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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVAFACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE CIENCIA, TECNOLOGIA E INGENIERIA DE ALIMENTOS
PROYECTO DE TESIS
“Caracterización reologica del licor de cacao de la variedad
CCN51 de la zona de Pucaca (Theobroma cacao)”
RESPONSABLE : BECERRA RAMIREZ, Edil
ASESOR : Ing. RIVERA ROJAS, Humberto
COASESOR :
TINGO MARÍA - PERÚ
2014
1
I. EL PROBLEMA
1.1 Planteamiento del problema
El cacao (Theobroma cacao) es un cultivo de notable
importancia económica para Perú; declarado recientemente como
producto bandera de Perú, por la Comisión Nacional de Productos de
Bandera (Coproba). Y debido al alto valor nutricional y amplio consumo
en la alimentación por el mundo en general; la producción de cacao,
chocolates y subproductos pasan a constituir una prioridad en el país.
Gran parte del cacao Peruano es exportado y continua siendo
considerado entre los más finos de aroma del mundo, sin embargo, su
participación en el mercado internacional es prácticamente
imperceptible en las estadísticas. Durante los últimos anos las
compañías procesadoras de cacao, y en particular aquellas
encargadas de la producción de chocolate, han comprendido que la
calidad sensorial constituye el éxito de un producto y, para ello, es
necesario conocer los factores que determinan la calidad sensorial de
dicho producto. En la elaboración del chocolate se pueden citar
innumerables factores vinculados a esta, cuyo manejo apropiado
puede generar un carácter aromático distintivo y deseable. Los
estudios que se han realizado en torno a las diferentes etapas que
2
conforman la elaboración del chocolate son diversos. Sin embargo, la
bioquímica y los procesos químicos que conducen a la formación y al
desarrollo del aroma y del sabor del chocolate, su relación con el
carácter final y la percepción de la calidad no se entienden por
completo.
Esta situación hace necesario en realizar la caracterización reológica
del licor de cacao para compilar la información necesaria, referente a
los diferentes factores que determinan la calidad sensorial del
chocolate.
La semilla del fruto del árbol de cacao es la principal materia prima
para la elaboración del chocolate, la cual es sometida a una serie de
etapas de transformación primaria en donde se efectúa la cosecha, la
apertura de la vaina, la fermentación y el secado. Posteriormente se
procede con el proceso de manufactura del chocolate en el cual los
granos son limpiados y tostados, seguidos por la producción del licor
de cacao, mezcla y refinado, conchado, temperado y moldeado,
enfriamiento y finalmente el embalaje, almacenamiento y
distribución. El sabor, el aroma, la apariencia y la textura son
fundamentales para la aceptación del chocolate, los cuales están
influenciados de una u otra forma por diversos factores, tales como la
variedad de cacao, el clima, el suelo, el tratamiento post-cosecha, así
como por el proceso de manufactura del chocolate.
3
1.2 Justificación
El presente trabajo de investigación se justifica por los siguientes
motivos:
La falta de datos científicos y de trabajos de investigación en
aguaje,fruto exótico de nuestra amazonia.
La información del presente estudio permitiráconocer los tipos de
isómeros de vitaminas y el contenido de los mismos presentes en la
pulpa de este fruto.
Los datos que se obtengan servirán para la formulación de nuevos
productos e incentivación para su producción y comercialización.
4
II. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Cuantificación deisómeros de vitaminas A, D yE en dos variedades de
pulpa deaguaje “Mauritia flexuosa” por HPLC en fase reversa.
2.2 Objetivos específicos
Realizar las medidas biométricas y el balance de materia en la
obtención de pulpa de aguaje: cascara, pulpa, piel y semilla.
Evaluación al estado fresco y seco, almacenados a -20ºC de las dos
variedades de aguaje.
5
III. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
3.1 Antecedentes
Según GARCÍA y REÁTEGUI (2002),realizaron la conservación de
pulpa de Mauritiaflexuosal. “aguaje” con aplicación de métodos de factores
combinados.El objetivo de este trabajo fue estudiar la estabilidad físico-
química, sensorial y microbiológica durante el almacenamiento a temperatura
ambiente de pulpa de aguaje. Se han realizado los estudios de aplicación de la
tecnología de factores combinados en la conservación de pulpa de aguaje.
