REPLIAGE DE PROTEINES I · PLIAGE DE PROTEINES I •« protein folding is a vital biological process as it adds functional flesh to the bare bones of genes » (U. Hartl, MPI, Martinsried)

CONTENU

Jochen Lang

Pr UB1

[email protected]

UMR CNRS 5248

Cellules beta-pancréatique et homéostasie glucose

- Transport vésiculaire/exocytose/fusion membranaire

- Signalisation induit par le glucose

- Biosenseurs hybrides (coll. Micro-électronique et diabétologie)

Biologie cellulaire et moléculaire, Biochimie, Electrophysiologie

TD: Pier Scotti

CONTENU

INTRODUCTION ET RAPPEL

Rôles des Membranes

Pliage et destruction de protéines

Le concept de chaperonnes moléculaires

le système DnaJ/DnaK (« les petites »)

le système GroEL/GroES (« les grandes »)

conclusions

PLIAGE DE PROTEINES I

• « protein folding is a vital biological process as it adds functional flesh to the bare bones of genes » (U. Hartl, MPI, Martinsried)

• Structure = Fonction

• Pourquoi un protéine se replie

• Et dans quel environnement?

PLIAGE DE PROTEINES II

PLIAGE DE PROTEINES III Exemple Ribonucléase

Structures largement feuilles b L’intérieur: des résidus hydrophobes densement arrangés

L’eau entoure les R polaires à la surface

Vue « cartoon » Coupé en deux

au milieu

Bleu: R polaires Violet: R hydrophobes

Vert: Eau

Vue extérieur

Coupé en deux au milieu Avec eau

synaptotagmin synaptotagmin

PLIAGE DE PROTEINES IV Propriétés d’acides aminés

From Livingstone, C. D. and Barton, G. J. (1993), "Protein Sequence Alignments: A Strategy for the Hierarchical Analysis of Residue Conservation", Comp. Appl. Bio. Sci., 9, 745-756.

http://www.russelllab.org/aas/

PLIAGE DE PROTEINES IV Rappel structure: Hélice a 1

# « squelette » polypeptide

autour d’une axe imaginaire

# chaînes latérales (R)

vers l’extérieur

# 1.5 A entre acides aminés,

# un tour

=5.4 ANGSTROEM (0.54 nm)

= 3.6 Acides Aminés

(donc 3 à 4 acides aminés)

f = -60

j = -50

# stabilisée

par liaison hydrogène entre

hydrogène du N et O du carbonyl;

chaque liaison peptidique participe

(sauf extrémités)

# en générale au moins 8 AA

R Ca

O

N

C carbonyl

H (+)


8

C

a O

N

-

+ C-ter

N-ter

# - O; +, H Dipôle de la liaison peptidique s’étend à travers de la hélice # Les 4 AA des deux extrémités de l’hélice ne participent pas aux liaisons hydrogènes déstabilisation # Contrepoids par AA avec R chargés (à charge contraire; négative au amino terminus, positive au carboxy terminus)

C

NH

NH

O

H

+ +

-


FACTEURS DE STABILITE INSTABILITE: Interactions entre Rs trois (ou quatre) AA à part attraction électrique Répulsion Volume de R (adapté) R grande trop de Pro ou Gly

dipôle

Interactions entre AA aux extrémités

PLIAGE DE PROTEINES IV Rappel structure: Feuillet b

FACTEURS DE STABILITE protéine entière

pH Liaison de ligand (inclus ioniques) Ponts disulfures Résidus intérieurs

FACTEURS DE STABILITE protéine entière

La plupart des protéines sont seulement marginalement stables

Analyse thermodynamique: État natif d’une protéine seulement 5 - 10 kcal/mol plus stable que la forme deplié

= force d’une seule liaison hydrogène!

