas dentistas e grandes amigas Dra. Cristina Miotto Menezes Coronel,

Profa. Dra. Nelita Del Vecchio Puplaksis que possibilitaram minha ausncia do

consultrio. Obrigada pela cumplicidade e pelo harmonioso convvio.

Aos colegas da FOP-UNICAMP que me acompanham h longos 22 anos. Que as

futuras geraes desfrutem da sombra de nossa rvore e se inspirem em nossa

amizade.

Ao Prof. Dr. Renato Mazzonetto (in memorian) meu colega desde os tempos de

graduao que muito me influenciou na busca da excelncia. Tive o enorme privilgio

de desfrutar do seu convvio e de sua adorvel famlia. A comunidade acadmica

perdeu uma de suas maiores referncias. Perdi um amigo. Obrigada por continuar

existindo em nossas vidas. Obrigada Adriana, Rafaella e Lucca Mazzonetto.

Secretaria de Sade do Municpio de So Paulo nas pessoas da Dra. Rosmari

Lucchesi de Almeida, supervisora da Regio Sudeste, do Dr. Clio Matsushita e do

Dr. Srgio Soeiro de Moraes pelo incentivo, apoio e compreenso durante o

desenvolvimento deste trabalho.

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Aos colegas do Ambulatrio de Especialidades Maurice Path, meus queridos

amigos, nas pessoas das gerentes da Unidade Luclia de Ftima Auricchio e urea

Bianchi. minha colega de consultrio Dra. Ana Rosa Sartorelli e minha auxiliar

de consultrio A.S.B. Wilma Silva de Oliveira Arajo, pela amizade, apoio,

compreenso e pacincia.

Ao Alex, meu querido.

FAPESP processos CEPID FAPESP 98/14270-8, 05/14270-8 e ao CNPq INCT /

INFO processo 573.916/2008-0 e CAPES / Pr Equipamentos 074742/2010.

Muito obrigada.

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Nada na vida deve ser temido, somente compreendido.

Agora hora de compreender mais para temer menos.

Marie Curie

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ESTUDO IN SITU DA RESISTENCIA DESMINERALIZAO DO ESMALTE

DENTAL SUBMETIDO IRRADIAO COM LASER Er,Cr:YSGG

ASSOCIADA AO USO DE PRODUTOS FLUORETADOS Claudia Bianchi Zamataro

RESUMO

A irradiao com o laser de Er,Cr:YSGG promove aumento da rea de

superfcie do esmalte dental irradiado, o que pode resultar em uma maior reteno e

um efeito prolongado do fluoreto (F-) presente em produtos fluoretados de diferentes

concentraes. O produto formado na superfcie de esmalte originado de uma nica

aplicao de flor fosfato acidulado (FFA 12.300 g F-/g) ou da frequente aplicao

tpica de dentifrcio contendo 1.100 g F-/g poderia ter seu efeito cariosttico

prolongado, pelo aumento de sua reteno na superfcie do esmalte dental irradiado.

Uma vez que o esmalte dentrio livre de biofilme no sofre desmineralizao na

cavidade bucal, sugerimos um estudo in situ onde se possa avaliar o prolongamento

do efeito do destas associaes, tambm na presena de placa. As condies de

irradiao do estudo in situ, foram determinadas, in vitro, com laser Er,Cr:YSGG no

esmalte de maneira isolada ou combinada com as aplicaes tpicas de: 1- dentifrcio

de concentrao 1.100 g F-/g ou 2- FFA, para posteriores anlises da formao e

reteno de CaF2. Foram realizadas anlises morfolgicas por microscopia eletrnica

de varredura, determinao da concentrao do flor solvel em lcali por meio do

eletrodo on especfico e anlise da microdureza em corte longitudinal. Os resultados

por microscopia eletrnica de varredura verificaram qualitativamente a formao de

produtos na superfcie de esmalte na forma de CaF2. A anlise bioqumica para

determinao quantitativa do F- solvel em lcali determinou como sendo

estatisticamente diferentes (p0,05) os Grupos nos quais o laser foi utilizado

previamente aplicao tpica dos dois tipos de produtos fluoretados de diferentes

concentraes (dentifrcio e FFA), in vitro. Em seguida, foi realizado o estudo in situ

quando voluntrios utilizaram dispositivos palatinos, contendo blocos de esmalte

humano, previamente tratados, com o objetivo de acmulo da placa nativa sobre os

mesmos. Durante a fase in situ, os voluntrios permaneceram utilizando dentifrcio F-

para verificao da ao do mesmo na presena de biofilme sobre os blocos

irradiados. Foram correlacionados os efeitos da formao de F-, decorrentes dos

tratamentos propostos, na reduo da desmineralizao. A anlise bioqumica para

quantificao do F- solvel em lcali determinou como sendo estatisticamente

diferentes (p0,05) os Grupos nos quais o laser foi utilizado aps a aplicao tpica

dos dois tipos de produtos fluoretados de diferentes concentraes (dentifrcio e FFA),

in situ, sugerindo um efeito prolongado da sinergia dos tratamentos na diminuio da

desmineralizao.

Palavras-chave: laser, esmalte dental, Er,Cr:YSGG, preveno da crie.

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IN SITU STUDY OF DENTAL ENAMEL DEMINERALIZATION RESISTANCE

WHEN IRRADIATED WITH Er,Cr:YSGG LASER ASSOCIATED TO

FLUORIDATED PRODUCTS

Claudia Bianchi Zamataro

ABSTRACT

The effect of the Er, Cr: YSGG laser promotes increased surface enamel area,

which can result in increased retention and prolonged effects of Fluoride (F-) present in

products with different concentrations of fluoride. The cariostatic effect from product

formed in the enamel surface originated from a single application of acidulated

phosphate fluoride (APF 12 300 g F-/ g), or frequent topical application of dentifrice

containing 1,100 g F-/ g, could be prolonged by increasing its retention on irradiated

enamel surface. Once the biofilm-free enamel does not suffer demineralization within

the oral cavity, it is proposed an in situ study where we can evaluate the prolongation

of the effect of these associations, also in the presence of plaque. The irradiation

conditions of the in situ study were determined in vitro with Er, Cr: YSGG laser

irradiation of enamel surface either alone or combined with one of the topical

applications: 1 - dentifrice F-1,100 g / g or 2 - APF For further analysis of the formation

and retention of CaF2. Morphological analyzes were performed by scanning electron

microscopy, determination of the concentration of alkali-soluble fluoride by specific ion

electrode analysis and microhardness. The results of scanning electron microscopy

verified qualitatively the formation of products in the enamel surface in the form of

CaF2. Biochemical analysis for quantitative determination of F-soluble in alkali

determined to be statistically different (p 0.05) Groups in which the laser was used

prior to application of topical fluoride products of two types of different concentrations

(APF and dentifrice) in vitro. Then, the study was conducted in situ when volunteers

wore palatal appliances containing blocks of human enamel, pretreated aiming native

plaque formation. During in situ experiment, the volunteers remained using F-dentifrice.

Correlations with the effects of F-formation, resulting from treatments proposed in the

reduction of demineralization were made. Biochemical analysis for quantitative

determination of F- alkali soluble determined to be statistically different (p 0.05).

Groups in which the laser was used after topical application of both types of different

fluoride concentrations (APF and toothpaste), in situ, suggested an synergic effect,

extending treatment efficiency in reducing demineralization.

Key words: laser, dental enamel, Er,Cr:YSGG, caries prevention.