Según GARCÍA et al (2008), determinaronpor CLAR la Vitamina E
en el “Pool” de Aceite de Hígado de Tiburón.En este trabajo se desarrolló y
validó un método analítico, por Cromatografía Líquida de Alta Resolución
(CLAR), para determinar vitamina E, aplicable al control de la calidad del “pool”
de aceite de hígado de tiburón.El método se basó en la separación de la
vitamina a través de una columna cromatográfica Lichrosorb RP - 18 (5 μm, 25
cm x 4 mm), empleando una fase móvil compuesta por metanol: agua (98:2).
La cuantificación de las vitamina E se realizó frente a muestras de referencia
empleando el método del estándar externo, a una longitud de onda de 284 nm.
6
El método analítico desarrollado resultó lineal, preciso, específico y exacto en
el rango de concentraciones estudiadas.
Según SIERRA et al (2007),realizaron la validación de una
metodología por cromatografía líquida de alta eficiencia para la determinación
simultánea de vitaminas A, D3 y E en inyectables de uso veterinario. Obtuvieron
resultados del desarrollo y de la validación de una metodología analítica para la
cuantificación simultánea de vitamina A palmitato, vitamina D3 y vitamina E
acetato en inyectables de uso pecuario. El procedimiento consiste en una
separación por cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) en fase inversa
empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo, metanol, agua
(45:50:2.5), una columna C18 a 45 °C y detección a una longitud de onda de
280 nm. Se encontró que el método es selectivo, lineal y preciso. Estas
características junto con su sencillez hacen que el método sea adecuado y
conveniente para el objetivo propuesto. La robustez de la metodología fue
también investigada. El método validado se aplicó para la determinación de las
vitaminas en tres productos inyectables del mercado colombiano con registro
sanitario del Instituto Colombiano Agropecuario (ICA).
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3.2 Conceptos básicos generales
3.2.1 Características botánicas del aguaje
3.2.1.1 Clasificación taxonómica
NAVARRO (2006), menciona que la taxonomía del aguaje
es la siguiente:
Reino : Vegetal
División : Fanerógamas
Clase : Monocotiledóne
Subclase : Liliopsida
Orden : Arecales
Familia : Arecaceae
Sub Familia : Calamaoid
Tribu : Lepidocaryeae
Género : Mauritia
Especie : flexuosa
3.2.1.2 Descripción morfológica
El aguaje es una palmera arborescente de un solo tallo, sin
espinas, que alcanza 25 a 30 m de altura en su estado de adulto. Crece en
suelos inundados o con mal drenaje. El tallo es cilíndrico con hasta 50 cm de
8
diámetro y está constituido por un material fibroso duro. La corona de hojas se
presenta en número de 10 a 20 por planta, con peciolo cilíndrico y largo (hasta 6
m). La planta es dioica con árboles de flores masculinas y árboles de flores
femeninas, sin características que permitan diferenciar a los individuos machos
de las hembras, hasta la floración. La proporción de plantas masculinas y
femeninas es similar, pero, es alterada por la práctica que existe de cortar las
plantas femeninas para cosechar los frutos.
El fruto es una drupa, de forma elíptica, con longitud entre 5 y 7 cm
y diámetro entre 4 y 5 cm. El epicarpio (cáscara) es escamoso, de color rojo vino
o rojo oscuro. El mesocarpio, la única parte comestible, de 4 a 6 mm de espesor,
es suave, sabor agridulce y de color naranja a naranja-rojizo y representa
solamente 12 a 13% del peso seco del fruto. El endocarpio (cobertura de la
semilla) es suave, rico en celulosa y pobremente diferenciado. Hay una, muy
raramente, de dos semillas por fruto, casi esféricas, cubiertas con una testa
marrón. La floración y fructificación se distribuyen irregularmente durante el año,
pero, siempre ocurren anualmente. Los frutos maduros se encuentran todo el
año, con abundancia en la primera mitad del año (Perú y Amazonía norte de
Brasil), o en la segunda mitad del año (Colombia, Venezuela y Amazonía central
de Brasil). El peso promedio de los frutos en una inflorescencia es de 40 kg
(VILLACHICA, 1996).
Se puedendiferenciar tres variedades de fruta por sucolor: el
Amarillo o Posheco, cuando todo elmesocarpio es de color amarillo; el Colorado,
cuando la parte externa del mesocarpioes de color rojo y el resto es amarillo;
elShambo, cuando todo el mesocarpio es decolor rojo (NAVARRO, 2006).