Exemple: collagène Source Temp. de fusion Température du corps Peau de veau 39 37 Peau de requin 29 24-28 Peau de morue 16 10-14

Raisons: * Flexibilité permet changement conformationel = fonction * Pliage et dépliage lors du transport à travers de membranes * Désassemblage des complexes/dégradation (régulation)

PLIAGE ET ESPACE

Albumine de sérum humaine, 585 AA, Mr 64.5 kDa

Structure: Problème de

volume

myoglobine: Différents modes de présentation ruban/»mesh»/surface/ruban +R/espace Fraction d’occupation: 0.75 Proche du max théoriquement possible (cristal)

PLIAGE DE PROTEINES V

• Pliage: structure 3D

• Optimalisation de l’espace

• Interactions spécifiques avec autres protéines

• « Dépliage », Agrégation:

• Exposition de séquences hydrophobes!

PLIAGE DE PROTEINES

• etape nécessaire :

• apres synthèse

• transduction sec a qques minutes (ca. 50 msec/AA E. coli, 0.5 sec/AA eukaryote)

• collapse hydrophobe qques millisecondes

• - transport a travers de membranes en forme élongée

• domaine: 30-200 AA; contiguë ou pas (feuillet b)

• rôle des interactions faibles (liaisons hydrogènes)

• les protéines sont seulement marginalement stable! (ex collagène)

• les protéines vivent dans un environnement dangereux:

• -protéases

• - dense! (34%)

• # mouvement brownienne

• # Ka entre macromolécules

• - polysomes ! (rapprochement de séquences similaires)

PLIAGE DE PROTEINES paradoxe de Levinthal a

Peptide de 100 acides aminés Synthèse en 5 s à 37

C 10 conformations/acides aminés =10100 conformations Vibrations moléculaire=1013 s 1077 années

1 ms de la vie d’une peptide

PLIAGE DE PROTEINES paradoxe de Levinthal: inter- vs intra moleculaire

CONTENU

• INTRODUCTION ET RAPPEL

• Rôles des Membranes

• Pliage et destruction de protéines

• Le concept de chaperonnes moléculaires

• le système DnaJ/DnaK (« les petites »)

• le système GroEL/GroES (« les grandes »)

• conclusions

REPLIAGE DE PROTEINES les membranes (a)

Chaperonnes: Habituellement soluble/cytosolique Ca. 40% des protéines sont membranaires Qui les stabilise et les aide à se plier?

Insertion membranaire

REPLIAGE DE PROTEINES VIIb les membranes b

Bleu = eau Orange = « têtes polaires Vert = chaînes acyl

cytosol membrane Gradient pH non oui Champ électr. Non oui Protéine/solvant 17% 35% Mol solvant/prot 15 4 Pression non oui DG liaison H ~0 +5 très stable!

Un environnement particulièr

REPLIAGE DE PROTEINES VII c les membranes c

Membranes et interfaces

REPLIAGE DE PROTEINES VII d les membranes d- stabilisation

Stabilisé par boucles

Stabilisé par polaires/eau

Avec ligands

Pression latérale

van der Waals

Effets hydrophobes

REPLIAGE DE PROTEINES protéines membranaires

“Hydrophobic Mismatch” Interactions entre membranes et protéines


Sous-domaine et triage de protéines

Changements conformationnels

Radeaux et organisation latérale


Epaisseur de la membrane « Protein tilt » ou Angle d’insertion

CONTENU







• conclusions

PLIAGE DE PROTEINES

• Mécanismes « protidiques »: chaperonnes, chaperonines (« chaperonnes à chambre »)

• Mécanismes due à l’architecture cellulaire

• Procaryote: plustot post-transductionnelle

• Eucaryote: plustot co-transductionnelle protéines plus complexes, plus longues E. coli: moyenne 35 kDa; 90% <500 aa levure: moyenne 53 kDa; 60% < 500 aa

• Domaines protidiques: 50-300 AA (archae, pro, eu) plus de protéines à multiples domaines chez les eucaryotes

• Co-transductionelle: pliage d’une domaine afin la fin de la synthèse de la prochaine domaine

• Conséquence: par exemple production actine recombinante 2 domaines (tête/queue) pliage incorrecte dans E. coli

PLIAGE DE PROTEINES IX survivre dans un espace fortement peuplé et dangereux

oligomere Hetero-oligomere

« arrays pathologiques » plaques

« aggregats »

Pliage avec protéines « non-chaperonnes »