xiii

xiii

SUMRIO

Pgina

1- INTRODUO E JUSTIFICATIVA 01

2- OBJETIVOS 06

3- REVISO DA LITERATURA 07

4- MATERIAL E MTODOS 21

4.1- EXPERIMENTO IN VITRO 22

4.1.1- Obteno e Polimento das Amostras de Esmalte Dental Bovino 25

4.1.2- Tratamento das Amostras de Esmalte Dental Bovino 28

4.1.3- Protocolo de Irradiao das Amostras 29

4.2- ANLISES DO EXPERIMENTO IN VITRO 32

4.2.1- Anlise Morfolgica por Microscopia Eletrnica de Varredura 32

4.2.2- Anlise de Flor por Meio do Mtodo do Eletrodo on Especfico 34

4.3- EXPERIMENTO IN SITU 37

4.3.1- Obteno e Preparo das Amostras de Esmalte Dental Humano 40

4.3.2- Determinao da Microdureza de Superfcie Inicial (Baseline) 42

4.3.3- Esterilizao das Amostras por Radiao Gama 46

4.3.4-Tratamentos das Amostras de Esmalte Dental para o Uso no Dispositivo

Palatino 51

4.3.5- Critrios de Incluso dos Voluntrios 53

4.3.6- Montagem dos Dispositivos Palatinos 55

xiv

xiv

4.3.7- Uso do Dispositivo Palatino In Situ pelos Voluntrios 56

4.3.8- Retirada dos Blocos 57

4.4- ANLISES DO EXPERIMENTO IN SITU 57

4.4.1- Determinao da Microdureza Longitudinal 57

4.4.2- Anlise Morfolgica por Microscopia Eletrnica de Varredura 60

4.4.3- Anlise de Fluoreto por Meio do Mtodo on Especfico 61

4.5- ANLISE ESTATSTICA 62

5- RESULTADOS 63

5.1- RESULTADOS DO EXPERIMENTO IN VITRO 63

5.1.1- Anlise Morfolgica por Microscopia Eletrnica de Varredura 63

5.1.2- Anlise de Flor por meio do Mtodo do Eletrodo on Especfico 74

5.2- RESULTADOS DO EXPERIMENTO IN SITU 79

5.2.1- Anlise Morfolgica por Microscopia Eletrnica de Varredura 79

5.2.2- Anlise de Flor por meio do Mtodo do Eletrodo on Especfico 80

5.2.3- Anlise de Microdureza Longitudinal 84

6- DISCUSSO 89

7- CONCLUSO 98

8- ANEXOS 99

ANEXO A - Certificado do Comit de tica no Uso de Animais-IPEN/SP 99

ANEXO B - Certificado do Comit de tica em Pesquisa FO-USP 100

xv

xv

ANEXO C - Laudos de testes biolgicos das amostras (esmalte humano) 102

ANEXO D - Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) 108

9- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 115

xvi

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

BDH: Banco de Dentes Humanos CaF2: Fluoreto de Clcio (Flor Fracamente Ligado ou Flor Solvel em lcali) CEP: Comit de tica em Pesquisa CEUA: Comit de tica no Uso de Animais CNEN: Comisso Nacional de Energia Nuclear Co: Cobalto (elemento qumico) CTR: Centro de Tecnologia das Radiaes Er, Cr:YSGG: Laser de xido de Glio, Escndio e trio dopado com Cromo e rbio F-: Fluoreto (forma inica do Elemento Flor) FO-USP: Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo FFA: Flor Fosfato Acidulado IN SITU: Modelo experimental em humanos (latim) IN VITRO: Modelo experimental laboratorial (latim) IPEN: Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares J/cm2: Joules por centmetro quadrado (unidade de grandeza) K: Kelvin (unidade de grandeza) Kgf: Kilograma fora (unidade de grandeza) kGy: Kilo Grey (unidade de grandeza) KHN: Knoop Hardness Number ou Nmero de Dureza Knoop LASER: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation Log: Funo Logartmica M: Mol ou Molar (unidade de grandeza) MDL: Microdureza Longitudinal MDS: Microdureza de Superfcie MEV: Microscopia Eletrnica de Varredura mJ: mili Joules (unidade de grandeza)

xvii

xvii

mV: milivoltagem (unidade de grandeza) NaF: Fluoreto de Sdio Nd:YAG: Laser de Neodmio Pbq: Peta Bequeris (ordem de magnitude) p/p: Peso por Peso (diluio) ppm: Partes por Milho (g/g) rpm: Rotaes por Minuto SAB: Meio de Cultura Sabouraud Dextrose Agar SIC: Segundo Informaes Colhidas TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido THIO: Meio de Cultura Fluid Thioglycollate TISAB: Total Ionic Strenght Adjustment Buffer ou Tampo de Ajuste da Fora Inica Total TSA: Meio de Cultura Tryptic Soy Agar TSB: Meio de Cultura Tryptic Soy Broth UFC: Unidades Formadoras de Colnia W: Watt (unidade de grandeza) % PDS: Porcentagem de Perda de Microdureza de Superfcie : Comprimento de onda %: Porcentagem : Variao

1

1- INTRODUO E JUSTIFICATIVA

O uso do laser tem sido uma alternativa vivel para a preveno da crie,

modificando a estrutura dos tecidos duros dentais e tornando-os menos solveis, de

maneira isolada [Featherstone et al., 1997] e em associao com produtos fluoretados

[Ana et al., 2007; Ana et al., 2012].

A reduo da desmineralizao do esmalte irradiado foi verificada pela

primeira vez por meio da irradiao do esmalte com o laser de rubi, quando se

observou decrscimo da permeabilidade de difuso dos ons. No primeiro estudo in

vitro [Stern et al., 1972], foi realizada a irradiao com laser de CO2 em esmalte, sob

densidade de energia de 10 e 15 J/cm2. Por meio de microscopia eletrnica de

varredura, observou-se que as regies irradiadas expostas ao ambiente cido

permaneceram mais ntegras morfologicamente, ao passo que as no irradiadas

mostraram caractersticas de desmineralizao. A perda de ons carbonato (CO3) da

superfcie dental pode estar correlacionada ao comprimento de onda do laser e da

densidade de energia utilizada, ocorrendo absoro da radiao pelo componente

mineral e sendo convertido em calor de superfcie. De fato, pressupe-se que deva

ocorrer a decomposio trmica dos cristais de apatita carbonatada para uma forma

menos solvel. A irradiao laser pode possibilitar como coadjuvante ao tratamento

convencional com produtos fluoretados, o aumento da formao, reteno e

incorporao de flor no esmalte. Dentre os lasers mais estudados para este fim,

destacam-se os lasers de CO2 [Meuerman et al., 1992; Featherstone et al., 2012],

Nd:YAG [Zezell et al., 2008, Harazaki et al., 2011], Argnio [Nammour et al., 2003]i,

Ho:YLF [Stern et al., 1972], Er:YAG [Del Bem et al., 2003] e, mais recentemente, o

laser Er,Cr:YSGG [Apel et al., 2003].

Foi relatada, anteriormente [Ana et al., 2012], a associao de vrios

comprimentos de onda, com diferentes densidades de energia, ao flor fosfato

acidulado (FFA), e os resultados apresentaram-se promissores. Tem sido

demonstrado que a utilizao do laser associado aplicao tpica de flor pode

reduzir potencialmente a progresso da leso de crie, sendo que a irradiao laser

capaz de aumentar a difuso do F, fazendo com que ocorra maior absoro do on

[Oho et al., 1990; Hicks et al., 2004]. Uma explicao para o mecanismo pelo qual o

esmalte irradiado adquire resistncia desmineralizao a formao de

microespaos devido remoo de componentes orgnicos do esmalte por meio da

irradiao (gua e carbonato), os quais agiriam como stios para deposio de ons

liberados pela desmineralizao [Caslavska et al., 1975]. Em acrscimo, o laser pode

2

propiciar a converso de hidroxiapatita em fluorapatita, por meio de fuso e

solidificao das camadas de cristais de hidroxiapatita combinadas com a camada de

flor incorporado pelo tratamento tpico, originando uma estrutura composta de

fluorapatita mineral que seria mais resistente aos cidos de origem bacteriana [Phan et

al., 1999].

O laser de neodmio tambm tem sido amplamente estudado para

preveno da crie, sendo reportado um aumento da resistncia desmineralizao

do esmalte e dentina quando irradiados com este comprimento de onda [Kwon et al.,

2003; White et al., 1996]. O potencial do laser Nd:YAG na preveno da crie dental

tambm demonstrado por estudos clnicos prvios, associadas ou no a aplicao

tpica de flor, contribuindo para uma diminuio da incidncia de leso inicial de crie

em crianas [Oho et al., 1990; Zezell et al., 2001; Harazaki et al., 2001].

A prevalncia da crie dental reduziu significativamente, tanto em pases

desenvolvidos [Rlla et al., 1991] como nos pases em desenvolvimento [Fejerskov et

al., 1994; Cury et al., 2004], nas ltimas dcadas do sculo XX. Apesar dos dados

disponveis na literatura referentes reduo de crie serem segmentados,

normalmente referentes a crianas em idade escolar, e os levantamentos utilizarem

diferentes critrios [Rlla et al., 1991], as concluses de reduo significativa da

doena no devem ser ignoradas. Esta reduo foi notada em diversos pases com

diferentes mtodos de preveno de crie, sendo um fator comum o uso de

dentifrcios fluoretados que atualmente tem sido considerados como a principal forma

de auto-aplicao de fluoreto [Marinho et al., 2006]. Portanto, o uso do dentifrcio

fluoretado tem sido apontado como a razo para a diminuio dos ndices de crie,

uma vez que a disseminao de seu uso coincide com esta reduo. Alguns autores

defendem que o uso isolado de dentifrcio fluoretado o responsvel por esta

ocorrncia enquanto outros sugerem um efeito sinrgico com outros fatores como, por

exemplo, com a higiene oral que, se considerada individualmente, provavelmente no

pode ser apontada como fator responsvel para os ndices de reduo de crie

observados. Por outro lado, a reduo do desafio cariognico, por meio do uso

consciente de carbohidratos fermentveis, que tem ocorrido em determinados pases

desenvolvidos, tambm no parece ser fator determinante ou preponderante, uma vez

que a reduo da doena tem sido significativa tambm em pases onde o consumo

de carbohidratos fermentveis aumentou [Rlla et al., 1991; Rlla & gaard, 1986].

No Brasil, apesar de ter sido notada uma diminuio do desenvolvimento e

progresso da doena, ela atinge de maneiras distintas as diferentes classes scio-

econmicas. Em funo de serem poucas as medidas preventivas que atinjam toda a

extenso do pas, trs fatores tm sido considerados importantes para a reduo de

3

crie: fluoretao da gua, programas preventivos em escolas pblicas e

disseminao do uso de dentifrcios fluoretados. At o final da dcada de 80, apenas

25% dos dentifrcios disponveis no mercado eram fluoretados, havendo uma mudana

neste quadro quando foi adicionado F aos dentifrcios mais consumidos. Assim, na

dcada de 90, a porcentagem de dentifrcios fluoretados comercializados no pas

atingiu a proporo de 90%, beneficiando em termos de reduo de crie at mesmo a

populao sem acesso gua de abastecimento pblico fluoretada. Este benefcio

possvel, independente da presena ou no de gua fluoretada, pois dentifrcios so

amplamente utilizados, sendo o Brasil o terceiro maior consumidor de dentifrcios

fluoretados, depois de Estados Unidos e Japo [Narvai, 2000]. Adicionalmente, este

consumo de dentifrcio tem aumentado desde o incio da dcada de 80 [Cury et al.,

2004].

Dentifrcios podem apresentar variao na concentrao de F presente em

suas composies. Este fato relevante para a recomendao clnica de um

dentifrcio levando-se em conta o balano de riscos e benefcios, uma vez que a

biodisponibilidade de F na saliva similar quando utilizado um dentifrcio de

concentrao convencional de F seguido de enxge e dentifrcio de baixa

concentrao de F sem enxge [Zamataro et al., 2008]. A eficincia anti-crie dos

dentifrcios contendo de 1.100 a 1.500 g F/g est amplamente relatada na literatura

[Marinho et al., 2007] e acredita-se que o efeito predominante do fluoreto tpico,

promovendo a remineralizao de leses de crie incipientes e diminuindo a

desmineralizao do esmalte dentrio [Featherstone, 1997].