9
3.2.1.3 Composición química
La pulpa del aguaje es el alimento más nutritivo de los
frutos del trópico. En la tabla 01, se presenta el análisis químico y el valor
nutritivo de la pulpa:
Cuadro 1. Composición química en 100 g de pulpa
Componentes 100 g de pulpa
Energía 283,0 kcal
Agua 53,6 g
Proteínas 3,0 g
Lípidos 21,1 g
Carbohidratos 18,1 g
Fibra 10,4 g
Ceniza 0,9 g
Calcio 74,0 mg
Fósforo 27,0 mg
Hierro 0,7 mg
Fuente: NAVARRO, 2006
3.2.2 Vitaminas
3.2.2.1 Vitamina A
Definición
10
La vitamina A, también denominada trans-retinol (retinol),
es un alcohol isoprenoide que desempeña un papel clave en la visión. Se trata
de un compuesto poliisoprenoide que contiene un anillo ciclohexano (MELO-
CUAMATZI, 2004).
Se conoce bien la importancia de la vitamina A como factor para el
crecimiento y la salud normal. El estudio del ojo y sus enfermedades, y las
investigaciones sobre el valor nutricional de las grasas a comienzos de siglo
fueron rutas diferentes que condujeron al descubrimiento de esta vitamina,
(SASTRE y HERNÁNDEZ, 1999).
En 1909, Stepp descubrió que en la yema del huevo existía una
sustancia soluble esencial para el mantenimiento de la vida. McCollum en
1992 introdujo el término de sustancia liposoluble A para este factor y en 1920
Drummond llamo a esta sustancia vitamina A. Además, fue la primera vez que
se observo que los extractos amarillos de planta ricos en carotenos tenían
actividad de vitamina A. La explicación llego años más tarde (1992) al
descubrirse en ratas que el beta caroteno se convertía en vitamina A. La
estrecha relación entre esta vitamina y los grupos carotenoides se rebeló
cuando se determino la forma estructural de ambos, aunque los carotenos ya
habían sido extraídos y cristalizados de zanahorias en el año 1831 por
Wakenroder. La vitamina A2 fue aislada por Morton en 1937 y la actividad
biológica del acido retinoico fue descubierta en el año 1946.
Wald en los 1934 - 1935 aisló retinaldehido de la retina y demostró
que estaba implicado en el proceso de la visión,(SASTRE y HERNÁNDEZ,
1999).
11
Estructura.
El termino vitamina A se ha utilizado para los derivados
beta ionona que poseen una estructura yactividad biológica comparable a la
molécula base que es el transretinol. En la naturaleza la vitamina A puede
encontrarse en tres estados de oxidación diferentes como resultado de la unión
de 4 unidades de isopreno: alcohol (retinol), aldehído (retinaldehido) y acido
(acido retinoico). En los mamíferos, la conversión del retinol a retinal es un
proceso reversible; sin embargo, la transformación del aldehído en acido
retinoico es irreversible,(SASTRE y HERNÁNDEZ, 1999).
Suele denominarse “retinoide” a todas las formas de vitamina A,
incluso a sus análogos sintéticos, por su enorme importancia en la fisiología de
la retina, aunque algunos autores consideran que son retinoides solo derivados
sintéticos y análogos de la vitamina A. El término incluye alrededor de unas
1500 formas.
Los retinoides pueden presentar cambios en su estructura tanto a
nivel de la cadena lateral como el anillo,(SASTRE y HERNÁNDEZ, 1999).
Los retinoides nativos en solución y también los carotenos por
acción de la luz, calor y iodo pueden sufrir transformaciones (transiciones).
Estas transiciones involucran las isomerizaciones cis-trans de los enlaces
dobles. La cadena lateral de la vitamina A tiene 4 dobles enlaces que
teóricamente son 16 isómeros. El 13-cis-retinol y all-trans-retinol están en
equilibrio en solución con un 33 por 100 de forma cis,(SASTRE y
HERNÁNDEZ, 1999).