Liaison avec chaperonnes

Chaine non-pliée

Partiellement pliée

pliée

Solutions concentrés (34%) Optimisation d’espace

Mouvement brownien réduit Interactions « non-spécifiques »

Protéines solubles Protéines membranaires

PLIAGE DE PROTEINES IXb l’agrégation intracellulaire

MTOC

Russell Aggresomes Maladies hépatiques neurodégénératives


Movie aggresome



Michele Vendruscolo, Proteome folding and aggregation , Current Opinion in Structural Biology Volume 22, Issue 2 2012 138 - 143

CONTENU







• conclusions

PLIAGE DE PROTEINES XI les concepts des chaperonnes (b)

• 1911 Chick et Martin : différence entre dénaturation et agrégation

• 1929 Wu : dénaturation : dépliement de proteines (hypothèse), liaisons faibles

• 1945 Anson : preuve expérimentale (hémoglobine)

•

• repliement in-vitro : ARNase possible (Dogme d’Anfinsen, 1961)

PLIAGE DE PROTEINES XI ANFINSEN

Toute l’information nécessaire contenu das la protéine

PLIAGE DE PROTEINES XI ANFINSEN

Forme native = forme la plus stable

PLIAGE DE PROTEINES XI les concepts des chaperonnes (b)

• 1911 Chick et Martin : différence entre dénaturation et agrégation

• 1929 Wu : dénaturation : dépliement de proteines (hypothèse), liaisons faibles

• 1945 Anson : preuve expérimentale (hémoglobine)

•

• repliement in-vitro : ARNase possible (Dogme d’Anfinsen, 1961)

• très lente : ca 20 min pour protéine monomérique simple ; in vivo rapide

• paradoxe de Levinthal

•

• certaines protéines trouvent spontanément leur forme, d’ autres pas

• définition de facteurs : repliement de la ARNase, influenza HA etc avec microsomes (ER)

• Rôles des ponts disulfures (PDI, ER)

• sucres N-linked oligosaccharides (hCG; biotech, bacteria)

PLIAGE DE PROTEINES X les concepts des chaperonnes (a)

1978 Laskey « Chaperonnes » nucleoplasmine/histones/ADN =nucleosomes

1989 Ellis “chaperonnes moléculaires”

Conclusions: Repliement nécessaire Chaque protéine peut théoriquement trouver sa bonne forme mais après combien de temps ??? Chaperonnes: augmentent efficacité (unité de travail/temps) VITESSE ne donne pas la forme (pas d’information stérique!) Seulement quelques protéines nécessitent chaperonnes ? Tous les protéines nécessitent les chaperonnes ? Peptides courtes =exception

PLIAGE DE PROTEINES XII les chaperonnes - classification

• Famille large, partiellement connue seulement

(hsp10,40,60,70,90,100; BiP, calnexine, calréticuline; PDI; proline-isomérase etc.)

• Classification approximative (!)

• « les petits »: <200 kDa

• Hsp70,(DnaK), Hsp40 (DnaJ) Hsp=heat shock protein

rôle du choc thermique

• « les grandes » > 800 kDa (chaperonines, « à chambre »)

• GroEL/GroES (Hsp60/Hsp10)

• TCP-1 (tail-less complex polypeptide 1)

PLIAGE DE PROTEINES XIII

Repliement spontané

Chaperonnes

Agrégation

Dégradation

Protéine native

PLIAGE DE PROTEINES XIII vue générale du système

Plusieurs chaperonnes: DDnaK pas létale Dtig (TF) pas létale DDnaK/Dtig (TF) létale synthétique Substance testée: luciférase

Hsp70 et apparentées levure: ca. 2% de protéines cellulaires •t 1/2 liaison ca. 15 sec

•Peptide naissant liée à un hsp pendant sa synthèse

PLIAGE DE PROTEINES XIII vue générale du système

Rôles biologiques de chaperonnes:

Assistance au pliage (substrats)

Guidage à travers des membranes biologiques (cis et trans)

Désassemblage des oligomères

Faciliter la dégradation

Control de l’activité de complexes protidiques • Cdk: progression vers G1 • eIF2a-kinase: initiation de la translation • Raf-1: MAP-kinase (traduction de signaux) • NOS: production NO (traduction de signaux)