Este mecanismo do efeito cariosttico dos dentifrcios fluoretados ocorre

por meio da formao de partculas de fluoreto de clcio na superfcie do esmalte

quando h presena de altas concentraes de fluoreto, conforme ilustra a Figura 1.

Estas partculas so mantidas na superfcie do dente e constituem um reservatrio de

liberao lenta de flor que mobilizado durante os ciclos de pH no biofilme [Rlla et

al., 1991]. O efeito anti-crie dos dentifrcios fluoretados est relacionado a um grande

aumento na concentrao de F na cavidade bucal imediatamente aps a escovao, e

manuteno de concentraes acima das basais por cerca de 1 hora, em funo da

liberao de fluoreto dos microreservatrios [Duckworth, 1991; Paes Leme et al.,

2004; Cenci et al., 2008] e no fluido da placa at por 10 horas ou mais aps a

escovao [Cenci et al., 2008]. A reao do F presente no dentifrcio com o esmalte

dental, formando depsitos de fluoreto de clcio [Cruz et al., 1992], tambm funciona

como um importante reservatrio do on durante os ciclos de pH, como pode ser

observado na Figura 1.

http://cochrane.bireme.br/cochrane/show.php?db=reviews&mfn=2428&id=&lang=pt&dblang=#O-10#O-10

4

Figura 1 Glbulos de fluoreto de clcio depositados no esmalte aps a aplicao de

suspenso de dentifrcio contendo 1.000 g F-/g pelo perodo de 1 hora. Extrado de

Cruz et al., 1992

Estudo recente [Tenuta et al., 2009] demonstrou que os produtos

fluoretados formados no esmalte dentrio, em decorrncia da aplicao de dentifrcio,

aumenta a concentrao de F- nas pores slidas e lquidas da placa (estroma e

fluido do biofilme) formada sobre o esmalte. Uma vez que o esmalte dentrio livre de

biofilme no sofre desmineralizao na cavidade bucal e as trocas inicas necessrias

para os processos de desmineralizao e remineralizao ocorrem na parte lquida do

biofilme, os resultados do estudo citado sugerem que o F- presente no fluido do

biofilme (placa) dental, remanescente aps a escovao, o principal responsvel

pelo efeito anticrie dos dentifrcios fluoretados. Entretanto o efeito anticariognico do

produto formado no esmalte em decorrncia do uso de dentifrcios associado

irradiao laser, na presena de biofilme dental, no tem sido explorado na literatura.

Desta maneira, propomos que a combinao de uma nica sesso de irradiao com

o laser Er,Cr:YSGG associada ao uso domstico de dentifrcio fluoretado poderia

potencializar a eficcia do dentifrcio, em casos isolados de pacientes com altos

ndices de crie. Desta maneira, casos clnicos indicados se beneficiariam de ambas

5

as tcnicas, com a finalidade preventiva, por meio de interveno profissional de

sesso nica associada a cuidados domsticos de higiene oral.

6

2- OBJETIVOS

Este trabalho tem como objetivo avaliar a sinergia da associao da

irradiao com o laser de Er,Cr:YSGG, com dentifrcio de concentrao 1.100 g F-/g,

em comparao com a aplicao tpica de flor fosfato acidulado de concentrao

12.300 g F-/g, em esmalte dental tambm na presena de biofilme dental.

Objetivos especficos:

1- Avaliar in vitro e in situ a formao e reteno de produtos na superfcie de

esmalte (Flor fracamente ligado, CaF2) decorrentes destas associaes;

2- Avaliar in vitro e in situ, quantitativamente, a formao de produtos solveis

em lcali (Flor fracamente ligado, CaF2) decorrentes dos parmetros

utilizados;

3- Correlacionar, in situ, a formao destes produtos na reduo da

desmineralizao do esmalte dental, na presena de biofilme.

7

3- REVISO DA LITERATURA

O modelo in situ proposto de maneira pioneira por Kolourides e Volker em

1964, e posteriormente modificado por Zero em 1992, consiste no estudo da crie e da

pesquisa aplicada do papel dos alimentos e do flor nos processos de des-

remineralizao em humanos sem causar interferncia em sua dentio natural. O

modelo envolve o uso de dispositivo intra oral que cria condies definidas na

cavidade oral de humanos para simular o processo de crie dental [Zero, 1995].

Modelos in situ tm sido utilizados, de maneira bem sucedida, para avaliar os

processos de des-remineralizao tanto em esmalte quanto em dentina, uma vez que

as condies criadas neste modelo so semelhantes s condies de um ensaio in

vivo, na medida em que utiliza a cavidade bucal como ambiente experimental. As

limitaes do modelo esto associadas variao individual dos voluntrios

envolvidos e a adeso dos mesmos ao experimento. O dispositivo intra oral utilizado

neste modelo pode ser palatal ou mandibular, tambm permitindo variao do

substrato a ser analisado. Amostras de dentina ou esmalte, de origem humana ou

bovina, tm sido utilizadas associadas ou no a materiais restauradores.

O modelo in situ de curta durao, proposto por Brudevold e colaboradores

em 1984, e posteriormente modificado por Zero e colaboradores em 1992, utiliza uma

placa teste produzida a partir de estreptococos do grupo mutans. Apesar de no se

tratar de um biofilme nativo, esta placa teste representa a resposta bacteriana aos

ciclos de pH induzidos por desafio cariognico, e seus efeitos sobre o substrato de

escolha. Por ser de curta durao, apresenta uma resposta rpida e mais acurada do

que ensaios in vitro. Quando Zero, em 1995, prope um modelo in situ de longa

durao, o dispositivo intra oral utilizado por perodo de tempo suficiente para

formao in vivo de placa bacteriana multicelular. O desafio cariognico realizado de

maneira extra oral, de modo a no interferir na dentio do voluntrio, porm pode-se

8

avaliar a capacidade tampo da saliva e demais variveis que ocorrem em ambiente

bucal.

A formao de biofilme necessria para a desmineralizao, porm,

somente sua formao no suficiente para que ela ocorra. necessrio que o

biofilme formado seja exposto sacarose para que ocorra a produo de cidos pela

comunidade bacteriana, causando diminuio do pH na superfcie dental. Atingindo

nveis crticos de pH (em torno de 4,5 a 5,5 para o esmalte, e em torno de 5,5 a 6,5

para dentina), ocorre o processo de desmineralizao. Desta maneira, protocolos de

desafios cariognicos podem variar, de acordo com as proposies. Ccahuana-

Vsquez e colaboradores, em 2007, avaliaram o efeito da frequncia da exposio de

sacarose na composio microbiolgica e bioqumica do biofilme dental formado e sua

relao com a desmineralizao do esmalte. Em um estudo in situ de longa durao

de trs fases, dez voluntrios com fluxo salivar considerado normal, residindo em

municpio com fluoretao tima da gua, utilizaram por 14 dias dispositivos palatinos

contendo dentes humanos. O desafio cariognico foi realizado na forma de

gotejamento de soluo de sacarose 20% e os voluntrios utilizaram dentifrcio

fluoretado, 3 vezes ao dia, para escovao de sua dentio natural. A frequncia do

desafio cariognico variou de 0 (controle), 2, 4, 6, 8 ou 10 vezes ao dia. Quando se

tratou da frequncia de 8 vezes ao dia, os horrios de gotejamento foram 8:00, 9:30,

11:00, 14:00, 15:30, 17:00, 19:00 e 21:00 h. As escovaes foram realizadas com

dentifrcio contendo 1.100 g F/g na forma de NaF e slica como abrasivo, aps as 3

principais refeies do dia. Foram realizadas anlises microbiolgica e bioqumica do

biofilme dental formado sobre as amostras de esmalte dental, que por sua vez tiveram

sua microdureza longitudinal avaliada. Mudanas microbiolgicas e bioqumicas no

biofilme foram observadas mesmo quando a soluo de sacarose foi utilizada em

frequncia inferior a oito vezes ao dia. Foram observadas aumento da biomassa,

aumento da produo de polissacardeos intra e extra celulares no biofilme formado.

9

Um aumento significativo da desmineralizao foi notado quando foi utilizada a

soluo de sacarose 20% em frequncia maior do que 6 vezes ao dia, mesmo

havendo sinergia da fluoretao da gua de abastecimento pblico e do dentifrcio,

sugerindo desta maneira, que a alta frequncia do consumo de sacarose seria a

responsvel pela perda mineral, a despeito do flor utilizado. Levou-se em conta que o

biofilme no foi desorganizado mecanicamente pela escovao, possivelmente

reduzindo ou impedindo o efeito do dentifrcio.

O biofilme formado na presena de sacarose apresenta alteraes

microbiolgicas e bioqumicas quando comparado ao biofilme formado na ausncia de

sacarose. Corroborando o citado anteriormente, na presena de sacarose ocorre a

formao de um biofilme menos celular, isto , com menor quantidade de

microrganismos e com maior quantidade de polissacardeos intra e extracelulares que

funcionam como uma reserva energtica para a comunidade bacteriana.

Adicionalmente, pode haver reduo da concentrao de ons Ca, Pi e F no biofilme

formado na presena de carbohidratos fermentveis [Tenuta et al., 2006].

Com relao ao substrato das amostras utilizadas no modelo in situ,

Ghaeth e colaboradores em 2011, realizaram reviso da literatura comparando o uso

de dentes bovinos em substituio aos dentes humanos em estudos in vitro e in situ.