12
Con respecto a la estabilidad, la vitamina A es muy sensible al
O2del aire, especialmente en presencia de luz y calor. Los esteres son más
estables al O2 de las formas alcohólicas. Las formas comerciales de la vitamina
A (retinil acetato y retinil palmitato) se presentan en forma oleosa, emulsión
acuosa o polvo estabilizado. Estos productos deben ser protegidos de la luz y
oxigeno durante su almacenamiento. La actividad de la vitamina A que
enriquece la harina disminuye solo con la luz cuando se almacena a 40 – 45 ºC
al cabo de varios meses,(SASTRE y HERNÁNDEZ, 1999).
Respecto a sus propiedades físicas la mayoría de las formas de
vitamina A son compuestos cristalinos con un punto de fusión relativamente
bajo. Por su estructura todos los retinoides tienen un espectro de absorción
característico que se utiliza para su identificación. Cuando se irradian con luz
UV el retinol emite una fluorescencia amarillo-verdosa, mientras que el 3-
dehidroretinol lo hace en el marrón-naranja, (SASTRE y HERNÁNDEZ, 1999).
La actividad de los carotenoides es similar a la vitamina A. Son
sensibles a la luz, ácidos y O2 la oxidación de los carotenoides con O2, produce
compuestos no coloreados. Son más bien solubles en cloroformo y benceno,
poco solubles en éter y acetona e insolubles en agua.
La unidad de medida de la actividad de vitamina A se expresa
como equivalente de retinol (RE). La concentración de vitamina A y β-caroteno
en plasma se expresan como µmol/L, µmol/dL o µmol/Ml, (SASTRE y
HERNÁNDEZ, 1999).
3.2.2.2 Vitamina D
13
Definición
La vitamina D se ha considerado durantedécadas como
factor antirraquítico esencial para la regulación del metabolismo mineral.
Actualmente se reconoce que su principal metabolito, la 1,2 (OH)2D o calcitrol,
es una hormona esteroidea con amplias funciones en el organismo,(SASTRE y
HERNÁNDEZ, 1999).
La 1,2 (OH)2D tiene acción en los principales órganos relacionados
con la homeostasis mineral como intestino, hueso y riñón. Además, está
implicada en el proceso de la osteogénesis, en la modulación de la respuesta
inmune, en la función de las células musculares, así como la diferenciación y
crecimiento del tejido hematopoyético y epidérmico,(SASTRE y HERNÁNDEZ,
1999).
La vitamina D efectúa muchas de estas acciones como el resto de
las hormonas esteroideas, es decir por acoplamiento con un receptor
nuclear/citosolico, que en una subsecuente asociación con regiones selectivas
de los genes produce un aumento o disminución de su expresión.
En los años treinta se aísla la vitamina D como principio activo,
pero permanecen desconocidos su metabolismo así como su mecanismo de
acción. En la década de los setenta se describen su fisiología y metabolismo.
Actualmente se puede considerar que es una vitamina y una
hormona. Puede considerarse como vitamina ya que cuando su síntesis
cutánea endógena es insuficiente, debido a irradiación solar baja o a
disminución en la capacidad de fotoconversion de la piel, su deficiencia puede
ser curada por suplementos de esta sustancia con la dieta. Pero ya sea
14
sintetizada por la piel o ingerida por vía oral, el esteroide básico es
transformado a metabolismo activo, actuando como una prehormona. En virtud
de su producción endógena, la regulación de su síntesis, su distribución por vía
sanguínea a los tejidos diana lejos del lugar de producción así como por su
mecanismo de acción, la vitamina D (en cuanto a su metabolito activo, la
1,25(OH)2D) puede considerarse como una hormona esteroidea, (SASTRE y
HERNÁNDEZ, 1999).
Estructura
La vitamina D tiene una estructura química muy semejante
a la del colesterol. El término calciferol engloba a dos esteroles: colecalciferol
(vitamina D3), que es la forma de la vitamina D que se encuentra en los
animales y en las plantas ergocalciferol (vitamina D2). Los calciferoles no están
ampliamente distribuidos en la naturaleza y la mayoría de los alimentos
animales o vegetales contienen solo precursores inactivos que necesitan de la
radiación ultravioleta para su conversión en calciferoles.