CONTENU







• conclusions

PLIAGE DE PROTEINES XIV le système DnaJ/DnaK (« pétites »)

Trois composants:

PLIAGE DE PROTEINES XV le cycle DnaK/DnaJ

ADP: haute affinité ATP: basse affinité

DnaJ stimule ATPase

GrpE stimule échange (ca 5000x)

relargage

pliage

Peptide à plier

PLIAGE DE PROTEINES XVb comment DnaK prend en charge une protéine

DnaK

Le substrat

PLIAGE DE PROTEINES XVI la famille DnaJ

PROTEINES AVEC DOMAIN J ET LEURS FONCTIONS Auxilin clathrin uncoating Sec63p translocation DNA tumor virus T antigen réplication Csp exocytosis TID56 suppression de tumeurs Mdj2p import mitochondriale Hsj1 fonction des neurones

PLIAGE DE PROTEINES XVI comment tester pour activer chaperone?

- Activité Luciférase

- Sensibilité protéolyse

PLIAGE DE PROTEINES XVII « les grandes »

« TIM barrel »: pliage des enzymes

PLIAGE DE PROTEINES XVIII a qui passe par ou? (a)

Différence de taille: Hsp70: 10 to 50 GroEL: 20 to 80 pI vers 6 (pourquoi?)

Label radioactive pour peptide nouvellement synthétisé Imminoprécipitation avec anti GroEL

PLIAGE DE PROTEINES XVIII a qui passe par ou? (a)

Distribution génome E. Coli (jaune) Protéine exprimé au cours de 15s à 30°C (bleu) Liaison à GroEL à l’intérieur d’E. coli à 37°C (verte) Liaison à DnaK à 40°C (rouge)

CONTENU






• le système GroEL/GroES (« les grandes »), Rubisco

• conclusions

PLIAGE DE PROTEINES XIX système GroEL - GroES

GroEL: 2 heptamères (2x7x60 kDa); 2x7 sites de liaison ATP; hsp60 GroES: 10 kDa

ATP

14 nm

18 n

m

PLIAGE DE PROTEINES XIX système GroEL - GroES

GroEL (ADP) GroEL-GroES (ATP)

hydrophobe peptide Force: ca 500 pN

PLIAGE DE PROTEINES XIX système GroEL – GroES les poches hydrophobes

GroES

GroEL

PLIAGE DE PROTEINES XX dynamique de GroEL - GroES

Changement de forme •Agrandissement chambre réaction • Cacher points hydrophobes •. Chambre devient hydrophile

GroEL GroEL/ATP-GroES GroEL/ATP-GroES

GroEL

PLIAGE DE PROTEINES XXI le cycle GroEL - GroES

Haute affinité Encapsulation pliage

Encapsulation Pliage

« actif »

Plages hydrophobes Haute affinité vers non-pliée: « unfoldase » T ca. 20s; éjection ca. 15 s; coopérativité cis/trans Coût de l’opération: ca. 350 kcal/mol; 10% synthèse

T, ATP; D, ADP

CONTENU







• conclusions

PLIAGE DE PROTEINES XXII les arrangements

PLIAGE DE PROTEINES XXIII résumé

PLIAGE DE PROTEINES XXIV pliage et destruction – »les agents doubles »

Pliage Dégradation

interactions: domaines TPR (tetratricopeptide repeats)

geldamycine

PLIAGE DE PROTEINES XXIV autres chaperonnes

Autres chaperonnes : HSP90 dimère de ca. 180 kDa lie ATP, agit souvent avec autres chaperonnes réagit avec quelques protéines spécifiques, p.e; CFTR; eIF2alpha kinase rôle ? Tampon de variation génétique? HSP100 « ring-like », mais plus petit que HSP60 rôle dans les prions de la levure Calnexin, calreticulin, PDI, PPI/TF Co-chaperonne: Csp?, auxilin (« uncoating »), BAG-1 (anti-apoptotique) etc…

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REPLIAGE DE PROTEINES I · PLIAGE DE PROTEINES I •« protein folding is a vital biological process as it adds functional flesh to the bare bones of genes » (U. Hartl, MPI, Martinsried)