Relatam como desvantagens e limitaes do uso de dentes humanos: dificuldade de

obteno em quantidade e qualidade suficientes, uma vez que, atualmente, extraes

so somente realizadas devido grande destruio do elemento dental; padronizao

da fonte e origem da coleta do dente humano, que pode levar a grandes variaes nas

anlises finais do estudo onde utilizado; relativamente, a rea do dente humano

pequena e a anatomia curva tambm pode limitar a obteno de amostras de

dimenses uniformes e regulares; risco de infeco cruzada ou contaminao do

voluntrio; limitaes ticas de obteno dos dentes humanos. Relatam que, na

10

literatura, foram propostos substratos no humanos em substituio. So eles: dentes

de primatas, bovinos, sunos, equinos e de tubaro. O dente bovino tem sido o mais

amplamente utilizado em substituio ao dente humano e seu uso tem aumentado nos

ltimos 30 anos, em funo de sua relativa fcil obteno em boas condies, com

composio mais uniforme que o dente humano. Adicionalmente, a rea de superfcie

do dente bovino, quando comparado ao dente humano, maior e no tem leses de

crie ou outros defeitos que possam afetar a anlise nos estudos onde so utilizados.

Entretanto, a validade do uso dos dentes bovinos e os resultados obtidos por meio de

seu uso foram questionados, uma vez que sua estrutura e bioqumica no so

idnticas ao dente humano. Desta maneira, foram revisados os seguintes aspectos:

morfolgico, composio qumica, propriedades fsicas, cries, eroso/abraso dental,

fora de adeso/unio, infiltrao marginal tanto em estudos in vitro quanto em

estudos in situ. Mais de 50% destes artigos revisados no mostraram diferena

significativa entre os substratos humano e bovino para, pelo menos, um dos aspectos

citados.

De acordo com Wolf & Sika, os mecanismos de ablao a laser, na rea do

ultravioleta, em tecidos duros so de maneira geral, denominados de processos

fototrmicos, muito embora, processos termomecnicos e processos fotoqumicos

possam contribuir. Na rea do espectro infravermelho, o mecanismo mais eficaz de

remoo tecidual se d por meio da exploso das molculas de gua contidas no

tecido dental, quando utilizados comprimentos de onda de 3 a 10 m. Desta maneira,

pode ser realizada uma remoo tecidual muito mais acurada em comparao aos

instrumentos rotatrios. As principais razes para utilizao da ablao laser, em

substituio aos instrumentos rotatrios na remoo de tecido duro dentrio durante a

prtica clnica, so: diminuio da sintomatologia dolorosa possivelmente associada

ao uso de instrumentos rotatrios; possibilidade de remoo tecidual selecionada,

como por exemplo, remoo de tecido cariado em contraposio a tecido dentrio

11

sadio; tratamentos minimamente invasivos com confeco de cavidades

conservadoras ou ultra conservadoras; diminuio da insalubridade da prtica clnica

por meio da reduo da emisso de rudos causados por instrumentos rotatrios.

citada tambm a relao positiva entre custo benefcio, uma vez que o equipamento

laser para prtica clnica tem se tornado mais acessvel.

A importncia de uma interveno mais conservadora, com especificidade

de remoo tecidual e de selamento preventivo est em acordo com a reduo dos

ndices da prevalncia da crie dental observados, tanto em pases desenvolvidos

[Rlla et al., 1991] como nos pases em desenvolvimento [Fejerskov et al., 2005], nas

ltimas dcadas do sculo XX. Leses incipientes, na impossibilidade de serem

tratadas com instrumentos rotatrios sem remoo de tecido sadio, so apenas

acompanhadas clinicamente pelo dentista. A mesma filosofia pode ser aplicada,

quando as condies de irradiao laser so apropriadamente escolhidas, para a

remoo de clculo dental sem ablao do tecido dental sadio adjacente. Apenas por

esta aplicao, a utilizao do laser na prtica clnica diria j representa benefcios

econmicos e de sade publica.

O entendimento dos processos de ablao, que ocorrem com diferentes

parmetros de irradiao, tem sido alvo de estudo na Literatura. H uma intrincada

correlao entre os parmetros de irradiao e as caractersticas teciduais. Dentre os

fatores que interferem nesta correlao esto o comprimento de onda do laser, o

tempo de durao do pulso, a densidade de energia e a intensidade da irradiao.

Com relao s caractersticas teciduais, os comportamentos mecnico, trmico e

tico do tecido podem influenciar a ablao por irradiao com laser. A composio do

tecido a ser ablacionado tambm deve ser levada em considerao, uma vez que o

contedo de gua do mesmo representa papel fundamental no processo de ablao.

12

A remoo tecidual por meio da ablao mediada pela exploso das

molculas de gua tem sido apontada como a maneira mais eficiente de remoo

tecidual com mnima transferncia de calor para o tecido adjacente. Esta caracterstica

da ablao laser corrobora o uso clnico, uma vez que diversos procedimentos

odontolgicos geram elevaes de temperatura na estrutura dental, em especial

quando so realizados com instrumentos rotatrios. A elevao de temperatura pode

comprometer a integridade do delicado tecido pulpar que extremamente sensvel s

variaes trmicas. Estes procedimentos seriam potenciais causadores de danos

pulpares reversveis ou irreversveis (a partir de 5,5 C), podendo levar necrose

[Zach, 1965].

Assim, a ablao mediada pela exploso das molculas de gua

considerada como o processo mais eficiente de remoo tecidual em termos de

quantidade (espessura) de tecido removido por pulso. O rpido aquecimento da gua

subsuperficial, confinada no interstcio do tecido duro dental, leva a um aumento da

presso subsuperficial que, facilmente, excede o mdulo de resistncia do tecido

dental levando remoo explosiva de material. A reduzida dimenso do interstcio

contendo gua garante uma troca de calor eficiente (equalizao da temperatura)

entre a gua e os componentes do tecido duro dental, em um perodo muito inferior a

um microssegundo. Do ponto de vista prtico, a informao importante no que diz

respeito ablao tecidual reside na taxa de ablao e a quantidade (ou frao) da

energia do pulso laser residual no tecido no ablacionado. A eficincia da ablao

efeito secundrio. A irradiao dos tecidos duros dentais resulta numa interao da luz

laser com os componentes orgnicos e inorgnicos do tecido. Se absorvida, a energia

irradiada convertida diretamente em calor. Este efeito trmico apontado como a

causa de alteraes microestruturais causando, em consequncia, aumento da

resistncia dos tecidos duros dentais dissoluo cida. Algumas teorias tentam

explicar este aumento de resistncia cida. A mais amplamente difundida a teoria de

13

reduo da permeabilidade do esmalte dental pela remoo de stios de carbonato

pelo aquecimento da irradiao laser resultando em uma forma menos solvel nos

ciclos de pH [Featherstone et al., 1998]. Esta alterao da estrutura cristalogrfica, de

uma forma mais solvel para uma forma menos solvel, parece ser mais facilmente

obtida quando utilizado o laser Er, Cr: YSGG na ausncia de refrigerao com ar ou

gua [Martins et al., 2012]. Assim, pode-se pensar que a utilizao do laser Er, Cr:

YSGG no preparo de cavidades, ocasio em que h necessidade de refrigerao para

evitar dano trmico pulpar, no oferece uma resistncia adicional ao aparecimento de

cries secundrias por uma mudana cristalina do esmalte dentrio. Com relao ao

aumento da resistncia cida, no parece haver diferena entre cavidades preparadas

com laser, quando comparadas quelas preparadas com instrumento rotatrio. Sob

este aspecto, no parece haver vantagem do laser em termos de aumento de

resistncia ao aparecimento crie secundria, na prtica clnica [Apel et al, 2004].

A matriz mineral dos tecidos duros dentais (esmalte e dentina) composta

por uma estrutura cristalina de hidroxiapatita [Ca10(PO4)6(OH)2] carbonatada.

Substituies de radicais na estrutura cristalina possivelmente causam uma mudana

de fase, alterando a solubilidade do cristal, quando comparado hidroxiapatita pura.

Entretanto, mesmo a incorporao inicial de carbonato na apatita biolgica um

assunto controverso. A partir de estudo [Rabelo et al., 2010] por espectroscopia

infravermelha transformada de Fourier (FTIR) acredita-se que o carbonato (tipo A)

ocupe stios de hidroxila [OH-] causando uma alterao na estrutura cristalina, ou que

o carbonato (tipo B) ocupe os stios de fosfato [PO43-] causando outro tipo de alterao

no cristal. Assim, a incorporao do carbonato pode aumentar ou diminuir a

solubilidade do cristal ao qual se incorpora por meio da mudana sua morfologia.

Tambm mencionado [Bachmann et al., 2005 e 2009] que a irradiao com laser Er,

Cr:YSGG promove a formao de uma fase menor, menos solvel, a partir de

formao de Tetraclcio Fostato imerso em uma matriz de hidroxiapatita, tambm

14

confirmado por FTIR. Posteriormente [Bachmann et al., 2009], foi tambm observada a

formao de Triclcio Fosfato na fase alfa e Triclcio Fosfato na fase beta.

Apel e colaboradores, em 2005, realizaram um estudo com objetivo de

investigar qualitativamente os efeitos da irradiao subablativa (sic) dos lasers de

rbio no esmalte dental humano. Foram utilizados os lasers Er:YAG ( = 2.94) e

Er:YSGG ( = 2.79) em estudos in vitro e in situ. Por meio de microscopia de varredura

confocal a laser, foram avaliadas as alteraes morfolgicas da superfcie de esmalte.

Foram observadas mudanas microscpicas, na forma de micro trincas na superfcie

de esmalte irradiado sugerindo regies suscetveis desmineralizao em ambiente

cido.