Las vitaminas D2 y D3 se producen en la piel de los animales y en
las plantas por la conversión no enzimática de sus precursores. El precursor de
la vitamina D3 en la piel es el 7-dehidrocolesterol. Por la acción de los rayos
ultravioleta se rompe la unión en el carbono 9-10; posteriormente se produce
una isomerización, y el ergosterol o el 7-dehidrocolesterol se transforma en
ergocalciferol (D2) o colecalciferol (D3), respectivamente,(SASTRE y
HERNÁNDEZ, 1999).
3.2.2.3 Vitamina E
15
Definición
Con el termino vitamina E se denominan a todos los
derivados del tocoferol y tocotrienol. Los cuales tienen una actividad biológica
cualitativa de alfa tocoferol. Este término también se aplica a deficiencia de
vitamina E, actividad de vitamina E, antagonistas de la vitamina E, etc. La
actividad de la vitamina E está condicionada por diferentes tocoferoles y
tocotrienoles presentes en la dieta. No se supo por muchos años con que
patología se podía relacionar esta vitamina. Se observó que la lechuga y el
germen de trigo eran ricos en este factor.
En 1992, Evans y Bishop publicaron la existencia de un nuevo
factor nutricional, primero llamado factor X, el cual prevenía la muerte fetal y
atrofia testicular. Tres años más tarde, Evans publico lo siguiente: “Nosotros
hemos adoptado la letra E como la designación de este nuevo factor dentro de
la serie alfabéticamás próxima a la designación de la vitamina antirraquítica D”.
En los 20 años siguientes fue dirigida a encontrar la aplicación de esta nueva
vitamina en la prevención o cura en los desordenes de la reproducción, tanto
en veterinaria como en medicina humana, sin ningún éxito. Hasta que cuarenta
años mas tarde de su descubrimiento que el edema y la hemolisis del recién
nacido pretermino estaban relacionados con la deficiencia de vitamina E.
Las investigaciones iniciales fueron difíciles por la falta de métodos
adecuados y por que la vitamina E no tiene una acción de coenzima selectiva
como las otras vitaminas y se encuentra e interviene en la fase lipídica. Esta
situación cambia cuando Evans y sus colaboradores aislaron en alcohol
vitamina E altamente activa de germen de trigo. Se determino su formula
16
(C29H30O2) y se le dio el nombre de α tocoferol (tocos = nacimiento); dos
años más tarde se aislaron el β y γ tocoferol con menor actividad que el
tocoferol. Al mismo tiempo Olcott y Emerson (1973) descubrieron que estos
tocoferoles eran efectivos antioxidantes, aunque su poder antioxidante y su
actividad biológica no eran paralelos.
Por mucho tiempo no se considero la función esencial de esta
vitamina en nuestra alimentación debido a que en los países bien nutridos esta
deficiencia es desconocida.
Además las reservas en órganos y tejidos son grandes, por la cual
es difícil producir una avitaminosis. Ha sido en los últimos 15 años cuando se
ha definido su papel esencial para un desarrollo normal y mantenimiento del
sistema nervioso central, nervios periféricos y músculos de niños y adultos.
Actualmente se reconoce que la deficiencia de vitamina E se produce
comúnmente en lactantes, niños y adultos con mala absorción crónica a las
grasas; como posible complicación de la nutrición parenteral total, es un
problema nutricional en países desarrollados, y como una característica del
error innato del metabolismo en el cual está involucrada la proteína
transportadora del α tocoferol hepático. Fue en 1968 cuando la Food and
Nutrition Board la considero como un componente esencial, (SASTRE y
HERNÁNDEZ, 1999).
Estructura
El termino de vitamina E se le da a una familia compuesta
de 8 sustancias similares que existen en la naturaleza derivadas del 6-
cromanol, cuatro tocoferoles (α,β, γ y δ tocoferol: la posición q ocupa el grupo
17
metilo en el anillo cromanol determina la letra griega utilizada como prefijo), con
la cadena lateral saturada y cuatro tocotrienoles ((α,β, δ y γ tocotrienol) con la
cadena lateral insaturada. Los grupos metilos le confieren diferente
bioactividad(alfa > gamma > beta > delta). La esterificación del grupo fenólico
del anillo de cromanol con acetato, succinato, nicotina, etc., protege al tocoferol
de la oxidación. Sin embargo, puesto que estos grupos ocupan los sitios donde
está la actividad antioxidante de este compuesto, se requiere que estos esteres
sean hidrolizados para que tengan actividad biológica.
La nomenclatura puede ser confusa pero hay un acuerdo
internacional que especifica que el d-α-tocoferol se llama RRR-α-tocoferol; es
la forma más extendida en la naturaleza. Al diesteroisomero con
configuración2S,4’R,8’R se llama 2-epi-α-tocoferol. A la mezcla RRR-α-
tocoferol y 2-epi-α-tocoferol obtenida por síntesis del fitol e hidroquinona se
denomina 2-ambo-α-tocoferol 1 UI se define como 1 mg de 2-ambo-α-tocoferil
acetato. La vitamina E sintetica es una mezcla de los 8 diesteroisomeros
conocida como all-rac-α-tocoferol.
El alfa tocoferil acetato es la forma cuantitativamente más
importante utilizada como suplemento dietético en medicina. La vitamina E no
esterificada se utiliza como antioxidante en tecnología alimentaria (evitan que
las grasas y aceites se enrancien).
En ausencia de O2, los tocoferoles tienen una estabilidad elevada
al calor, la luz y alcalinidad. En presencia de O2 pierden sus propiedades
antioxidantes,(SASTRE y HERNÁNDEZ, 1999).
Fuentes
18
La vitamina E se encuentra principalmente en el aceite de
los vegetales (soja, maíz, algodón y girasol), granos, plantas y en el tejido
adiposo de los animales. Se localiza principalmente en las hojas y partes
verdes de las plantas, las cuales contienen másα-tocoferol que las partes
amarillas. También se encuentran en algas marrones, verdes y rojas, en
algunas levaduras y hongos, pero no en las bacterias. La distribución de los
tocoferoles es diferente a los tocotrienoles. Los tocotrienoles son abundantes
en el aceite de la semilla de palma. El aceite de girasol es tal vez la fuente más
importante de vitamina E (42,1 a 113 mg/100g de aceite). El aceite de germen
de trigo es comparable al de girasol. La destilación de un aceite produce
pérdidas considerables en su contenido de vitamina E, que causa
desestabilización del mismo, por lo que son los vapores destilados en la
refinería de los aceites utilizados en la alimentación las fuentes naturales más
importante de vitamina E.
Normalmente en un cocinado cuidadoso se pierde un 10 por 100
de esta vitamina. Las mayores pérdidas ocurren al freír, asar o cocer a fuego
lento, y son totales cuando se fríe en aceites que son recalentados
repetidamente. El tocoferol se degrada lentamente si hay una gran cantidad de
ácidos grasos insaturados en los alimentos congelados. En los granos
almacenados se pierden un 10 por 100 cada mes. El germen y salvado del
grano contienen la vitamina E por lo que las harinas blancas prácticamente se
eliminan en la elaboración. En los vegetales desecados las perdidas fluctúan
entre el 50 – 70 por 100.
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Para los niños las principales fuentes dietéticas son los aceites
vegetales, margarinas, germen de trigo, nueces y hojas verdes. Las formulas
infantiles contienen 0,4 mg de vitamina E/mg de Polyunsaturated fatty acids
(PUFA).
3.2.3 CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Es una técnica de separación de compuestos, que permite aislar,
identificar y cuantificar los compuestos desconocidos tales como vitaminas,
proteínas y compuestos activos como flavonoides, alcaloides y esteroles en
una muestra o solución conocida. Para la cuantificación de estos compuestos
se utiliza estándares específicos (Horie et al., 2000).
La técnica HPLC describe el proceso en el cual la fase móvil
(líquido) es mecánicamente bombeado a través de una columna que contiene
la fase estacionaria (sólido) y la cuantificación de los analitos se realiza
mediante un detector (Nielsen, 1998).
Según Nielsen, 1998 el sistema HPLC consta de las siguientes
partes:
1. Bomba: Son dispositivos de alta tecnología que tiene por función de
entregar la fase móvil a través del sistema, a diferentes flujos según lo
especifique el método, en cantidades exactas y de manera precisa.
2. Inyector: El fin del proceso de inyección es introducir la muestra en
un reservorio sujeto a acción de la bomba para luego ser llevado a la columna.
3. Columna: La columna es considerada como una herramienta para la
separación de las moléculas presentes en la muestra que está siendo
20
analizado.