O mesmo laser Er, Cr:YSGG que utilizado para o corte de esmalte e

dentina ou canais radiculares, pode ser considerado tambm para preveno da crie,

na medida em pode tornar o esmalte dental menos solvel em ambiente cido. Para

esta ltima aplicao, a irradiao deve promover mudanas microestruturais no

esmalte induzidas pela ao trmica do pulso [Apel et al, 2002 e 2004]. Da Ana e

colaboradores, em 2007, realizaram um estudo in vitro avaliando o aumento de

temperatura da superfcie e da cmara pulpar de dentes irradiados com laser Er,

Cr:YSGG ( = 2,79 m), na presena e na ausncia de fotosensibilizadores. Uma vez

que este comprimento de onda melhor absorvido pela gua e OH- presentes na

hidroxiapatita do esmalte dental, ocorre um aumento de, aproximadamente, 800C na

regio de incidncia do pulso. Assim, o comprimento de onda altamente absorvido e

sua energia eficientemente convertida em calor, gerando mudanas cristalogrficas

no esmalte dental, podendo resultar num aumento da resistncia aos cidos. A

despeito da resistncia cida do esmalte ser relacionada, in vitro, a maiores

densidades de energia, o aumento da temperatura pulpar em funo da dissipao de

calor pode comprometer a vitalidade do elemento dental. Assim, o estudo citado

15

avaliou a determinao de parmetro de irradiao, visando o mximo de benefcio do

aumento da resistncia cida com o mnimo risco de aquecimento pulpar. Para tanto,

dentes terceiros molares humanos extrados foram submetidos irradiao com laser

Er,Cr:YSGG ( = 2,79) isoladamente, ou associada ao uso de fotossensibilizador. As

densidades de energia utilizadas foram de 2,8; 5,6 e 8,5 J/cm2 sem refrigerao com

ar ou gua, por 30 segundos. Em seguida, os dentes foram avaliados com relao

alterao morfolgica da superfcie, temperatura da superfcie e temperatura pulpar.

Aps a irradiao, a superfcie observada no microscpio eletrnico de varredura

mostrou morfologia tpica de reas de ablao apresentando crateras cnicas com

exposio de prismas de esmalte, para todas as densidades de energia. Quando foi

utilizada a densidade de energia de 8,5 J/cm2 associada ao uso de fotossensibilizador,

sem refrigerao, no houve evidncia de carbonizao. A avaliao das temperaturas

de superfcie e pulpar foram avaliadas com auxlio de cmera termogrfica. Na

superfcie, para amostras irradiadas com 8,5 J/cm2, foi observada a temperatura

247.630.2C quando no foi aplicado o fotossensibilizador e 211.822.6C com

aplicao de fotossensibilizador. Ao trmino da irradiao, as temperaturas de

superfcie apresentaram queda exponencial, retornando temperatura inicial aps,

aproximadamente, 10 segundos da irradiao. Na cmara pulpar, para amostras

irradiadas com 8,5 J/cm2, foram observados os maiores aumentos de temperatura, em

relao s demais densidades de energias utilizadas. Houve um aumento de

temperatura pulpar de 1.260.5C com uso de fotossensibilizador e 2.110.9C sem o

uso de fotossensibilizador. Foi discutido o tempo de irradiao (30 segundos), e a

espessura do esmalte e da dentina. Importante ressaltar que, na extrapolao para o

uso clnico, a presena de leso levaria a um aumento do contedo de gua no tecido

e maior proximidade ao tecido pulpar podendo haver maior transferncia de calor.

Considerando a grande variao anatmica dos elementos dentais humanos, e

levando-se em conta a baixa condutividade trmica da dentina, o operador deve julgar

as condies do tecido dental para minimizar o risco de dano trmico em tecido pulpar.

16

Em 2010, Secilmis e colaboradores avaliaram o contedo mineral de

esmalte dental humano irradiado com laser Er, Cr:YSGG ( = 2,79). As amostras

foram irradiadas com 80% de gua e 90% de ar, em modo de no contato com

densidade de energia de 17,68 J/cm2 e 1 W ou 35,36 J/cm2 e 2 W. Aps a irradiao,

as amostras foram analisadas morfologicamente por microscopia eletrnica de

varredura e tiveram seu contedo de Clcio, Potssio, Magnsio, Sdio e Fsforo

determinados. No foram notadas diferenas significativas com relao ao contedo

mineral das amostras de esmalte dental humano, para ambas as densidades de

energias, aps a irradiao com laser Er, Cr:YSGG ( = 2,79). A anlise por

microscopia eletrnica de varredura indicou que so observadas maiores alteraes

morfolgicas quando utilizada uma maior densidade de energia (35,36 J/cm2 e 2 W).

A irradiao laser tem sido apontada com um tratamento promissor tambm

na preveno de crie, no s isoladamente, mas tambm quando associada ao uso

de produtos fluoretados. O trabalho de Adrian et al. [1971], foi o primeiro a relatar os

efeitos benficos do laser na associao com o fluoreto de sdio, onde o laser

promovera aumento na absoro de flor e decrscimo na taxa de dissoluo de

clcio em soluo cida.

Estudo in vivo utilizando uma baixa densidade de energia (10,74 J/cm2) de

laser de Argnio, associada aplicao de flor, mostrou que h um aumento

significativo da reteno do flor na superfcie de esmalte, quando comparada com

superfcies no irradiadas, por um perodo de tempo de at 6 meses [Nammour et al.,

2005].

Tagliaferro e colaboradores, em 2007, realizaram um estudo in vitro

avaliando os efeitos do laser de CO2 ( = 10,6 m) utilizado isoladamente, ou

17

combinado com a aplicao de flor fosfato acidulado (FFA), na inibio da

desmineralizao do esmalte de dentes decduos submetidos s leses artificiais de

crie. As amostras obtidas a partir de 30 dentes decduos hgidos foram submetidas

induo de leses artificiais de cries e, em seguida, submetidas aos tratamentos

isolados (FFA ou laser) ou combinao dos tratamentos (FFA + laser ou laser +

FFA). Aps a ciclagem de pH, foi analisada a microdureza longitudinal. Os resultados

mostraram que a irradiao laser isoladamente, assim como a combinao laser +

FFA reduziu significativamente a progresso da desmineralizao no esmalte de

dentes decduos. Entretanto, no houve evidncias de um efeito adicional quando o

esmalte foi tratado com a combinao dos tratamentos de laser CO2 ( = 10,6 m) e

FFA.

Em estudo in vitro realizado comparando o efeito na reduo de

desmineralizao do esmalte dental humano por meio da irradiao com laser Er,

Cr:YSGG (8,5 J/cm2) com o dentifrcio fluoretado (NaF) foi possvel observar que a

irradiao laser leva a um aumento da resistncia cida comparvel ao efeito

cariosttico obtido pelo uso do dentifrcio fluoretado, para os parmetros testados

[Freitas et al., 2010].

Com relao s mudanas cristalogrficas, no aumento da resistncia do

esmalte dental submetido irradiao, quando foram comparados em estudos in situ

[Apel et al., 2004], e in vitro [Zezell et al., 2010], os lasers de Neodmio (Nd:YAG) e

rbio (Er, Cr:YSGG e Er:YAG), foi observado que todos os lasers indicam uma

tendncia de diminuio significativa da desmineralizao. Quando aplicado o FFA

previamente irradiao com laser Er, Cr:YSGG ocorre um efeito sinrgico dos

tratamentos, com aumento significativo da reduo da desmineralizao, confirmando

prvios estudos in vitro [Moslemi et al., 2009; Zezell et al., 2010]. O aumento da

18

reteno de CaF2, formado a partir da aplicao de FFA, por meio da posterior

irradiao com laser sugere um maior potencial anticrie.

Estudo recente [Ana et al., 2012], sugere que irradiao com laser Er,

Cr:YSGG no esmalte dental humano, quando utilizada uma densidade de energia de

8,5 J/cm2, diminui a perda de dureza, porm no ocorre efeito sinrgico quando a

irradiao laser combinada a aplicao tpica de flor fosfato acidulado (FFA). Nas

amostras polidas de esmalte dental humano submetidas aplicao de FFA, foi

realizada anlise pela espectroscopia de energia dispersiva de raio x (EDS),

confirmando a formao de glbulos de CaF2 em decorrncia do tratamento fluoretado.

Interessante notar que, quando avaliada a concentrao de on fluoreto fracamente

ligado na superfcie de esmalte, submetida combinao dos tratamentos (FFA +

laser Er, Cr:YSGG), h um aumento de formao e reteno do CaF2.

O uso dos lasers na prtica clnica diria j uma realidade e a tendncia

que ele seja usado tambm nos procedimentos de preveno. Estudo in vivo utilizando

o laser de Nd:YAG em pacientes ortodnticos [Harazaki et al., 2001] mostrou que a

densidade de energia de 40 J/cm2 aumenta a resistncia cida da estrutura dental.

Foram tratados 10 pacientes com o parmetro citado e, em seguida, os mesmos foram

submetidos aplicao tpica de FFA. Aps um ano, as leses de manchas brancas

reduziram significativamente nos pacientes irradiados, em comparao com os no

irradiados. Quando o laser de Nd:YAG foi utilizado in vivo em dentes posteriores de 33

pacientes, utilizando a densidade de energia de 84,9 J/cm2 seguida da aplicao de

FFA, foi observada uma reduo de manchas brancas aps um ano [Zezell et al.,

2009]. O exame final foi realizado, de maneira cega por outro examinador calibrado,

por meio de inspeo visual, inspeo ttil com auxlio de sonda exploradora e

exames radiogrficos. No estudo citado, foram tambm realizados testes de vitalidade

pulpar, atestando a segurana clnica da densidade de energia utilizada. Estes

19

resultados corroboram o acompanhamento clnico realizado por White e colaboradores

[1994] em pacientes que foram irradiados com Nd:YAG (100 mJ/pulso), com a

finalidade de remoo de cries, implicando numa maior proximidade ao tecido pulpar.