4. Detector: El detector por lo general es ultravioleta (UV) o visibles
(VIS), es el instrumento que detecta la presencia de las moléculas motivo de
análisis. Una vez que la muestra sale de la columna es presentada al detector
que identifica en función a la absorbancia la cantidad presente de un
determinado analito; luego el detector convierte esta interacción en señal
electrónica que es enviada al sistema de datos. La magnitud de esta señal es
graficada contra el tiempo.
En la Figura 1 se esquematiza un sistema HPLC en gradiente de
baja presión, que es la configuración con la que se trabajará.
21
Figura 1. Sistema HPLC en gradiente de baja presión
22
IV. HIPOTESIS
Es posible evaluar el contenido de isómeros de vitaminas A, D y E
de dos variedades de pulpa de aguaje (Mauritia flexuosa) por HPLC en fase
reversa.
23
V. MATERIALES Y METODOS
5.1 Lugar de ejecución
El presente trabajo de investigación se realizará en el Centro de
Investigación de Productos Naturales de la Amazonía (CIPNA), de la
Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS).
5.2 Materiales
5.2.1 Materia prima
Las dosvariedades de aguaje (Amarillo y Shambo)se obtendrán del
ámbito de la región amazónica peruana.
5.2.2 Materiales de laboratorio
5.2.2.1 Materiales
- Tubos de ensayo (10ml)
- Vasos de precipitación(1000ml,500ml,100ml,50ml,10ml)
- Fiolas (1000ml, 500ml, 100ml, 50ml, 10ml)
- Probetas
- Termómetros
- Microtubos (1,5 ml, 2 ml)
- Puntas para micropipeta(1000ul, 200ul, 100ul)
- Micropipetas
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- Matraces Erlenmeyer
- Geringas
5.2.2.2 Equipos
- Estufa
- Congeladora
- Centrífuga
- Homogenizador
- Destilador
- Desionizador
- Equipo de Cromatografía Líquida de Alta Performancia
(HPLC)
- Refrigeradora
5.2.2.3 Reactivos y solventes
- Acetonitrilo (grado HPLC)
- Isómeros de vitamina A, D y E
- Etanol al 99.9%
5.3 Métodos de análisis
5.3.1 Evaluacióndel contenido de vitaminas A, D e isómeros de
vitamina E por HPLC
Se realizará de acuerdo al método descrito por SUPELCO – Sigma
Aldrich (1999), para la determinación de vitaminas liposolubles.
25
VI. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
El siguiente trabajo de investigación estará dividido en dos etapas:
6.1 Obtención de los extractos
En esta etapa se procederá a la obtención de los extractos (Ver
figura 2).
6.1.1 Obtención de la muestra
Las dos variedades de aguaje se obtendrán del ámbito de la región
amazónica peruana, tomando criterios de poscosecha (frutos de color rojo
oscuro).
6.1.2 Determinación de medidas biométricas
Se medirán el diámetro y la longitud de los frutos de las dos
variedades de aguaje empleando un vernier.
6.1.3 Maduración del aguaje
Los frutos se sumergirán en agua a 55 ºC, por 2 horas y media
para su maduración, (GARCIA y REATEGUI, 2002).
6.1.4 Obtención de la pulpa y balance de materia
Se desprenderá la cascarilla del endocarpio del fruto con la ayuda
de una cuchara y luego se separará la pulpa. Se realizará el balance de
materia pesando la cascara, pulpa, piel y semilla.
6.1.5 Conservación y Almacenado de la pulpa
26
Se realizaran los tratamientos descritos a continuación:
T1= Empacadoy almacenado a -20ºC.
T2 = Secadoa 45 ºC, empacado y almacenado a -20ºC.
T3= Inmersión en solución de ácido cítricoal 0.3 % por 5 seg, oreado por
5 min, secado a 45 ºC,empacado y almacenado a -20ºC.
6.1.6 Extracción
La pulpa se someterá a una solución de etanolal 70 % con el fin de
extraer los isómeros para su caracterización.
6.1.7 Filtración
Se realizará con papel filtro y con la ayuda de una bomba de vacio
para agilizar este proceso.
AGUAJE
MADURADO
27
Figura 2. Obtención de los extractos para las dos variedades de aguaje.