O acompanhamento foi realizado at trs anos aps a irradiao e no houve

sintomatologia ou evidncias de pulpite irreversvel ou necrose pulpar. No estudo in

vivo de Zezell e colaboradores [2009], apesar de ter sido notada a reduo de

manchas brancas aps um ano, no foi possvel determinar a durabilidade dos efeitos

do laser na reteno de fluoreto. Porm, foi concludo que a utilizao do laser

Nd:YAGG, nos parmetros citados, seguida da aplicao de aplicao tpica de flor,

pode ser um tratamento clinicamente indicado para preveno da crie em dentes

permanentes. Tambm foi recentemente relatado o uso pioneiro do laser de CO2 com

a finalidade de preveno [Rechmann et al., 2009]. No estudo citado, foi realizada a

irradiao com o laser de CO2 de pulsos curtos ( = 9,6 m) combinada apenas com o

uso de dentifrcio fluoretado contendo 1.100 ppm F na forma de NaF. Os pacientes

participantes do estudo citado residiam em regio com gua de abastecimento pblico

otimamente fluoretada. Os resultados mostraram uma maior resistncia

desmineralizao nos dentes irradiados, quando comparados com os no irradiados.

Estes resultados corroboram prvio estudo in situ, quando o laser de CO2 ( = 9,6 m),

utilizado de maneira isolada ou combinado com o fluoreto, mostrou uma inibio da

perda mineral em ambiente cido [Rodrigues et al., 2006]. Neste estudo in situ citado,

foi possvel notar uma sinergia dos tratamentos no aumento da resistncia mineral,

mostrando que os parmetros estudados seriam eficientes nos tratamentos de

preveno da crie.

Flor fracamente ligado , por definio, o fluoreto adsorvido na superfcie

do esmalte dental. Presume-se que este fluoreto o principal responsvel na

preveno de crie, no que diz respeito perda mineral, uma vez que ele atua na

cintica da dissoluo mineral do esmalte. A mxima inibio da dissoluo da

20

superfcie cristalina do esmalte, pelo fluoreto adsorvido, depende do aporte contnuo

de fluoreto na forma lquida na cavidade bucal, uma vez que o flor fracamente ligado

mobilizado nos ciclos de pH [Arends & Christoffersen, 1990]. Clinicamente, nos

locais onde o biofilme no foi totalmente removido, o fluoreto ter ao, tanto ativando

a remineralizao por todo o perodo de tempo que o pH estiver neutro, como

reduzindo a desmineralizao quando o pH do biofilme cair pela exposio a

acares.

21

4- MATERIAL E MTODOS

O presente estudo est didaticamente descrito em duas etapas:

experimento in vitro e experimento in situ. Na primeira etapa, aps iseno do Comit

de tica no Uso de Animais (106 CEUAIPEN/SP), as amostras de esmalte obtidas a

partir de dentes bovinos foram aleatorizadas entre 8 Grupos (n = 34 por grupo). O

cronograma do delineamento experimental in vitro ilustra que os primeiros quatro

Grupos so considerados controles e os outros quatro Grupos restantes so

experimentais. O delineamento est reproduzido ao final desta seo. Aps a

aleatorizao, as amostras foram submetidas aos respectivos tratamentos e em

seguida o total de amostras de cada grupo foi dividido de maneira que metade deste

total foi analisada morfologicamente por Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) e

a metade restante deste total foi submetida a uma anlise quantitativa do fluoreto (F-)

solvel em lcali, por meio do mtodo de eletrodo on especfico.

Na segunda etapa, foi realizado um experimento in situ de longa durao

onde, aps aprovao pelo Comit de tica em Pesquisa (34338 FO-USP), 15

voluntrios adultos utilizaram dispositivos palatinos contendo oito amostras, obtidas a

partir de blocos de esmalte dental humano. As amostras, de microdureza de superfcie

previamente determinada, foram tratadas e submetidas ao uso in situ pelos

voluntrios. A seguir, foram analisadas para avaliar o efeito da sinergia dos

tratamentos propostos, diante da ao tpica de soluo de sacarose, na presena de

biofilme dental formado in vivo. Para tanto, foram selecionadas, por meio da

Microdureza de Superfcie (MDS), amostras que foram esterilizadas e utilizadas no

dispositivo palatino seguindo o modelo boca dividida, que possibilita a utilizao

simultnea de um controle (positivo ou negativo) e dos tratamentos experimentais. O

dispositivo palatino foi utilizado por duas semanas, e sobre as amostras, foi gotejada

extra oralmente uma soluo de sacarose 8 vezes ao dia. A aplicao extra oral dos

tratamentos nas amostras utilizadas no dispositivo palatino, no interferiu na dentio

do voluntrio quando o mesmo utilizou o dispositivo in situ. Aps este perodo as

amostras foram retiradas e analisadas por meio de Anlise Morfolgica por

Microscopia Eletrnica de (MEV), Anlise da Microdureza Longitudinal, Anlise do

fluoreto (F-) solvel em lcali, por meio do mtodo de eletrodo on especfico.

22

4.1- EXPERIMENTO IN VITRO

Para o estudo in vitro, aps iseno do Comit de tica no Uso de

Animais-IPEN/SP (Anexo A), foi utilizado um delineamento cego utilizando dentes

bovinos, previamente armazenados em gua destilada e deionizada e mantidos sob

refrigerao a 4 C.

De cada elemento dental foram obtidos, por meio de corte por disco

diamantado, sob refrigerao, blocos de esmalte de dimenses aproximadas de 5 x 5

x 2 mm. Os blocos foram posteriormente planificados e polidos, conforme descrito na

literatura, e aleatorizados entre os Grupos descritos a seguir:

Grupo 1 (Controle Negativo para CaF2): Amostras sem tratamento;

Grupo 2 (Controle Positivo para CaF2): Amostras submetidas a aplicao de Flor

Fosfato Acidulado (FFA concentrao 12.300 g F-/g);

Grupo 3 (Controle Positivo para CaF2 a partir da aplicao de dentifrcio):

Amostras submetidas a aplicao de dentifrcio contendo 1.100 g F-/g;

Grupo 4 (Controle laser Er, Cr: YSGG): Amostras irradiadas com laser Er, Cr: YSGG

8,5 J/cm2;

Grupo 5: Amostras irradiadas com laser Er, Cr: YSGG 8,5 J/cm2 e submetidas a

aplicao de dentifrcio contendo 1.100 g F-/g;

Grupo 6: Amostras irradiadas com laser Er, Cr: YSGG 8,5 J/cm2 e submetidos a

aplicao tpica de FFA 12.300 g F-/g;

Grupo 7: Amostras submetidas a aplicao de dentifrcio contendo 1.100 g F-/g e

irradiadas com laser Er, Cr: YSGG 8,5 J/cm2;

Grupo 8: Amostras submetidas a aplicao tpica de FFA 12.300 g F-/g e irradiadas

com laser Er, Cr: YSGG 8,5 J/cm2.

Os Grupos foram codificados por cores para evitar identificao dos

tratamentos nas anlises posteriores. Assim como os demais Grupos, os blocos do

Grupo 1 (Controle Negativo para CaF2) foram armazenados em ambiente umidificado

23

com gua destilada e deionizada e refrigerados a 4 C at serem submetidos s

anlises. Os blocos do Grupo 2 (Controle Positivo para CaF2) foram submetidos

aplicao de gel de flor fosfato acidulado (12.300 g F-/g de flor, pH 3,6 3,9. DFL,

Rio de Janeiro, RJ, Brasil) [Featherstone et al., 1991] por 4 minutos. Decorrido este

tempo, os blocos foram lavados com fluxo contnuo de gua destilada e deionizada e,

em seguida, secos com tira de papel absorvente. Os blocos do Grupo 3 (Controle

Positivo para CaF2 a partir da aplicao de dentifrcio) foram submetidos a imerso em

uma suspenso 1:3 (p/p) de dentifrcio contendo 1.100 g F-/g, na forma de NaF (Oral

B Complete. Oral B, SP, Brasil), sob agitao por 10 minutos [Cruz et al., 1992]. As

aplicaes de dentifrcio foram repetidas de 4 em 4 horas, num total de 3 aplicaes

no perodo de 12 horas. Aps cada aplicao de dentifrcio fluoretado, os blocos foram

lavados por 10 segundos com fluxo contnuo de gua destilada e deionizada e, em

seguida, secos com tira de papel absorvente. As amostras do Grupo 4 (Controle laser

Er, Cr: YSGG) foram irradiadas sob a forma de varredura sobre toda a superfcie das

amostras, de maneira uniforme, evitando-se a aplicao por duas vezes sobre o

mesmo ponto com auxlio de deslocador micromtrico de passo X-Y-Z automatizado,

que deslocou-se somente nos planos X-Y. Os demais Grupos foram tratados com a

varivel da aplicao dos produtos fluoretados ser feita antes da irradiao ou aps a

irradiao. Aps os respectivos tratamentos, os Grupos foram armazenados em

ambiente umidificado com gua destilada e deionizada e refrigerados a 4 C at serem

submetidos s anlises.

As amostras foram submetidas s analises quantitativa e qualitativa. Para

esta finalidade, cada grupo de amostras foi dividido aleatoriamente em dois

subgrupos, cada um contendo 50% do total das amostras. Foi realizada uma anlise

qualitativa, em 50% do total das amostras de cada grupo, por meio de anlise

morfolgica por Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) para avaliar a formao e

reteno de produtos na superfcie de esmalte, verificando a formao de flor

fracamente ligado (CaF2) em decorrncia das associaes propostas nos tratamentos.

Foi tambm realizada uma anlise quantitativa, nos 50% remanescentes do total das

amostras de cada grupo, por meio do mtodo on-especfico para avaliar a

concentrao de produtos solveis em lcali formados na superfcie de esmalte (F-

fracamente ligado) decorrente das associaes propostas.

O diagrama da metodologia aqui descrita est representado no

delineamento in vitro a seguir.

24

25

4.1.1- Obteno e Polimento das Amostras de Esmalte Dental Bovino

As amostras de esmalte dental para o estudo in vitro foram obtidas a partir

de dentes bovinos, pois de acordo com a literatura, substratos de tecidos duros (como,

por exemplo, dentina e esmalte) humano e bovino so muito semelhantes do ponto de

vista estrutural [Ogaard et al., 1990; Mellberg JR, 1999], podendo este ltimo ser uma

alternativa bastante aceitvel para o estudo da des-remineralizao tanto em modelos

in vitro como em modelos in situ. Apesar do substrato de escolha ser o esmalte dental

humano, deve-se levar em conta a dificuldade de obteno de suprimento adequado e

questes ticas envolvidas na utilizao de dentes humanos. Levando-se em conta

que a inteno deste estudo mimetizar uma situao bastante prxima ao que ocorre

na cavidade bucal, minimizando o grau de artificialidade [Shellis et al., 2011], porm

mantendo a viabilidade de obteno de amostras, o dente bovino foi a opo de

escolha para esta etapa. Substratos artificiais como, por exemplo, hidroxiapatita em

discos, apesar de evitar quaisquer questes ticas de obteno, foram descartados,

pois os resultados no podem ser inferidos para estudos in situ [Shellis et al., 2011]

Todos os dentes foram obtidos no mesmo frigorfico na regio da cidade

de Bauru, Estado de So Paulo. Os dentes foram lavados com gua e limpos para a

remoo de resduos grosseiros de material orgnico. Para o transporte, os dentes

ficaram armazenados em gua destilada e deionizada. Aps a limpeza inicial, os

dentes bovinos foram armazenados em soluo de Timol (concentrao 1 g/ L) e

mantidos em refrigerador a 4o C, por 48 horas. Transcorrido este perodo, os dentes

foram retirados da soluo e exaustivamente lavados em gua corrente. As razes

foram removidas com um disco diamantado (Struers srie 641654H4, rotao mxima

12.225 rpm. EUA) montado em uma cortadeira (Struers Accutom-5 rotao de 300 a

3.000 rpm. EUA). Aps a remoo das razes, o tecido pulpar foi removido e as coroas

foram examinadas visualmente de maneira macroscpica, apenas com auxlio de uma

lupa estereoscpica provida de lmpada fria (Ramsor Indstria e Comrcio Ltda. SP,

Brasil). Os dentes foram colocados em papel absorvente para remoo do excesso de

umidade e selecionados. Foram utilizados somente aqueles com ausncia de

manchas, trincas ou defeitos visveis, sendo os demais excludos. Aps o minucioso

exame, os dentes selecionados foram colocados em um novo recipiente com gua

destilada e deionizada, para evitar possvel desmineralizao durante o

armazenamento. Os dentes foram mantidos sob refrigerao a 4o C e foi realizada

troca peridica da gua de imerso, para evitar crescimento de microrganismos ou

fungos. Por meio de corte com discos diamantados foram obtidos os blocos de

esmalte (Figuras 2 e 3), para obteno das amostras, conforme descrito a seguir.

26

Figura 2 - esquerda: dente bovino com cortes realizados por meio de discos

diamantados para remoo de bloco de esmalte de dimenses aproximadas de 5 x 5 x

2 mm. direita: blocos de dentes fixados em suportes planos de acrlico para

obteno das amostras polidas

Figura 3 - Aumento dos blocos obtidos a partir de dentes bovinos antes da

regularizao de dentina (A) e polimento do esmalte (B) para obteno das amostras

Os dentes foram fixados em suportes planos de acrlico com auxlio de

cera pegajosa (Kerr, EUA), de maneira que a face lingual do dente ficasse em contato

27

com o suporte para possibilitar o corte da face vestibular. Dois discos diamantados

foram montados paralelamente na cortadeira com auxlio de um espaador com

espessura de 5 mm posicionado entre eles. Os cortes foram realizados

perpendicularmente, sob refrigerao com gua. Foi obtido, de cada elemento dental,

o maior nmero possvel de blocos de esmalte com 5 x 5 mm de lado e com

espessura mdia inicial de 3 mm.

Aps a obteno, os blocos foram planificados e polidos conforme descrito

na literatura [Cury et al., 2003]. Para facilitar o manuseio, cada um dos blocos obtidos

foi fixado, individualmente, com auxlio de cera pegajosa, em um suporte de acrlico

plano de maneira que o esmalte ficasse em contato com o suporte para possibilitar a

regularizao da dentina. A dentina foi previamente regularizada manualmente

utilizando discos de lixa gramatura 400 umedecidos com gua destilada e deionizada,

para eliminao de pontas agudas. Aps a prvia regularizao manual, os blocos

tiveram a dentina regularizada em politriz. O desgaste na politriz foi feito de 20 em 20

segundos, sob refrigerao com gua, utilizando disco de lixa gramatura 400 e

velocidade reduzida de 100 rpm. A cada 20 segundos, os blocos foram medidos com

paqumetro (Mitutoyo. Suzano, SP, Brasil) digital e as espessuras mensuradas foram

de 2,04 mm (mnima) a 3,66 mm (mxima). Aps a regularizao da dentina, os blocos

foram descolados dos suportes de acrlico e invertidos de maneira que a dentina

regularizada ficasse justaposta em contato com o novo suporte acrlico limpo para

possibilitar o polimento do esmalte dentrio. O esmalte foi polido na politriz, sob

refrigerao com gua, com discos de lixa de granulao crescente (600, 1.200, 2.500

e 4.000 gros). O polimento inicial foi realizado com disco de lixa de gramatura 600

por 15 segundos, aproximadamente. O exame visual de cada bloco foi feito,

individualmente, aps a secagem do mesmo com papel absorvente macio especfico

para este uso. Em seguida foi usado o disco de lixa de gramatura 1.200 por

aproximadamente 10 segundos em cada bloco. O mesmo procedimento foi realizado

para cada bloco com disco de lixa de gramatura 2.500 e 4.000. A seguir, sem

refrigerao com gua, foi feito o ultra polimento com disco de feltro (Polishing Cloth,

METADI, Buehler 40-7618, IL, USA) e suspenso diamantada com partculas de 1 m

(METADI Diamond suspension, Color Polishing Water-spray base 40-6530, Buehler,

IL, USA), por 1 minuto, em velocidade 300 rpm. Por meio de exame macroscpico

cuidadoso foi verificada a qualidade do polimento e ausncias de riscos em cada um

dos blocos secos. Aps o trmino do polimento, os blocos foram lavados em uma

lavadora ultra-snica (Thornton, Unique Ind. e Com. Ltda., So Paulo/ SP, Brasil) para

total remoo de resduos de sua superfcie de esmalte, a ser submetida aos

tratamentos propostos. Foi utilizada a lavadora por um perodo de 30 minutos em dois

28

ciclos de 15 minutos. Os blocos de esmalte fixos aos suportes de acrlico foram

posicionados na cuba da lavadora contendo gua destilada e deionizada. Entre os

ciclos de lavagem de 15 minutos, os blocos foram retirados para a troca da gua e

lavagem do recipiente da lavadora, antes de serem recolocados para o segundo ciclo

de lavagem de 15 minutos.

Os blocos permaneceram fixos em seus respectivos suportes de acrlico

que foram numerados de 01 a 274, para aleatorizao entre os oito Grupos de

tratamentos. A randomizao dos blocos entre os Grupos foi feita por meio do

programa de software Excel que utiliza nmeros aleatrios. Em uma coluna foram

colocados os nmeros das amostras de 01 a 274, e na coluna vizinha o programa gera

nmeros aleatrios de zero a um. Em seguida, os nmeros aleatrios foram

organizados em ordem crescente, randomizando os nmeros da primeira coluna

referente s amostras. Cada um dos oito Grupos de tratamento recebeu 34 blocos de

esmalte.

4.1.2- Tratamento das Amostras de Esmalte Dental Bovino

Neste estudo in vitro, foi utilizada a irradiao do esmalte dental bovino

com laser Er, Cr: YSGG combinada com a aplicao tpica de FFA 12.300 g F-/g, ou

com a aplicao de dentifrcio de concentrao convencional de F contendo 1.100 g

F-/g. Para cada combinao da irradiao com laser, associada com a aplicao de

produto fluoretado, h uma varivel da aplicao do produto fluoretado ser realizada

antes ou aps a irradiao. As irradiaes foram realizadas sob a forma de varredura

sobre toda a superfcie das amostras, evitando-se a aplicao por duas vezes sobre o

mesmo ponto.

Para as amostras submetidas s aplicaes de produtos fluoretados, de

acordo com designado para cada Grupo, foi utilizado um dos seguintes protocolos:

-Aplicao tpica de gel de Flor Fosfato Acidulado (FFA) com

concentrao de 12.300 g F-/g de flor e 0,1 M de cido fosfrico, pH 3,6 3,9 (DFL,

Rio de Janeiro, RJ, Brasil). A durao da aplicao foi de 4 minutos [Featherstone et

al., 1991], conforme preconizado para o uso clnico.

- Imerso em uma suspenso 1:3 (p/p) de dentifrcio contendo 1.100 g

F/g, na forma de NaF (Oral B Complete. Oral B, SP, Brasil), em agitao por 10

minutos [Cruz et al., 1992], a 36,5C. As suspenses foram preparadas com 50 g de

dentifrcio fluoretado e 150 ml de gua destilada e deionizada. As aplicaes foram

repetidas de 4 em 4 horas, num total de 3 aplicaes, no perodo de 12 horas.

29

A aplicao tpica de gel de flor fosfato acidulado foi realizada com

auxlio de uma almotolia plstica totalmente limpa e previamente abastecida com o gel

que foi dispensado diretamente sobre a amostra, mantendo uma quantidade excessiva

de FFA pelo perodo de tempo determinado. Cada aplicao de dentifrcio fluoretado

foi realizada por meio da imerso das amostras em um recipiente contendo a

suspenso, que permaneceu em mesa agitadora (Marconi Incubadora e

Refrigeradora. Marconi Equipamentos para Laboratrio. Piracicaba, SP, Brasil), com

temperatura constante de 36,5C, pelo perodo de tempo determinado. Aps cada

aplicao de ambos os produtos fluoretados, pelo tempo determinado, as amostras

foram lavadas com fluxo contnuo de gua destilada e deionizada por 10 segundos, e

secas com tira de papel absorvente macio de 10,5 cm de comprimento. A lavagem e a

secagem das amostras foram realizadas com intuito de evitar a contaminao por

resduos dos produtos. Desta forma, as anlises avaliaram apenas os depsitos de

fluoreto de clcio formados e retidos na superfcie do esmalte das amostras, assim

como a sinergia destes depsitos formados e retidos em associao com a irradiao

com laser Er, Cr: YSGG.