6.2 Evaluación del contenido de vitaminas A, D eisómeros de vit. E por
HPLC
La caracterización de las vitaminas se realizara en dos grupos:
6.2.1 Vitaminas A y E empleando columna cromatográfica C8, CLC
Para la caracterización de isómeros de las vitaminas A y E se
trabajará utilizando las siguientes características que debe tener el equipo:
- Columna: Shim Pack CLC - C8, 15cm x 4.6mm ID, 5µm partículas
- Fase móvil:Acetonitrilo:agua (90:10)
- Flujo de alimentación: 2mL/min
28
- Temperatura:30ºC
- Detección: UV, 290nm
- Inyección:10µL
6.2.2 Vitaminas D2y D3 empleando columna cromatográfica C18,
Supelco
Para la caracterización de isómeros de la vitaminaD se trabajara
utilizando las siguientes características para el equipo:
- Columna: Supelco C18, 15 cm x 4.6mm ID, 5µm partículas
- Fase móvil: Acetonitrilo 100%
- Flujo de alimentación: 1.5 mL/min
- Temperatura:30ºC
- Detección: UV, 290nm
- Inj.:10µL
29
VII. DISEÑO EXPERIMENTAL
Figura 3.Diseño experimental para la caracterización de los isómeros de las vitaminas propuestas.
Donde:
A, y B: Son las variedades de aguaje.
T1, T2, y T3: son los tratamientos para evaluar el contenido de vitaminasA, D eisómeros de vit. E.
R1, R2 y R3 son las repeticiones para cada tratamiento.
R3R1 R2 R1 R3R2R1 R3R2
A B
Variedades
T1 T3T2
Mauritia flexuosa
CARACTERIZACION DE LOS ISOMEROS DE LAS VITAMINA A, D y E
30
VIII. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para evaluar los resultados de acuerdo al diseño experimental se
utilizará el modelo estadístico diseño completo al azar con arreglo factorial de2
x 3con tres repeticiones, por cada vitamina, para lo cual se empleará el
siguiente modelo matemático:
yij = μ + ai + bj + (ab)ij+ eij
Donde:
Yijk : Contenido de Isómeros de vitaminasA, D y E.
U : Efecto de la media general de las evaluaciones.
ai : Efecto de las variedades de aguaje.
bj : Efecto de los tratamientos de conservación en la pulpa de
aguaje.
(ab)ij : Efecto de la interacción de la variedades y los tratamientos
de conservación en la pulpa de aguaje.
eij : Efecto del error experimental.
De existir significancia entre los tratamientos, se evaluará con la
prueba de Duncan, con un nivel de significación del 5%. El análisis estadístico
se realizará mediante el software STATGRAPHICS PLUS 5.1
31
IX. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
En el siguiente cuadro, se muestra el cronograma de actividades,
los meses divididos en semanas.
Cuadro 2. Cronograma de actividades de la presente investigación.
Meses
Actividades 1 2 3 4 5 6
Elaboración del proyecto X X
Presentación y aprobación
del Proyecto
X X X X
Desarrollo de pruebas
experimentales
X X X X XX X X X X X X X X
Redacción del informe X X X X X X X X X X X X X X X
Donde:
X = Semanas.
32
X. PRESUPUESTO
En el Cuadro 3, se presenta el presupuesto para la ejecución de
este trabajo de investigación.
Nº Rubro Costo unt.S/.
Costo total S/.
Costo rubro
S/.
Costo total
partida (S/.)
01.0001.10
01.20
01.3001.40
02.0002.1002.2002.3002.40
02.5002.60
BienesMateriales de escritorio- 2mill. Papel bond A4- 4u. Plumones indelebles- 1u. Cuaderno de registroMateriales de procesamiento de datos- 1 Memoria USB- 2 CD’s- 4 Cartuchos impresiónImpresión, fotocopias, internetMateria prima, insumos y reactivos- 20 kg aguaje- otrosServiciosPasajes y viáticosAnálisisMaterial de apoyoTipeos, impresiones y encuadernadosServicios de água y luzAlquiler de equipos
33.007.002.00
50.001.50
60.00
2.5020.00
66.0028.00
2.00
50.003.00
240.00
50.0020.00
96.00
293.00
250.0070.00
250.002000.00
50.00300.00
200.00500.00
709.00
3300.00
Sub. totalImprovistos (10%)
4009.00400.90
TOTAL 4409.90Cuadro 3.Presupuesto para la ejecución del trabajo de investigación.
33
XI. BIBLIOGRAFIA
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