As amostras do Grupo 4 (Controle laser Er, Cr: YSGG) foram irradiadas

conforme o protocolo descrito a seguir e, imediatamente aps as irradiaes,

armazenadas em ambiente umidificado com gua destilada e deionizada, e refrigerado

a 4 C, at serem submetidas s anlises.

4.1.3- Protocolo de Irradiao das Amostras

De acordo com o tratamento proposto, as amostras foram irradiadas com o

laser de xido de glio, escndio e trio dopado com cromo e rbio, o Er,Cr:YSGG

(Millenium, Biolase, San Clemente, EUA) do Laboratrio de Biofotnica do

IPEN/CNEN-SP processo CEPID FAPESP 98/14270-8. Este laser apresenta

comprimento de onda de 2,79 m, largura de pulso temporal entre 140 e 200 s, taxa

de repetio de 20 Hz, com potncia mdia ajustvel entre 0 a 6 W e energia por pulso

at 300 mJ. O sistema de entrega composto por uma fibra tica e pea de mo

metlica com ponta de safira modelo S 75, de 750 m de dimetro e comprimento de 6

mm, que possui uma luz guia vermelha que indica a focalizao do feixe, que no

opera em contato. No presente estudo foi empregada a densidade de energia de 8,5

J/cm2 [Ana et al., 2012] em forma de varredura sobre toda a superfcie da amostra. A

energia emitida no feixe foi mensurada por um medidor de potncia (powermeter,

Coherent FieldMaster GS e Detetor LM-P10I. Coherent, CA, EUA).

30

O protocolo de irradiao deste estudo in vitro foi realizado com a varivel

da aplicao de produtos fluoretados ser feita antes da irradiao, ou aps a

irradiao, para anlise do efeito das alteraes cristalogrficas promovidas pelo laser

em sinergia com a presena de CaF2 formado e retido na superfcie da amostra. As

amostras foram irradiadas de maneira que os Grupos foram intercalados,

sucessivamente, para aleatorizao de possveis alteraes dos equipamentos ou vis

do operador, conforme protocolo de randomizao de anlise.

As amostras foram removidas dos suportes de acrlico, toda a cera de

fixao foi removida. Em seguida, foi utilizada fita dupla face para fixao em novos

suportes acrlicos totalmente limpos. Esta manobra visou evitar o aquecimento da cera

de fixao durante a irradiao e, consequentemente, possveis respingos que

poderiam deixar resduos sobre a superfcie irradiada. A pea de mo metlica do

sistema de entrega do feixe de laser foi mantida fixa sobre mesa tica por meio de um

aparato especfico com suporte metlico para que a sua ponta de safira fosse mantida

imvel em posio perpendicular a amostra. Cada suporte acrlico contendo uma

amostra foi posicionado em um deslocador micromtrico (Model ESP 300, Newport

Corporation, CA, EUA) em ngulo reto com relao ponta de safira mantendo uma

distncia padro menor de 1 mm da mesma, conforme ilustram as Figuras 4 e 5. O

deslocador micromtrico de passo X-Y-Z automatizado foi especificamente

programado para que as amostras fossem deslocadas de maneira padro na razo da

distncia de 8 mm no eixo X por 8 mm no eixo Y a uma velocidade de 7,5 mm/s com

distncia entre as linhas de 0,375 mm percorrendo um total de 22 linhas por amostra.

A distncia entre as linhas foi determinada como sendo (1 1/e) do dimetro do feixe

laser. Desta forma, cada uma das amostras foi submetida irradiao de toda sua

superfcie de esmalte de rea de 25 mm2 evitando que o mesmo ponto fosse irradiado

duas vezes ou que houvesse pontos falhos, no submetidos irradiao. O laser foi

ligado a um estabilizador de voltagem e programado para atuar com 1,25 W de

potncia mdia, correspondente a uma densidade de energia de 8,5 J/cm2 com 0% de

gua e 0% de ar. A cada 12 amostras irradiadas, a energia por pulso foi mensurada e

aferida por um medidor de potncia (powermeter), mantendo a mdia de energia por

pulso (33,30 mJ/ pulso). A Figura 6 ilustra todo o equipamento utilizado para a

irradiao das amostras.

31

Figura 4 - Aparato de fixao da pea de mo metlica do sistema de entrega do feixe

de laser. A ponta de safira foi mantida imvel, a 1 mm da amostra, durante a irradiao

Figura 5 - Detalhe do aparato onde se observa o suporte de acrlico contendo amostra

sobre deslocador micromtrico automatizado em ngulo reto em relao ponta de

safira

32

Figura 6 - esquerda: laser de Er, Cr:YSGG Biolase. direita abaixo: aparato de

fixao do sistema de entrega do feixe posicionado sobre deslocador micromtrico

automatizado e a direita acima: medidor de potncia de energia.

4.2- ANLISES DO EXPERIMENTO IN VITRO

4.2.1- Anlise Morfolgica por Microscopia Eletrnica de Varredura

A anlise por Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) possibilita a

gerao de uma imagem da superfcie de esmalte das amostras por meio da emisso

de um feixe de eltrons onde uma parte dos eltrons primrios incidentes pode ser

retida nos tomos da amostra deslocando simultaneamente eltrons das rbitas

destes tomos. Os eltrons ejetados pelo feixe de eltrons primrios so referidos

como eltrons secundrios que quando emitidos promovem um desequilbrio

energtico, pois os eltrons secundrios possuem um nvel de energia inferior ao dos

eltrons primrios. Esta diferena de energia dissipada em forma de Raios X, que

caracterstico em termos de energia e de para cada elemento exposto ao feixe de

eltrons primrio. Porm deve-se levar em conta que a parte da amostra que emite

eltrons secundrios captados para a gerao da imagem, de superfcie e restringe-

33

se rea iluminada pelo feixe e que define a resoluo da MEV (Kitajima e Leite,

1999).

Aproximadamente metade do total das amostras de cada Grupo (n = 17)

foi submetida anlise por MEV. As amostras foram removidas dos suportes acrlicos

e transferidas para incio do preparo para anlise morfolgica por MEV. Aps a fixao

inicial em soluo de glutaraldedo 2%, durante 2 horas, foram realizadas 3 lavagens

de 5 minutos com soluo de tampo fosfato 0,1 M e a seguir as amostras foram

deixadas em soluo de tampo tetrxido de smio por 20 minutos. Novamente as

amostras foram submetidas a 3 lavagens de 5 minutos com soluo de tampo fosfato

0,1 M. A seguir, foram submetidas desidratao progressiva em solues de

concentraes crescentes de lcool (25%, 50%, 70%, 90% e 100%), onde foram

submersas por 15 minutos em cada soluo. A desidratao progressiva evita a

deformao dos glbulos de CaF2 formados e retidos na superfcie do esmalte das

amostras, mantendo a fidelidade da imagem final obtida. Aps a desidratao

progressiva, as amostras foram fixadas em Hexamethyldisilazane (HMDS) por 20

minutos e secas em capela por 2 horas e mantidas secas em dissecador por, no

mnimo, 24 horas antes de serem submetidas ao incio da metalizao. At o momento

da obteno das imagens, as amostras foram mantidas em dissecador com slica para

evitar alterao da superfcie preparada. Os Grupos foram codificados por cores para

evitar identificao nas anlises, mantendo o delineamento cego de estudo.

As amostras foram examinadas em dois diferentes Microscpios

Eletrnicos de Varredura. Foi utilizado o microscpio Phillips XL 30 (Eindhover,

Holland) do Centro de Caracterizao de Materiais do IPEN-CNEN/SP, com tenso de

20 K, e o microscpio TM 3000 Tabletop Microscope (Hitachi, Japan) do Centro de

Lasers e Aplicaes IPEN-CNEN/SP, com tenso de 5 K.

Quando foi utilizado o microscpio Phillips XL 30 foi necessria a

metalizao das amostras. Neste caso, aps o trmino do processo de desidratao

progressiva, cada uma das amostras foi fixada com fita adesiva condutora feita base

de carbono em suportes metlicos (stubs) tambm apropriados para conduo de

ons, e sobre elas foi depositado durante 120 segundos um filme fino de ouro com

espessura aproximada de 10 m. Para a metalizao das amostras foi utilizado o

equipamento Sputter Coater (TEC SCD050, Bal Tec, Zurich, Ge). Quando foi utilizado

o microscpio TM 3000 Tabletop Microscope, no houve necessidade de metalizao

das amostras aps a desidratao progressiva.

As amostras foram analisadas de maneira que os Grupos previamente

codificados foram intercalados sucessivamente para aleatorizao de possveis

34

alteraes dos equipamentos de MEV ou vis do operador, conforme protocolo de

randomizao de anlise.

Para cada amostra analisada foram obtidas, no mnimo, quatro imagens

em diferentes aumentos pr determinados: a primeira imagem foi realizada com a

magnificao de 50 X para verificao da superfcie da amostra, seguida por imagens

de 700 X, 2.000 X e 4.000 X de aumento ou mais.

Foram observados os aspectos estruturais e morfolgicos do esmalte,

decorrentes da irradiao com o laser de maneira isolada, e das combinaes da

irradiao com o FFA, ou com o dentifrcio fluoretado.

4.2.2- Anlise de Flor por Meio do Mtodo do Eletrodo on Especfico

H vrios mtodos que identificam a presena do flor associado a outros

elementos. O mtodo on especfico aqui utilizado pode determinar somente a

presena de fluoreto e tambm possui como vantagens a simplicidade da tcnica e o

menor custo operacional [Aguilar, 2002]. No presente estudo, em